Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Значение гастрин-рилизинг пептида в бульбарных механизмах регуляции дыхания

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Значение гастрин-рилизинг пептида в бульбарных механизмах регуляции дыхания"

На правах рукописи

а

Алиев Артём Алиевич

ЗНАЧЕНИЕ ГАСТРИН-РИЛИЗИНГ ПЕПТИДА В БУЛЬВАРНЫХ МЕХАНИЗМАХ РЕГУЛЯЦИИ ДЫХАНИЯ

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

? о '^н гт

0050621<п

Ульяновск - 2013

005062141

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

Инюшкин Алексей Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, заведующий

кафедрой адаптивной физической культуры ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» Балыкин Михаил Васильевич

доктор биологических наук, профессор, декан естественно-географического факультета,

заведующий кафедрой зоологии и анатомии, физиологии, безопасности жизнедеятельности человека ФГБОУ ВПО «Поволжская государственная социально-гуманитарная академия» Попов Юрий Михайлович

Ведущая организация: ФГБУН «Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН»

Защита состоится «28» июня 2013 г. в 12 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» по адресу: г. Ульяновск, ул. Набережная реки Свияги, д. 106, корпус 1, ауд.703.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, а с авторефератом - на сайте ВУЗа http://www.uni.ulsu.ru и на сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки РФ http://vak.ed.gov.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, д. 42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований.

Автореферат разослан « мая 2013 года

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

С.В. Пантелеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время физиология дыхания, благодаря использованию современных экспериментальных методик, располагает точными и достоверными данными о локализации и взаимном расположении структурно-функциональных областей дыхательного центра. В результате внутриклеточной регистрации биоэлектрической активности дыхательных нейронов в комбинации с другими нейрофизиологическими методами удалось вплотную подойти к пониманию природы дыхательного ритмогенеза. Тем не менее, механизмы нейрохимического обеспечения деятельности дыхательного центра, основанные на разнообразии медиаторов, нейромодуляторов, на специфических синаптических взаимодействиях нейронов различных типов, требуют дальнейшего изучения. Данные о нейрохимической организации дыхательного центра являются важным шагом к пониманию особенностей функционирования дыхательного центра, механизмов его взаимодействия с центрами других физиологических функций.

Важнейшей группой эндогенных химических регуляторов, принимающих активное участие в механизмах взаимодействия нейронов дыхательного центра, являются нейропептиды. Представляя обширную группу нейромодуляторов, они вовлечены в тонкую регуляцию физиологических функций, в том числе дыхания. Интерес к этим биологически активным веществам вызван их распространенностью в центральной нервной системе, их полифункциональностью и плейотропностью, а также перспективами их использования в медицине, что определяет необходимость детального изучения полного спектра физиологической активности нейропептидов [Ашмарин с соавт., 1999; Strand, 2003; Egleton et al„ 2005; Merighi et al„ 2011].

В настоящее время активно изучаются центральные эффекты пептидов бомбезинового семейства, в частности, гастрин-рилизинг пептида. Показано участие данного нейропептида в регуляции аппетита [Ladenheim et al., 2002], температуры тела [Tsushima et al., 2003], в реализации стрессорных реакций [Merali et al., 2002], грумингового поведения и локомоторной активности у грызунов [Masui et al., 1993]. Получены данные о вовлечении гастрин-рилизинг пептида в механизмы памяти и обучения за счет модуляции высвобождения ГАМК на уровне ядра солитарного тракта и структур миндалевидного комплекса [Shumyatsky et al., 2002; Kamichi et al., 2005].

Поводом для изучения участия гастрин-рилизинг пептида в центральных механизмах регуляции дыхания послужили результаты иммуногистохимических исследований. Согласно им, в области ядра солитарного тракта, входящей в состав бульварного дыхательного центра, наблюдается относительно высокий уровень экспрессии специфических рецепторов к гастрин-рилизинг пеггщду [Kamichi et al., 2005], матричной РНК пептида [Wada et al., 1990] и самого эндогенного гастрин-рилизинг пептида [King et al., 1989].

