Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль полиаминов в сопряжении энергетического и конструктивного обмена у ESCHERICHIA COLI

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль полиаминов в сопряжении энергетического и конструктивного обмена у ESCHERICHIA COLI"

ШНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ(РОССИЯ) ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ТКАЧЕНКО Александр Георгиевич

РОЛЬ ПОШМИНОВ В СОПРЯЖЕНИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО И КОНСТРУКТИВНОГО ОБМЕНА У ESCHERICHIA. COLI.

03.00.04 - биохимия 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских неук

ЧЕЛЯБИНСК - 1993г.

Работа выполнена в лаборатория биоэнергетики Института экологии и генетики микроорганизмов Российской академии наук

Научный консультант:

доктор медицинских наук, чл.-корр. АН России В.АЛерешнев

Обфациальныв оппоненты:

доктор медицинских наук, чл.-корр. АЕН России О.В.Бухарин доктор ыедацинекшс наук Н.А,Глотов доктор биологических наук В.Е;Рябинин

Ведущая организация - Институт биохимии ш.:.Ьаха АН России

Защита диссертации состоится 1993г. в_час

на заседании специализированного совета Д - 084.04.01 при Челябинском медицинском института (454092 г. Челябинск, ул. Воровского, 64)

С днееартавдей модно ознакомиться в нау-шой библиотеке института.

Автореферат разослан " "_1993 г.

Учзпй секретарь слецивлизярованногэ совета, доцент

Л.В.Кривохизина

Актуальность проблемы. Одним из центральных событий в метаболизме клетки является сопряжение процессов генерирования энергии и биосинтеза ее компонентов. с. особенности это касается микроорганизрдзв, разнообразие и изменчивость местообитания которых определяет гибкость реакции их метаболизма на изменение потока энергии. Несмотря на то, что проблеме энергетического сопряжения уделяется значительное внимание, в особенности в последние '¿-3 десятилетия, конкретные механизмы, лежащие в его основе, всё ещё далеки от полного понимания. Значитель-:гым стимулом в исследовании данной проблемы послу:хшш работы Митчела ( Mitchell, -öcl), которые разработкой своей хемиосмотической гипотезы . сопря;:вния внес резолющонный вклад в новое понимание механизмов сопряжения дыхания и .¿юсфорилпрозания. Наряду с энергетичз сдсим сопряге-нием на мембранах существует относительно самостоятельная система сопряжения энергетического и дзнструктинюго метаболизма в целом, определяющая эфузектизность использования генерированной различными путями энергии з реакциях биосинтеза.

i последнее время в научно:: литературе, глазным образом зарубежкой, растет поток работ, посвященных изучению роли полиаминов в многочисленных биосинтетических процессах, местом их регуляторного воздействия является не единичная метаболическая реакция или путь, а совокупность процессов макромолекулярного синтеза, включая репликацию дйК, транскрипцию, трансляцию, биосинтез ¡росшолипидов и другие процессы жизнеобеспечения клетки, причем как правило на уровне функционирования надмолекулярных структур i Morris, Morton,IS8I; Sohu-Ъег, 1969). Ь то :ке зремя практически не уделяется внимания изучению взаимодействия полиамидов и шерментов их синтеза с энергогенерирую-щими системами клетки. Прямая зависима сть скорости многое еденных биосинтетических процессов от уровня полиаминов делает актуальной задачу поиска факторов, регулирующих величину их внутриклеточных пулов. Предпринятое в настоящей .диссертационной работе изучение влияния энергетического состояния на уровень полиаминов в клетке и активность ключевых ферментов их синтеза послужило основанием для разработки концепции о роли системы синтеза полйаминов как механизма сопряжения энергетического и конструктивного метаболизма у E.coli.

Исследование взаимоотношении мезду энергетическим состоянием клетки, уровнем полиаминов и скоростью роста клеток имеет большое значение не только для понимания механизмов энергетического сопряжения у микроорганизмов, но и представляет значительный интерес для медицины с точки зрения изучения закономерностей роста опухолей и канцерогенеза. Прямая зависимость меаду уровнем полиаминов и ско-

ростью злокачественного роста (Ъердинсккх, Балеток,ISB7) делает актуальный изучение механизмов, регулирующих внутриклеточный пул по-лаашнов, С этой точки зрения микроорганизмы являются удобной моделью для обощений и проверки изученных закономерноcreli на различных уровнях организации яавого, включая эукариотическиь клетки человека.

деля я задачи исследование. Исхода из вышеизложенного, основное цельзз настоящей работы является поиск и изучение признаков, характеризующих степень сопряжения энергетического и конструктивного метаболизма, биохимических механизмов, лежащих в его основе, а такае путей адаптации микроорганизмов к условиям энергетического разобщения.

В соответствии с целями исследования конкретными его задачами являются;

1. Разработка эффективных методов определения нуклеотидоз а полиаминов.

2. Поучение энергетического статуса клетки как признака, характери-зуядэго степень сопряжения энергетического- а ■ инструктивно го метаоо-лязод.

3. Изучение регуляторннх эффектов энергетического состояния клетки на активность системы синтеза поллаыинов.

4. Изучение роли взаимодействия аденилатно;. и полиаминсиатезирунцей систем в регуляции 'гушшзонального состояния нуклеиновых кислот.

5. Изучение роли системы синтеза полиаминов г регуляции фосфолшщд-ного обмена мембран и хункцпоннровании мсмбрано связанных фершнтов (Н+АТмза, дыхательная цепь).

6. Изучение роли полиаминсинтезяруиаей системы в ионном транспорте

кл8тш1.

7. Изучение взаимодействия днергогеяеоируших и подиашнсинтезарую-sjsfl систем клетки как ыеханвзка адаптации к стрессовым воздействиям,

р^т-т-т- г теоретическая значимость. На пути к достижению

4*u . jc„rœc£ р-бохн разработаны оригинальные ¿ысокочувстотолыше ,< ci вгиеяопяс вуклоотсдов (Ткг»геш«>,1391) и полаоми-

■> OLû ^-г., благодаря штсрш стало кшмзгзл ро-

w 1' ^г^ю с, дач. Z етгэсаьо эти: и друг^хг согрсизппкг кзто-. i v 4 IÇ3L т . I Еараллслыше ксслздошш:я энергетического ссо-

,1 х"- j с.. _ к glictcî.rj ceht3s0 полпсшпов k3r е клсточ-

' . ir- 1 I ciiioocoïax .ехгаубютх» TLÏZJZ i-ак czpcjûr/

va п"1 » ' r с чиашшЗ cxpcoct шггвтелшю iî гН - ■

i т" ' î с с + i у ' л. С пошць» кжг кс-

с t.- г г " с е , г ;гяу содстс:ап;с:з АТС

в клетке :: активностью ключевого фермента биосинтеза пояиакинов, ор~ шшшдекарбоксилазы (Одд). В опытах in vitro эта завиошэсть на ада свое полное лодтвергдение, когда Чфизиологические"концентрации АТФ окулировали активность ОДК на 200-300^. На основании зтих экспери^-ментальных данных впервые «¿юрмулирована гипотеза о роли системы синтеза полиаминов как одной из точек сопряжения энергетического и конструктивного метаболизма (Ткачешсо, Чудино3,19896), Впервые показана роль транспортных процессов полиаминов з обеспечении гомеостаза их внутриклеточной концентрации, обеспечивающей оптимальную скорость биосянтетических процессов в клетке. Впервые изучено влияние стрессовых воздействий на процессы связывания полиакиноз с ДНК, которые сопровождается характерными изменениями её электронношкроисогшчес-кой структуры, благоприятны;® для синтеза адаптивных белков (Ткачен-ко и соавт.,1992). Впервые показана роль транспорта палкамина лут-ресцина в адаптации клеток к шэлочному шоку и в модальных экспериментах доказана его роль в обеспечении гомзостаза внутриклеточного-калия при участии специфического мембранного переносчика путресщгн+^ / 2л*" (Ткачешсо, Чудаков,1990). Впервые изучена роль полиаминов в определении фосерлипидного состава мембран в ответ на изкснение энергетического состояния в процессе перехода в анаэробиоз ( Мса-_ ohenJío et al , IS9I).

С теоретической точки зрения результаты настоящей работы isrocffi вклад в лучше понимание процессов регуляции метаболизма не толысо микробной клетки, но и могут послуятть сяяяушл для .сходных исследований более сложных,- организкеннкх уровней. В настоящее врег.зд извэо-тно, что эукарпотические клетки злокачественных опухолей п.квт внутриклеточные уровни полиакинов, в десятки раз прэЕниагязо такоЕне з нормальных тканях. Получешше нами данные могли бы стимулировать гто-вые идеи не только в объяснении данного фенокзла, so и в разработке¡ подходов я лечению онкологических заболеваний.

Дракгдтесгсо.е, значекттэ рдйогн. Разработка оригинальных етеокочув-стнятелышх котодов опредзлоння адвкзловнх нуклеотздов СГкачетгэ, Í99I) я пояижяшов СТпаченЕо, Чудиков, 1989а)' как одпя из этапов изо« тоядсЗ работы открывает язрэкяэ возшсюстя юс использования з различных об»-' х: сюдоют и медицины. Высокая информативность показао юдаразше аденалатов н палаакянов в клетка :i ízo-

логкческпх гадететяг органззка даат зозкоггасть по зеякчкзо этих параметров судить о состоянии энергетического и хоаструктЕШОго болвзна. Эхо етпрнЕэез! зокзгаоста для раднсй дпзгнооест заболеваний, когда нзрутапая гетабоднзка з организма сдо из прггэдп к ргзвд-■;тг> írr.-:?,' •v.niz4zs¡2a& кпптгдз. 3 тзотноетл rosasa» (Есрдхпш^хг, Зя-

леток,1987), что уровень полиамиков з кров:: /. моче человека возрастает ухе на этапе контакта клеток с канцерогенами и достигает зксо-кях значений на ранних этапах развития онкологических засолезакин. Разработанный наш метод определения полиашнов обладает рядом преимуществ перед ранее известными. Наряду с высоко:: чувствительностью он обладает высокой производительностью и сравнительной простотой, что дает возможность за коротки: срок обследовать большое колхчестзо лддей. .Летод использован нам: для кассового обследования населения по раннему овнаруааназ онкологических заболезаки.: в ряде медицинекп:с учреждений г. Перми и лолучил хороша отзывы. .-.а основании этих наблюдений нами составлена программа по ра сайре ним сети диспансеризации населения с целью ранней диагностики онкологических заболеваний, которая представлена для рассмотрения в комиссии <*»нда прикладка: исследовании г.Перми. ¿ругой запатентованный нами метод определен::;: адениловых куклеотндоз нашел применение для ранне:; диагностики заоо-левании сердечно-сосудисто;: системы, легких и крови, которш. такие использован 2 медицинских учреждениях г.Перми. выявленные в настоящей работе закономерности о соотношении энергетического и конструктивного метаболизма з условиях переходных состоянии, в частности аэробно-анаэробных лереходоз, использованы нами з рамках хоздоговорной работы для разраоотки биотехнологии очистки сточных вод „гка-линокей атомной электростанции от неорганического .аэс^рра. ..ракти-чэская значимость настоящей работы реализована Т2к..-:е о кслольповакю: ее результатов а чтении лекций для студентов биологического факультета Пермского госуниверситета.

