Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль нейропептидов в бульбарных механизмах регуляции дыхания

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль нейропептидов в бульбарных механизмах регуляции дыхания"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ИНЮШКИН Алексей Николаевич

РОЛЬ НЕЙРОПЕПТИДОВ В БУЛЬВАРНЫХ МЕХАНИЗМАХ РЕГУЛЯЦИИ ДЫХАНИЯ

03.00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

МОСКВА 1998

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Самарского государственного университета

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: доктор биологических наук, профессор С.А. Чепурнов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор М.Г. Айрапетянц

доктор биологических наук, профессор Н.С. Попова

доктор биологических наук P.C. Винницкая

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: НИИ нормальной физиологии имени П.К. Анохина РАМН

Защита состоится 7j.6>4-, ¿f^P в_в Большой Биологической

аудитории на заседании Диссертационного совета Д.053.05.35 Биологического факультета МГУ им. Ломоносова (119899, Москва, Воробьёвы горы, МГУ, Биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 7Q "___ 1998 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Физиологическая и нейрохимическая организация центральной регуляции дыхания остаётся одной из актуальных проблем физиологии. Современный уровень развития экспериментальной электрофизиологической техники сделал возможным глубокое изучение функциональных свойств дыхательных нейронов in vivo и in vitro, позволил вплотную подойти к пониманию клеточных и субклеточных механизмов, являющихся основой дыхательной ритмики (Haji et al., 1996; Champagnat & Fortin, 1997; Ramirez et al., 1997; Richter et al., 1997). Вместе с тем, многие ключевые вопросы структурно-функциональной организации дыхательного центра и принципы его деятельности остаются дискуссионными, слабо изученными.

В последнее время особое внимание уделяется исследованию нейрохимического обеспечения бульбарных механизмов регуляции дыхания, изучению участия нейромедиаторов и нейромодуляторов в регуляции активности дыхательных нейронов и их функционального взаимодействия в пределах дыхательного центра, что является одной из основ генерации респираторного ритма (Bonham, 1995; Bianchi et al., 1995; Schmid et al., 1996; Bayliss et al., 1997; McCrimmon et al., 1997).

В рамках проблемы нейрохимических механизмов регуляции дыхания особый интерес представляет изучение роли нейропептидов. Впервые на кафедре физиологии человека и животных МГУ исследовали роль тиролиберина в механизмах восстановления дыхания и нормализации мозгового кровообращения, его антигипоксическое действие (Ашмарин и соавт., 1989, 1992). В.настоящее время выявлена способность опиоидных пептидов, субстанции Р, соматостатина, бомбезина,

тиролиберина, брадикинина, холецистокинина вызывать разнообразные изменения дыхания при системном введении (Воинов, Лосев, 1985; Сербенюк и соавт., 1988; Yamamoto et al., 1986; Bianchi et al., 1995; Bonham, 1995; Ponchon et al., 1995, Walker & Jennings, 1996). Эти данные были подтверждены иммуногистохимическими и ауторадиографическими

исследованиями, в которых показана высокая концентрация нейропептидов и плотность рецепторов к ним в бульбарных дыхательных ядрах (Handbook of Chemical Neuroanatomy, 1990), что свидетельствует о возможности непосредственного участия эндогенных нейропептидов в деятельности дыхательного центра в норме и патологии.

Несмотря на большие успехи нейрохимии и патофизиологии регуляторных пептидов (Ашмарин и соавт., 1978, 1986; Судаков, 1981, 1997; Бадиков, 1982; Крыжановский, Глебов, 1983; Гомазков, 1990, 1997; Зилов, 1992; Айрапетянц, 1992, 1996; Адрианов, Попова, 1997), многие вопросы нейрохимической организации дыхательного центра ещё требуют исследования. Доказана ведущая роль сосуществования нейропептидов с классическими медиаторами в организации нервных центров и их эффективной функции (Ашмарин, Каменская, 1988), но в физиологии дыхания отсутствуют сведения о сравнительной роли различных отделов дыхательного центра в реализации респираторных эффектов нейропептидов, и о конкретных механизмах их участия в регуляции дыхания. В этом плане особенно перспективным представляется исследование механизмов действия нейропептидов на дыхательные нейроны с использованием современного метода петч-клемпинга. Это позволяет изучить непосредственное влияние нейропептидов на формирование мембранного потенциала клетки и ионные токи (Hille, 1992).

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось:

изучение роли и основных физиологических механизмов участия нейролептидов в регуляции дыхания на уровне бульбарного дыхательного центра, регуляции активности нейронов различных ядерных образований дыхательного центра и хемочувствительных структур вентральной поверхности продолговатого мозга;

изучение возможных механизмов регуляции ионных токов дыхательных нейронов нейропептидами in vitro.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Произвести сравнительный анализ респираторных эффектов нейролептидов (тиролиберин, тахикинины, опиоидные пептиды) при локальном воздействии на функционально-различные отделы дыхательного центра.

2. Определить, в каких дозах и при каких концентрациях эффективны тиролиберин, тахикинины, лейцин-энкефалин, p-эндорфин, морфин в случае их микровведений в ядра дыхательного центра или аппликации к вентральной поверхности продолговатого мозга; выявить характер дозо-зависимых эффектов.

3. Изучить участие нейролептидов в реализации рефлекса Геринга-Брейера на уровне ядра солитарного тракта, влияние нейролептидов на вентиляторную реакцию, вызываемую гипоксией.

4. Исследовать изменения паттерна дыхания и электрической активности одиночных нейронов дыхательного центра, возникающие при воздействии нейролептидов на вентральную поверхность продолговатого мозга. Изучить влияние прямого воздействия нейролептидов на центральные хеморецепторы на вентиляторную чувствительность к гиперкапнии.

5. На переживающих срезах продолговатого мозга изучить активность клеток дыхательных ядер in vitro, изменения их

мембранного потенциала и ионных токов под влиянием нейропептидов, обладающих респираторной активностью при системном и локальном воздействии.

Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное исследование респираторных эффектов, возникающих при воздействии тиролиберина, тахикининов и опиоидных пептидов на функционально-различные отделы дыхательного центра. В структурах дыхательного центра установлена преимущественная роль МК-|-рецепторов по сравнению с ЫИ^-рецепторами к

тахикининам. Преимущественный агонист ц-рецепторов (морфин) наиболее активен при воздействии на ядро солитарного тракта, а агонист 5-рецепторов (лейцин-энкефалин) - при воздействии на комплекс пре-Бётцингера. Конкретные особенности дыхательных реакций определяются не только действующими нейропептидами, но и функциональными свойствами отдела дыхательного центра, подвергающегося воздействию.

Впервые продемонстрирована эффективность тиролиберина, тахикининов и опиоидов при применении их в ультра-малых дозах и концентрациях. Эти данные в совокупности со сведениями о пептидергической нейрохимической организации дыхательного центра предполагают участие эндогенных нейропептидов в регуляции дыхания.

Получены новые доказательства модулирующих влияний нейропептидов на специфическую афферентацию, поступающую в ядро солитарного тракта от рецепторов растяжения лёгких и периферических хеморецепторов. Установлено, что модуляция нейропептидами классического рефлекса Геринга-Брейера на уровне ядра солитарного тракта лежит в основе механизма _ регуляции глубины дыхания.

Впервые в срезах продолговатого мозга с помощью техники петч-клемпинга исследованы мембранный потенциал, спонтанная активность, выходящий калиевый ток нейронов дорсальной дыхательной группы и комплекса пре-Бётцингера. Установлено, что тиролиберин и лейцин-энкефалин вызывают изменение мембранного потенциала и уровня спонтанной активности нейронов. Доказано, что в основе активирующего действия тиролиберина лежит его способность частично ингибировать калиевый А-ток.

Обнаружено, что наряду с клеточными образованиями дыхательного центра важную роль в реализации влияний нейропептидов на дыхание играют поверхностные вентролатеральные структуры продолговатого мозга. Доказано, что уровень концентрации нейропептидов в данной области (кровь и цереброспинальная жыдкость) существенно влияет на активность нейронов дыхательного центра и определяет изменения центральной хемочувствительности.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты проведённого исследования позволяют расширить и конкретизировать научные представления о пептидергической организации бульбарного дыхательного центра и центральных (медуллярных) хеморецепторов дыхания. Сведения о роли опиоидных пептидов, тиролиберина и тахикининов в деятельности дыхательного центра важны для понимания нейрохимических закономерностей генерации дыхательного ритма, особенностей формирования специфической механо- и хемоафферентации, поступающей к дыхательному центру, раскрывают механизмы обработки этой афферентации. Впервые на нейронах бульбарного дыхательного центра получены данные о мембранно-ионных механизмах действия нейропептидов, что позволяет внести теоретически значимые уточнения в общепризнанные в нормальной

физиологии схемы центральной регуляции дыхания. Обнаруженные особенности центральной регуляции дыхания могут быть использованы для нового обоснования практического применения нейропептидов при дыхательных расстройствах, возникающих вследствие гипоксии, кровопотери, нарушений мозгового кровообращения, в восстановлении регуляции дыхания в практической реанимации, при синдроме внезапной смерти новорожденных при асфиксии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Среди структур бульбарного дыхательного центра наиболее важную роль в реализации респираторных регуляторных влияний нейропептидов играют нейроны ядра солитарного тракта и комплекса пре-Бётцингера.

2. На уровне мембранно-ионных отношений нейропептиды регулируют активность клеток, расположенных в структурах дыхательного центра за счёт изменения мембранного потенциала и калиевого А-тока.

3. Важным системным механизмом пептидергической регуляции дыхания является модуляция тиролиберином, тахикининами, опиоидными пептидами чувствительности нейронов дыхательного центра к афферентации, поступающей от рецепторов растяжения лёгких и периферических хеморецепторов, что проявляется в соответствующих изменениях рефлекса Геринга-Брейера и вентиляторного ответа на гипоксию.

4. Нейропептиды включаются в рефлекторную регуляцию активности нейронов дыхательного центра, воздействуя на поверхностные ростровентролатеральные структуры продолговатого мозга. Тахикинины и опиоидные пептиды способны модулировать уровень центрального респираторного

хемочувствительного драйва и, тем самым, изменять выраженность вентиляторного ответа на гиперкапнию.

Аппробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на VI Всесоюзной конференции по физиологии вегетативной нервной системы (Ереван, 1986); на VII научной конференции "Центральная регуляция вегетативных функций" (Тбилиси, 1987); на XV съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П. Павлова (Кишинёв, 1987); на Поволжской конференции "Физиология вегетативной нервной системы" (Куйбышев, 1988); на VI Всесоюзном симпозиуме "Физиология медиаторов. Периферический синапс" (Казань, 1991); на I и II Международных симпозиумах "Механизмы действия сверхмалых доз" (Москва, 1992, 1995); на XVI (учредительном) съезде Всероссийского физиологического общества им. И.П. Павлова (Пущино, 1993); на республиканской научной конференции физиологов, посвящённой 95-летию со дня рождения М.В. Сергиевского (Самара, 1993); на III, IV, V и VII съездах Европейского Нейропептидного Клуба (Кембридж, Великобритания, 1993; Страсбург, Франция, 1994; Лунд, Швеция, 1995; Марбург, Германия, 1997); на симпозиуме Европейского Нейропептидного Клуба "Neuropeptides in the Peripheral and Central Nervous System" (Бад Наухайм, Германия, 1994); на Международном симпозиуме "Peptide Receptors" (Монреаль, Канада, 1996); на 11 Международном симпозиуме по регуляторным пептидам (Копенгаген, Дания, 1996).

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 298 страницах машинописного текста, иллюстрирована 47 рисунками и 10 таблицами. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, шести глав с описанием результатов экспериментальных исследований, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Список

цитируемой литературы включает 53 отечественных и 272 зарубежных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 380 взрослых белых крысах, наркотизированных этаминалом натрия или уретаном, и на 47 срезах продолговатого мозга крыс-самцов Wistar.

В экспериментах на наркотизированных крысах производили трахеостомию, катетеризировали правую общую сонную артерию для регистрации артериального давления. Голову животного закрепляли в стереотаксическом приборе и осуществляли доступ к дорсальной или вентральной поверхности продолговатого мозга.

Для локального воздействия нейропептидов на структуры дыхательного центра использовали метод микроинъекций. Растворы вводили в мозг с помощью микрошприца МШ-1 через стеклянную микропипетку с диаметром кончика около 20 мкм. Инъецируемые вещества растворяли ex tempore в искусственной цереброспинальной жидкости и вводили в объёме 50 нл со скоростью 2.5 нл/с под контролем бинокулярного микроскопа. Для исследования зависимости доза-эффект использовали 10-14-1 о-4 М растворы нейропептидов. С целью контроля локализации точки микроинъекции в конце эксперимента в ту же точку вводили 50 нл 0.2% раствора бромфеноловой синьки. По окончании опыта мозг фиксировали в формалине и на гистологических срезах определяли локализацию окрашенной метки. Для воздействия на вентральную поверхность продолговатого мозга использовали метод аппликаций.

Показатели дыхания определяли по спирограмме, ЭМГ диафрагмы и наружных межрёберных мышц. Регистрацию внешнего дыхания осуществляли с помощью миниатюрного спирографа с

фотооптическим датчиком перемещений. Величину дыхательного объёма переводили в систему ВТРБ. ЭМГ диафрагмы и наружных межрёберных мышц (в межреберье справа) регистрировали с помощью игольчатых электродов, биполярно. Сигнал от электродов подавали на усилитель биопотенциалов, затем с помощью ИС-интегратора с постоянной времени около 80 мс получали интегрированные производные ЭМГ. Среднее артериальное давление регистрировали с помощью индукционного датчика. Частоту сердечных сокращений определяли по ЭКГ.

Рефлекс Геринга-Брейера изучали с помощью инфляционного теста. Производили раздувание лёгких четырьмя уровнями избыточного давления : 2.5, 5.0, 7.5 и 10.0 см вод.ст. Для каждого уровня давления определяли величину "нормализованной" продолжительности выдоха: ТЕ норм. = ТЕ ра3д. / ТЕ исх., где ТЕ разд.- максимальная продолжительность выдоха при раздувании лёгких, ТЕ исх- продолжительность выдоха до раздувания лёгких.

Выраженность вентиляторного ответа на нарастающую гипоксию и гиперкапнию определяли с помощью теста возвратного дыхания. В первом случае систему возвратного дыхания заполняли атмосферным воздухом и соединяли с поглотителем СС>2, а парциальное давление кислорода в системе регистрировали с помощью газоанализатора АК-10. Для изучения ответа на нарастающую гиперкапнию систему возвратного дыхания предварительно заполняли чистым кислородом, а парциальное давление углекислого газа в системе регистрировали с помощью газоанализатора АУГ-02. На основании полученных данных строили аппроксимальные графики линейной зависимости вентиляции лёгких от парциального давления кислорода или углекислого газа в

системе возвратного дыхания и по наклону графика судили о выраженности вентиляторной реакции.

Внеклеточную регистрацию электрической активности дыхательных нейронов осуществляли с помощью стеклянных микроэлектродов, заполненных ЗМ раствором хлорида натрия. Сигнал с микроэлектрода через усилитель биопотенциалов подавали на двухканальный осциллограф С1-18, снабжённый фотооптическим регистратором ФОР-2. Для идентификации типа дыхательных нейронов одновременно с помощью термосопротивления МТ-54М, встроенного в трахеостомическую канюлю, регистрировали внешнее дыхание.

В ходе экспериментов регистрировали ректальную температуру и поддерживали её на уровне 37 + 0.5 °С.

В экспериментах in vitro использовали крыс-самцов Wistar в возрасте 3-4 недели 45-65 г веса. Крыс декапитировали, быстро выделяли ствол мозга и помещали его в охлаждённую до 1-3 °С искусственную цереброспинальную жидкость, содержащую 124 мМ Na CI, 5 мМ KCI, 1.2 мМ NaH2P04, 1.3 мМ MgS04, 1.2 мМ CaCI2, 26 мМ №НСОз, 10 мМ глюкозы (рН 7.4) и непрерывно продуваемую карбогеном. С помощью микротома готовили 200 мкм поперечные срезы продолговатого мозга и инкубировали их в растворе того же состава при температуре 35 °С в течение часа, а затем при комнатной температуре до начала регистрации. Для регистрации срезы помещали в камеру и перфузировали искусственной цереброспинальной жидкостью, насыщенной карбогеном, со скоростью 1.5 мл/мин. Регистрацию осуществляли при температуре 37 °С. Нейрон для регистрации выбирали под бинокулярным микроскопом Zeiss Axioscope, снабжённым видеокамерой Newvicon С2400-07-С (Hamamatsu, Япония). Для лучшей визуализации мелких деталей срез освещали инфракрасным светом с максимальной

длиной волны 780 нм, а затем с помощью видеокамеры и компьютерной программы Screen Machine II (Fast Multimedia AG, Германия) получали изображение на экране монитора и, при необходимости, сохраняли в виде файла для последующей обработки.

Регистрацию осуществляли в "whole-ceir-конфигурации техники петч-клемпинга. Использовали усилитель RK-300 (Bio-logic Science Instruments, Франция). Генерацию стимулирующего сигнала и обработку данных осуществляли с помощью компьютерной программы IS02 Multitasking-Patch-Clamp-Software (MFK Computer, Германия). Регистрирующие электроды (сопротивление 2-5 мом) готовили из боросиликатного стекла и заполняли раствором, содержащим 140 мМ KCl, 2 мМ M9CI2, 1 мМ СаС^, 10 мМ EGTA, 2.

мМ МдАТР, 0.2 мМ NaGTP, 10 мМ HEPES (pH 7.25).

После достижения "whole-ceH''-конфигурации в перфузионный раствор добавляли 0.5 мкМ тетродотоксина с целью блокады натриевого тока. Для выделения быстрого инактивируемого компонента выходящего калиевого тока использовали тетраэтиламмоний в концентрации 5 мМ, а для блокады калиевого А-тока - 4-аминопиридин в той же концентрации.

В работе использованы следующие нейропептиды, агонисты и антагонисты пептидергических рецепторов: тиролиберин (синтезирован в НИИ экспериментальной эндокринологии и химии гормонов, Москва и препарат фирмы "Sigma"), субстанция Р, кассинин, ß-эндорфин (синтезированы в лаборатории проф. О.А.Каурова и М.П. Смирновой НИИОЧБ, Санкт-Петербург), лейцин-энкефалин (синтезирован в НИИ экспериментальной эндокринологии и химии гормонов, Москва и пре.парат фирмы "Sigma"), морфин и налоксон ("Sigma").

Статистическую обработку полученных результатов производили с помощью t критерия Стьюдента для оценки различий средних значений. При оценке выраженности вентиляторных реакций на гипоксию и гиперкапнию использовали метод регрессионного анализа. Для статистической обработки и построения графиков пользовались программным пакетом Sigma Plot (Jandel Scientific, США). Все данные представлены как средние значения + ошибки средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

^Сравнительный анализ респираторных эффектов нейропептидов при локальном воздействии на функционально-различные отделы дыхательного центра.

У наркотизированных крыс исследованы реакции внешнего дыхания, интегрированной активности инспираторных мышц, среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений на микроинъекции 1(И4-1СМ М тиролиберина, тахикининов (субстанция Р, кассинин), опиоидных пептидов (лейцин-энкефалин, ß-эндорфин) и морфина в область локализации дорсальной дыхательной группы, рострального и каудального отдела вентральной дыхательной группы, комплекса Бётцингера и комплекса пре-Бётцингера. Установлено, что тиролиберин и тахикинины стимулируют, а опиоидные пептиды и морфин угнетают дыхание. Наиболее выраженные реакции дыхания возникали при воздействии нейропептидов на область дорсальной дыхательной группы и комплекс пре-Бётцингера (рис.1). При этом некоторые пептиды (тиролиберин, субстанция Р, лейцин-энкефалин, морфин) вызывали достоверные изменения уже в концентрации 10-"14-10-12.М.