В отдельных работах получены данные о том, что аналог гастрин-рилизинг пептида бомбезин вызывает респираторные эффекты при микроинъекциях в область ядра солитарного тракта наркотизированных крыс [Глазкова с соавт., 2003; Инюшкин, Глазкова, 2005]. Однако бомбезин обладает практически одинаковой аффинностью как к ВВ,, так и ВВ2 рецепторам, тогда как гастрин-рилизинг пептид является преимущественным агонистом ВВ2 подтипа, и его респираторные эффекты могут определяться, в первую очередь, экспрессией ВВ2 подтипа рецепторов в функционально-специфичных областях дыхательного центра. К тому же, в отличие от бомбезина, выделенного у амфибий, гастрин-рилизинг пептид, наряду с нейромедином В, является специфичным для млекопитающих эндогенным нейропептидом [\Vada « а1„ 1990], поэтому исследование на теплокровных животных центральных респираторных эффектов данного представителя нейропептидов бомбезинового семейства выглядит более адекватным.

Цели и задачи исследования: целью работы явилось изучение роли и физиологических механизмов участия гастрин-рилизинг пептида в центральной регуляции дыхания.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Идентифицировать отделы дыхательного центра, играющие наиболее важную роль в реализации респираторных эффектов гастрин-рилизинг пептида.

2. Определить характер респираторных реакций на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в ядро солитарного тракта и их зависимость от концентрации исследуемого вещества.

3. Изучить роль гастрин-рилизинг пептида в реализации рефлекса Геринга-Брейера на уровне ядра солитарного тракта.

4. Исследовать влияние микроинъекций гастрин-рилизинг пептида в область ядра солитарного тракта на выраженность вентиляторных реакций на гиперкапнию.

5. Выяснить особенности респираторных реакций на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в отдел дыхательного центра, играющий важную роль в ритмогенезе дыхания - комплекс пре-Бётцингера.

6. Установить характер респираторных реакций на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в ростральный и каудальный отделы вентральной респираторной группы и комплекс Бётцингера.

Научная новизна работы. В данном исследовании впервые изучены респираторные эффекты на микроинъекции различных концентраций гастрин-рилизинг пептида в структурно-функциональные отделы бульварного дыхательного центра. Показано участие исследуемого нейропептида в центральных механизмах регуляции дыхания.

Обнаружено, что активность гастрин-рилизинг пептида реализуется, главным образом, на уровне дорсальной респираторной группы и, в меньшей степени, комплекса пре-Бётцингера. Установлено, что специфика реакций со стороны паттерна внешнего дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц, определяется не только концентрациями гастрин-

рилизинг пептида, но также функциональными особенностями исследуемых отделов мозга. В частности, характерной реакцией на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в комплекс пре-Бётцингера, ритмогенерирующий отдел дыхательного центра, являлся рост частоты дыхания, в то время как дыхательный объем изменялся незначительно. При этом в экспериментах с введением нейропептида в ядро солитарного тракта возрастал дыхательный объем и незначительно снижалась частота дыхания.

Получены данные, указывающие на участие гастрин-рилизинг пептида в модуляции центральной хемочувствительности к углекислому газу на уровне дорсальной респираторной группы. Показано, что микроинъекции данного пептида в ядро солитарного тракта ослабляют вентиляторную чувствительность к гиперкапнии. Полученные в работе результаты впервые продемонстрировали участие гастрин-рилизинг пептида в механизмах передачи афферентации, поступающей в ядро солитарного тракта от рецепторов растяжения легких. Показано, что локальное воздействие пептида на эту область ствола мозга оказывает ингибирующее влияние на проявление рефлекса Геринга-Брейера. Этот эффект может лежать в основе модулирующего влияния гастрин-рилизинг пептида на глубину дыхания.

Теоретическое и практическое значение работы. Исследования центральной респираторной активности гастрин-рилизинг пептида ранее не проводились. В литературе достаточно полно освещены вопросы экспрессии, фармакологии, связывания и структуры специфических рецепторов к гастрин-рилизинг пептиду, однако его функциональное значение, в частности, на уровне бульварного отдела ствола мозга до настоящего времени оставалось неясным. Результаты работы, раскрывающие роль и механизмы участия гастрин-рилизинг пептида и его рецепторов в деятельности дыхательного центра, важны для понимания нейрохимических закономерностей респираторного ритмогенеза и регуляции паттерна дыхания.