Апробация заботы. Результаты работы сыли доложены и представлены на зсессюзных конференциях:"Теория и практика управляемого иультизи-рования ми:^роорганизшз'Ч-:лез,1'зЫ) /'Управляемое культивирование шкрооргащгзмоз'Ч.-уаино.^со),Структурно-Функциональная организация küstoí: микроорганизмов"iД/авыо, Ifco?), "V-иосштвз вторичных кетаооли-тов'Чаудино.Ло'/),"¿нергетяческае аспекты клеточкой '^зиодогиа'ЧПу-циио,1УЬс), "'.имитирование и илгибирова;п;е роста микрооргакизмэЕ'Ч...,-HHHo,iSb»),'Регуляция микробного метаболизма"(Пузшо,ii>oy)," „олеку-лярные механизмы и регуляция энергетического обмена"(Пущнно.хгиь), "лонкый транспорт и регуляция доиоши .чзетки'Члешыград, iaiC); на международных конференциях: "14 международный конгресс по биохита" (Прага,lübb),"Х Объединенный симпозиум биотических обществ ч/СС?-Гд?, .механизмы регуляции клеточпок ахтквиосги'Ч»аш<ент,ibc-.-),"..&»-дународная кон^реншя по хроматогра^ш'Чп.Новгород,!^), "гДикро-биология охраны биосферы з регионах Удала и северного Прикаспия" (Оренбург,хау1),".«еждународшк симпо'^йум по проблемам токсиколог:»!

-о—

и дрикдадноц э^'»логии|,(.досква-Пермь,1&б1); ка 71 съезде ВШ (Рига, 1580), на /II съезде В,.!0 (Алма-Ата,1585). Результаты работы были доложены ка Московском отделении ВБО (¡лоскза,1989).

Публикации» По материалам диссертации опубликовано 45 работ.

Объем заботы. .-.'.атеркалы диссертации изложены в моногамической ;:.орме ка ¿68 стр. ма;2:лопиского текста, включая 13 таблиц и 77 рисунков. Список литературы содержит 255 библиографических источников 35 на русском и '¿20 на иностранных языках.

Содержание работы

1. ..атераалк и методы исследования

1.1. Разработка методов определения адениловых нуклеотидов и подиаж.-юе, их научное и практическое значение.

Стимулом для разработки нового метода определения адениловых нуклеотидов, обладающего высокой чувствительностью, преимуществом определения всех трех нуклеотидов з одной пробе, не связанного с ферментативными реакция?.®, деаезого и доступного для рядовой отечественно:-. лаборатории послужили недостатки существующих методов (ЗЪгесЫег , То-ьъег ,Гг5£). принцип разработанного нами метода (Тг.аченко,!^;) основан на использовании реакции дансилирования первично;: аминогруппы адениловых нуклеотидов. Полученное в результате реакции дансилирования производное АТ4>, АДФ и А1ЛФ приобретает свойство интенсивно флуоресцировать при облучении его ультрафиолетовым светом, что резко повышает чувствительность определения. На основании результатов исследования подобраны оптимальные условия дая проведения реакции дансилирования и разделения дансиладенилатов. Количественное содержание нуклеотида определяли по величине свечения полученных после разделения пятен, которая была пропорциональна концентрации нуклеотида в пятне. Ъеличину флуоресценции измеряли фотографированием хроматограмм е ультрафиолетовом свете с последующим денситометрированием_негатизов. Средняя чувствительность метода 0,72x10""^ ^ДхЮ'^моля. Препаративное выделение дансилированных нуклеотидов показало возможность их использования в качестве флуо-ресциругадих аналогов субстратов в биохимических реакциях (Ткаченко, 1990). Кинетические параш/ры для дансилированных производных были определены наш в ферментативных реакциях, которые бшш подобраны таким образом, чтобы катализируемые ими реакции представляли основные группы экзргозависимых реакций. Среди них гексоккназа, катализирующая энергопотребляюеую реакции фос$»рилировашя глюкозы, яируват-киназа - одну из последовательностей энергс-давдей системы субстратного фосаорилирования, АТФаза -обратимую реакцию окислительного фос-форилирования, аденилаткиназа» регулирующая соотношение адениловых

нуклеотвдов б клетке. Результаты исследования показали, что все ио-штаняые ферменты способны метаболизировать дансиладекилаты, несмотря на то, что молекула аденилового нуклеотвда, связываясь с дансил-хлоридом, претерпевает значительные изменения.

Таблица I.

Сравнительные кинетические характеристики ферментов энергетического метаболизма дая аденилатов и их флуоресцируших аналогов.

Фермент Субстраты и ^ ^кох 1,1кмси1ь/ Стносятель- Относительная

аналоги мг мин кое сродство V

Н+АТФаза АТФ 0,37*0,05 117,6±Ю,3 1,0 1,0

Дансил-АТФ 0,67*0,1 20,0*3,6 0,55*0,07 0,Г7±0,02

Гоксо- АТФ 0,12*0,01 36,8*4,3 1,0 1,0

киназа Данснл-АТФ 1,18*0 ,11 5,0*0,7 0,1 ¿0,013 0,14*0,01

е АТФХ 2,С - 0,66 0,38

Пируват- АЛФ 0,31*0,04 124,4*12,5 1,0 1,0

киназа Дансия-АДО 5,0 ¿0,06 0,14*0,01 0,06*0,001 0,001

еАДФх 0,3 - ' 1,0 0,8

Примечание. х- данные взяты из литературных источников (Иванов, Кост, i960),

Привадашшо в таблице кинетические характеристики дан аудированных аденилатов в сравнении с другими нх производными дают основание полагать, что эти флуоресцентно меченные соединения наряду с другими цогут аайти шровзе применение в исследовании структуры и функции ©ерюятов энергетического метаболизма. Другие аспекты практического использования обсуядены в соответствуицем разделе автореферата.

Дая определения содерганкя соляашшов разработан метод, в котором исяэльзован принцип, сходный с описанным выше для определения адаагзошх нуклеотидов (Ткаченхо, Чуданов, 1Э89а). Отработанные оп-тагальныз режимы дая проведения реакции дансшшрования и разделения дансияарвзшшых производных солиакаков обеспечили высокую разрешаю-

способность е чувстшташгасть метода, которая составляет бхКН*2

лэля в пятно.

1.2, Объект исследования, метода культивирования и биохимического агалаза.

Объектом исследования служила культура Escherichia coli Кг-12 (ЗКМ). КультяЕтровакие шнфоергавЕзшв осуществляли в аппаратах оте-lacTsosE^r® проЕЗВодства АНКУМ-2, дащзх возможность контроля и а&-тематического рвгуляроЕаюгя таких параметров как pH, содержа нае кн'о-лсродз, окислитольно-ЕЭсстановительный потенциал, оптическая плотность, концевтраддя компонентов шгтаг^гьяой среды и другие. Конкретнее ешоазше рваишв кульждрованяя^айШтся в соответствухшх

главах диссертации.

Активность Н^АТ^азы определяли в цитоплазматических везикулах, полученных методом дифференциального ультрацентрифугирования (Тка-ченко и соавт.,1993). Скорость потребления кислорода измеряли полярографическим методом в термостатируемой ячейке ( Robinson, Cooper , 1970). Активность орнктин-, лизин- и аргининдекарбоксилаз определяла по образованию конечного продукта (Ткаченко, Чудинов,1989а). Активность трансгидрогеназы определяли спектродотометрически с использованием НАДН-регенврярующей системы (Burstein et al ,1979). Активность гексокиназы, пируваткиназы и аденилаткиназы измеряли двумя методами; спектрофотометрическим, в сопряженных биохимических реакциях, и прямым, с использованием флуоресцирующих субстратов (Ткаченко, 1990). Содержание калия в клетках и среде измеряли на пламенном фотометре Flapho var ("Carl Zeiss" ,• ФРГ), фосфора - методом Бетлаха (Eathbun , Betiaoh ,1969), белка - методом Лоури (Lowry et al ,1951), глюкозы - ферментативным методом (Bergmeyer at al ,1974). Анализ фосфолишщного состава клеточных мембран осуществляли методом Блай-Дайера в модификации Зймса с использованием двумерной тонкослойной хроматографии (Ames ,1968). Электронно-микроскопические исследования проводили методом Келленбергера (Kellenberger , Нуter ,1964).

2, Соотношение энергетического и конструктивного обмена в клеточном цикле fí.coli,

Многие метаболические процессы, происходящие в условиях культуры микроорганизмов не могут быть поняты без знания закономерностей их протекания в жизненном цикле единичной клетки. Гармоничное развитие жвой клетки требует внутренней координации между отдельными звеньями обмена веществ, а такке приведение их в соответствие с условиями среды, в которых в данный момент находится микроорганизм.. Несмотря на то, что предложен ряд моделей сопряжения процессов синтеза ДНК, роста биомассы, поверхности клеток и септообразования (Helmetetter et al ,1968; Donachie ,1968), истинная природа регуляторов, участвующих в механизмах их сопряжения окончательно не установлена. Среда наиболее важных и общих параметров для большинства процессов, протекающих в клетке, наше внимание привлекли энергетические параметры клетки, включая аденилатную систему (АТФ,АДФ,АМФ), а также система синтеза полиаминов (путресцин, спермядин, кадаверин, спермин).

_______- _ Анализ данных литературы дает основание предполагать, что

эти соединения могли бы выполнять важную регуляторную роль в клеточ» ном цикле прокариотов, в частности, E.coli , делая свой вклад в функционирование "клеточных часов" на уровне клеточных метаболитов.

Основным инструментом при изучении клеточного цикла у микрорга-

-В-

ниэиов являются синхронные культуры, которые также представлял интерес как явление, сопутствующее в ряде случаев нормальному развитию искусственно не синхронизированных культур микроорганизмов №а-форостова и др.,1975), Среди множества методов синхронизации более естественным для микроорганизмов состоянием, индуцирующим синхронную репликацию дйд и деление клеток, является голодание по источнику углерода и энергии, которое было использовано в настоящей работе ::ак процедура синхронизации (Ткаченко, 4удинов,1ьЬ7; IbbG).