1 2 34 567

Рис.1. Сравнительная выраженность респираторных реакций на микроинъекции 10-6 М нейропептидов в различные отделы дыхательного центра. ДДГ- дорсальная дыхательная группа, рВДГ, кВДГ- ростральный и каудальный отделы вентральной дыхательной группы, КПБ-комплекс пре-Бётцингера, КБ- комплекс Бётцингера. У^- дыхательный объём (мл), Г частота дыхания (мин-1). 1-контроль, 2- тиролиберин, 3- субстанция Р, 4- кассинин, 5- морфин, 6- лей-энкефалин, 7- (3-эндорфин. Различия с контролем обозначены: *р<0.05; **р<0.01; ***р<0.001.

Дыхательные реакции при воздействии нейропептидов на область ядра солитарного тракта характеризовались преимущественным изменением дыхательного объёма и соответствующими изменениями амплитуды интегрированной активности инспираторных мышц. Микроинъекции нейропептидов в область крмплекса пре-Бётцингера вызывали преимущественное изменение частоты дыхания и длительности дыхательных фаз. При этом инъекции концентрированных растворов тиролиберина и субстанции Р вызывали появление особого "диспноэтического" паттерна дыхания, характеризовавшегося неустойчивостью большинства респираторных параметров и появлением тонической активности на ЭМГ диафрагмы. 10-6-10-4 М растворы наиболее активного опиоидного пептида лейцин-энкефалина вызывали остановку дыхания.

Отмечено, что изменения глубины дыхания, возникающие при воздействии нейропептидов на структуры дыхательного центра обусловлены соответствующими изменениями активности диафрагмы и наружных межрёберных мышц. При этом изменения активности наружных межрёберных мышц были более выраженными и возникали, как правило, под действием менее концентрированных растворов нейропептидов. Активность диафрагмы, напротив, отличалась относительной стабильностью.

Обнаружены определённые различия в выраженности и характере респираторных эффектов нейропептидов, входящих в состав одного семейства. В ■ частности, установлено, что преимущественный агонист ЫК-|-рецепторов субстанция Р имеет

более выраженную активность на уровне структур дыхательного центра, чем преимущественный агонист ЫКг-рецепторов кассинин.

Преимущественный агонист опиатных ц-рецепторов морфин был наиболее активен при воздействии на ядро солитарного тракта,

преимущественный опиоидный 5-агонист лейцин-энкефалин - при воздействии на комплекс пре-Бётцингера. ß-эндорфин демонстрировал слабую респираторную активность. Микроинъекции в структуры дыхательного центра 10 мкг антагониста опиатных рецепторов налоксона вызывали рост лёгочной вентиляции и эффективно предотвращали респираторные эффекты опиоидных пептидов и морфина.

Таким образом, характер и выраженность реакций паттерна дыхания при воздействии нейропептидов на структуры дыхательного центра определяются как действующим пептидом и его концентрацией, так и функциональными свойствами структуры, подвергающейся воздействию. Из литературы известно об особой функциональной значимости отделов дыхательного центра, проявивших наибольшую чувствительность к воздействию нейропептидов. Данные исследований in vitro и in vivo свидетельствуют о непосредственном участии нейронов комплекса пре-Бётцингера в механизмах генерации дыхательного ритма (Ramirez & Richter, 1996; Greer et al., 1996). Особенностью дорсальной дыхательной группы крысы является крайне небольшое количество бульбоспинальных нейронов (Portillo & Nunez-Abades, 1992; Dobbins & Feldman, 1994), в связи с чем основной функцией этого образования считается восприятие и первичный анализ афферентных сигналов. Особую важность для деятельности дыхательного центра представляет поступающая в эту область специфическая механо- и хемоафферентация.

2. Влияние микроинъекций нейропептидов в ядро солитарного тракта на рефлекс Геринга-Брейера.

В область ядра солитарного тракта поступает афферентация от рецепторов растяжения лёгких (Bonham & McCrimmon, 1990),

благодаря которой реализуется рефлекс Геринга-Брейера. Поэтому, изменения дыхания, наблюдающиеся при микроинъекциях нейропептидов в ядро солитарного тракта могут объясняться модуляцией данного рефлекса.

Проведённые исследования показали, что микроинъекции нейропептидов в данную область ствола мозга вызывают изменения рефлекса Геринга-Брейера (рис.2). В частности, тиролиберин и субстанция Р в концентрации 10-12-10-4 М вызывали угнетение рефлекса. Аналогичное влияние оказывал 10-4 м кассинин. Морфин и лейцин-энкефалин в концентрации 10-8-10-4 М усиливали проявление рефлекса Геринга-Брейера. Антагонист опиатных рецепторов налоксон введённый в ядро солитарного тракта в дозе 10 мкг вызывал угнетение рефлекса.

Приведённые данные свидетельствуют о том, что тиролиберин, тахикинины и опиоидные пептиды модулируют рефлекс Геринга-Брейера на уровне ядра солитарного тракта. Полученные результаты дают объяснение своеобразию изменений паттерна дыхания, возникающих при воздействии на данную область. Модулирующее влияние нейропептидов на рефлекс Геринга-Брейера приводит к соответствующим изменениям глубины дыхания, слабо отражаясь на параметрах дыхательного ритма. Относительная стабильность последних, очевидно, объясняется тем, что нейроны дорсальной дыхательной группы не принимают непосредственного участия в дыхательном ритмогенезе (В'1апс1"и е1 а1„ 1995).

ТЕ, norm. А ТЕ.

40 40

30 к 10"1 м 30

20 20

10 10'" м м 10

0 • 0

2,5 5,0

7,5 10,0

р.пп. (cm Н20)

В

10" м

2,5 5,0 7,5 10,0 «W«nH20)

ТЕ, norm.

40

30

20 •

10 ■

0 •

2,5 5,0

7,5 10,0 P,na (<=m Н20)

Те, norm 40 30 20 10 0

D

2,5 5,0 7,5 10,0 Ртя. (cm Н20)

Рис.2. Влияние микроинъекций тиролиберина (А), субстанции Р (В), морфина (С) и налоксона р) в ядро солитарного тракта на рефлекс Геринга-Брейера. По оси абсцисс- давление раздувания лёгких, по оси ординат- нормализованная продолжительность выдоха, равная отношению максимальной длительности выдоха на фоне раздувания лёгких к длительности выдоха до раздувания. Обозначения на графиках: К- контроль; 10-12 м, 10-8 М и ю-4 м-концентрация пептидов в инъецируемом растворе; Н- 10 мкг налоксона.

-203. Влияние микроинъекций нейропептидов в ядро солитарного тракта на вентиляторную чувствительность к гипоксии.

Область ядра солитарного тракта является местом переключения афферентных проекций, поступающих в продолговатый мозг от периферических хеморецепторов (М|ТПп, 1997). Эти проекции играют важную роль в регуляции структурами дыхательного центра уровня вентиляции лёгких в соответствии с напряжением кислорода в артериальной крови, а также в реализации дыхательной реакции на гипоксию. Следовательно, определённая часть респираторных эффектов нейропептидов на уровне ядра солитарного тракта может быть обусловлена модуляцией чувствительности нейронов данной области к периферическому хемоафферентному драйву.

В контрольных наблюдениях нарастающая гипоксия вызывала закономерный рост лёгочной вентиляции. Зависимость вентиляции лёгких от парциального давления кислорода в системе возвратного дыхания аппроксимировалась уравнением линейной регрессии (рис.3). Микроинъекции субстанции Р в ядро солитарного тракта в концентрации 10-12-1 о-А м вызывали дозо-зависимое снижение выраженности вентиляторного ответа на гипоксию. Угнетение вентиляторной чувствительности к гипоксии наблюдалось также под действием кассинина, однако эффект данного пептида был менее выраженным и наблюдался лишь после микроинъекций 10-4 м раствора.

Микроинъекции тиролиберина и опиоидных пептидов в область ядра солитарного тракта не оказывали влияния на вентиляторную чувствительность к гипоксии.

Таким образом, тахикинины модулируют вентиляторную чувствительность к гипоксии на уровне ядра солитарного тракта. Ранее, с помощью иммуногистохимической техники, были

160 140 120 100 • 80 -60 40

А

120

Г = 0.73 ЮО

60

80

100

Г = 0.85 г = 0.96

г = 0.91 ?02

80

60

40

40

В

60

80

100

02

Рис.3. Влияние микроинъекций субстанции Р (А) и кассинина (В) в ядро солитарного тракта на выраженность вентиляторной реакции на нарастающую гипоксию. По оси абсцисс-парциальное давление кислорода в системе возвратного дыхания (мм рт.ст.), по оси ординат-вентиляция лёгких (мл/мин). Обозначения на графиках: К- контроль; 10'12 м, 10'8 М и 1СИ М-концентрация нейропептидов в растворе. Зависимость аппроксимировалась уравнением линейной регрессии вида: У| = а Рог + Ь. Коэффициент а, отражающий степень наклона линий регрессии, составил в контроле -0.88 + 0.04; при воздействии 10-12, 10"8 и Ю-4 М субстанции Р, соответственно, -0.66 + 0.06 (р<0.05), -0.42 + 0.08 (р<0.01) и -0.37 + 0.11 (р<0.05); при воздействии растворов кассинина той же концентрации, соответственно, -0.90 +_0.03, -0.85 + 0.02 и -0.77 + 0.02 (р<0.05). г- коэффициент линейной регрессии.

обнаружены проекции в ядро солитарного тракта от каротидного тела, содержащие субстанцию Р (Otsuka & Yoshioka, 1993). Кроме этого, продемонстрировано высвобождение данного пептида в области ядра солитарного тракта при гипоксии (Lindefors et al., 1986). Таким образом, есть все основания рассматривать тахикинины в качестве основных кандидатов на роль нейромедиаторов вентиляторного рефлекса на гипоксию на уровне интернейронов ядра солитарного тракта.

4. Мембранно-ионные механизмы действия нейропептидов в области бульбарного дыхательного центра.

Исследования выполнены на 23 нейронах вентролатерального отдела ядра солитарного тракта и 22 нейронах области комплекса пре-Бётцингера в срезах продолговатого мозга крыс-самцов Wistar.