Полученные данные об особенностях центральной респираторной активности гастрин-рилизинг пептида, о характере респираторных реакций на микроинъекции пептида в различные структурно-функциональные отделы дыхательного центра, о модуляции им рефлекса Геринга-Брейера и вентиляторной чувствительности к гиперкапнии являются существенным вкладом в понимание физиологических механизмов действия данного нейропептида на бульбарном уровне.

Результаты настоящей работы могут использоваться при разработке лекарственных препаратов на основе аналогов пептидов бомбезинового семейства для центральной коррекции дыхательных нарушений, а также препаратов, участвующих в регуляции защитных дыхательных рефлексов (например, противокашлевые средства центрального действия). Сравнительно недавно было продемонстрировано периферическое действие бомбезин-родственных пептидов и их специфических рецепторов в реализации легочных

хеморефлексов, кашле, бронхоспазме и гиперсекреции слизи в дыхательных путях [Gu, Lee, 2005].

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Среди бульбарных структур, входящих в состав дыхательного центра, главную роль в опосредовании респираторных эффектов гастрин-рилизинг пептида играют вентролатеральный отдел ядра солитарного тракта и комплекс пре-Бётцингера.

2. Микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в область дорсальной респираторной группы и комплекс пре-Бётцингера приводят к изменениям паттерна внешнего дыхания, биоэлектрической активности наружных межреберных мышц и диафрагмы.

3. На уровне ядра солитарного тракта гастрин-рилизинг пептид повышает чувствительность нейронов к афферентным сигналам, поступающим от медленно адаптирующихся рецепторов растяжения легких, что приводит к ингибированию рефлекса Геринга-Брейера.

4. Локальное воздействие гастрин-рилизинг пептида на вентролатеральный отдел ядра солитарного тракта ослабляет вентиляторную чувствительность к гиперкапнии, что указывает на участие данного нейропептида в модуляции центральной хемочувствительности к углекислому газу на уровне дорсальной респираторной группы.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на XV Конференции молодых учёных «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды» (Санкт-Петербург, институт физиологии им. Павлова РАН, 2010); XV и XVI международных Путинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011, 2012); XXXV, XXXVI и XXXVII Научных конференциях молодых учёных и специалистов СамГУ (Самара, 2010, 2011, 2012); Ежегодной Всероссийской научно-практической конференции «Наука. Образование. Медицина» (Самара, СМИ "Реавиз", 2011); II межвузовской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Самара, СМИ "Реавиз", 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, иллюстрирована 1 таблицей и 38 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы (30 отечественных и 352 зарубежных источника).

Материалы и методы исследования

Эксперименты проведены на белых нелийненых крысах обоего пола массой 200-320 г, наркотизированных уретаном (1,6 г/кг) внутрибрюшинно. В работе было использовано 86 животных. К операции приступали через 10-20 минут, когда наркоз достигал необходимой глубины. Производили трахеостомию, трепанацию затылочной кости и осуществляли доступ к дорсальной поверхности продолговатого мозга.

Воздействие на различные функционально-специфические отделы дыхательного центра производили методом микроинъекций. Гастрин-рилизинг пептид («Sigma») инъецировали с помощью микрошприца МШ-1 через стекляную микропипетку с диаметром кончика около 20-30 мкм. Пептид растворяли в искусственной цереброспинальной жидкости ex tempore и вводили объеме 50 нл в соответствии с координатами, полученными в электрофизиологических исследованиях [de Castro et al., 1994; Chitravanshi, Sapru, 1999]. Использовали растворы следующих концентраций: Ю"10, 10'8, 10'5 M. Скорость введения пептида была постоянной и составляла около 5 нл/сек. В контрольных экспериментах в те же области инъецировали 50 нл искусственной цереброспинальной жидкости.

По окончании эксперимента продолговатый мозг извлекали и помещали в 4% раствор формальдегида на 7-14 суток для последующего гистологического контроля места микроинъекции [Fox et al., 1985].