Как показали результаты исследования, снижение Aw во время голодания по глюкозе сопровождалось резким подъемом содержания Ад^ и АЖ>, что приводило к возрастанию обдего аденклатиого пула на ;:.оне падения энергетического заряда (рис.1). ..шно предположить, что сил-тез адениловых нуклеотидов ¿.coli в меньшей степени реагирует на уменьшение потока энергии, чем высокочувствительные к изменению энергетического заряда реакции синтеза РНл, утилизирующие адепилаг-ный пул, величина -которого при этом возрастает. Биологическая целесообразность описанного нами Феномена, по-видимому, заключается в быстром тормокекид. основных реакций конструктивного обмена низкими значениями энергетического заряде (Cbapman, Atkineon ,iä77). Ларал-лельное исследование состояния системы синтеза полиаминов показало, что активность ее ключевого фермента, орнитиндекарбоксилазк, изменяется во время голодания неоднозначно. Период колебания энергетических параметров сопровождался лииь незначительным снижением ее активности (рис.1). Следуиаее за ним устойчивое снижение энергетических параметров совпадало со значительным падением активности ОдХ, демонстрируя ее прямую зависимость от уровня АТф в клетке. Снижение активности ОДК в период устойчивого снижения A'iV приводило к падению внутриклеточного пула пут ре спин а, минимальный уровень которого наб-лвдался в момент возобновления подачи глюкозы (рис.«;), адзкое содержание этого диамина в клетке является синхронизирующим ректором ( Inouye , Pardee ,1970).

С целью проверки правильности предположения о регуляторном воздействии аденилатных пулов на скорость конструктивных процессов опосредованно, через систему синтеза полнашноз, нами были проведены исследования внутриклеточного содержания полиашнов и их соотношения в клеточной цикле параллельно с изучением поведения аденшшв-* ных пулов (рао.2). Вслед за быстрым возраст алией AT -¡> в клетке nocJU добавления глюкозы в голодащую культуру начинался рост внутршедб^-' точного пула дутрасдина - продукта орнитиндехарбоксклазной реакппи, пик которого совпадал с цаксимуг^и atf^ и такжз опоре хал возрастание скорости деления клеток синхронной к^^рури. Содержание сперкидияв

Рис.1 Рис.2

Рис.1. Изменение активности орнитиндекарбоксилазы (ОДК) в процессе голодания в зависимости от энергетического статуса E.coli. I-активность ОДК (а), нмоль/(ч мг белка); 2-шутршиеточный пул АТФ (б), нмолъ/мг АСБ; З-энергетический заряд (в), ед. Рис.2. Изменение энергетических параметров и пула полиаминов в процессе синхронного роста е.coli.

I-абсолютно сухая биомасса (X), г/л; 2-удельная скорость роста ( f* ), З-отношение путресцкн/спермвдин (д), ед.; 4-энергетический заряд (а), ед.; 5-внутриклеточный пул АТФ (б), нмолъ/мг АСБ; 6-внутргклеточный пул путресцина (в,г), нмоль/мг АСБ; 7-внутриклеточный пул спермидина (в,г), нмоль/мг АСБ.

оставалось на значительно более низком уровне и мало изменялось в процессе синхронного роста, что определило характерные изменения отношения нутресцен/спермиддн (ПТ/СД), 3 некоторых работах указывается на важность этого параметра дош регуляции клеточного деления и образования септ (Деккель и др.,1974). При этом наибольшие его значения характерны для быстро делящихся клеток, а низкий уровень приводил к образованию у E.coli длинных неделящихся $орм (Hirahfield et ai ,1970). Эти данные свидетельствуют о вовлечении полиаминов в регуляцию клеточного деления. Пик отношения ПТ/СД предшествовал делению и совладал с максимальным значением АТФ. Синхронные изменения пулов АТФ и путресцина, наблвдаемые в последовательных циклах деления, а такте корреляция меаду уровнем АТФ и активностью ОДК в голодающей культуре дали нам основание предположить наличие стимулирующего действия АТФ на активность ключевого фермента синтеза путресцина. С целью проверки данного предположения были проведет опыты in vitro по изучению влияния концентрации АТэ на активность орни-тин-, лизин- и аргияиндекарбоксилаз в гомогенате клеток, полученном из экспоненциально растущей культуры E.coli (рис.3). Известно, что основным путем синтеза путресцина у E.coli является декарбоксилиро-зание орнитина, катализируемого ОДК, а аргкшшдекарбоксшаза проявляет сзоа активность лишь в специфических условиях развития. Исследование предполагаемого эффекта ATv на оба альтернативных пути синтеза путресцина показало абсолютную специфичность стимулирутацего действия (200-300^) в отношении ОДК, максимум которого находился в пределах "физиологических" концентраций еденозинтри^осфата. Таким образом, экспериментальные данные, изломанные в этом разделе диссертации свидетельствуют о регуляторном воздействии адениловых нуклео-тидоб, з частности АТФ, на активность ключевого дзермента полиамин-синтезирующей системы и, следовательно, количество полиаминов в клетке в клеточном цикле E.coli . Колебания пула адениловых нуклео-тидов в клеточном цикле, которые можно рассматривать так проявление неполного сопряжения энергетического и конструктивного метаболизма Е этом процессе, через активность ОДК управляют количеством полиаминов в клетке и непосредственно оказывают влияние на скорость протекания процессов биосинтеза в клеточном цикле.

3. Взаимодействие аденилатной и полиаминсинтезирующей систем з процессе периодического роста B.ooli.

Количественные исследования микробного роста 'И его энергетика начали изучаться около 50 лет назад, однако до настоящего времени теории, описывающие взаимоотношение »Jfcoy концентрацией субстрата,

а

Рис.3. Влияние концентрации АТФ на активность декарбэксипаз.

1 - ориитиндбкэрбокеилаза (а), тюль/ч мг белка;

2 - аргининдекарбексилаза (б,в), нкэль/ч иг белка;

3 - лизиндекарбоксилаза (б,а), кмоль/ч 1лг белка.

Темными круакамл обозначена активность ОЖ в присутствии ДШ (10 М).

сксростыо роста и величиной выхода биомассы так или *ьсче связаны с классически?.® исследованиями -юно (Monod ,l¿4<¡). «¡оно постулировал, что какое-то небольшое количество субстрата может быть необходимо метке для поддержания процессов её жизнедеятельности. Точная природа процессов поддержания и их минимальные энергетические потребности до настоящего времени во многом не известка. Ответ на этот и другие вопросы кроется в изучении механизмов сопряжения энергетического и конструктивного типов метаболизма. Целью настоящего раздела работы является исследование взаимодействия эденилатной и голи-аминсинтезируадей систем в периодических культурах в.coli с подпиткой источником углерода и энергии (глюкоза).

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что изменение биокассы в культуре с периодическим добавлением глюкозы (рис.4) происходит неравномерно и характеризуется чередованием периодов замедления и ускорения роста, за счет частично;: его синхронизации. Чередование периодов спада и подъема скорости дыхания имеет цикличность, соотнесение котороя с колебаниями // , подтверждает синхронный характер роста (Poole ,IäbC). ..аксилальяые значения внутриклеточного пула AT¿, энергетического заряда и отношения ATw/АДФ, претерпевавшие значительные колесан/.я в культуре с периодическим добавлением субстрата,свидетельствуют о неполном сопрязжнии двух типов обмена на синхронном участке развития таких культур (Ткаченко, Чудаков, 19Ь7). При этом гиперпродукция и выброс в среду продуктов неполного окисления глюкозы (ацетат, лактат, сукцинат) в конечном итоге приводят к полной остановке роста при концентрации биомассы 34 г/л.

Полученные наш данные (см. глава '¿) показали, что концентрация AT*' оказывает сильное стимулирующее воздействие на актиьность ОДК в условиях ш vi-tro (рис.3). На рисунке 5 приведено сопоставление уровня путресциаа и концентрации AT* в культуре ¿¿.coli с подпиткой, где периоды голодания опущены. Результаты свидетельствуют, что в уо-ловиях культур с подпиткой существует прямая корреляция мезду количеством ATw в клетке, размером внутриклеточного пула путресцина с одной стороны и удельной скоростью роста, отрахащей общую скорость конструктивных процессов в клетке - с другой. Эти результаты еще раз подтверждают правильность выдвинутой наш гипотезы о том, что энергетический статус клетки мохет оказывать не только прямое воздействие на скорость конструктивных реакций (Chapman , Atkinson ,19?7У, но и влиять на неё, изменяя активность системы синтеза полиаминов* .лаксимальная скорость выброса путресцина из клетки совладает с мак-сшдумом внутриклеточного содержания АТ* (рис.5), что подтверждает высказанную ранее точку зрения о том£\сто полиамины могут при

гис.4.Соотношение конструктивных и энергетических парамгтров периодической культуры £.оо11 с добавлением глюкозы. 1~абсодатно сухая биомасса, Х,г/л; насыщения (а); 3-(}д ,

ммоль/л ч:(б); 4-удельная скорость роста(.^ ) ^; 5-экергетпч§скиР заряд, ед. (в); б-АТФ/Ш.ед. (г); 7-АТФ, 9-АД5, 9-АМ$,кмоль/мг (д). Стрелками обозначены моменты введения

32

24

16

- 0,4

-о 3 4

16 ч

12

0 -1- 0

120

80

40

Рис.5. Изуанение содержания АТФ и полиаминов в периодической культуре E.coli .

1-относительная скорость выброса путресцина (V ), нмоль/Смг шн),

2-стносительная скорость потребления цутресцина (V ), нмоль/ (мг мин); 3-отношение дутрвсцин/спермидин (а), ед.; 4-концент-рация абсолютно сухой биомассы (б), г/л; 5-удельнвя скорость роота (в), ч"1; 6-внутриклв точный пул АТФ (г), нмоль/мг АСБ; 7-внутриклеточный цул путреедина (г), нмоль/мг АСБ; 8-содержани^ нут ре едина в среде (д), нмоль/мл; 9-шутриклэ точный пул спермин дина (г), нмоль/мг АСБ.

избытке энергетического субстрата выполнять роль механизма сброса избыточной энергии. Последующее снижение АТФ в клетка сопровождалось замедлением скорости выброса путресцина, которое затем сменялось его возрастающим потреблением из среды.

Сложность физиологии периодических культур с подпиткой (рис.4), объясняемая множеством свойственных им переходных состояний и их сочетанием, включая смену периодов роста и голодания, синхронного ж асинхронного роста, избытка кислорода и его лимита, накопление продуктов обмена и их частичное потребление в периоды голодания, накладывает отпечаток как на энергетическое состояние клетки, так и на поведение системы синтеза даляашнов. При этом сяихете энергетического статуса клетки в период голодания сопровождается падением активности ОДК и соответствувдим снижением уровня путресцина в среде и клетке (рис.1). Колебание уровня АТФ в клеточном цикле сопровоадает-ся синхронным колебанием внутриклеточного пула путресцина (рис.2). Снижение внутриклеточного пула АТФ и других энергетических параметров культуры с подпиткой в условиях отравления продуктами обмена сопровождается снижением активности системы синтеза полиаминов и соответствующим падением уровня путресцина в клетке и среде (рис.5).