В условии фиксации мембранного тока 52% нейронов ядра солитарного тракта и 82% нейронов в области комплекса пре-Бётцингера были спонтанно-активны, остальные охарактеризованы как "молчащие". Из 18 спонтанно-активных нейронов в области комплекса пре-Бётцингера 11 имели залповый паттерн, характерный для дыхательных нейронов in vivo, 7- тонический. В ядре солитарного тракта лишь 1 из 12 спонтанно-активных нейронов имел залповый паттерн активности, остальные характеризовались тонической активностью. Величина мембранного потенциала нейронов ядра солитарного тракта составила -66 + 2 мВ, нейронов области комплекса пре-Бётцингера -64 + 1 мВ.

Введение в перфузионный раствор Ю-8 М тиролиберина вызывало деполяризацию мембраны нейронов ядра солитарного тракта (7 + 1 мВ); деполяризация нейронов области комплекса пре-Бётцингера была более значительной (11 + 1 мВ). Другим эффектом

тиролиберина в данных условиях был рост спонтанной активности нервных клеток. Частота импульсной активности нейронов ядра солитарного тракта возросла с 3.3 + 2.0 до 7.9 + 1.9 с-"1. Под влиянием тиролиберина у двух "молчащих" нейронов данной области возникла тоническая активность. Частота импульсации нейронов области комплекса пре-Бётцмнгера возросла под действием тиролиберина с 5.6 + 1.0 до 9.7 + 1.4 с1. У нейронов с залповым паттерном активности наблюдалось значительное укорочение интервалов между началом соседних залпов (с 3.23 + 0.22 до 2.33 + 0.26 с-1).

Ю-6 М лейцин-энкефалин вызывал гиперполяризацию нейронов ядра солитарного тракта на 8 + 2 мВ и снижение частоты импульсации с 5.3 + 1.1 до 2.7 + 0.6 с-1. Гиперполяризация нейронов области комплекса пре-Бётцингера под действием 10"8 М лейцин-энкефалина составила 9 + 1 мВ, а частота импульсации снижалась с 4.8 + 0.7 до 2.6 + 0.3 с-1, причём у двух клеток наблюдался переход залповой активности в тоническую.

Поскольку нейропептиды вызывают изменение частоты спонтанной активности дыхательных нейронов in vivo (Bianchi et al., 1995), можно предполагать, что их эффект объясняется модуляцией быстрого инактивируемого компонкнта выходящего калиевого тока. Именно этот вид мембранного тока наиболее существенно влияет на продолжительность интервалов между потенциалами действия (Hille, 1992). Калиевые мембранные токи исследованы в 15 нейронах ядра солитарного тракта и 16 нейронах области комплекса пре-Бётцингера в условиях фиксации мембранного потенциала на уровне -80 мВ. Деполяризация мембраны до -40, 0 и +20 мВ вызывала появление выходящего калиевого тока, амплитуда которого прямо зависела от величины деполяризации. Применение специальных протоколов стимуляции с последующим

компьютерным дифференцированием и перфузия срезов 5 мМ тетраэтиламмонием позволили в 100% случаев выделить из общего выходящего тока быстрый инактивируемый компонент, который был охарактеризован как калиевый А-ток. Такое заключение сделано на основании следующих данных. Амплитуда этого компонента зависела от величины деполяризующего потенциала. Константа инактивации (т) при деполяризующем потенциале +20 мВ составила 11.4 + 3.0 мс, что примерно соответствует значению константы инактивации "классического" А-тока в нейронах ЦНС млекопитающих при физиологической температуре (Hsiao & Chandler, 1995; Beise et al., 1998; Inyushkin et al., 1998). Потенциалы 50% активации и 50% инактивации, вычисленные с помощью распределения Больцмана, составили -39.6 ±2.1 и -81.3 + 2.5 мВ. Эти значения также соответствуют величине потенциалов 50% активации и 50% инактивации А-тока при физиологической температуре. Наконец, быстрый инактивируемый ток в нейронах данной области на 78.6 + 6.3% (при деполяризующем потенциале +20 мВ) блокировался 5 мМ 4-аминопиридином.

Характер влияния тиролиберина на калиевый А-ток нейрона области комплекса пре-Бётцингера показан на рис.4. Все представленные на нём экспериментальные записи были сделаны в условиях перфузии среза 0.5 мкМ тетродотоксином и 5 мМ тетраэтиламмонием. Амплитуда и кинетика выходящего калиевого тока определялись величиной деполяризующего потенциала, а также зависели от препотенциала. Гиперполяризация мембраны до -110 мВ, предшествующая основному стимулу (а), активировала, наряду с А-током, и медленный неинактивируемый компонент выходящего калиевого тока (delayed rectifier). Последний активировался изолированно от А-тока при деполяризующем препотенциале -60 мВ (Ь). Путём компьютерного

Рис.4. Влияние аппликации 10"8 М тиролиберина на калиевый А-ток нейрона области комплекса пре-Бётцингера. Объяснение в тексте.

дифференцирования (а-Ь) получали кривые А-тока {1-5). Исходная величина А-тока (7) данного нейрона под влиянием тиролиберина уменьшалась более, чем в 2 раза (2), однако это уменьшение было обратимым и удаление нейропептида из омывающего раствора привело к полному восстановлению А-тока (3). 5 мМ 4-аминопиридин блокировал около 80% А-тока (4). 15-минутное отмывание среза от 4-аминопиридина позволило получить практически полное восстановление А-тока (5).

Наблюдения в условиях фиксации потенциала показали, что тиролиберин частично обратимо блокирует калиевый А-ток в нейронах ядра солитарного тракта и комплекса пре-Бётцингера. В то же время, воздействие лейцин-энкефалина не оказывало существенного влияния на амплитуду калиевого А-тока исследуемых нейронов. Можно предполагать, что действие лейцин-энкефалина связано с другими видами мембранных токов. Так, недавно в исследованиях на нейронной культуре было продемонстрировано модулирующее влияние данного нейропептида на функцию мембранных Са++-каналов (СагаЬеШ е{ а!., 1996; ТовеШ е\ а!., 1997).

5. Дыхательные эффекты аппликаций нейропептидов к вентральной поверхности продолговатого мозга.

Аппликации нейропептидов к участкам вентральной поверхности продолговатого мозга, расположенным ростролатеральнее корешков подъязычных нервов, вызывали дозо-зависимые изменения паттерна дыхания и электрической активности дыхательных нейронов.

10-12-10-4 М тиролиберин вызывал рост лёгочной вентиляции за счёт увеличения дыхательного объёма. Аппликации 10-4 м пептида дополнительно вызывали снижение частоты дыхания. Воздействие

10-5-10"4 М тиролиберина на вентральную поверхность продолговатого мозга приводило к росту активности большинства инспираторных нейронов (рис.5), причём в ряде случаев наблюдался переход залповой активности клеток в тоническую с учащением в инспирацию. Активность большинства экспираторных нейронов снижалась, однако в 18% случаев отмечался рост частоты импульсации экспираторных нейронов с возникновением тонического паттерна активности.

Аппликации тахикининов к вентральной поверхности продолговатого мозга также вызывали рост вентиляции лёгких. При этом большую активность проявляла субстанция Р, аппликации которой в концентрации Ю-Ю.ю-4 М вызывали дозо-зависимое увеличение дыхательного объёма при стабильной частоте дыхания. Воздействие кассинина приводило к аналогичным изменениям паттерна дыхания, но активность данного пептида проявлялась лишь в концентрации 10-4 М. Установлено, что аппликации 10'5 М субстанции Р стимулируют активность большинства инспираторных нейронов, в то же время реакции экспираторных нейронов отличаются разнообразием (рис.5).

Аппликации морфина к вентральной поверхности продолговатого мозга вызывали снижение дыхательного объёма при использовании 10-8-10-6 М растворов, а 10"4 М морфин во всех случаях вызывал остановку дыхания. Частота дыхания слегка возрастала под действием 10-Ю М, но снижалась под действием. 10"6 М морфина. 10-8-10-4 М лейцин-энкефалин вызывал дозо-зависимое уменьшение дыхательного объёма. Аппликации 10-6-10-4 М лейцин-энкефалина дополнительно приводили к снижению частоты дыхания. При воздействии 10'4 М пептида в 83% случаев возникала остановка дыхания на выдохе. Под действием 10"6 М лейцин-энкефалина наблюдалось угнетение активности большинства

А

В

93%

79%

10-5-Ю-4 м тиролиберин

83%Ш

93%

32%

10-5 м субстанция Р

91%

10-6 м лей-энкефалин

54%

14%

Г~1 Возбуждение Ц Торможение Н Нет реакции

Рис.5. Процентное соотношение реакций дыхательных нейронов на аппликации нейропептидов к вентральной поверхности продолговатого мозга. А- инспираторные, В-

экспираторные нейроны.

инспираторных нейронов; активность большинства экспираторных нейронов, напротив, возрастала (рис.5), ß-эндорфин в диапазоне концентраций 10-14-1 о*4 М не вызывал достоверных изменений паттерна дыхания. Аппликации 20 мкг налоксона к вентральной поверхности продолговатого мозга приводили к росту дыхательного объёма и частоты дыхания.

Полученные результаты показывают, что воздействуя на вентральную поверхность продолговатого мозга, нейропептиды способны регулировать активность дыхательных нейронов и паттерн дыхания. Наличие такого механизма физиологической регуляции дыхания подтверждается присутствием в поверхностном слое данной области большого количества тел и терминален нейронов, содержащих нейропептиды, а также существованием пептидергических проекций из данной области к структурам дыхательного центра (Holtman & Speck, 1994; Palkovits et al., 1995; Boone & Corry, 1996).

6. Влияние аппликаций нейропептидов к вентральной поверхности продолговатого мозга на вентиляторную чувствительность к гиперкапнии.

В области вентральной поверхности продолговатого мозга расположены центральные (медуллярные) хеморецепторы дыхания (Nattie, 1995; Erlichman & Leiter, 1997). Они играют главную роль в установке уровня лёгочной вентиляции в соответствии с напряжением углекислого газа и pH в цереброспинальной жидкости и межклеточной жидкости мозга. В данной серии экспериментов изучали влияние аппликаций нейропептидов к данной области продолговатого мозга на выраженность вентиляторной реакции на гиперкапнию.

