Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль пероксидазного окисления в метаболической активации бензидина и его канцерогенных производных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль пероксидазного окисления в метаболической активации бензидина и его канцерогенных производных"

ИНСТИТУТ РАДИОБИОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ БЕШУСЬ

На правах рукописи

ИСМАИЛ ИЕРАХИМ

Ч -

РОЛЬ ПЕРСКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ В МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ БЕНЗЩЩНА И ЕГО КШЕРОГШШХ ПРОИЗВОДНЫХ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой. степени кандидата биологических. наук

Минск - 1992

Работа выполнена в НИЛ биохимии обмена веществ при кафедре биохимии Белорусского государственного университета

Научные руководители - доктор биологических наук, профессор Дикулев А,Т,; кандидат биологических наук, старший научный; сотрудник Курченко В.П.

Официальный оппоненты: доктор медицинских, наук, профессор Кухта 8.К. доктор химических наук, .

старший научнкй сотрудник Усаноа С.А.

Ведущая организащя - Институт биохимии АН Республики Беларз

Защита состоится и ^ " 1992 г. в ( Ц часов

на заседании специализированного совета Д 006.30,01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Институте радиобиологии АН РБ по. адресу: 220600, г. Минск, ул. Жодинсцая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института радиобиологии АН Республики Беларусь

Автореферат разослан " £ ' " _ 1992 г.

Ученый сеадетарь специализированного совета

Актуальность темы.Одним из важнейших направлений в исследовании злокачественных новообразований является выяснение механизма канцерогенного действия химических веществ. Успешное решение его позволит определить основные подхода в рациональной терапии . опухолей. К наиболее активным и распространенным канцерогенам относятся ароматические амины, в том числе бензидин и его различные производные, использующиеся в анилино-красочной, резинотехнической промышленности и других отраслях народного хозяйства. В организме возможны, различные пути химических превращений аминобифенилов, приводящих к образованию реактивных метаболитов. Особую актуальность приобретает выяснение наиболее вероятных путей :окисления канцерогенов, так как это создает предпосылки к целенаправленному поиску ададтогенов, способных снижать генотоксич-ность этих.веществ.

■ Цель и-задачи исследования. Целью'настоящей работы являлось систематическое исследование кинетических параметров, пероксидаз-ного окисления, ряда.аминобифенилов гемолротеинами. Выявление ок-сидантов, .способных повреждать ДНК, а также поиск-веществ, - способных ннгибировать окисление ароматических аминов и образование генотоксичных продуктов. Поставленная цель определила решение следующих конкретных задач:

- исследование особенностей пероксидазного окисления-рядом гемопротеинов-бензидина и его производных;

- выявление повреждений ДНЕ продуктами пероксидазного окисления изучаемых-'ашнобифеншюв; -

- выяснение влияния бензидина и его производных- на микросо-мадьную систему окисления печени и на глутатионзависимые ферменты детоксикации метаболитов;

.-т поиск-веществ, предотвращающих'окисление аминобифенилов по пероксидазному пути и защищающих ДНК от повреждений метаболитами. . - ■ • ' . . ....

Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое исследование кинетических параметров окисления ряда аминобифени-лов гемопротеинами и микросомами печени. Выявлена взаимосвязь структуры аминобифенилов и их индуцирующей способности на ферментные системы I и II фаз детоксикации чужеродных веществ. Показано, что продукты окисления бензидина способны образовывать меямолеку-

лярные сшивки ДНК, в то время как его производные, имеющие заместители в третьих положениях проявляют такие свойства значительно хуже, а наличие четырех Заместителей по третьему и пятым положениям полностью предотвращает взаимодействие оксидантов с ДНК. Найдены оксиданты меланиновой природа, способные ингибиро-вать процесс повревденая ДНК продуктами пероксидазного окисления бензидана и его производными. ■

• Практическая значимость работы. Созданная система метаболической активации ароматических аминов на основа гемопротеинов в 1 сочетании с электрофорезом ДНК, экспонированной к'продуктам окисления, позволяет бистро выявить ксенобиотики, поврелдаицие ДНК и способные проявлять свойства мутагенов в канцерогенов. Такая простая тест-система может войти в батарею тестов на канцероген-ность химических веществ, используемых в промышленности. Выявлены свойства эномеланина, возводящие использовать его как адап-тоген при интоксикации ароматическими шинами.