Таким образом, изложенные в настоящем разделе экспериментальные данные потдтверкдают выдвинутую наш гипотезу о регуляторном взаимодействии энергетического и конструктивного метаболизма при участии системы синтеза полиаминов и дают основание рассматривать её как одно из звеньев в сопряжении двух типов обмена у микроорганизмов.

4. Взаи.^дейстзие энергогенериругацей а голиаминсинтезирующей систем как фактор адаптации В.coli к условиям изменения содержания кислорода в среде.

Характерная особенность факультативных анаэробов л, в частности В.coli ,-их способность к существованию в широком диапазоне концентраций растворенного кислорода. Это обстоятельство обусловлено в первую очередь необычайной гибкостью их энергетического метаболизма, в основа которой лежат с одной стороны разветвленность дыхательной цепи, с другой - обратимость работы АТФззы, которая в анаэробных условиях частично берет- на себя функции дыхательной цепи, генерируя траясмембранный потенциал протонов за счет энергии фосфатной связи АТФ ( Kästlest, 1983). В то же время кислород можно рассматривать каз. сигнал среда, который вызывает значительные изменения генной экспрессии и играет большую роль в механизмах запуска адаптивных реакций у микроорганизмов. Поюша известных систем регуляции метаболизма в ответ на изменение поступления кислорода к кяетке (luchi . Linn 1988) в этом процессе йохазанг рЭль суперскручивания ДНК (Xamamoto,

Droffner ,1985). Значительную роль в развитии адаптивных реакций у микроорганизмов играет энергетическое состояние клетки и, з частности, содержание и соотношение адениловых нуклеотидов, которое оказывают сильный регуляторный э^дакт на уровне аллостерических ферментов, таких как фосхофруктокиназа ( Atkiasoa,I976), а также на уровне экспрессии генов, регулируя суперскрученность ДНК через активность АТФ зависимой ДйК-гаразы { Sugino et al,I976).

В этой системе регуляции метаболизма значительный интерес привлекает система синтеза полиаминов. О одной стороны полиамины как биогеяныэ поликатионы имеют тропизм к таким важным клеточным полимерам, как нуклеиновые кислоты. Они имеют отрицательны!', заряд к молекулярную структуру, близко соответствующую структурным элементам двойной спирали ДНК С labor, labor ,19Ь4). С другой - активность системы синтеза полиаминов в значительной степени определяется энергетическим статусом клетки (Ткаченко, Чудинов,Е»бу).

Эти обстоятельства послужили основанием для предположения, что полаашны; реагируя на энергетическое состояние клеток во время аэробно-анаэробных переходов, могут участвовать в регуляции метаболических переотроек, связанных с адаптацией клеток к разным концентрациям кислорода в среде.

Аэробна-анаэробный переход воспроизводили путем плавного уменьшения аэрации с последующи полным ее отключением и продувкой среды аргоном. Возврат к аэробному состоянию осуществляли возобновлением продувки среда воздухом. Результаты исследования показали, ото снижение уровня растворенного кислорода в среде до Ъ0-60% насыщения приводило к резколу снижению энергетического статуса клетки (рис.6), и, прежде всего, - к падению энергетического заряда. В этот период начиналось саидание внеклеточного пула путресцина, тогда как актив-нооть ОДК сохранялась еие на уровне, близком к максимальному и внут-триклеточный пул путресцина лишь незначительно отмгелся от максимальных значений. Продолжающееся к этому времени (I час культивирования) возрастание концентрации спершдина в клетке приводило к паданию отношения ПТ/СД и сопровождалось уменьшением удельной скорости роста. Дальнейшее сшьшнае внутри- и внеклеточного пулов путресцина происходило на фоне относительно высокой активности СДК, что свидетельствует о связывании этого диамина с компартменташ клетки, в частности, о ДНК.

Нзучэш> ультра структурной организации клеток.в дроцассе аэробао-енаэробяого порзхода показало характерную картину двнашрошх изменений, в порцга очэредь затрагивакаах ог^аапзлтшп вещество нуклооада. Прн 100^-ном насыаоши среда шсиорРЕ^^^вдялводд имеет тшшчнув для

I ' 2 3 5 ч

Рис.6. Аэробно-анаэробный переход в культуре s.ooll, I-отношение путресщгаа к спермидану (а), ед.2-активность орнитин-декарбоксилазы (б), нмоль/ч ж белка; 3-внутриклеточный пул путрео-ВДна (в); 4-внутриклеточный пул спершдина (в), нмоль/мг АСБ; 5-содеряание путресцина в среде (г), нмоль/мя; 6-энергетический заряд (д), ед.; 7-отношение АТФ/АДФ (е), ед.; 8-общий аденилатный Пул (ж); 9-АТФ (ж); 10-АДФ (ж); II-AI® (s), нмоль/мг АСБ. "■ Стрелками обозначено: А-отключение аэрации, Б-момент исчерпания в среде кислорода и продувки среды аргоном.

E.ooll тонковолокнистую структуру, изменения в которой начинают проявляться уже при скитании содержания кислорода в среде до 50% насыщения. Тонковолокнистая структура нуклеоида сменяется формированием сети волокон с мелкозернистыми злектронкошшткыми включениями. При полном исчерпании кислорода нуклеоид приобретает характерную се-тевидную структуру, когда его вещество представлено в виде грубых тяжей, в месте пересечения имеющих участки повышенной электронной плотности на фоне не заполненных веществом пространств.Описанная картина изменения организации нуклеоида свидетельствует о конденсации составляющих его молекул ДНК (Bloorafield ,1УБ1).

Полученные нами результаты, а также данные литературы (Потоки, 1975) даот основание считать, что изменение структуры нуклеоида являются следствием его связывания с полиаминами, в частности, с пут-ресцином. Связывание полиаминов с компартментами клетки и скитание их содержания в цитоплазме оказывает двойной рёгуляторный эдазкт, приводя с одной стороны к замедлению протекающих в цитоплазме бяо-синтетических процессов, в частности, синтеза белка, с другой, связываясь с ДИК, они могут привести к торможению экспрессии генов биосинтеза и индукции стрессорных генов.

Переход к анаэробным условиям сопрововдался значительными изменениями фосфолипвдного состава мембран E.coli . Наибольшие изменения касались 50 сфатидклэтанолашша (а>ЭА) , на долю которого приходится около 70$ от суммы фо силицидов, и фосс^атидилглицерина (vT), соо-тавлящего в исходных клетках около 205?. Уровень этих фосфолипидов в клетке в течение первого часа анаэробиоза падал на 50$ и 70$ соответственно и в дальнейшем оставался без изменений. Для третьего фосфолипида кардиолшшна (KEL) падение уровня в клетке было менее выраженным и составляло приблизительно 30$ от исходного количества. В работе Петера с соавторами ( Teter et al,I979) показана прямая корреляция мезду синтезом (¿осфолипвдов и содержанием в клетках полиаминов, которое в анаэробиозе, как нами показано (рис.6), резко снижалось. Таким Образом, низкий энергетический статус клетки может замедлять фосфолипидный метаболизм не только путем ограничения поступления энергии, но и опосредованно, ингибируя активность полиамиасин-тезирувдей системы (Ткаченко, Чудинов,1989).

Известно, что перестройка фосцвлипидного состава мембран сопровождается изменением их физических свойств, в *астности, текучз ст£ (Дергунов и др.,1981), что в значительной мере моает повлиять на функционирование мембраносвязанных белков, таких как Н+АТОаза. Как ' показали измерения, первоначально урогчнь её активности лишь незначительно изменялся в ответ на отключена? подачи воздуха и был близок

к аэробному. Полное исчерпание кислорода совпадав« с максимумом Н^АТуазной активности, интенсивно генерирующей в этот период трансмембранный потеншал. Одновременное возрастание пула АДФ и АШ>, падение энергетического заряда и ATi подтверждает усиление АТФ-гидро-лизуотей активности. Описанные изменения активности мембраносвязан-ного «рермента представляют собой адаптивный ответ клеток на отстояние анаэробиоза, в механизме которого важная роль принадлежит изменению фосфолипидного состава клеток.

Введение кислорода в культуру и разбавление ее сведай питательной средой индуцировало подъем внутриклеточного уровня путресцина со скоростью, значительно превышающей возможности его синтеза de novo . Аналогичная картина наблюдалась при осмотическом шоке у E.coli , когда было показано, что введение ингибитора ОДК дифторме-тилорнитина не снижало скорость возрастания путресцина в клетке ( Pegg et al,I98I). Исходя из этого можно првдти к заключению, что первоначальный подъем пула этого диамина в условиях нашего эксперимента есть, главным образом, следствие его высвобождения из связанного с компартментами клетки состояния. Роль таких компартментов, в частности, может выполнять ДНК нуклеовда, что подтверждается данными электрономикроскопического исслеодования ультраструктуры клеток при переходе от анаэробных к аэробным условиям культивирования.

При возобновлении подачи кислорода в культуру характерная для анаэробиоза картина компактизированного нуклеоида постепенно возвращается к тонковолокнистой структуре, свойственной клеткам в оостоянии аэробного роста. Возврат клеток к аэробным условиям сопровождается также постепенным восстановлением аэробного типа фосфолипидного состава мембран на фоне нормализации энергетического состояния клетка и активности системы синтеза полиаминов. Описанные в данной главе экспериментальные данные, а также их обсувдение с привлечением данных литературы дают основание придти к заключению, что вазшая роль в адаптивной реакции микроорганизмов на изменение доступа кислорода к клетке принадлежит механизму, в который вовлечено взаимодействие анергогенериругацих систем клетки с системой 'синтеза полиаминов,

5. Взаимосвязанное поведение энергогенерирумцей и полиаминсикте-зирующей систем E.coli в процессе адаптации к изменениям рН среды культивирования.

Центральную роль в энергообеспечении клетки играет циркуляция ионов через цитоплазматическую мембрану. За последние 10 лет стало ясно, что внутриклеточный рН микроорганизмов относительно постоянен, то есть гакрооргаяязмы обладают гомеостатической системой, которая

способна справляться с обоими типами отклонения внутриклеточного рН от регулируемого оэ стояния. Первичные протонные помпы, такие как дыхательная цепь и Н^АТФаза, вовлечены в регуляцию шутрикдеточного рН, однако их основная роль в метаболизме клетка сводится к генерации трансмембранного электрохимического потенциала протонов. Было показано, что катион-протонные антипортеры играют основную роль в в стабилизации внутриклеточного рй у микроорганизмов. У бактерий потребление калия имеет доминирующее значение дяя компенсации заряда на протоне ( Bakker , Hangerich ,1981). Рециркуляция калия в клетках возмо;хна благодаря существований множественных систем его транспорта ( v/alderhau£ et al ,1987). Энергозависимость описанных систем транспорта калия дает основание предполагать, что в критических ситуациях, сопровождающихся снижением энергетического статуса клетки, могут действовать альтернативные системы калиевого транспорта. С этой точки зрения нале внимание привлекли биогенные поликатионы аолиамины, роль которых в ионном балансе микроорганизмов остается еще далеко не изученной.