-30В контрольных наблюдениях нарастающая гиперкапния закономкрно вызывала респираторную реакцию, выражавшуюся в увеличении лёгочной вентиляции преимущественно за счёт роста дыхательного объёма. Установлено, что аппликации тахикининов и опиоидных пептидов к вентральной поверхности продолговатого мозга модулируют вентиляторный ответ на нарастающую гиперкапнию. Субстанция Р и кассинин в концентрации 10-8 и 10'4 М вызывали увеличение наклона аппроксимирующего графика зависимости лёгочной вентиляции от парциального давления углекислого газа в системе возвратного дыхания (рис.6), что свидетельствует о повышении вентиляторной чувствительности к гиперкапнии. Морфин и лейцин-энкефалин в концентрации Ю-8 М вызывали снижение вентиляторной чувствительности к гиперкапнии (рис.6). Так как аппликация 10"4 М растворов этих веществ приводила к остановке дыхания, оценить их влияние на вентилятоную чувствительность к гиперкапнии не представлялось возможным, р-эндорфин в диапазоне концентраций 10-12-1 (Н М не оказывал влияния на выраженность вентиляторного ответа на гиперкапнию. Аппликации антагониста опиатных рецепторов налоксона в дозе 20 мкг вызывали рост вентиляторной реакции на гиперкапнию. В условиях воздействия на данную область тиролиберина, несмотря на значительное повышение уровня вентиляции лёгких, не отмечено изменений зависимости вентиляции от парциального давления углекислого газа в системе возвратного дыхания.

Полученные дынные указывают на связь респираторного влияния тахикининов, морфина, лейцин-энкефалина и налоксона при их воздействии на вентральную поверхность продолговатого мозга с функцией центральных хеморецепторов. В то же время, стимулирующее респираторное действие тиролиберина,

Рис.6. Влияние аппликаций лей-энкефалина (А) и субстанции Р (В) к вентральной поверхности продолговатого мозга на выраженность вентиляторной реакции на нарастающую гиперкапнию. По оси абсцисс- парциальное давление углекислого газа в системе возвратного дыхания (мм рт.ст.), по оси ординат- вентиляция лёгких (мл/мин). Обозначения на графиках: К-контроль; 10-12 м, 10"а М и 10"4 М- концентрация нейропептидов в растворе. Зависимость аппроксимировалась уравнением линейной регрессии вида: = а Р02 + Ь. Коэффициент а, отражающий степень наклона линий регрессии, составил в контроле 4.24 + 0.04; при воздействии 10-12 и Ю-8 М лей-энкефалина, соответственно, 4.10 + 0.06 и 3.51 + 0.09 (р<0.001); при воздействии 10-12, ю-8 и Ю-4 М субстанции Р, соответственно, 4.36 + 0.06, 4.86 + 0.18 (р<0.01) и 5.77 + 0.21 (р<0.001). г- коэффициент линейной регрессии.

наблюдавшееся при его воздействии на данную область, очевидно, не связано с механизмом вентиляторной хемочувствительности к СС>2 и рН. Можно предполагать, что рассматриваемый эффект

тиролиберина в значительной степени связан с его прямым воздействием на популяцию ритмогенерирующих нейронов, обнаруженную вблизи поверхности мозга в области воздействия (Onimaru et al., 1995).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании установлено, что активность нейропептидов на уровне бульбарного дыхательного центра обусловлена главным образом их участием в регуляции функциональной активности дорсальной дыхательной группы и комплекса пре-Бётцингера. Результаты экспериментов in vitro показывают, что нейропептиды способны регулировать активность фазных и тонических нейронов, расположенных в структурах, входящих в состав дыхательного центра, путём воздействия на уровень мембранного потенциала и на калиевый А-ток. Полученные данные также показывают, что наряду с участием в механизмах генерации дыхательного ритма и паттерна дыхания, нейропептиды модулируют чувствительность дыхательного центра к специфической механо- и хемоафферентации.

Для оценки роли нейропептидов в физиологических механизмах регуляции дыхания необходимо учитывать данные об источниках пептидергических проекций к структурам дыхательного центра и о факторах, определяющих высвобождение эндогенных нейропептидов в этих структурах. Полученные результаты в совокупности с такими данными позволили разработать

концептуальную схему пептидергических механизмов регуляции дыхания (рис.7).

Единственным источником тиролиберина, поступающего в дыхательный центр, являются проекции нейронов каудальной группы ядер шва (серотонинергические нейроны групп В1, В2, В4: Hokfelt et al., 1984). В окончаниях этих нейронов тиролиберин сосуществует с серотонином и тахикининами. Известно, что активность данных нейронов и количество медиаторов, высвобождающихся из их окончаний, изменяется в соответствии с фазами цикла сон/бодрствование, при боли, изменениях температуры (Le Bars, 1988; Fornal & Jacobs, 1988; Veasey et al., 1995). Поскольку действие всех перечисленных факторов приводит к изменениям дыхания, есть все основания полагать, что тиролиберин и тахикинины, наряду с серотонином, участвуют в реализации этих изменений. Установлено, что в окончаниях этих нейронов тиролиберин играет роль котрансмиттера серотонина, а тахикинины являются пресинаптическими модуляторами, регулирующими его высвобождение (Hokfelt et al., 1984). В последние годы появились сведения о наличии энкефалинергических проекций в структуры дыхательного центра из каудальных ядер шва (Tanaka et al., 1995). Есть данные о сосуществовании энкефалинов в данных проекциях с серотонином и тахикининами (Batten, 1995).

Данные нашего исследования указывают на важную роль тахикининов в реализации респираторных рефлексов на гипоксию и гиперкапнию. Эти данные хорошо согласуются с результатами работ других исследователей, предполагающими участие субстанции Р в реализации дыхательных хеморефлексов. В частности, известны проекции в область ядра солитарного тракта от хеморецепторов каротидного тела, содержащие данный нейропептид. К тому же, с помощью методики микродиализа продемонстрировано

Сон / бодрствование Боль

Гипертермия /гипотермия

Боль

Поведенческие реакции, эмоции, стресс

Центральные хеморецепторы

Изменения частоты дыхания

гипоксия ' хеморецепторы

Рис.7. Концептуальная схема пептидергических механизмов регуляции дыхания. Объяснение в тексте.

высвобождение субстанции Р в области ядра солитарного тракта при гипоксии (Lindefors et al., 1986; Morilak et al., 1988). Характер респираторных реакций и изменений вентиляторной чувствительности к гипоксии при воздействии тахикининов на область ядра солитарного тракта в совокупности с результатами данных работ позволяет сделать предположение о том, что тахикинины являются нейромедиаторами респираторного рефлекса на гипоксию на уровне интернейронов ядра солитарного тракта. Описаны также группы нейронов вблизи вентральной поверхности продолговатого мозга, содержащие субстанцию Р и проецирующихся к структурам дыхательного центра (Holtman & Speck, 1994). Здесь же обнаружены энкефалинергические нейроны с аксонными проекциями в область комплекса пре-Бётцингера (Boone & Corry, 1996). Эти группы клеток могут играть важную роль в рамках механизма центральной хемочувствительности дыхания.

В исследовании получены данные о модулирующем влиянии нейропептидов на рефлекс Геринга-Брейера. Эти результаты указывают на наличие пептидергического механизма регуляции глубины дыхания на уровне нейронов дорсальной дыхательной группы. Существование такого механизма подтверждается данными литературы о наличии прямых пептидергических (в частности, знкефалинергических) проекций в ядро солитарного тракта от рецепторов растяжения лёгких (Rutherfurd & Gundlach, 1993).

Не менее важной представляется роль других знкефалинергических проекций к дыхательному центру. Одним из источников энкефалинов являются нейроны т. наз. "PS-оп''-области медиальной части ретикулярной формации продолговатого мозга, участвующей в "запуске" парадоксальной фазы сна (Fort et al., 1990). Есть все основания предполагать особую роль этих проекций в формировании паттерна дыхания, характерного для данной фазы

сна. В публикации ВЬтяи^ а1. (1986) описаны прямые энкефалинергические проекции в область вентральных отделов дыхательного центра из ядра Кёлликера-Фузе. Данная группа энкефалинергических нейронов, получающая афферентацию от ноцицептивных нейронов спинного мозга, расположена в ядре моста, входящем в состав пневмотаксического центра. Рост уровня активности этих нейронов при действии болевых раздражителей может быть одной из причин респираторной реакции на боль. Важную роль в реализации дыхательного компонента поведенческих реакций, эмоций, стресса способны играть проекции в область ядра солитарного тракта энкефалинергических нейронов центрального ядра миндалины и паравентрикулярного ядра гипоталамуса, описанные КаэзеН е! а1. (1986); 8а\л/сЬелко & 5\л/апзоп (1986).

Таким образом, анализ полученных результатов позволяет сделать заключение о наличии особой группы нейропептидных механизмов регуляции дыхания. Благодаря этим механизмам становится возможной тонкая регуляция деятельности дыхательного центра в соответствии с уровнем специфической и неспецифической афферентации, осуществляется взаимодействие системы дыхания с другими функциональными системами организма.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ респираторных реакций, вызываемых микроинъекциями нейропептидов в структуры бульбарного дыхательного центра, позволил выявить следующие нейрохимические особенности регуляции: тиролиберин и тахикинины стимулируют, а опиоидные пептиды - угнетают дыхание.

Выраженность и конкретные особенности изменений паттерна дыхания под влиянием изученных нейропептидов зависят от концентрации и дозы, функциональных свойств отдела дыхательного центра, в который вводится нейропептид. Реакции наблюдаются при введении нейропептидов в ультра-малых дозах и концентрациях.

2. Установлено, что пептидергическая регуляция дыхания в значительной степени обусловлена влиянием нейропептидов на нейроны в области ядра солитарного тракта. При микроинъекциях в ядро солитарного тракта тиролиберина, тахикининов и опиоидных пептидов возникают выраженные респираторные реакции, характер которых указывает на преимущественные изменения в механизмах регуляции глубины дыхания. Эти реакции обусловлены участием всех изученных нейропептидов в модуляции рефлекса Геринга-Брейера. Тахикинины оказывают также дополнительное влияние на чувствительность к гипоксии, выявляемую по вентиляторным реакциям.