Основные положения, выносимые нд защиту;

1. Мшфосош печени и цктохром Р-450 эффективно окисляют бензидан. Наличие мегалышх и метокси- заместителей в молекуле бензидана резко снижает эффективность окисления производных.

2. Продукты пероксидазного окисления бензидана вызывает образование сшивок ДНК-ДНК. Оксид анты 3,3-диметилбензидина образуют сшивки значительно хуже, а 3,3,5,5-тетрамвтилбвнзидин не образует мелмолекулярннх ставок ДНК.

3. Метальные производные бензидана являются индукторами т-тохрома Р-450 и глутатионтравсферазы.

4. Восстановленный глутатион я эномеланин защищают ДНК от повреждений продуктами пероксидазного окисления бензидана.

Дпрпбедця работц.Результаты исследований представлялись на Всесоюзных симпозиумах "Эколого-генетический мониторинг состояния окружающей среда" (Караганда, 1990); "Биохимия опухолевой клетки" (Минск, 1990); 711 Международной конференции "Биохимия, биофизике, цитохрома Р-450" (Москва, 1991).

Публикация .До результатам исследований опубликовано 2 статьи и тезисы 4 докладов.

Структура и объем работы. Диссертация излояена на 119 стран;'-

цах машинопистного текста, содержит II таблиц.и 24. рисунка. Работа состоит из введения, аналитического обзора.литературы,, описания материалов и методов, изложения: полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (146.источников, из них 33 отечественных). ■ ■■

МАТЕРИАЛЫ И.'МЕТОда ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные. Исследования проведены на беспородных белых крысах. Ксенобиотики вводили 4 дня внутрибрюшинно в ; дозе 100 мг/кг массы животного-в'сутки (В.В.Ляхович, 1981); забивали на пятые сутки после начала введения. Микросомальную фракцию получали по общепринятой методике (А.И.Арчаков, 1984).

. Электройоретические методы. Разделение и идентификацию ДНК проводили электрофорезом в агарозном геле (Т.Маниотис, 1984). Фотографирование гелей вели в проходящем УФ. Негативы сканировали на спектрофотометре "Бекман-8" (США) и определяли процент ДНК, подвергнутой модификации оксидантами аминобифенилов,-

Методы анализа. Концентрацию цитохромов Р-450 (КФ I.I4.I4.I), в5 (КФ 1.6.2.2) определяли методом (т- Оииго, R.Sato <f 1964), гемоглобина, пероксидазы (КФ 1.П.1.7) ( i'S. Schenkman ( 1972), активность НАДВД-цитохром Р-450 редуктазы (КФ 1.6.2.4) ( i.s.French 1979). Активность ферментов определяли: пероксидазную - калоримет-ричеоки (ГЛ.И.Савенкова, 1983), глутатионпероксидазную (КФ I.II.1.9) по окислению глутатиона восстановленного (В.И.Моин,'1981), глута-тионредуктазную (КФ 1.6.4.2) по скорости разложения НАДФН (Л.Б.Юсупова, 1989), глутатионтрансферазную (КФ 2.5.1.18) по образованию конъюгата asH с 1-хлор-2,4-динитробензолом. ( W;H.Habig,. 1974); содержание SH -групп по реакции с 5,5-дитиобиснитробензойной кислотой ( i.Seblak , 1968). Определение белка проводили методом ( D.bowry, 1951). Полученный экспериментальный материал обработан методами вариационной статистики. В таблицах приведены средние арифметические значения (х) со средне-квадратичной ошибкой (sx).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Пероксидазное окисление бензидина и его производных Одним из возможных путей метаболической активации канцерогенных ароматических аминов является пероксидазное окисление. Гемоглобин, миоглобин, каталаза, различные пероксидазы, цитохромы с,

Вд, Р-450,'другие гемопротеины обладают свойствами пероксидаз. Они катализируют реакции окисления-соединений по уравнению:

АН2 +Н202-^А° + 2Н20 , где АН£ - донор водорода, при этом окисление бензидина и его производных сопроваждается образованием нескольких продуктов речк- _