Как показано в предыдущих разделах работы, метаболизм E.ooli характеризуется интенсивным обменом полиаминами мевду клеткой и средой, направленность которого зависит от физиологического состояния клеток. Однако роль полиаминов в адаптации микроорганизмов к экстремальным воздействиям рН среды остается совершенно не изученной. Целью настоящего раздела работы является изучение энергетического статуса, активности основных протонных помп и полиаминсинтези-рушщей системы в процессе адаптации E.ooli к неблагоприятным воздействиям рН среды.

рН-переходы воспроизводили автоматическим титрованием НС1 или кн^он . Ощутимое снижение энергетического статуса клетки отмечалось при увеличении рН выше 8,0 (рас.7). Активность Н+АТФазы и дыхательной цепи в процессе заболачивания среда выше 7,4-7,6 экспоненциально снижается. Таким образом, рН гомеостатическая роль первичных протонных помп прй щелочном сдайте, по-видимому, ограничена. Показано, что основным механизмом, участвующим в стабилизации внутриклеточного рН в этих условиях является работа катион-протонных антипортеров, в частности К+/Н+ обменника ( Booth ,1585). Измерение содержания калия в наших экспериментах (рис.7) показало снижение его внутриклеточной концентрации. Этот факт свидетельствует о том, что знергодаг висимая система транспорта калия в этих условиях.не справляется с восполнением его внутриклеточной концентрации. Во времени это совпадало со значительным снижением АТ*$чпула и общего энергетического стэтуса клетка, чем объясняется низкая, активность систем транспорта

-14

"12 -10

-8

"6

-4 в

-| 0,8 " 0,6

" 0,4

- 0,2 Д

250

^00

150 100

50

0

10,0 1«

Рис.7, Изменение энергетических параметров и внутриклеточного пула калия в процессе защелачиваюш культуры я.соИ нн^он. 1-ахтивяость Н+АТФазы.нмоль/мг-мин (а); 2-скорость потребления хислородв (0о_ ),мыоль/г-ч (б); 3-энергетический заряд,ед.(в); 4-внутриклето^ннй пул АТФ,нмоль/мг АСБ (г); 5-внутриклеточный пул калия, ыМ (д).

кадия з осеопечеегз потока мег^ду ялетко'.: к средой.

..сследоакке содер:.икгг путресцина в клетке и среде при задела чивални :тй;:изг.;:о возрастание его внутриклеточного пула, пик которого наол-здался лра Р--: о,в-о,Ь (рис.В) и совладал с максимальной активностью О^л, ^.ермзнта его биосинтеза. Интенсивный синтез путресцина сопровождался его выбросом и накоплением в среде культивирования с последуюцим синением внутриклеточного пула, выход калия и снижение его концентрации в клетке мо;кет слулять стимулом к наблюдаемого возрастанию активности ОДК в клетке (labor , labor ,1984). Ъиологическш: сгшсл резко возросшего синтеза и выброса путресцина из клетки в процессе защелачивания среды кажется обоснованным, если учесть ¿что энергонезависимый обмзн калия ;:з путресцин с использованием его градиента, направленного нар/;:;;, способен обеспечить восполнение депо калия в клетке в условиях се низкого энергетического статуса.

С целью доказательства существования антипортерного механизма транспорта ионов д*" э клет:^ в обмен на путресцин"1"^ проведена серия модельных экспериментов, в которой клетки E.coli , нагруженные пут-ресцином и истощенные по л~, инкубировали в бескалиевой среде. При этом регистрировали содержание калия и путресцина в клетках и среде, добавление в культуру карбошшдаанидхлорметоксифенилгидразона (СССР) приводило к отключению основной транспортной системы калия ( ТгЗс). Как показано на рисунке 9 в этих условиях сразу после добавления калия в среду начинается его транспорт в клетку с одновременным выходом путресцина в среду. Действие второй известной системы транспорта калия (KdP ) ингибируется высокой концентрацией добавленного калия ( Walderbaug et al,IS87). Результаты этих экспериментов, а так;;® данные, полученные в культурах при защелачивании среды дают основание считать, что обмен путресцина на калий при участии специфического переносчика участвует в циклизации штока калия для обеспечения гомеосгаза внутриклеточного pH.

Иная картина имеет место при закислении среды культивирования. ■ В этом случае работа К1"/!!4' антипортерной системы направлена на вход калия в обмен на протон. При этом существенных изменений активности системы синтеза полиаминов не наблюдается. В то не время'анализ энергетического состояния E.coli в процессе закисления показал значительную активизацию основных протонных помп (Н+АТФаза, дыхательная цепь). Возрастание активности И^АТФазы на ¿¡»не падения содергания ATi? в клетке и возрастания АДФ и АШ свидетельствует о направлении ее работы в сторону выброса протонов из клетки за счет энергии фосфатной связи.

а б 4 -г 0,8

0,4

80

60

40

20

Л е 0,6-

0,4-

0,2-

400

200

100 мин

Рис.5. Изменение ростовых параметров к.coll (А) п активности обмена путроедина ib) при сдвиге рН среды к щелочным значениям.

1-содерпяние абсолютно сухой биомассы (АСБ),г/л,(а);

2-рН среды,ел.(в);

3-удельная скорость роста ( М (б);

4-внутрию:эточяыЙ пул пут ре спин а, тол ь/ мг АСБ (г);

5-активяость орнктандекарбоксилазы.нюль/мг ч (д);

6-содэр.тзнио путресцина в среде,нколь/мя (е);

Стрелкой отмечено начале процесса защелачивакия культура.

О

О

Рио.9. Обмен путресцина и калин между клеткой и средой в культуре E.ooii К-12, ингибированной 0,05мМ СССР.

А: 1-содержание путресцина в среде, нмоль/мл;

2-внутриклаточная концентрация путресцина, мМ; Б: 3-внутриклеточная концентрация К*", иМ. Стрелкой отмечен юмент добавления в среду 2 мМ К*".

Таким образом, изло:;:енЕые экспериментальные данные дают основание считать, что в процессе сдвига рК к щелочным условиям адаптивной реакцией ¿¡.coli является гиперпродукция путресцина на ^оне снижения внутрик® точнок концентрации калия. Потеря клетками калкя в результате функционирования i^/ff" обменника как рК-гомеостаягче скоро механизма не может быть полностью компенсирована энергозазксимыи! транспортными системами -s зследстзие снижения энергетического статуса. В этих условиях недостаток калия з г.-.етпах частично восполняется за счет работы обменника путресцин','""/~--'г. и условиях кислотных сдвигов возрастает активность протонных и, в первую очередь Н^АТаазы, которые наряду с другими сис-е:,.с:л: участвую? з сохранении гомеостаза цитоплазматического рК E.coli .

6. азаимодепствив энергогенерирувдей и цолиагдикскнтезирущек систем в.coli в стрессовых ситуациях и его роль в адаптации разобщающим воздействия;.! голодания и стресса.

Бактериальные клетки координироэанно регулируют рост и клеточное деление в ответ на множественные воздействия окру.-.зще:: среды. Сигналы, генерируемые клетко;; в ответ на эти воздействия, до сих пор остаются недостаточно понятыми. Одно!; из причин сходства откликов микроорганизмов на различные факторы внешней среды может быть воздействие последних на одни и те га клеточные структуры, з частности ДНК. При этом очевидно, что изменения, позникаацае в ДКК, не специфичны, подобно мутациям, происходящим з конкретных генах, а носят обратимый, физиологический характер, привода к временному изменению экспрессии генов, что дает возможность клетке вернуться з исходное физиологическое состояние после снятия стресса. 3 последнее зрегл показано, что одним из важнейших сакторов, регулирующих экспрессию генов у микроорганизмов, является степень отрицательной суперскрученности ДНК ( flrlloa ,1987), которая претерпевает изменения при смене условий среды культивирования. Большое значение для процесса суперскручивания ЛНК имеет энергетическое состояние плетки, ото объясняется с одной стороны зависимостью от AT* ¿Нл-гиразнок реагащи, с другой - регулирующим Эффектом энергетического состояния на аотив-ность системы синтеза полнаминов (Ткаченко, чудшюв,1^Ь9). Топология ДНК так или иначе связана со структурой нуклеовда (Kyter,Qhang,li/75).

Проведенные нами злектронноюкроскошпесхда исследования показа-ля, что,ивсьятря на неоднозначную реакцию энергетического состояния клеток (табл.2), при разных стрессовых воздействиях имела место изменения вэцоства нуклеовда одной направленности (за исключением за-щедачдванзя) - а сторону повнзоная его кошактнзаши. Сопоставляя

Таблица 2.

Изменение энергетического состояния и активности полиамилсштезярующеК системы E.coli при различных стрессовых воздействиях

Характер стрессового воздействия АТФ, нмоль/мгАСБ Энергетический заряд,ед Ч» ий/глг ч АТ«аза, мкмоль/мг МИ.1 Путресщш Путреспдн в клетке, в среде, нмоль/мгАСБ нмоль/мл . Активность 0ДК, шшолъ/кг ч

I.Экспоненциальный

аэробный рост 5,62*0,14 0,8310,01 10,66*0,67 0,67*0,03 23,1*3,4 15,4*4,21 C,0IB*G,GG2

(контроль)

2.Аэробно-анаэробный

переход 2,33*0,20 0,68*0,05 5,58*0,42 0,^8*0,04 6,1*2,4 1,4*0,30 0,012*0,003

3.Исчерпание глюкозы 3,34*0,09 . 0,97*0,02 1,08*0,04 0,48*0,01 20,6*2,1 2,5*0,75 0,012*0,003

4.Исчерпание аммония 5,36*0,11 0,90*0,01 5,31*0,12 - 8,6*0,9 следы -

б.Закисление среды 0,97*0,01 0,33*0,01 9,90*0,31 0,98*0,23 14,5*0,6 1,3*0,11 0,014*0,001

б.Защелачивание среды 0,42*0,Gl 0,20*0,01 2,40*0,66 0,23*0,01 66,9*3,8 454,2*43,0 0,052*0,002

7.Осмотический шок 8,23*0,83 0,87*0,01 8,63*1,08 0,50*0,02 8,3*0,6 32,5*1,90 0,044*0,009

То же35 2,53*0,30 0,79*0,01 2,10*0,30 0,30*0,01 6,4*0,5 37,3*2,10 0,031*0,010

в.Температурный

переход . 0,94*0,01 0,33*0,01 1,72*0,31 0,58±0,02 2,3*0,4 48,6*5,40 0,005*0,0003

То хвш 0,50*0,02 0,20*0,02 0,27*0,10 0,48*0,16 0,9*0,2 49,6*4,20 0,003*0,0003

Примечание ^Осмотический шок (20 и 120 мин спустя) Температурный переход (Т=46-48° к 60°)

полученные нами данные об ультраструктуре нуклеоида и имеющиеся в литературе сведения о топологии ДНК в изученных нами состояниях, монно првдти к выводу об их тесной взаимосвязи. Исследование энергетического статуса и полиаминсинтезирувдей системы клеток в стрессовых состояниях (табл.2) дает нам основание сделать заключение об их участии в механизме регуляции метаболизма клеток на уровне экспрессия генов путем изменения топологии ДНК. Бри этом резкое изменение энергетического состояния в стрессовой ситуации может явиться сигналом, измешшцш активность АТФ-зависимой ДНК-гиразы. Возрастание энергетического статуса (лимит по аммонию, осмотический шок) может, по-видимому, непосредственно стимулировать энергозависимую суперскручиващую активность ДНК-гирагы, а продолжающаяся транскрипционная активность клеток в анаэробиозе при угнетении ДНК-топоизоме-разы I (lamamoto , Broffner ,1985) монет вызвать сходный эффект отрицательного суперскручивания ДНК. Рассматривая энергетический статус клетки как один из основных сигналов запуска адаптивных реакций в клетках в стрессовых ситуациях, необходимо отметить, что регуляцию метаболизма на уровне транскрипции при участии полиамянов можно рассматривать как эдаективный механизм блокирования непроизводительных затрат энергии и сохранения ее для нуэд поддержания микроорганизмов в критических ситуациях.