3. Тиролиберин, тахикинины и опиоидные пептиды играют важную роль в регуляции активности комплекса пре-Бётцингера. Влияние нейропептидов на данный отдел дыхательного центра выражается в перестройке механизмов, определяющих частоту дыхания и продолжительность дыхательных фаз. Получены данные, указывающие на непосредственное участие нейропептидов в механизмах генерации дыхательного ритма.

4. Изученные нейропептиды оказывают опосредованное влияние на дыхание и активность нейронов дыхательного центра через структуры, расположенные в поверхностных ростральных отделах вентролатеральной области продолговатого мозга. Если возникающие при этом респираторные эффекты тахикининов, лейцин-энкефалина и морфина объясняются модуляцией драйва от

центральных хеморецепторов, то эффекты тиролиберина не связаны с функцией медуллярных хеморецепторов.

5. На участие опиатных рецепторов в исследованных реакциях указывают эффекты универсального антагониста опиатных рецепторов налоксона. При микроинъекциях налоксона в структуры бульбарного дыхательного центра и при его аппликации к вентральной поверхности продолговатого мозга наблюдается стимуляция дыхания. Налоксон тормозит" рефлекс Геринга-Брейера и усиливает вентиляторную реакцию на гиперкапнию. Всё это свидетельствует о наличии у крыс тонического модулирующего влияния со стороны эндогенных опиоидных пептидов на функциональную активность дыхательных нейронов и центральных хеморецепторов, которое сохраняется и в условиях наркоза.

6. Доказано, что изменения объёмного компонента паттерна внешнего дыхания, вызываемые микроинъекцией нейропептидов, обусловлены соответствующими изменениями активности инспираторных мышц. Основной вклад в реализацию данных реакций вносят наружные межрёберные мышцы; функция диафрагмы отличается относительной стабильностью.

7. В условиях in vitro, на переживающих срезах продолговатого мозга с помощью летч-клемп метода, для всех нейронов, исследованных в ядре солитарного тракта и комплексе пре-Бётцингера, зарегистрирован быстрый инактивируемый компонент выходящего калиевого тока. Доказано, что этот компонент отвечает критериям, существующим для калиевого А-тока, и может играть важную роль в регуляции частоты импульсной активности нейронов дыхательного центра.

8. Установлен механизм действия тиролиберина на уровне бульбарного дыхательного центра (нейронов дорсальной дыхательной группы и нейронов комплекса пре-Бётцингера),

заключающийся в деполяризация мембраны и частичном ингибировании калиевого А-тока. Лейцин-энкефалин, напротив; вызывает гиперполяризацию мембраны нейронов, и не оказывает влияния на калиевый А-ток. Респираторные влияния лейцин-энкефалина могут быть связаны с модуляцией других видов мембранных токов, в частности, Са++-токов.

Список публикаций по теме диссертации

1. Сергеева Л.И., Инюшкина Ю.Е., Инюшкин А.Н., Кудрявцева Н.В., Дружинин А.Л. Структурно-функциональная организация дыхательного центра как парного образования. Учебное пособие к спецкурсу "Физиология дыхания". Куйбышев. 1985, 56 с.

2. Инюшкин А.Н., Юшкова Т.А., Стукова Т.А., Скулкова Н.П., Баженов В.Н., Кольцова Н.С., Третьякова А.Л., Дучицкая А.Л., Юхманова O.K., Фомичева И.В., Кульчицкий В.А. Метод диагностики центрального гиповентиляторного синдрома при диспансерном обследовании детей. В сб.: Научно-технический прогресс и диспансеризация населения. Новое в медицине. Материалы Куйбышевской областной научно-технической конференции. Куйбышев. 1986, с.64-66.

3. Инюшкин А.Н. Динамика показателей внешнего дыхания крыс в условиях прямого воздействия нейропептидов на вентральную поверхность продолговатого мозга. В сб.: Механизмы физиологических функций. Материалы 1 съезда физиологов Уральского региона. Уфа. 1986, с.147-148.

4. Инюшкин А.Н. Дыхательные реакции при воздействии тиро-либерина на вентральную поверхность продолговатого мозга у крыс. В сб.: Областная научно-техническая конференция "Молодые

учёные и специалисты - народному хозяйству". Куйбышев. 1986, с.71.

5. Песков Б.Я., Пятин В.Ф., Кульчицкий В.А., Измалкова H.H., Инюшкин А.Н. Участие бульбарных хемочувствительных структур в регуляции дыхания и кровообращения. В сб.: Материалы 6 Всесоюзной конференции по физиологии вегетативной нервной системы. Ереван. 1986, с.243.

6. Инюшкин А.Н., Песков Б .Я. Изменения лёгочной вентиляции при воздействии окситоцина на вентральную поверхность продолговатого мозга у крыс. В сб.: Современные проблемы физиологии дыхания. Куйбышев. 1987, с.70-75.

7. Песков Б.Я., Пятин В.Ф., Кульчицкий В.А., Измалкова H.H., Инюшкин А.Н. Регуляция дыхательных и вазомоторных реакций с вентральных отделов продолговатого мозга. В сб.: Материалы 15 Всесоюзного съезда физиологов. Ленинград. 1987, с.232-234.

8. Песков Б.Я., Пятин В.Ф., Кульчицкий В.А., Измалкова H.H., Инюшкин А.Н. Механизмы регуляции постоянства Н+ внеклеточной жидкости мозга системами дыхания и кровообращения. В сб.: Вклад учёных Куйбышевского медицинского института им Д.И. Ульянива в развитие научно-технического прогресса и практического здравоохранения. Материалы областной научно-практической конференции. Куйбышев. 1987, с.33-34.

9. Песков Б.Я., Инюшкин А.Н. Дыхательные реакции при воздействии тиролиберина на медуллярные хеморецепторы. В сб.: Материалы 7 научной конференции ЦНИЛ Тбилисского ГИУВ "Центральная регуляция вегетативных функций". Тбилиси. 1987, с.220.

10. Песков Б.Я., Пятин В.Ф., Бабкин С.М., Инюшкин А.Н., Зайцев В.Д., Юрасов В.Ф., Сорокина В.Е. Структурно-функциональная организация центрального аппарата регуляции дыхания и деятель-

ности дыхательной и сердечно-сосудистой системы у человека и животных. М.: ВНТЦ. № госрегистрации 018200076949. 16 с.

11. Песков Б.Я., Инюшкин А.Н. Показатели внешнего дыхания крыс в условиях воздействия лейцин-энкефалина и налоксона на вентральную поверхность продолговатого мозга. В сб.: Материалы Куйбышевской областной конференции "Физиология вегетативной нервной системы". Куйбышев. 1988, с.99.

12. Инюшкин А.Н. Значение воздействия опиоидов на вентральную поверхность продолговатого мозга в регуляции дыхания. В сб.: Материалы конференции "Актуальные проблемы молодых учёных и специалистов области в организации научно-технического творчества молодёжи". Куйбышев. 1988, с.47.

13. Инюшкин А.Н. Реакции бульбарных дыхательных нейронов на аппликации лейцин-энкефалина и тиролиберина к вентральной поверхности продолговатого мозга. В сб.: Центральные механизмы регуляции дыхания и кровообращения. Куйбышев. 1988, с.98-100.

14. Пятин В.Ф., Песков Б.Я., Инюшкин А.Н., Измалкова H.H. Участие нейронных образований вентролатеральной области продолговатого мозга в регуляции дыхания. В сб.: Материалы юбилейной научной сессии "Куйбышевскому медицинскому институту им. Д.И. Ульянова - 70". Куйбышев. 1989, с.202-203.

15. Песков Б.Я., Инюшкин А.Н. Дыхательные реакции при воздействии тиролиберина на вентральную поверхность продолговатого мозга. Физиол. журн. СССР им. И.М. Сеченова, 1990, Т.76, №5, с.637-643.

16. Инюшкин А.Н. Респираторные эффекты тиролиберина: гипотеза о множественности структур-мишеней. В сб.: Материалы областной научно-технической конференции "Молодые учёные и специалисты - производству". Куйбышев. 1990, с. 106.

-4217. Пятин В.Ф., Инюшкин А.Н. Предполагаемая роль пептидерги-ческих структур вентролатеральной области продолговатого мозга в обеспечении пластичности паттерна дыхания. В сб.: 6 Всесоюзный симпозиум "Физиология медиаторов. Периферический синапс". Казань. 1991, с.85.

18. Инюшкин А.Н. Респираторная реактогенность вентральных и дорсальных поверхностных структур продолговатого мозга при действии лейцин-энкефалина. В сб.: Вопросы экспериментальной и клинической пульмонологии (Материалы Всероссийской конференции). Самара. 1991, с.120.

19. Инюшкин А.Н. Респираторные эффекты лейцин-энкефалина: роль вентролатеральных отделов продолговатого мозга. В сб.: Нейрогуморальные механизмы регуляции дыхания и кровообращения. Самара. 1991, с.34-40.

20. Инюшкин А.Н. Центральные респираторные влияния малых доз тиролиберина. В сб.: Материалы областной научно-технической конференции молодых учёных. Самара. 1992, с.21-22.

21. Inyushkin A.N., Chepurnov S.A. Central respiratory effects of TRH in ultra-low doses. Neuropeptides, 1993, vol.24, p.216.

22. Инюшкин A.H., Меркулова H.A. Влияние микроинъекций тиролиберина в область ядра солитарного тракта на показатели дыхания и кровообращения. Физиол. журн. им. И.М. Сеченова, 1993, Т.79, №11, с.52-58.

23. Инюшкин А.Н. Респираторные влияния микроинъекций тиролиберина в ядро солитарного тракта у крыс. В сб.: Республиканская научная конференция физиологов, посвященная 95-летию М.В. Сергиевского. Самара. 1993, с.55-57.