* ции. Принято считать, что первичным продуктом пероксидазного окисления бензидина является хинондиимин. При значениях рН 3,7 образуется бис-азодифенил. Наряду с этими продуктами реакции возможно образование катион-радикала и его комплекса с переносом заряда между бензидином и его хинондииминоад. Эти продукты окисления могут являться конечными канцерогенами. Их накопление и высокая стационарная концентрация зависит от эффективности ферментов, катализирующих окисление рманобифенилов. В связи с вышеизложенным, наш изучены кинетические закономерности пероксидазного окисления бензидина и его производных о различными заместителями в третьих и пятых положениях - бензидина (БД). З.З^-диметилбензидина. (ДМВД).

• 3,3^-диметоксибензидина (ДМОВД) и 3,3',5,Ен-тетраметилбензидина (ТМЕД рядом гемопротеинов и микросомами печени. Спектры поглощения окисленных продуктов в присутствии пёроксидазы, цитохрома Р-450 ЛМ2 и других белков близки, что свидетельствует о сходстве состава продуктов окисления аминобифенилов этими гемопротеинами. В строго идентичных,' оптимальных условиях были измерены начальные скорости накопления продуктов реакции пероксидазного окисления изучаемых аминов от концентрации различных гидроперекисей. Процесс окисления подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен, из преобразования которого по методу Лайнуивера-Берка получены кинетические параметры.

В таблице I приведены каталитические константы окисления бензидина и его производных пероксидазой хрена в присутствии гидроперекиси водорода и третбутила. Из таблицы видно, что в присутствии гидроперекиси врдорода эффективность катализа, оцениваемая по соотношению Ккат<1А1д» возрастает в 20 раз при-введении двух метокси-заместителей (ДДООВД) и в 14 раз при введении двух метальных заместителей (ДМБД) в третьи положения молекулы бензидина. Тетр&мегпл-бензидин окисляется эффективнее бензидина более чей в 130 раз.

Таблица I

Кинетические параметры пероксидазного окисления бензидина и его производных в зависимости от концентрации перекиси водорода и гидроперекиси третбутила

Субстрат Перекись водорода . Гидропер екись тр этбутила

' _ и & ь. и О М К М о нв 1 он М со и • 1-1 <3 Яо м ■ « о. . н 1 1-н (а со 1—1 • 1 О М 1 к

Щ 4,0 0,3 ! 0,087 7,1 3,3 4,65 ДМОЕЯ ; 2,5 5,0.' 2,0 ■ 0,8 : 0,05 0,65 дащ . 4,6 5,6 1,2 6,2 9,1 1,45. ТВД : .3,3 40,1 '12,0 2,0 .0,1 0,75

Такий образом, производные бензидина в присутствии, гидроперекиси водорода окисляются значительно быстрее в Зависимости характера заместителей и их количества. Эффективность пероксидазного окисления в присутствии гидроперекиси третбутила значительно ниже,, а введение-метальных заместителей в молекуле бензидина затрудняет процесс катализа ДМВД в З раза, а ТМЕД'-в 6;раз.

Сравнительное рассмотрение данных.литературы по пероксидаз-ному окислению этих и других-субстратов показывает, что :всем кинетическим данным удовлетворяет ранее предложенная схема.

Кт

Е + Н202

+

А11о

К

-2

Кс

Ж,

е2ш

* р

пероксидазы, Е^АШ, - комплекс

В этой схеме, Е^-' означает комплекс соединения I пероксидазы с субстратом, Е2АН - комплекс полуокис-лениого субстрата с соединением II пероксидазы. Полученные наш . значения константы-скорости К^ (таблицы I и 2) хорошо соответст-

■ Таблица 2

Кинетические параметры пероксидазного окисления бензидана и его производных, рядом гемопротеинов

Препараты

ВД"

а

р} о «

I СО МП

£В

►Э *

ы

о см

.даовд

дат

э

о, ^ I о> нч

«г-

ш 1-э.