7. использование питательных шифтов для оценки степени сопряженности энергетического и конструктивного обмена у к.coli .

Соотношение скоростей энергодаодих и энергопотреблягацих реакций является фактором, в значительной степени определяющим особенности метаболизма микроорганизмов. Удобной методической моделью для изучения этого соотношения являются переходные состояния, возникающие в момент исчерпания ( о Mit down ) и возобновления подачи (oblft up ) одного из компонентов питательной среды. При этом питательные сдвиги по энергетическому источнику (глюкоза) в первую очередь затрагивают энергетический обмен, а по источнику азота (неотъемлемый компонент белка и нуклеиновых кислот) - конструктивный. Наибольшей информативности при изучении переходных состояний, связанных с питательными сдвигами, иохяо ожидать от величины внутриклеточного пула АТФ, который выполняет роль связующего звена ме.тду двумя типами метаболизма и представляет собой одновременно продукт энергодапих и субстрат зыергопотребляюшх реакций биосинтеза. Очень высокие скорости его оборота в клетке, измеряемые секундами и долями секунд, дают основание огвдать значительных изменений этого а взаимосвязанных с ним компонентов адешиштной системы даже при небольших сдвигах в соотно-

-Ношении скоростей конструктивного и энергетического метаболизма.

Цельа настоящей главы является сравнительное изучение поведения энергетических параметров периодической культурк 2.coli в процессе исчерпания и возобновления подачи глюкозы л аммония и ;:х использование для оценки степени сопря::сенности энергетического :* конструктивного птоз метаболизма.

j периоды роста, предшествующие исчерпанию субстрата, а также в процессе голодания и возобновления подачи глюкозы к аммония, из культуры отбирали пробы, в которых определяли содержание адениловых нуклеотидов разработанным нами методом. Ускоренный отбор проб с интервалом I се:: осуществляли з момент возобновления подачи субстрата с помощью сконструированного нами автоматического устройства.

Значительные различия в ¿изиологическок состоянии E.ccii при разных видах лимитирования начинали проявляться уда е перше секунды после исчерпания субстрата. Анализ нуклеотидного состава клеток в момент Лансируемого прекращения роста показал снижение урсзня АТ-^> как при исчерпании глюкозы, таг. и амьюния, хотя в первом случае это с:а; :енке бьио значительно более глубоким. Наиболее существенные различия проявляются е поведении пулов у. AJ$, коюрые при истощении глюкозы резко возрастали, обусловливая глубокое чадение экоргетячес-кого заряда и отношения АТФ/АД2. Описанное псгздение энергетических параметров типично для дефицита энергетического источника.

Аналогичный период голодания по источнику азота характеризуется прягло противоположным изменением пулов iui> и АД*, быстрое падение которых в момент исчерпания аммония сопровождалась подъемом адени-лагкого энергетического заряда, хотя и менее выраззняым, чем его падение при исчерпании глюкозы, возрастание энергетического-статуса глеток при азотном голодании свидетельствует з пользу преобладания энергогенерируювшх реакци.': метаболизма над знергспотребляюсдами и, как s случае глюкознои лкг.п:? } ггодтвер.кдаег концепцию неполного сопряжняя.

В отличие от исчерпания субстрата,нулевое время отсчета при во-, зобновлении его гтодачи мо-жо было четко контролировать, что сделало возмоляшд к целесообразным использование автоматического устройства ускоренного отбора проб. Высокая скорость массообмека в ферментере обеспечила практически мгновенное перемешивание компонентов питательной среды. В этих условиях с введением глюкозы в голодающую культуру без задержки начиналось возрастание AT» в клетке (рис.10), которое продолжалось в течение 3-4 секунд со скоростью 0,5 нмоль/мг АСЕ в I сек и стабилизировалось при достижении концентрации аденозсттра-Сосфата в клетке 6 наодь/мг АСЕ. Убываете в этот период пулов АД£ и

ЛТФ/АДФ

//ъ

с/

нмоль/ >.сг

1С

^—л~

/ ^

.3.

0,9

-л-»._

12

16

_ 0,8 С,7 J 0,6

20 сек

Рис,10. Изменение энергетических параметров я.соН в момент внесения глюкозы в голодающую культуру. 1-отношение АТФ/АДФ,ед.; ^-энергетический зарлд(Э.З.),ед; 3-общий адеяилатный пул, нмоль/мг АСЬ; 4-шутрикяеточныЗ пуд АТФ; 5-АДФ; 6-АМ1>, таль/кг АСБ.

4

О

ÄJ* является следстзие". ::юс-юраяярования и адештлаткшгазной реакции, включение биосинтетических реакций происходит на 4 секувде после внесения глюкозы, что соответствует стабилизации пула AT* при значении энергетического заряда 0,75. С этого момента начинается снижение общего аденилатного пула, утилизируемого в реакциях конструктивного метаболизма.

Таким образом, внесение глюкозы в голодающую культуру в первую очередь включает максимальную скорость энергетического метаболизма и лишь при восстановлении оптимального энергетического статуса клетки запускаются реакции конструктивного обмена.

Противоположная картина наблюдается в ответ на добавку аммония после азотного голодания (рис.11). При этом происходит быстрое снижение пула ATi со скоростьо, приблизительно равной его возрастанию в случае с глюкозой. В этот период продолжительностью 4-5 сек суммарный адшилэтныЕ пул находится приблизительно на одном уровне за счет эквимолярного возрастания содержания АД±> и АЫФ в клетке как продуктов гидролиза фосфатной связи в биосинтетических реакциях. В результате этого процесса происходит резкое падение энергетического заряда на 0,17 ед., что является мощным стимулом к запуску энергоге-нерирупцих механизмов клетки. Последнее сопровождается быстрым возвратом упомянутых параметров и их стабилизацией на уровне, характеризующем равновесное состояние синтеза ж гидролиза АТФ в процессе роста клеток. Описанные изменения энергетического статуса характерны для опережающего включения биосинтеза по сравнению с энергогенери-рующими процессами после снятия азотного голодание.

Таким образом, время, необходимое для достижения равновесного состояния энергетических параметров после снятия голодания, может служить критерием для оценки степени сопряженности энергогенерирую-щих и биосинтетических процессов у В.coli.

8. математическая обработка экспериментальных данных

Наиболее эффективными для математической обработки большого массива экспериментальных данных являются методы, запрограммированные ' для Э3.;1, что требует их адаптации к конкретному языку и операционной системе. В разработанной и использованной в настоящей диссертационной работе программе (ДРРЕОХ ) (Богатырев, 1990) реализован следующий подход. Аппроксимируемая функция f (х) задана в отрезке (а, ъ), который разбивается на внутренние отрезки bj , hg ,...., h^ . Для каждого отрезка h^ в точках zki известны значения аппроксимируемой функции fici . Надо построить функцию в (х), непрерывную вместе со своей первой производной всюду на отрезке (а, ь), сужение

АТФ/АДФ

Рпс.П.'Изкеяекяо энергетггосхях параметров 2.оо11 в момвят внесши ашзокня в голодапяуг» культуру. 1-отиошвние АТФ/АДФ, ед.; ^-энергетический заряд(Э.З.),ед; 3-обпий адонялатяыЗ цул,вколь/мг АСБ; 4-внутриклеточный пул АТФ; 5-АДФ; 6-АМФ, нмоль/мг АСБ

кторой на отрезке Ь^ представляется кубичсс-ц::.: полиномом р, (х). При этом пункция s (х) шаяшзируот ^.'¡-и-'лонал

где ^.>0 - набор весовых г,носителе;., зыбираемых в программе автоматически, для обеспечения большей гладкости аппроксимируемо:; кривой е "русле": Cffc. - < 6 , определяемом заданно;; оаибкой в наблюдаемых данных?" Программу mo:sîo использовать как модуль, вызываемый-из программ, нааисашшх на языке лртран-77, на всех типах ЗВ.«, где существует кошвиятор с этого языка. Реализованная на основе этой программ система отображения экспсршлентальдых данных, получавших при реаении задач автоматизации научных исследований, требует наличие 00 Л?ЭС версий 2,С и графического стандарта cors . Использование данной программ позволило автоматизировать и стандартизировать обработку экспериментальна дашшх. Особенно эффективным оказалось использование программы, когда полученный массив данных представляет собой значения измеряемых параметров, не совпадающие во времени з разных экспериментах, что происходит при частом отборе проб и динамичности поопессов, связанных с переходными состояниями. При это;.! степень достоверности графически изображенных в данной работе экспериментальных данных составляла 45%. правые, изображенные на рисунках, представляют собой результат машинной аппроксимации, а изображенные точки - значения параметров,'полученных в конкретном эксперименте.

Заключение ■

Проблема сопряжения энергетического и конструктивного метаболизма занимает одно из центральных мест з регуляции обмена веществ микроорганизмов. С целью изучения этой проблемы наш были разработаны и после всесторонних испытаний использованы новые методы определения адениловых нуклеотидов и полиаминов, обладающие рядом преимуществ перед существующими аналогами, что подтверждено авторские свидетельством на изобретение. Измэнение внутриклеточных аденилатных пулов является признаком, характеризузапм сопряжение энергетического и конструктивного обмена. Исследсзание физиологии микроорганизмов в различных условиях культивирования показало существование прямой корреляции мезду величиной энергетического статуса плетки и активность» системы синтеза полиаминов. Б регуляции внутриклеточных пулов полиаминов помимо транспортных процессов играет роль их связывание с компартментами клетки, важнейшими из которых являются нуклеиновые кислоты и мембранные структуры, что способствует формировании двух

—'хи-

тинов тяутрихлсточного пула полиамидов, свободного я связанного. Характерные изменения нукдеоадз в стороиу кошактязшет свидетельствует о том, что связывание долиаметов с ЛНК сопровождается избиением транскрипционной активное—j.