Регистрация внешнего дыхания производилась инвазивным методом с помощью спирографа для мелких лабораторных животных. Параллельно с паттерном дыхания регистрировали биоэлектрическую активность диафрагмы и наружных межреберных мышц (в VI-VIII межреберьях) с левой стороны тела животного с помощью стальных игольчатых электродов биполярно. Сигналы от спирографа и электромиографических электродов усиливали и подавали на АЦП (L-780, L-Card, Россия), а затем регистрировали на персональном компьютере с помощью программы PowerGraph 3.2 в течение всего эксперимента. С помощью той же программы производили первичную обработку и хранение экспериментальных данных.

В конце каждого эксперимента производили калибровку дыхательного объема. Для этого в систему вводили точные объемы воздуха с помощью шприца. На спирограммах определяли дыхательный объем (Vt), продолжительность вдоха (Т;) и выдоха (Тс), вычисляли длительность дыхательного цикла (Т,), частоту дыхания (f) и минутный объем дыхания (Vj). Частоту дыхания (f) определяли по формуле f = 60/Tt. Минутный объем дыхания (Vj) рассчитывали по формуле Vj = f ' V,. Электромиограмму инспираторных мышц интегрировали с постоянной времени т = 100 мс, а затем измеряли амплитуду интегрированной активности в процентах от исходного уровня (%).

Для выявления эффектов микроинъекций определяли значения исследуемых показателей спирограммы и ЭМГ в исходном состоянии,

ежеминутно в течение первых 10 минут, и далее через 15, 20, 30, 40 и 60 минут после микроинъекции.

Рефлекс Геринга-Брейера вызывали раздуванием легких в начале выдоха четырьмя уровнями избыточного давления: 5, 10, 15 и 20 мм вод. ст. Тест производили через 15-20 минут после микроинъекции 10"5 М гастрин-рилизинг пептида или искусственной цереброспинальной жидкости (контроль) в объеме 50 нл в ядро солитарного тракта. Для оценки выраженности рефлекса на интегрированной ЭМГ диафрагмы определяли нормализованную продолжительность выдоха (Тс. та/Гс, Величину данного параметра рассчитывали как отношение продолжительности выдоха на фоне раздувания лёгких до появления последующего вдоха (Те, ти) к исходной продолжительности выдоха (Те. ¡„ц) [ВопЬаш, МсСпттоп, 1990]. На основании полученных данных строили графики зависимости нормализованной продолжительности выдоха от давления раздувания лёгких на фоне действия гастрин-рилизинг пептида и после микроинъекции искусственной цереброспинальной жидкости.

С целью исследования реакций дыхательной системы на гиперкапнический стимул использовали метод возвратного дыхания. Для воздействия гиперкапнического стимула и одновременного устранения возможного побочного влияния гипоксии использовали гиперкапнически-гипероксическую смесь, содержащую в начале тестирования 95% кислорода и 5% углекислого газа. Высокая степень гипероксии была обусловлена необходимостью физиологической блокады периферических хеморецепторов для получения гиперкапнической реакции с центральных хеморецепторов в чистом виде.

Гастрин-рилизинг пептид в концентрации 10"5 М или искусственную цереброспинальную жидкость в контрольных экспериментах инъецировали в вентролатеральный отдел ядра солитарного тракта.

Продолжительность каждого тестового воздействия с возвратным дыханием составляла 30 минут, в течение которых производилась регистрация ЭМГ наружных межреберных мышц. В целях определения динамики содержания углекислого газа в гиперкапнической смеси, каждые 2 минуты производили измерение уровня С02 (%) с помощью капнографа монитора МПР 6-03 «Тритон». При этом учитывали, что прирост легочной вентиляции от степени нарастания концентрации С02 имеет линейную зависимость [Донина, Александрова, 2010].