о

О

I Ш

I—I «

г

1-

о з

1 1- ■ н

и О и

ТМЕД

вГ

и

я

о, м 1рз

а*

»

нЗ >

ъ

Микросомы печени 1»25 4,85 38,8 0,91 1,87 20,5

Цитохром Р-450 М- 1,96 6,70 34,2 1,82 : 0,40 .2,15

Пит охр ом В5 0.83 0,71 8,6 1,85 0,86 4,60

Гемоглобин 1,43 163,8 1145 1,04 6,90 66,3

Пероксидаза . 1,18 1320. 11186 0,74 1400 18918

1,01 2,12 20,9 1,68 1,68 27,7 9,09 2,40 2,60 4,0 1,60 4,0 2,0 0,57 2,90 1Д7 3,20 27,4 1,02 14,10 133,2 0,68 • 2800 41176 1,09 10100 92660

зуют литературным данным о скорости взаимодействия разных субст-)атов с комплексом I пероксидазн. ...

Представляло значительный интерес сравнить кинетические'Параметры пероксидазного окисления аминобифенилов различными гемо-1ротеинами, способными принять участие, в их метаболизме и,ода*-, мть эффективность катализа шли. В таблице 2 представлены 'параметры пероксидазного окисления бензидина и его производных микросомами и рядом гемопротеинов: цитохромами Р-450, Вд, гемоглобином и пероксддазой хрена в присутствии перекиси водорода. В сравнении с пероксидазой, гемоглобин окисляет бензидин в 10 раз медленнее, а введение метальных заместителей по третьим и пятый, положениям молекулы бензидина уменьшает эффективность окисления производных. Пероксидазная активность цитохрома Р-450-Ж,, по отношению к бензидину соизмерима с активностью микросом печени а в 4 раза выше, чем у цитохрома являющегося компонентом системы микросомального окисления. •..•'.'

Суммируя результаты по влиянию заместителей на эффективность пероксидазного катализа гемопротеинами необходимо отметить,■что' для гемоглобина, вдтохромов Вд и Р-450, наблюдается снижение каталитической активности, при окислении производных бензидина, в то время как микросомы печени достаточно эффективно окисляют бензидин и. его производные. Сравнивая эффективность катализа гемопротеинами и микросомами, .необходимо отметить высокую каталитическую активность гемоглобина. Полученные результаты свидетельствуют также о возможности окисления. бензидина и его производных микросомами печени, формами цитохрома Р-450 по пероксидазному механизму.

■ 2. Повреждение ДНК продуктами пероксидазного окисления • аминобифенилов

Большинство генотоксичных соединений активно взаимодействуют с ДНК и вызывают в ней разнообразные повреждения. Показано, что трансформация клеток под воздействием канцерогенных веществ связана с одно- и двунитевнми разрывами, мажнитевыми сшивками ДНК ' и сшивками ДНК-белок. Эти повреждения, независимо от механизма их возникновения, являются мерой генотоксичности химических соединений. При пероксидазном окислении аминобифенилов образуются различные электрофилыше продукты, основное.количество которых приходится на дшшины, являющиеся, как известно, бифункциональными реаген-

тами. Исходя из этого, мы предположили, что наиболее вероятным повреждением ДНК продуктами окисления ВД и его производных могут быть межнитевые сшивки ДНК и перекрестные сшивки ДНК-ДНК. Наибол доступным методом для исследования таких макромолекулярных изменений ДНК является элекгрофоретическое разделение модифицированной ДНК от поврежденной. При этом ожидалось, что перекрестно-сшитая ДНК будет обладать значительно меньшей форетической подвижностью. • ■

Б связи С'этим, было проведено исследование электрофоретиче-ской подвижности ДНК фагах , тимуса теленка, экспонированной к продуктам пероксидазного окисления бензидина и его производных. Показано влияние на электрофоретическую подвижность ДНК продуктов окисления ВД в зависимости от времени пероксидазной реакции. Наблюдается накопление на старте фореградаы медленно мигрирующей ДНК в зависимости от времени воздействия на ДНК продуктов окисления. Практически вся ДНК подвергается перекрестным сшивкам за 3 . ■минуты в выбранных оптимальных условиях окисления бензидина. Кривая накопления перекрестно-сшитой ДНК совпадала с кривой накопления Продукта окисления бензидина - дииминобифенила.