Энергия градиента пугреецнне используется для возобновления внутриклеточного депо калия в условиях, когда энэрготическай статус клетки снижен настолько, что затрудняет работу обычных эноргазавкся-иых систем транспорта кадия ( trk, ир ). a cood очередь депо калня в метке используется для регуляции внутриклеточного рй в условиях заяалачлвания среды при участив ¿íf/a+ - переносчика, когда протон переносится в клетку в обман на калия.

В стрессовых ситуациях, связанных с переходом клеток из аэробного в анаэробное состояние пролеходкт снижвЕпе содержания кислых фос-'¡хзлнпадов в ьгзмбране и изменение их соотношения. Этот про по со связан в первую очередь с ограничением потока энергии, а также с участием в этом процессе системь синтеза поляамияов. 3 ста о очередь изменение составэ фоо^олапидаой матрицы изменяет -¿язако химические свойства мембран, их текучесть, что как нами показано, связывается на азквяо-шш работы аемораносвязанных $ер^знтоа, твких как ^АТЗаза, дыха-твл^4ая иепь.

Такшг образом, активность ¡шяевого фермента синтеза полааминов, орнатиндекарбокеялазы, и уровень полиаминов з клетке определяется её энергетическим состоянием. Учаотие подааканов в разнообразных ^процессах биосинтеза а ионного транспорта, а также взанмодвйстЕЗЭ о поли анионными макроколекулярнкми структурам (Дпп, аитопдазкзтичво-кяе мембраны) обусловливает упорядоченный отклик многочисленных функциональных систем клетка на изменение активности система сантаэа полыаманов.

Полученные нами экспериментальные данные, а также анализ литературы, дает основание придти к заключении о существовзнгл у B.ooli сценического механизма сопряжения конструктивного и эпорготпчоско-го обмена при участия састемы синтеза полиагошол.

Лрахмчвсгшв рекоиэквоцет

Успешная опробацкя и иопользовашгэ разработанных методов опро-дагепия адвюлошх нуклеотгггг a noinsisitoa а хшотоски учроадэ-шш г.Дори дзот основание рекюмэндоаать их для бол о о пзрокого ио-пользэгэгпи о колья рзннэй дшгпгоетякя ошюлогячэскнх заболевжгЗ, а таягз а:боловзшгй ¡сроет, сордэгло-сосудастоа и дыхательной crorfeíj; НезбольтЯ оф+зкт слэдузт огядать от соснет ного -ассальзогшгая рэхо-кзвдусггяс катодов, что дает возгэтооть покквггь юроятеость

лравильного диагностирования. С целью охвата обследованием более широких слоев населения рекомендуется создавать сети диагностикао~ ких,лаборатории, владеющих данными методами при клини^воквх учрегудениях и на крупных промышленных предприятиях.

Вывода .

I. Разработаны высокоэффективные и чувствительные метода определения адениловых нуклеотйдов и полиаминов, которые использованы в настоящей работе. На основе метода определения аденилатов отработан способ препаративного ввделения флуо ре сцируацих аналогов аденидаяоз дансил-АТ4>, дансил-АД«, дансил-Ar/iï, доказана возможность их участия в качестве субстратов в различных ферментативных реакциях энергетического обмена и определены кинетические константы. Это открывает ноше возможности дая тонкого изучения механизмов ферментативных реакции и может найти практическое применение в фундаментальной научно-исследовательской работе. Метода использованы в медицинской практике для ранней диагностики заболеваний. В частности, метод определения полиаминов в моче использован нами для диагностики онкологических заболеваний, которые сопровождаются значительным возрастанием уровня полиаминов в организме.

'¿. количество адениловых нуклеотйдов изменяется в переходных состояниях, связанных с изменением внутренней (клеточный цикл) и внешней среда (различные вида голодания и-стресса), что является следствием неполного сопрянения энергетического и конструктивного метаболизма. Скорость изменения аденилатных пулов может служить критерием оценки сопряжения двух типов метаболизма.

3. Уровень ATw в клетке регулирует активность ключевого фермента системы синтеза полиаминов, орнитиндекарбоксилазы, и, следовательно, величину внутри- и внеклеточного пула шлиаминов. Данная закономерность нашла свое подтверждение как путем моделирования различных энергетических состояний клетки в культурах с пошщью изменения внешней и внутренней среды, так и опытами 1л vitre при изучении влияния различных концентраций АТФ на активность орнитиндекарбоксилазы В'бесклеточных экстрактах.

4. На основании обобщения собственных экспериментальных, данных, а таювз литературных источников сформулирована гипотеза, согласно которой система синтеза полиаминов рассматривается как один из механизмов сопряжения энергетического и конструктивного обмена. Согласно этой гипотезе, система синтеза полиаминов посредством ключевого фер~ мента орнитиндекарбоксилазы реагирует на шток энергии в клетке, во*. ответственно ему изменяя свою активность и количество полиажнов.

-35В сбою очередь полиамины, являясь универсальны:.! регулятором бнос;ы-тетических процессов на уровне мохроыолекулярпых структур, -е.'игтспо:: своих внутриклеточных пулов определяют скорость протекания этих процессов в клетке. .'Дногестзенность точек приложения этих э^ектоа полиаминов в конструктивном обмене определяет согласованное изменение скорости составляющих его биосинтетическнх реакции в ответ на изменение уровня полиамиков, что (лшииизирует затраты энергии на сверхсинтез предшественников в метаболических путях.

5. Впервые показано существование систеш гомеостазо внутри-неточного пула полиаминов, в частности путресцина, при участии транспортных процессов, в результате которых происходит постоянны*', обмен полиаминами ме;%цу клеткой и средой, повышенный синтез полиа:л::;оз, имеющий место при избытке энергетического субстрата (периодические 1сультуры микроорганизмов) способствуют активизации" процессов выброса полиаминов с формированием внеклеточного пула в среде культивирования. Лимитирование энергетическим источником стимулирует транспортные процессы переноса полиамидов внутрь клетки. На примере периодических культур с подпиткой впервые описано кинетическое соотношение т:е:кду скоростями потребления и выброса полиашшов.

6. Адаптация микроорганизмов к различным стрессовым воздействиям происходит при взаимодействии систем генерации энергии и синтеза полиаминов в соответствии с выдвинутой нами гипотезой сопряжения энергетического и конструктивного метаболизма. Стрессовые воздействия, которые приводят к снижению энергетического статуса, вызывают однонаправленный перенос полиашнов из среды в метку и связывание с внутриклеточными комяартментами. Динамичные электронкокикроскогат-ческие исследования показали, что местом их связывания является нук-леоид, ультраструктура которого претерпевает изменения, характерные для возрастания степени компактизации ДНК. Ь свою очередь изменение топологии ДНК является ^актором, регулирующим ее функциональное соо-тоянае, в частности экспрессию стрессовых генов, определяющих адаптивные реакции микроорганизмов на неблагоприятные воздействия окружающей среды.

7. На примере щелочного стресса впервые показано, что транспорт путресцина через клеточную стенку осуществляется в обмен ка калий при участии специфического переносчика: путресщш+2/2К*". В модельных экспериментах, проведенных на s.coll в условиях ингибирования основных транспортных систем калия, показано, что перенос носит злектрононейтральный характер: на один ион путресцина"^, вышедший из клетки, внутрь клетка поступает 2 иона К1". Эта система транспорта используется клетками для восполнения депо калия в условиях низкого

экергетичгского статуса, когда эффективность эяергозависимлх систем (Sri , Kdp ) снимается. При этом дви^цей силой процесса является градиент путресцина, внутриклеточное содер:.сание которого в условиях защелачпванпя среды ¡.гюгокрзтно возрастает.

Ь. Joc_.o.innimHKi: состав цктоплазматической мембраны Б.coli за-злслт от энергетического состояния клетки и активности систем синтеза поллэ:.2шоз, которые .изменяются в различных условиях культивирования. Ла примере аэробно-анаэробного перехода показано, что количество кислых ¿ос.уолишщов в отсутствие кислорода непропорционально сни.зется, что приводит к изменению их нормального сооткоыения. От химического состава мембран зависят их физические свойства, такие как те::учестъ, изменения которых могли помутить причиной описанных ¡¡ами изменений работы мембраносвязанных ферментов. 5 частности, показано возрастание активности Н^ТЗазы в сторону гидролиза AT* как адаптивная реакция клеток, направленная на генерацию электрохики-ческого потенциала протонов за счет энергии фосфатной сзязе АТФ.

Список опубликованных работ ш теме диссертации

1. Барихин С.Я., Ткаченко А.Г., Пшеничнов P.A., Холотэв 3.«1. Стимулирующая добавка к синтетической питательной среде для культивирования микроорганизмов.// A.c. 49I69I. 1975.

2. Ткаченко А.Г. Потребление источника азота и глюкозы е.coli

в условиях модифицированного хемостата.// Тез. докл. 71 съезда ВЬЮ. Рига. I960. Т.4. C.I34.

3. Ткаченко А.Г. О соотношении селективного и аутометабоднчэско-го типов регуляции численности и структуры бактериальных популяций./ / ¿акторы развития бактериальных популяций. Свердловск. I960. С.75-64.

4. Пшеничнов P.A., Ткаченко А.Г., Ьелешш E.H. Влияние внеклеточных аутомэтаболитов на экономически:: коэффициент поцуяяции Б.coli различной плотности.// Экология. IS8I. & I. C.S3-S5.

5. Ппеничнов P.A., ¡¿»лотов З.м., Ткаченко А.Г. Роль внеклеточных аутометебслптоз з сохранении популягзмьйя ¿¡.coli исходной гетерогенности по скорости раз:ляо::;ения,// Экология. IS8I. & 2. С.85-87.

6. октябрьский O.K., Пшеничнов P.A., Ткаченко А.Г. и др. Изменения окислительно-восстановительного потенциала при остановке роста a.coli .// .жшробиология. IS8I. Зып.З. С.467-470.

7. Ткаченко А.Г., Жданов A.A. Определение адениловых нукпшли-дов ;летодои тонкослойной хроматографии з сочетании с реакцией дав-сидирования./,' Прикл. биохимия и микробиология. IS85. Т.21. Вып.4. С.553-557.

t. А.Г. Несопряззэшши рост периодической культуры с

подпиткой субстратом,// Тез. докл. /II съезда д.Ю. Алма-Ата. 1985. С.47.