24. Инюшкин А.Н. Локализация гемодинамических эффектов тиролиберина в ядре солитарного тракта с помощью метода микроинъекций. В сб.: Всероссийская научно-техническая

конференция "Аппаратно-программные средства диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний". Самара. 1994, с. 19.

25. Chepurnov S.A., Inyushkin A.N. Respiratory effects of TRH microinjections into the nucleus tractus solitarii. Neuropeptides, 1994, vol.26, Suppl.1, p.27.

26. Меркулова H.A., Ведясова O.A., Кузьмина B.E., Сергеева Л.И., Инюшкин А.Н., Гаврилов И.И. Билатеральные механизмы регуляции дыхания. Успехи физиол. наук, 1994, вып.З., с.107-108.

27. Inyushkin A.N., Merkulova N.A. Respiratory effects of TRH microinjections into the rostral ventrolateral medulla oblongata. In: Minisymposium of the European Neuropeptides Club "Neuropeptides in the Peripheral and Central Nervous System". Bad Nauheim. 1994, p.24.

28. Инюшкин A.H., Меркулова H.A. Респираторные влияния микроинъекций ультра-малых доз нейропептидов в область комплекса пре-Бётцингера. В сб.: 2 Международный симпозиум "Механизмы действия сверхмалых доз". М. 1995, с.96-97.

29. Inyushkin A.N., Merkulova N.A. Respiratory effects of kassinin microinjected into the solitary tract nucleus in rat. Pharmacol. Toxicol., 1995, vol.76, Suppl.4, Abstr. 19.

30. Меркулова H.A., Инюшкин A.H. Модуляция нейропептидами инспираторно-тормозящего рефлекса Геринга-Брейера. Вестник Самарского университета, 1995, спец. выпуск, с.152-158.

31. Inyushkin A.N., Merkulova N.A., Chepurnov S.A. Respiratory effects of kassinin and substance P microinjected into the solitary tract nucleus. In: An International Multidisciplinary Symposium "Peptide Receptors". Montreal. 1996, p.313.

32. Inyushkin A.N., Chepurnov S.A., Merkulova N.A. Respiratory and circulatory effects of opioid peptides microinjected into the solitary tract nucleus. Regulatory Peptides, 1996, vol.64, №1-3, p.75.

-4433. Инюшкин А.Н. Респираторные и гемодинамические реакции у крыс на микроинъекции опиоидов в ядро солитарного тракта. Российский физиол. журн. им. И.М. Сеченова, 1997, т.83, №3, с.112-121.

34. Чепурнов С.А., Инюшкин А.Н. Влияние микроинъекций тахики-нинов в область ядра солитарного тракта на дыхание и кровообращение у крыс. Российский физиол. журн. им. И.М. Сеченова, 1997, т.83, №4, с.117-125.

35. Inyushkin A.N., Merkulova N.A. Modulation of respiratory reflexes by tachykinins. In: European Neuropeptide Club 7*h Annual Meeting. Marburg. 1997, 11.

36. Инюшкин A.H., Меркулова H.A., Чепурнов C.A. Комплекс пре-Бётцингера участвует в реализации респираторных эффектов тиролиберина. Российский физиол. журн. им. И.М. Сеченова, 1998, т.84, №4. В печати.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Инюшкин, Алексей Николаевич, Самара

/

САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РОЛЬ НЕЙРОПЕПТИДОВ В БУЛЬВАРНЫХ МЕХАНИЗМАХ

РЕГУЛЯЦИИ ДЫХАНИЯ

03.00.13 - физиология человека и животных

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени

На правах рукописи

ИНЮШКИН Алексей Николаевич

УДК 612.828: 612.825.1

Научный консультант доктор биологических наук профессор С.А. Чепурнов

доктор

САМАРА 1998

-2-

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ...........................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................. 13

1.1. Бульбарные механизмы регуляции дыхания............ 13

1.1.1. Структурно-функциональная организация дыхательного

центра млекопитающих.......................13

1.1.2. Роль поверхностных вентральных структур продолгова-

того мозга в регуляции дыхания................35

1.2. Респираторная активность нейропептидов............. 51

1.2.1. Тиролиберин....................................52

1.2.2. Тахикинины.....................................62

1.2.3. Опиоидные пептиды.............................68

Глава 2. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.....................79

2.1. Методика экспериментов in vivo...................... 79

2.1.1. Экспериментальные животные. Операционная подго-

товка ......................................79

2.1.2. Микроинъекции растворов в структуры мозга. Аппликации

растворов к поверхности мозга................81

2.1.3. Регистрация паттерна дыхания................... 87

2.1.4. Регистрация биоэлектрической активности дыхательных

мышц......................................88

2.1.5. Исследование рефлекса Геринга-Брейера..........89

2.1.6. Исследование вентиляторных реакций на гипоксию и

гиперкапнию...............................90

2.1.7. Регистрация биоэлектрической активности дыхательных

нейронов...................................91

-32.1.8. Регистрация артериального давления и частоты сердеч-

ных сокращений ............................92

2.1.9. Поддержание изотермии.........................93

2.2. Методика экспериментов in vitro......................93

2.3. Статистическая обработка данных....................95

Глава 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РЕСПИРАТОРНЫХ ЭФФЕКТОВ НЕЙРОПЕПТИДОВ ПРИ ЛОКАЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНО-РАЗЛИЧНЫЕ ОТДЕЛЫ ДЫХАТЕЛЬНОГО ЦЕНТРА................................................96

3.1. Влияние тиролиберина............................. 99

3.2. Влияние тахикининов.............................. 113

3.3 Влияние опиоидных пептидов........................126

Глава 4. ВЛИЯНИЕ МИКРОИНЪЕКЦИЙ НЕЙРОПЕПТИДОВ В ЯДРО СОЛИТАРНОГО ТРАКТА НА РЕФЛЕКС ГЕРИНГА-БРЕЙЕРА ... 153

Глава 5. ВЛИЯНИЕ МИКРОИНЪЕКЦИЙ НЕЙРОПЕПТИДОВ В ЯДРО СОЛИТАРНОГО ТРАКТА НА ВЕНТИЛЯТОРНУЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ГИПОКСИИ ....................................159

Глава 6. МЕМБРАННО-ИОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ НЕЙРОПЕПТИДОВ В ОБЛАСТИ БУЛЬВАРНОГО ДЫХАТЕЛЬНОГО

ЦЕНТРА............................................... 167

6.1. Мембранный потенциал и основные параметры выходящего калиевого А-тока в нейронах области дыхательного центра...................................167

-46.2. Влияние тиролиберина на мембранный потенциал, спонтанную активность и калиевый А-ток нейронов ядра солитарного тракта

и области комплекса пре-Бётцингера.......................170

6.3. Влияние лейцин-энкефалина на мембранный потенциал, спонтанную активность и калиевый А-ток нейронов ядра солитарного тракта и области комплекса пре-Бётцингера............... 177

Глава 7. ДЫХАТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ АППЛИКАЦИЙ НЕЙРОПЕПТИ-ДОВ К ВЕНТРАЛЬНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ПРОДОЛГОВАТОГО МОЗГА................................................ 184

3.1. Влияние тиролиберина.............................184

3.2. Влияние тахикининов.............................. 190

3.3 Влияние опиоидных пептидов........................195

Глава 8. ВЛИЯНИЕ АППЛИКАЦИЙ НЕЙРОПЕПТИДОВ К ВЕНТРАЛЬНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ПРОДОЛГОВАТОГО МОЗГА НА ВЕНТИЛЯТОРНУЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ГИПЕРКАПНИИ........202

Глава 9. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................211

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................... 241

ВЫВОДЫ...........................................248

ЛИТЕРАТУРА

251

-5-

ВВЕДЕНИЕ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Физиологическая и нейрохимическая организация центральной регуляции дыхания остаётся одной из актуальных проблем физиологии (Сергиевский и соавт., 1975, 1993). Современный уровень развития экспериментальной электрофизиологической техники сделал возможным глубокое изучение функциональных свойств дыхательных нейронов in vivo и in vitro, позволил вплотную подойти к пониманию клеточных и субклеточных механизмов, являющихся основой дыхательной ритмики (Haji et al., 1996; Champagnat & Fortin, 1997; Ramirez et al., 1997; Richter et al., 1997). Вместе с тем, многие ключевые вопросы структурно-функциональной организации дыхательного центра и принципы его деятельности остаются дискуссионными, слабо изученными.

В последнее время особое внимание уделяется исследованию нейрохимического обеспечения бульбарных механизмов регуляции дыхания, изучению участия нейромедиаторов и нейромодуляторов в регуляции активности дыхательных нейронов и их функционального взаимодействия в пределах дыхательного центра, что является одной из основ генерации респираторного ритма (Bonham, 1995; Bianchi et al., 1995; Schmid et al., 1996; Bayliss et al., 1997; McCrimmon et al., 1997).

В рамках проблемы нейрохимических механизмов регуляции дыхания особый интерес представляет изучение роли нейропептидов. Впервые на кафедре физиологии человека и животных МГУ исследовали роль тиролиберина в механизмах

восстановления дыхания и нормализации мозгового кровообращения, его антигипоксическое действие (Ашмарин и соавт., 1990, 1992). В настоящее время выявлена способность опиоидных пептидов, субстанции Р, соматостатина, бомбезина, тиролиберина, брадикинина, холецистокинина вызывать разнообразные изменения дыхания при системном введении (Воинов и соавт., 1993; Сербенюк и соавт., 1988; Bianchi et al., 1995; Bonham, 1995). Эти данные были подтверждены иммуногистохимическими и ауторадиографическими

исследованиями, в которых показана высокая концентрация нейропептидов и плотность рецепторов к ним в бульбарных дыхательных ядрах (Handbook of Chemical Neuroanatomy, 1990), что свидетельствует о возможности непосредственного участия эндогенных нейропептидов в деятельности дыхательного центра в норме и патологии.