. Процесс повреждения ДНК зависел от рН и достигал оптимума при рН 5,5, что соответствует оптимальному протеканию пероксидазного окисления ВЦ и максимальному накоплению продуктов его окисления. Образование сшитой ДНК зависело от концентрации ВД и дос-■ тигало максимума при его концентрации 5,0 • 10"® М. При экспонировании ДНК к продуктам окисления производных бензидина: ДМВД и ТМВД, имеющим метйльные заместители по 3 и 5 положениям (рис. I), образование сшитой ДНК наблюдается только с ВД и ДОЩП,. Полностью сшивается 100 % ДНК при концентрации ДЩД в 5 раз более высоких (10~4 М), чем для ВД, что свидетельствует о более высокой реакционной способности оксидангов ВД. Продукты пероксидазного окислени ТМВД не вызывали образование сшивок ДНК, хотя процесс его окисления идет в 1000 раз более эффективно, чем ВД (таблица 2), но, вероятно, четыре метильных заместителя вызывают стерические затруд-. нения при взаимодействии с ДНК и не позволяют образовать ковален-тные связи с ДНК по типу ДНК-БД^-ДНК. •

Таким образом, продукты пероксидазного окисления ВД и ДМВД проявляли ярко выраженную способность вызывать образование сшивок

Рис. I. Влияние времени пероксидазного окисления АА на процент сшивок ДНК;

I - вд, 2 - дмвд,' з - тмвд.

ДНК - ВД* - ДНК и ДНК - ДМЕЩ^ - ДНК. Эти аминобифенилн, как известно, являются сильными непрямыми канцерогенами. Продукты пероксидазного окисления ТМВД, имеющего метальные группы по 3 и 5 поло-.. Жениям, не способны вызывать химическую модификацию ДНК и проявлять генотоксические свойства при их пероксидазном окислении.

3. Влияние аминобифенилов на систему метаболизма чужеродных веществ. Индукция цитохрома Р-450 аминобифенилами.

Производные бензидина, третьи и пятые положения которых блокированы заместителями, не подвергаются окислению по этим положениям, затруднено их окисление и по 4 положению (таблица 2). Такие производные способны оказывать индуцирующее влияние на монооксиге-назную систему микросом печени, влиять на соотношение фсрм.цитохро ма Р-450 и за счет этого существенно менять тип окисления и скорость метаболизма аминобифенилов.Как видно из таблицы 3, удельное содержание цитохрома в^ в микросомах печени животных, получавших различные индукторы, менялось мало; Активность НАДФН-питохром Р-450 редуктазы несколько уменьшалось, а удельное содержание цитохрома Р-450 существенно возрастало. Бензидин и диметоксибензндии вызывали незначительное увеличение удельного содержания цитохрома Р-450, а МЩ и ШДЦ увеличивали его количество более чем в 3 и 2

раза соответственно.

' Таблица 3

Состав монооксигеназной системы макросом печени крыс при ; введении различных аминобифенилов

Индуктор ■ ■ в5 НАДФН-цит.с- ■ Р-450

редуктаза ■

•. нМ/мг белка мкмоль/мг белка нМ/мг белка

Микросомы 0,52 ± 0,02 , •ч107,0 ± 0,01 0,55 ± 0,01

контр, животных ■

0^3 ± 0,02 ~~ • 94,2 ¿!0,02 . ..... , 0,80 ± 0,03й

дмовд 0,58 - 0,02" 67,2 ± 0,02й 0,78 ± 0,04й

ДОНД 0,59 ± 0,02 74,4 ± 0,01* 1,78 ± 0,02х

ТМЩ 0,64 ± 0,02 105,0 ± 0,02х 1,18 ± 0,09х

х - достоверные отличия между контрольной и опытными группами

• Р> 0,05

Таким образом, бензидан и его производные проявляют свойства индукторов монооксигеназной системы,.что согласуется с представлениями' о индуцирующей способности галогенобифенилов. Важным являлось выяснение вопроса о каталитической активности макросом печени крыс, получавших различные аминобифенилы, по отношению к самим индукторам. В таблице 4 приведены скорости пероксидазного окисления бензидина и его производных микросомами печени крыс, получавших эти вещества 4 дня в дозе 100 мг/кг массы животного, а также очищенными-формами .цитохрома Р-450' и Р-450т, из печени крыс, ин-