Для оценки выраженности вентиляторной реакции на гиперкапнию судили по интегрированной производной ЭМГ наружных межрёберных мышц, на которой определяли амплитуду залпов интегрированной активности и частоту дыхания. Затем вычисляли интегральный показатель их биоэлектрической активности (%) как произведение частоты дыхания %) и амплитуды в залпах интегрированной активности. Такой экспериментальный подход теоретически обоснован существованием высокой положительной

корреляции между величиной дыхательного объёма и амплитудой залпов на интегрированной ЭМГ инспираторных мышц [Evanich et al„ 1976].

На основе полученных данных строились аппроксимирующие функции интегрального показателя биоэлектрической активности наружных межреберных мышц и частоты дыхания от концентрации углекислого газа в дыхательной смеси. Они имели следующий вид: у = b + kx, где у -результирующий признак (значение интегрального показателя ЭМГ, либо частота дыхания (%)), х - факторный признак (концентрация С02), к -коэффициент регрессии, b - значение параметра при концентрации углекислого газа во вдыхаемом воздухе, равной нулю.

Кроме того, строились функции линейной регрессии для каждого эксперимента и рассчитывались средние значения параметров "Ь" и "к" + ошибка средней.

В отдельной серии экспериментов, наряду с исследованием показателей внешнего дыхания на микроинъекции 10 М гастрин-рилизинг пептида в область ядра солитарного тракта, производили регистрацию артериального давления. С этой целью животным вводили в просвет общей сонной артерии канюлю, заполненную гепаринизированным физиологическим раствором. Выше места надреза накладывали лигатуру, фиксировали канюлю с дыхательной трубкой, а затем подключали к ней датчик давления.

Полученные экспериментальные данные подвергали статистической обработке с помощью компьютерных программ SigmaStat 3.1 и SigmaPlot 9.01 (Jandel Scientific, USA). При анализе данных повторных измерений использовали тест ANOVA (one way repeated measures ANOVA), который дополняли парным t-тестом Стьюдента для попарного сравнения значений исследуемых параметров с исходными. В случае несоответствия данных нормальному распределению для анализа повторных измерений использовали ранговый тест ANOVA (one way repeated measures ANOVA on ranks), а для попарного сравнения значений параметров с исходными использовали знаковый ранговый тест Уилкоксона (Wilcoxon Signed Rank Test). Нормальность распределения данных в выборках проверяли с помощью теста Колмогорова-Смирнова, однородность дисперсий - с помощью теста Левена. Все данные представлены как средние арифметические ± стандартные ошибки среднего. Изменения исследуемых параметров считались статистически значимыми при Р<0.05. Для построения графиков использовали программу SigmaPlot 9.01 (Jandel Scientific, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Реакции внешнего дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в различные структурно-функциональные отделы дыхательного центра.

В данной главе представлены результаты экспериментов, выполненных с целью изучения реакций внешнего дыхания и биоэлектрической активности

диафрагмы и наружных межреберных мышц на микроинъекции 10'5. 10"8 и Ю"10 М гастрин-ршшзинг пептида в область локализации дорсальной респираторной группы, комплекса пре-Бётцингера, комплекса Бётцингера, рострального и каудального отделов вентральной дыхательной группы у наркотизированных крыс.

Микроинъекции искусственной цереброспинальной жидкости в перечисленные отдел дыхательного центра в контрольных наблюдениях не вызывали статистически значимых изменений показателей паттерна внешнего дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц.

Характер и выраженность дыхательных реакций на введение гастрин-рилизинг пептида в область ядра солитарного тракта зависели от концентрации исследуемого нейропептида в инъецируемом растворе. В частности, микроинъекции 10 М гастрин-рилизинг пептида не вызывали статистически значимого изменения паттерна дыхания и показателей ЭМГ инспираторных мышц.

В то же время, локальное введение 10"5 и 10~8 М растворов гастрин-рилизинг пептида в исследуемую область продолговатого мозга приводило к изменениям исследуемых показателей параметров паттерна внешнего дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц (рис. 1.1).