Несмотря на большие успехи нейрохимии и патофизиологии регуляторных пептидов (Айрапетянц и соавт., 1980, 1983а, 19836; Крыжановский, Глебов, 1983; Ашмарин, 1984, 1992; Клуша, 1984; Ашмарин, Обухова, 1985, 1986, 1994; Чепурнов, Чепурнова, 1985; Ашмарин и соавт., 1992; Судаков и соавт., 1995а, 19956; Малышенко, Попова, 1990; Гомазков, 1991, 1995; Зилов, 1992; Попова, Доведова, 1995; Попова и соавт., 1996), многие вопросы нейрохимической организации дыхательного центра ещё требуют исследования. Доказана ведущая роль сосуществования нейропептидов с классическими медиаторами в организации нервных центров и их эффективной функции (Ашмарин, Каменская, 1988), но в физиологии дыхания отсутствуют сведения о сравнительной роли различных отделов дыхательного центра в реализации респираторных эффектов нейропептидов, и о

конкретных механизмах их участия в регуляции дыхания. В этом плане особенно перспективным представляется исследование механизмов действия нейропептидов на дыхательные нейроны с использованием современного метода петч-клемпинга. Это позволяет изучить непосредственное влияние нейропептидов на формирование мембранного потенциала клетки и ионные токи (Hille, 1992).

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось: изучение роли и основных физиологических механизмов участия нейропептидов в регуляции дыхания на уровне бульбарного дыхательного центра, регуляции активности нейронов различных ядерных образований дыхательного центра и хемочувствительных структур вентральной поверхности продолговатого мозга;

изучение возможных механизмов регуляции ионных токов дыхательных нейронов нейропептидами in vitro.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Произвести сравнительный анализ респираторных эффектов нейропептидов (тиролиберин, тахикинины, опиоидные пептиды) при локальном воздействии на функционально-различные отделы дыхательного центра.

2. Определить, в каких дозах и при каких концентрациях эффективны тиролиберин, тахикинины, лейцин-энкефалин, ß-эндорфин, морфин в случае их микровведений в ядра дыхательного центра или аппликации к вентральной поверхности продолговатого мозга; выявить характер дозо-зависимых эффектов.

3. Изучить участие нейропептидов в реализации рефлекса Геринга-Брейера на уровне ядра солитарного тракта, влияние нейропептидов на вентиляторную реакцию, вызываемую гипоксией.

-84. Исследовать изменения паттерна дыхания и электрической активности одиночных нейронов дыхательного центра, возникающие при воздействии нейропептидов на вентральную поверхность продолговатого мозга. Изучить влияние прямого воздействия нейропептидов на центральные хеморецепторы на вентиляторную чувствительность к гиперкапнии.

5. На переживающих срезах продолговатого мозга изучить активность клеток дыхательных ядер in vitro, изменения их мембранного потенциала и ионных токов под влиянием нейропептидов, обладающих респираторной активностью при системном и локальном воздействии.

Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное исследование респираторных эффектов, возникающих при воздействии тиролиберина, тахикининов и опиоидных пептидов на функционально-различные отделы дыхательного центра. В структурах дыхательного центра установлена преимущественная роль NKi -рецепторов по сравнению с 1\И<2-рецепторами к

тахикининам. Преимущественный агонист ju-рецепторов (морфин) наиболее активен при воздействии на ядро солитарного тракта, а агонист 6-рецепторов (лейцин-энкефалин) - при воздействии на комплекс пре-Бётцингера. Конкретные особенности дыхательных реакций определяются не только действующими нейропептидами, но и функциональными свойствами отдела дыхательного центра, подвергающегося воздействию.

Впервые продемонстрирована эффективность тиролиберина, тахикининов и опиоидов при применении их в ультра-малых дозах и концентрациях. Эти данные в совокупности со сведениями о пептидергической нейрохимической организации дыхательного

центра предполагают участие эндогенных нейропептидов в регуляции дыхания.

Получены новые доказательства модулирующих влияний нейропептидов на специфическую афферентацию, поступающую в ядро солитарного тракта от рецепторов растяжения лёгких и периферических хеморецепторов. Установлено, что модуляция нейропептидами классического рефлекса Геринга-Брейера на уровне ядра солитарного тракта лежит в основе механизма регуляции глубины дыхания.

Впервые в срезах продолговатого мозга с помощью техники петч-клемпинга исследованы мембранный потенциал, спонтанная активность, выходящий калиевый ток нейронов дорсальной дыхательной группы и комплекса пре-Бётцингера. Установлено, что тиролиберин и лейцин-энкефалин вызывают изменение мембранного потенциала и уровня спонтанной активности нейронов. Доказано, что в основе активирующего действия тиролиберина лежит его способность частично блокировать калиевый А-ток.

Обнаружено, что наряду с клеточными образованиями дыхательного центра важную роль в реализации влияний нейропептидов на дыхание играют поверхностные вентролатеральные структуры продолговатого мозга. Доказано, что что уровень концентрации нейропептидов в данной области (кровь и цереброспинальная жидкость) существенно влияет на активность нейронов дыхательного центра и определяет изменения центральной хемочувствительности.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты проведённого исследования позволяют расширить и конкретизировать научные представления о пептидергической организации бульбарного дыхательного центра и центральных

(медуллярных) хеморецепторов дыхания. Сведения о роли опиоидных пептидов, тиролиберина и тахикининов в деятельности дыхательного центра важны для понимания нейрохимических закономерностей генерации дыхательного ритма, особенностей формирования специфической механо- и хемоафферентации, поступающей к дыхательному центру, раскрывают механизмы обработки этой афферентации. Впервые на нейронах бульбарного дыхательного центра получены данные о мембранно-ионных механизмах действия нейропептидов, что позволяет внести теоретически значимые уточнения в общепризнанные в нормальной физиологии схемы центральной регуляции дыхания. Обнаруженные особенности центральной регуляции дыхания могут быть использованы для нового обоснования практического применения нейропептидов при дыхательных расстройствах, возникающих вследствие гипоксии, кровопотери, нарушений мозгового кровообращения, в восстановлении регуляции дыхания в практической реанимации, при синдроме внезапной смерти новорожденных при асфиксии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Среди структур бульбарного дыхательного центра наиболее важную роль в реализации респираторных регуляторных влияний нейропептидов играют нейроны ядра солитарного тракта и комплекса пре-Бётцингера.

2. На уровне мембранно-ионных отношений нейропептиды регулируют активность клеток, расположенных в структурах дыхательного центра за счёт изменения мембранного потенциала и калиевого А-тока.

3. Важным системным механизмом пептидергической регуляции дыхания является модуляция тиролиберином, тахикининами,

опиоидными пептидами чувствительности нейронов дыхательного центра к афферентации, поступающей от рецепторов растяжения лёгких и периферических хеморецепторов, что проявляется в соответствующих изменениях рефлекса Геринга-Брейера и вентиляторного ответа на гипоксию.

4. Нейропептиды включаются в рефлекторную регуляцию активности нейронов дыхательного центра, воздействуя на поверхностные ростровентролатеральные структуры

продолговатого мозга. Тахикинины и опиоидные пептиды способны модулировать уровень центрального респираторного хемочувствительного драйва и, тем самым, изменять выраженность вентиляторного ответа на гиперкапнию.

Аппробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на VI Всесоюзной конференции по физиологии вегетативной нервной системы (Ереван, 1986); на VII научной конференции "Центральная регуляция вегетативных функций" (Тбилиси, 1987); на XV съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П. Павлова (Кишинёв, 1987); на Поволжской конференции "Физиология вегетативной нервной системы" (Куйбышев, 1988); на VI Всесоюзном симпозиуме "Физиология медиаторов. Периферический синапс" (Казань, 1991); на I и II Международных симпозиумах "Механизмы действия сверхмалых доз" (Москва, 1992, 1995); на XVI (учредительном) съезде Всероссийского физиологического общества им. И.П. Павлова (Пущино, 1993); на республиканской научной конференции физиологов, посвящённой 95-летию со дня рождения М.В. Сергиевского (Самара, 1993); на III, IV, V и VII съездах Европейского Нейропептидного Клуба (Кембридж, Великобритания, 1993; Страсбург, Франция, 1994; Лунд, Швеция, 1995; Марбург,

Германия, 1997); на симпозиуме Европейского Нейропептидного Клуба "Neuropeptides in the Peripheral and Central Nervous System" (Бад Наухайм, Германия, 1994); на Международном симпозиуме "Peptide Receptors" (Монреаль, Канада, 1996); на 11 Международном симпозиуме по регуляторным пептидам (Копенгаген, Дания, 1996).

- 13-Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Бульбарные механизмы регуляции дыхания 1.1.1. Структурно-функциональная организация дыхательного

центра млекопитающих

Дыхание является одним из основных физиологических ритмов. Оно появляется перед рождением и продолжается в течение всей жизни организма. Благодаря ритмичным сокращениям дыхательных мышц обеспечивается постоянство ряда важнейших гомеостатичес-ких параметров. Однако, несмотря на первостепенную важность проблемы регуляции дыхания, в ней до настоящего времени имеется множество нерешённых и дискуссионных вопросов, главным среди которых является вопрос о механизмах генерации дыхательного ритма.

Благодаря исследованиям нескольких поколений отечественных и зарубежных физиологов в настоящее время общепринятым стало положение о том, что ведущая роль в регуляции дыхания принадлежит структурам бульбарного дыхательного центра. Несмотря на наличие определённых разногласий в отношении целесообразности включения некоторых ядер продолговатого мозга в состав дыхательного центра (Сергиевский и соавт., 1975, 1993; Bianchi et al., 1995; Duffin et al., 1995), это образование рассматривается в первую очередь как совокупность дыхательных нейронов, активность которых синхронна с фазами дыхательного цикла (Сафонов и соавт., 1980; Euler, 1986; Long & Duffin, 1986). В соответствии с характером паттерна активности дыхательные нейроны подразделяются на шесть основных типов (Bianchi et al.,

- 141995): ранние инспираторные, инспираторные с нарастающим паттерном активности, поздние инспираторные, постинспираторные, экспираторные с нарастающим паттерном активности, преинспираторные. Современная техника внутриклеточной регистрации биоэлектрической активности дыхательных нейронов позволила сопоставить паттерн их активности с изменениями мембранного потенциала, происходящими в различные фазы дыхательного цикла. Это позволило глубже понять межнейронные взаимодействия в дыхательном центре и впл