О О

дуцарованных фенобарбиталом и Арохлором. Из таблицы видно, что введение животным БД приводит к резкому снижению, скорости.его пероксидазного окисления в расчете на цитохром Р-450. У животных, получавших Щ, удельное содержание цитохрома Р-450 несколько возросло (таблица 3), а падение скорости окисления БД связано с су- • щаственным изменением изоформ цитохромов Р-450 в пользу форм, имеющих низкую каталитическую, активность к этому субстрату. Такое предположение подтверждается сравнением скоростей окисления ЕЩ очищенными цитохромама Р-450. и Р-450„ (таблица 4) и свидетелъст-

• О В

вует о вероятной индукции ВД цитохрома Р-450.. Наибольший шщуци-

и

руиций эффект на систему микросомального окисления печени оказал

ДМЕЩ, при этом удельная активность микросом животных, получавших этот индуктор по отношению к ВД была равна активности-контрольных микросом. Это свидетельствует-о том,..ДМВД, вероятно, являемся индуктором смешанного. тип а.' "

Таблица 4 '

Пероксидазная активность микросом печени крыс, нолучавших различные аминобифенилы и очищенных цитохромов Р-450 ( Т/ х Ю"7 М/с/нМ Р-450)

Субстрат . Микросомы животных,получавших индуктор Цатохромы

для -. Контр. . ВД тощ лш тмвд Р-450„ Р-450в

окисления

ВД 27,3' 14,1* 24,1х 27,2 25,4 8,1 14,3

даовд 2,5 1,9* 2,2х 1,1* 1*6* 0,9 1,3

довд 7,5. 5,4* 7,7 4,0* 4,1* 1,8 3,3

ТМБД 6,3 3,6* 5, I* 1,5* 1,7* 2,2 4,3

Примечание: ж - достоверные отличия меяду контрольной и

опытными группами Р> 0,05. Таким образом, исследования эффективности окисления ряда ами-нобифенилов выявили существенные различия в их метаболизме. Эти отличия позволили предположить возможность проявления аминобифе-нилами свойств индукторов системы микросомального окисления. Действительно, БД и его производные вызывают индукцию ферментов системы микросомального окисления, тем самым резко меняя характер пероксидазного окисления За счет изменения состава форм цитохрома Р-450. . -

Реакции II фазы окисления аминобифенилов относят'к истинным реакциям детоксикации. Среди,них ключевую роль играют реакции конъюгации с глутатионом, катализируемые глутатионтраясферазой. Глутатион способен взаимодействовать с электрофильными метаболитами аминобифенилов как ферментативным, так и неферментативным путем и ингибировать процесс пероксидазного окисления бензидина и его производных. В связи с этим, представляло интерес изучить влияние заместителей в молекуле производных бензидина на особенности взаимодействия продуктов их пероксидазного окисления с восстановленным глутатионом. На рис. 2 показан ингибирующий эффект

каталитической активности ПХ при окислении; v I Щ, 2 - ДМДД, 3 - ДМОВД, 4 - .ТМЩ

-на.процесс пероксидазного окисления ВД.и его производных. Глутагион .эффективно, тормозил процесс окисления БД и- ДЛВД. Наличие двух метоксизаместателей (ДМОЩ) и четырех метальных (ШЕД) у производных бензидина приводит к.-неспособности продуктов их пероксидаэного окисления взаимодействовать с gsh , хотя эффективность пероксидазного окисления.с введением .этих заместителей резко возрастает. Были сняты 'зависимости.скорости .окисления БД от их исходных концентраций в присутствия различных концентраций восстановленного глутаа'иона. Их анализ показывает,-, что ингибирование' процесса окисления бензидина носит конкурентный характер. Константа ингибирования для Щ составила 9х1ЕГ° М, а для ДМВД К; =1,02х 10"^ М. Для остальных субстратов ингибирование восстановленным глутатионом не наблюдалось. Полученные результаты свидетельствуют о том, что реакция неферментативного взаимодействия восстановленного глугатиона с катион-радикалами и'другими электрофильными

тродукташ пероксидазного окисления ашнобифенилов определяется характером и количеством заместителей в молекуле ЗД. .