А

исходная запись 3 минута 10 минута 20 минута

b-A/VVVVV ААААЛА J\J\J\J\J\J\ АЛЛЛЛЛ»

* «у у » Чь m> fr fr fr » ^ f # Ф * » * ft ffr » -|г

/VWVAA. ЛЛЛЛЛЛ AAAA^JU3

-т»-тт-•tu—ч»-- ■■#—■-А—wr—t^r —t-T V—fr- -rr—#—*%—1fr—Т—я<""14

Б

Ь-ОЛ^Л-АА/ьиЛЛ/

_м—ц—» и. 1>—I»—. —4.-*-1»--*--(V—IV—ч—*—и " «» -Г*—»—«—И1—* 2

-V—«—¿Г-*-«Г—*<-- -1"—*—К—И—«--*-—и «► » Л—ч г »—*—*—«> "I 4

Рис. 1.1. Реакции паттерна дыхания (1), ЭМГ диафрагмы (2) и её интегрированной производной (3), ЭМГ наружных межреберных мышц (4) и её интегрированной производной (5) на микроинъекции 10"5 М (А) и 10"8 М (Б) гастрин-рилизинг пептида в область ядра солитарного тракта. Слева калибровка дыхательного объема, 1 мл; справа - калибровка по времени, 1 с

Наиболее выраженные респираторные реакции наблюдались при введении в ядро солитарного тракта Ш'8 М раствора гастрин-рилизинг пептида (рис. 1.2). Характерным признаком реакции было значительное увеличение

дыхательного объема (р<0,001: ANO VA) и короткий латентный период. Уже на второй минуте после инъекции он возрос с 0,74 ± 0,02 до 0,94 ± 0,07 мл (р<0,05: парный t-тест), а максимальный рост показателя зарегистрирован на 5 минуте воздействия пептида: с 0,74 ± 0,02 до 0,95 ± 0,06 мл (р<0,05: парный t-тест).

Одновременно с ростом дыхательного объёма наблюдалось статистически значимое снижение частоты дыхания (р<0,01: ранговый тест ANOVA). Данный показатель наиболее существенно снижался к 9 минуте после микроинъекции гастрин-рилизинг пептида - с 69,49 ± 1,52 в исходном состоянии до 62,23 ± 1,77 мин'1 (р<0,05: парный t-тест). Анализ продолжительности фаз цикла внешнего дыхания показал, что снижение частоты дыхания произошло за счёт удлинения выдоха (Р<0,01: ранговый тест ANOVA). Максимум изменений продолжительности которого приходился на 3 минуту после начала воздействия (с 0,58 ± 0,02 в исходном состоянии до 0,68 ± 0,01 с; р<0,01: парный t-тест).

1ДО ШЗЧДД ЕЭМОД I 1ЭМГ диафрагмы ^ЯЭМГ наружных межреберных мышц

Рис. 1.2. Динамика изменений дыхательного объема, частоты дыхания, минутного объема дыхания, амплитуды интегрированной электромиограммы диафрагмы и наружных межреберных мышц (в % от исходного уровня) после микроинъекции Ю"5 М (А) и 10 8 М (Б) гастрин-рилизинг пептида в вентролатеральный отдел ядра солитарного тракта. Звездочками обозначены статистически значимые результаты: *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001

Параллельно с дыхательным объемом возрастала амплитуда интегрированной электромиограммы наружных межреберных мышц (р<0,001: АИОУА). Максимальное увеличение этого параметра наблюдалось на 5 минуте после введения исследуемого нейропептида (на 21,9 ± 6,44%; р<0,05: парный N

тест). В то же время статистически значимых изменений аналогичного показателя активности диафрагмы не выявлено.