£. 1:1аченко А.Г. Соотношение конструктивного ц энергетического типов метаболизма з процессе ошхроныого роста В.coli.// Тез. докл. jcec. по управляемом}' к>'льтивнровакш чи^рооргаьизмоз. Пушно.

19Ь6. 85-66.

o.e. Ткаченко п.Г., -.удикэя А.л. Энергетические аспекты разгатия Sscherichia coli , сх-:::ронИ9арэзвнно1: голоданием.// ..акробяология. i?o7. T.Ou. JHn.i. С. об—ôô.

-I. Ткьчвнко л.Г., iyдин о в л.А., ?аев ..¡.Б. Изменение внутряклеточ-кого п^ла адениловых нунлеотадов периодической культуры Escherichia coli с подпиткой субстратом.// Экология и па.тулягжжкая генетика микрооргакизмоз. овеодловск. IS67. С.70-75,

12. Ткаченко А.Г., Чудиков A.n., Колбккг £.л. изменение энергетического статуса синхронных :ульт. р escherichia coli в процессе аэробно-энаэробкьос переходов./'/ :.акроб::о.-.огия. Т.57. лып.1.

С. jo—17¿.

-ó. Ткаченко л.Г. Энергетические параметры ¡шк отражение переход-кил cjстояний в периодических культура;: Sscheriohia coli с добавлением субстрата.// „лкробиология. 1986. Т.57. Вып.4. С.615-62*..

14. Чурилова ¡i.e., Ткаченко. А.Г., Чудиков A.A., Попов ВД. Особенности суСмикроскопичеокой организации S.coli в процессе аэробно-анаэробных переходов.// Тез. докл. Всес. kohw. по электронной микроскопии. Звенигород. IÖ68. С,104.

15. Чудинов A.A., Ткаченко А.Г. Обмен полиаминов между клеткой я средой как экологичеогш значимы}; фактор.// Тез. конф. 'Урал: экология". Свердловск. 1987. С.5а.

16. Ilcacheniso i..G., Raev И.В. Alteration of the H^AÎPaee actiTity to bCCD in dependence of energetic states of aerobic to anaerobio transitions of S.coli.// Abstr. 14th International Congr. of Biochea. Praga. July.14. 1933. P.185.

17. Ткаченко А.Г. йзменензе параметров голодающей культуры S,оoli как отражение* вторичного мэтабодпама.// Тез. докл. Бсес. копф. "Биосинтез вторичных метаболитов". Пущшо. 1987. С.55.

16. Ткаченко А.Г., Чудило в а. А. Обмен полгжзяска мзжду. клеткой, и средой как один из секторов, отражающих разЕггпэ культур Escherichia coli с подпиткой.// ликробаологет. 1989. Т.58. Вып.4. С,584-590.

19. Ткаченко А.Г., Чудлнов A.A., Чурилова H.G. Ролт. внутриклеточного .тупа полиамидов рогулдщпс конструктивного обмена • ichla er И *- прецэооэ аэробно-анаэробных пароходов.// Микробиология. 1£2ЭЧ

-Jö-

Зып.5. С.709-715.

20. Ткаченко А.Г., Чудинов A.A. .¡з:.;сленяе пула дслиа:.аиов з процессе перехода от анаэробных к аэробным уоаовкям п локализация ферментов их синтеза В клетках Escherichia coli .// .микробиология. 1989. Т.58. Вып.6. C.885-SSI.

21. Ткаченко А.Г., Чудинов A.A. Роль энергетического статуса в регуляции пула полиадаьов. в клеточной эдкле .// Тез 10-го Объед. еимпзиуиа биохим. обществ СССР-ГДР. Тазкент. 1989, С.77.

'¿'¿. Ткаченко А.Г., ЧудияоЕ A.A. Энергетически статус клетки как регулятор пуда подиаминов в цикле деления ¡¿.coli .// Тез. Бсес. конф. "Рефляция клеточного метаболизма". Дущияо. IS8S. С. 133-134,

23. Ткаченко А.Г. Роль энергетических параметров в регуляции метаболизма культур E.ooli с подпиткой субстратом.// Тез. Всес. конф. "Регуляция неточного метаболизма". Пущино. 1989. С.140.

24. Чудинов A.A., Т;аченко А.Г. Обмен полиаминада меэду клеткоЁ и средой в периодической культуре E.ooli с подпиткой субстратом./

/ Тез. Зсес. конф. "Регуляция клеточного метаболизма". Пущино. 1989. C.I6S.

25. Ткаченко А.Г., Чудинов A.A. Роль системы сиатеза полиаминов в энергетическом сопряжении у Escherichia coli .// Доклады A3 СССР.

1989. Т.305. Г; I . С.219-222.

26. Чудинов A.A., Ткаченко А.Г. взаимосвязь функции диаминов и локализация ферментов их синтеза в метаболизма E.coli .// Тез. Всес. конф. "Регуляция клеточного метаболизма". Пущино. 1989. C.X68-I69.

27. Ткаченко А.Г. Изменение сопряженности энергетического и конструктивного обмена s.coli в процессе питательных шифтов по глк>~ козе и ашоикн.// Тез. Зсес. конф. "Лимитирование и ингкбирование роста микроорганизмов". Пудино. 1989. С.88.

28. Чудинов A.A., Ткаченко А.Г., Чурилова Н.С. Изменение активности полиаминсинтезирующей системы в процессе аэробно-анаэробных переходов е.coli .// Тез. Всес. конф. "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов". Пущино. 1989. С.97-98.

29. .Ткачешсо А.Г., Чудинов A.A. Влияние pH переходов на энергетический статус и обмен ^/путресцан в клетках E.ooli .// Цитология.

1990. № 9. С.953-954.

30. Ткаченко л.Г., Чудинов A.A., Вихарев В.Я. и др. Аденидатный энергетический заряд крови.// Уральские нивы. 1990. В 7. С,Г7.

31. Ткаченко А.Г., Чудинов A.A. Соотношение энергетических параметров и свободного пула полиаминов Escherichia coli в процессе синхронного роста.// .Микробиология. 1990. Т.59. С.1-6.

32. Ткачспко л .Г. ..змененпа энергетических параметров Escherichia coli з процессе исчерпания :: возобновления подачи глюкозы и аммония как -•актор, херактеризуэдсй сопряженность энергетического и конструктивного тппоэ метаболизма.// ..йкробиология. I9SC. Т.5У. Зьш.2. V.ÀS7-2С4.

33. Ткачекко А.Г. Препаративное выделение и ;:слользова:п:сг ,;ансил-аденилатов в ¡хчестве „лу°ресцируюаих субстратов в рзакпкях энергетического метаболизма.// Прпид. биохимия и жкробпологкя. 1990. Т.26. Ьып.1. C.Ï24-I3C.

34. чудаков A.A., Ткаченко А.Г. Роль полигонов при лимитации роста периодлческо». культуры Escherichia coli псточнжшк! углерода и аммонийного азота.Л' ж-акторн и ::охагп:з?.за регуляции развития бактериальных популяций, изердлонск. ItsС. С.¿£-35.

35. Ткаченко .».Г., Чудилов л...-.., Роев снергетпка аэробно-анаэробных пероходов в процессе гт:;;-:рон::ого и асинхронного роста Eoohoriohia coli в культурах с лодга:?:»*:,// моторы и механизмы регуляции развития бактерпйльшг: популяций. Свердловск. ISvü. C.5-I<¡.

36. Ткачекко л.Г., Розоибдат Г.»., Чудцноз л.л. и др. Роль энергетического статуса Escherichia coli з изменении .о&.олигшдного состава меточных мембран iron аэробно-аназрооньп: переходах.// Прикл. биохимия и микробиологии. I3SÏ. Т.<.7. ->a'.4. 0.Ö58-564.

37. Чудпнов A.A., Ткаченко а.Г. Активность трлиадхлеинтезируяцей системы - экологически .значимый ^гктор развития сактериальшк популяций.// Тез. докл. Зсес. сш.шоз. ".¿кробпологкя охраны биосферы з регионах Урала а Северного прикаспия". 1991. Оренбург. C.ISC-ÄoI.

ЗЬ. Ткаченко А.Г. Роль энергетичес::ого статуса клетки з оценке стрессовых воздействий услови.. среды.// Тез. ме;.:дунар. Симп. по проблемам токсикологии прикл. экологии. ..лскза-иермь. 1991. C.78-7S.

39. Ткаченко А.Г., Чудикоз ^.а., Чурилона К,С. Влияние ^лзиолот-гического состояния Bacherichia coli ;,¡q ультра структуру нуклеодда з условиях стрессовых воздействий.// .»зн. Ah ССОР. Сер. биолог:"!. IS92. .:• I. С.42-51.

<10. Ткаченко А.Г. Способ определения аденплонюс куичеотлдов в биологическом материала.// А. с. I7(j;>216. 19»!.

4Х„ Shaohonico Л.G,, Rosenhlat G.P., Chudinov A.A. oí al. Tho rolo of tJio coll energetic atatujs end polyeainec in • phospholipid 00a-tcs.4 oí визЬтяпеа in Sccbsrichiu coli in tfco oouras oí aerobio-ana-1,гЬЩс tremía it iotiB »// Current Microbiology. 1591. V.22» ЗМ51-15Э.

■ /ft;, Ткаченко ¿.Г., Чудпнов л.л., »¡агорских Т.Г. Роль энергетц-4cc::cïv„стстусз к транспорта дутрветш в обеспечении гомеостаза хяртрхзя&гощюго к1 в процессе цй?очп:г; ц ккслоттп: плггтов у Eooho-

riohia coli .// ¡Микробиология. 19S3. Т.62. Вып.1. С.37-45.

43. Ткаченко А.Г., Чурилова Н.С., Чуданов A.A. Соотношение скоростей энергодахиаих z энергопотребляющих реакций у seoharichit. coli пр:: различии типах голодания.// чизиология и биохимия микроорганизмов. Екатеринбург: УрО РАН, I9S2. ü.iö-2».

44. Чудинов A.A., Ткаченко А.Г. Лзменение внутриклеточного содержания полиаминов в синхронных культурах a.coii и их роль в регуляции клеточного цикла.// Физиология и биохимия микроорганизмов. Екатеринбург: УрО РАН, :%2. С.30-36.

45. Ткаченко А.Г., Чудияов A.A. Участие путресцина в антипортном механизме транспорта калия у Escherichia coli и его роль в регуляции клеточного pH.// Микробиология. (Принято в печать, будет опубликовано в 1993. Т.62. Вып.4.)

¡¡здгшеано в печать н.ог.^ъ Печать офсетная. Оормат 60x84 1/4. Усл. печ. л. Тираж »20 -жз. Заказ »20

614600. г. Пермь,-ул. Букирева, 15. Т:;погр.чфия ПТУ.