Был определен уровень ®зн и изучётта активность ряда ферментов, определяющих его уровень в клетке. Интоксикация животных Щ приводила к ноникешЬ сэн в" 3 раза (таблица 5), Такое снижение объясняется высокой 'эффективностью ег.о ферментативного и нефермен-гзглвного взаимодействия с продукта!® окисления ЕЩ. Кроме того, Щ 1рояпил индуцирующее действие на НАДФН-глутатионредуктазу, повысив эе. активность в 2 раза и глутатионтрансфераэу, активность которой возрасла на 60 %.

Таблица 5

Активность глутатионзависимых ферментов печени крыс, получавших аминобифенилы

Яндуктор СВН Глутатион- Глутатион- Глутатион-

ЙДЦФН редук- трайсфераза пероксидаза

таза

нглоль/гусг мкмоль/мин/мг мкмоль/мин/мг мкмоль/мин/мг

белка белка белка белка

контроль' 96,3 ± 25,8 13,7 ± 0,7 125,3 ± 4,8 3,81 ± 0-,7

вд 32,0 ± 4,9х 26,1 ± 1,5я 203,8 ± 8,3х 3,73 ± 0,4

ЦМЩ 1050 ± 281,0й 29,4 ± 1,2х 202,0 ± 20,8я 2,37 ± 0,2

ЦМОВД 814,0 ± 62,0х 34,9 ± 1,0х 279,0 ± 15,9х 2,0 ± 0,1

ж - достоверные отличия медцу контрольной и. опытными группами

. Р> 0,05

Суммируя полученные результаты по действию ЕД на биохимические защитные системы (таблицы 3, 4, 5), необходимо отметить, что под °го влиянием в печени не происходит существенного изменения в системе микросомального окисления, определяющей I фазу метаболизма этого ксенобиотика. В ходе II фазы БД резко, снижает антл онсчдгчитнип статус клетки за счет уменьшения уровня ЮН , при это»; чабдодэзтея индукция ферментов II фазы метаболизма - фазы де-тогопкаллн, чго должно приводить к повышению устойчивости к ток-'••"Т'ггу ;гр"'оттп'! этого канцерогена.

1, Рсчлга УЖ от псппвяаешй етитаокспдантшш вещества

г[рз~л..тяг""\"л-'л де-'гстр;'я рвш&погешч/г .^пс '

g

«

о

ts*.

50

1,0 ■ 2,0 [эномеланин] , мг/мл Рис. 3. ,Влияние эномеланина на процент сшивок ДНК, . образующихся при пероксидазном окислении ВД тических ашнов является поиск ингибиторов канцерогенеза.' Нами были изучены серусодержащии антиоксидант - глутатион, органические кислоты - ванилиновая и п-оксибензойная и меланины - эномеланин из культурных сортов винограда и МЩЩа - гидролизат мяса мидий. Показано ингнбирущее влияние восстановленного глутатиона на повре ждение ДНК, вызванного продукта!«® пероксидазного окисления Щ. Высокая внутриклеточная концентрация gsh должна служить.хорошим протектором от мутагенного действия ВЦ- При этом производные ВД -ДМ01Д и.ДЩД вызывают повышение уровня gsh в печени крыс, получавших эти канцерогены почти в 10 раз (таблица 4). Влияние ванилиновой кислоты и п-ОЖ на процесс пероксидазного окисления 'ВД и других аминобифенилов имеет много общего. Наиболее эффективно этими кислотами ингибируется процесс пероксидазного окисления ВД. Окисление ТМВД практически не ингибируется исследуемыми органическими кислотами. Значительный практический интерес в плане антиканцерогенной активности вызывают меланины, полученные из доступного растительного-или животного сырья. На рис. 3 показана зависимость уменьшения процента сшитой ДНК фага л от концентрации эномеланина в реакционной смеси. Эномеланин практически полностью предотвращал повреждения ДНК продуктами окисления ВД при концентрации 2,0 мг/мл. Аналогичное действие оказывал и препарат ЖПКа, представляющий собой- продукт кислотного гидролизата мяса мидии., в сос-

тав которого входят аминокислоты, амины, белки, меланины с № 10-15 х Ю-4. В условиях нашего эксперимента он полностью снимал сшивки ДНК-ДНК фага А , вызванные продуктами пероксидазного окисления. Щ.

Полученные нами результаты по действию восстановленного глу-татиона, органических кислот и меланинов различной природы на процесс повреждения ДНК оксиданТами бензидина свидетельствуют о высоких хемозащитных свойствах этих веществ. Представляется перспективным дальнейшее исследование свойств меланинов, выделенных из растительного и животного сырья при поиске адаптогенов Для защиты от химического канцерогенеза, вызванного аминобифениламй.' .

Анализ полученных экспериментальных данных и сопоставление их с имеющимися в литературе сведениями позволяет сделать'следующие выводы: т

1. При пероксидазном окислении канцерогенов - бензидина и его производных - 3,3^-диметилбензидина и 3,3^-диметоксибензидина образуются метаболиты, вызывающие повреждения ДНК в виде ее межмолекулярных сшивок. Пёроксидазные оксйданты неканцерогенного*З.З'.Б.Б^-тетраметилбензидина не проявляют подобных свойств,'

2. Эффективность пероксидазного катализа при введении в третьи положения молекулы бензидина двух метоксигрупп возрастает в 1,7 -раза, двух метальных групп - в 3,7 раза и четырех метальных групп

в третьи и пятые положения в 8,3 раза. При окислении метальных и метоксипроизводннх бензидина гемоглобином, цитохромами Вд й Р-450, микросомами печени эффективность.катализа снижается«.

3. По своей каталитической активности при пероксидазном окислении бензидина гемопротеины расположены в следующий ряд: пероксидаза> гемоглобин> цитохром Р-450?-цитохром вд. • 1

4. Восстановленный глутатион является- эффективным ингибитором пероксидазного окисления аминобифенилов, способным предотвращать повреждения ДНК их оксидантами.

5. Эномеланин из культурных сортов винограда эффективно инги-Зирует образование ме.таолекулярных сшивок ДНК продуктами перокси-¡тазногб окисления бензидина.

6. Интоксикация белых беспородных крыс бензидином и его проид-роднют! в дозе 100 от/кг массы тела вызывает индукцию монооксиге-лезиов системы печени. Наиболее сальным индуктором ферментной слс-гег.п.т окисления чуяэродннх веществ является З.З-даметилбензидин.

7. По пгду!Е1Р7,-щеглу действию на глутатионтрансферазу печени

белых беспородных крыс ашшобифенилы расположены в следующий ряд 3,З-даметоксибензидин > 3,З-диметилбензидин > бензлдин.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

I. Курченко В.П., Семак И .В., Кульба A.M., Ишаил И. Определение генотоксичности различных химических веществ на основе мониторинга повреждений плазмидной ДНК. // Эколого-генетическый мониторинг, .состояния окружающей среды: Мат.секции. - Караганда,' .. 1990. С. 70. ,■. „ ■:

,. 2. Исмаил И., Семак И.В., Кульба A.M., Курченко В.11. Влияние ряда адаптогенов на повреждения ДНК продуктами окисления канцерм нных. аминобифенилов. // Эколрго-генетический мониторинг состояния окружающей среды : Мат. секции, - Караганда, 1990. С. .58.

3. Семак И.В., Курченко В.П., Исмаил И. Молекулярные подходь к определению канцерогенности аминобифенилов и других химических веществ // Биохимия опухолевой клетки: Тез. докл. Всесоюз. симп. Минск, 1990.. С. I3I-I32. .>■..•

4. Курченко В.П., Гавриленко Н.В., Исмаил И., Пикулев А.Т. Кинетика окисления бензидана и,его производных с участием различных гемопротеинов.// Вестник НУ. Сер. 2. - 1991„ - С. 28-31.

■ 5. Курченко В.П., Пронская И.В., Исмаил И. Роль канцерогенных аминобифенилов в дифференцировке гепатоцитов // Вопр. мед. химии. - 1991. - Т. 37, вып. 6. - С. 50-52. " ■ ■

6. Pikulev А.Т., Kurchenko У.P., Ismahil I. The role of he-ibopxoteineB in ША adducts formation at peroxidase oxidation,of number aminobiphenyls with decreasing carcinogenecity // 7-th international conference "Biochemistry, biophysics of cytochrome P-450j structure and function, biotechnological and ecological as peers. - Moscow, .1991. P. 123. ■ ' yr '