Характерные изменения показателей дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц обнаруживались и при введении в область ядра солитарного тракта 10"5 М раствора гастрин-рилизинг пептида (рис. 1.2.). Наблюдавшиеся при этом реакции характеризовались ростом дыхательного объема (р<0,001: ANO VA) и снижением частоты дыхания (р<0,001: ANO VA). Максимальное изменение дыхательного объема в данных экспериментальных условиях зарегистрировано на 20 минуте после микроинъекции пептида (с 0,75 ± 0,03 в исходном состоянии до 0,88+0,01 мл; р<0,05: парный t-тест). Значение частоты дыхания оказалось наименьшим через 7 минут после начала воздействия, когда выявлялось её снижение с 59,84 ± 1,19 до 51,57 ± 1,17 мин" (р<0,05: парный t-тест). Снижение частоты дыхания происходило за счёт удлинения выдоха (Р<0,001: ранговый тест ANO VA), максимум изменений которого приходился на 5 минуту после начала воздействия (с 0,61 ± 0,02 до 0,78 + 0,04 с; р<0,05: парный t-тест). Статистически значимых изменений продолжительности вдоха не выявлено. Параллельно с дыхательным объемом возрастала амплитуда интегрированной электромиограммы наружных межреберных мышц (р<0,01: ANOVA) и диафрагмы (р<0,01: ранговый тест ANO VA). Максимальное увеличение амплитуды электромиограммы наружных межреберных мышц выявлено на 10 минуте после инъекции (на 19,2 ± 5,90 %; р<0,05: парный t-тест), а электромиограммы диафрагмы - на 15 минуте (на 11,8 ± 4,10 %; р<0,05: парный t-тест).

Введение 105 М гастрин-рилизинг пептида сопровождалось небольшими, но статистически значимыми изменениями вентиляции лёгких (р<0,001: ANOVA). Минутный объём дыхания с 44,64 ± 1,01 мл/мин в исходном состоянии снижался до 39,89 ± 1,70 мл/мин к 5 минуте после введения пептида (р<0,05: парный t-тест), что определялось снижением частоты дыхания. На 1030 минутах эксперимента наблюдалась тенденция к возрастанию лёгочной вентиляции, но статистически значимых её изменений в этот период не обнаружено.

Стоит заметить, что респираторные реакции на микроинъекции 10" М гастрин-рилизинг пептида характеризовались коротким латентным периодом (в пределах 1 минуты) и динамика изменений объёмных и временных показателей паттерна внешнего дыхания несколько различалась. В частности, изменения временных показателей дыхания оказались наиболее выраженными на 4-8 минутах после инъекции, тогда как пик реакции объёмных показателей отмечался несколько позже (на 15-20 минутах). Примерно такая же продолжительность латентного периода реакций и динамика изменений временных показателей наблюдались и после микроинъекций 10' М гастрин-рилизинг пептида, тогда как максимальные изменения объёмных показателей обнаруживались несколько раньше (на 2-5 минутах).

Так как ядро солитарного тракта является не только областью локализации дорсальной респираторной группы, но также центральным звеном

рефлекторной дуги, принимающей афферентные импульсы от баро- и хеморецепторных зон [Jordan, 2001], особый интерес представляло исследование потенциальной возможности комплексного воздействия гастрин-рилизинг пептида на кардиоореспираторные показатели. Обнаружено, что гастрин-рилизинг пептид не оказывает статистически значимого влияния (р>0,05: ANOVA) на уровень среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений. В исходном состоянии среднее динамическое артериальное давление составляло 87,2 ± 3,6 мм рт.ст., а наиболее значительное его изменение наблюдалось через 20 минут после инъекции пептида, когда данный показатель составил 83,1 ± 3,5 мм рт.ст. (р>0,05: парный t-тест). В это же время наиболее отчётливо прослеживалась тенденция к росту частоты сердечных сокращений, которая возросла с 267 ± 26 мин"1 в исходном состоянии до 283 ± 12 мин"1 (р>0,05: парный t-тест).

В ходе исследования эффектов локального введения 10 s М гастрин-рилизинг пептида в область локализации комплекса Бётцингера было установлено, что данное вещество не оказывает существенного влияния на показатели паттерна внешнего дыхания и параметры ЭМГ инспираторных мышц. В частности, после микроинъекций гастрин-рилизинг пептида в комплекс Бётцингера дыхательный объём (р = 0,942: ранговый тест ANOVA) и амплитуда интегрированной ЭМГ диафрагмы (р = 0,028: ранговый тест ANOVA) и наружных межрёберных мышц (р = 0,798: ANOVA) оставались относительно стабильными на протяжении всего времени наблюдения. Хотя на отрезке времени от 2 до 15 минут после микроинъекции наблюдалась слабая тенденция к снижению частоты дыхания (с 78,88 ± 5,43 мин'1 в исходном состоянии до 75,29 ± 4,53 мин"1 на 15 минуте; р = 0,074: парный t-тест) и минутного объема дыхания (с 56,60 ± 4,60 мл/мин в исходном состоянии до 54,28 ± 3,98 мл/мин на 15 минуте; р = 0,132: парный t-тест), статистически значимых изменений этих показателей выявлено не было (р = 0,290 и 0,951, соответственно: ранговый тест ANOVA). В данных экспериментальных условиях гастрин-рилизинг пептид не оказывал влияния на продолжительность инспираторной (р = 0,113: ANOVA) и экспираторной (р = 0,330: ранговый тест ANOVA) фаз цикла внешнего дыхания.

Микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в область локализации комплекса пре-Бётцингера вызывали изменения параметров паттерна внешнего дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц. При этом характер и выраженность дыхательных реакций на введение гастрин-рилизинг пептида в комплекс пре-Бётцингера зависели от концентрации исследуемого нейропептида в инъецируемом растворе. Микроинъекции 10"8 М гастрин-рилизинг пептида не вызывали статистически значимого изменения паттерна дыхания и ЭМГ инспираторных мышц. Локальное введение 10"5 М раствора гастрин-рилизинг пептида в исследуемую область продолговатого мозга приводило к стимуляции дыхания, что проявлялось в соответствующих изменениях исследуемых показателей внешнего дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц (рис. 1.3).

исходная запись 3 минута 10 минута 20 минута

И 'ÍUUUJJ.А -ЛЛЛЛЛЛ.ЛЛ Л.АЛ.ЛЛЛ.АЛ. -AJW\J\J\J\JU1

4> « « <—<—--* * i » « J * <>2

ч ■ f ■

-+-f i f И1 М1 *—Н » Н Mi t t т »* Ti4

7\.л.л..л./\_л.А АЛлЛЛЛАЛ..

1 с

Рис. 1.3. Реакции паттерна дыхания (1), ЭМГ диафрагмы (2) и её интегрированной производной (3), ЭМГ наружных межреберных мышц (4) и её интегрированной производной (5) на микроинъекции 10"5 М гастрин-рилизинг пептида в область локализации комплекса пре-Бётцингера. Слева калибровка дыхательного объема, 1 мл; справа - калибровка по времени, 1 с

Наиболее характерной чертой респираторных реакций, наблюдавшихся после введения 10"5 М раствора, было существенное увеличение частоты дыхания (рис. 1.4) (р<0,001: ANOVA), которое характеризовалось коротким латентным периодом. Уже на первой минуте после инъекции изменения составили +6,17+1,49 мин"' (с 75,53 ±2,37 до 81,69 + 2,93 мин"1; р<0,01: парный t-тест), а максимальный рост частоты дыхания зарегистрирован на третьей минуте воздействия пептида: с 75,53 + 2,37 мин"1 в исходном состоянии до 83,27 ± 3,61 мин'1 (р<0,05: парный t-тест). Анализ продолжительности фаз цикла внешнего дыхания показал, что увеличение частоты дыхания произошло за счёт укорочения выдоха (р<0,001: ANO VA), максимум изменений которого приходился на третью минуту после начала воздействия (с 0,54 + 0,04 с до 0,47 + 0,03 с; р<0,01: парный t-тест). Существенных изменений продолжительности вдоха обнаружено не было (р = 0,579: ANOVA).

40 % 30

20 -1 10

-10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 20 30 40 60 мин ■■ДО' 14ПЛ ШЕЗМОД С13ЭМГ диафрагмы Е53ЭМГ наружных межреберных мышц

Рис. 1.4. Динамика изменений дыхательного объема, частоты дыхани) минутного объема дыхания, амплитуды интегрированной электромиограмм] диафрагмы и наружных межреберных мышц (в % от исходного уровня) поел микроинъекции 10"5 М гастрин-рилизинг пептида в область локализаци комплекса пре-Бетцингера. Звездочками обозначены статистически значимы результаты: *р<0,05, **р<0,01, ***р<0.001

Одновременно с ростом частоты дыхания наблюдалось небольшое, но статистически значимое увеличение дыхательного объема (р = 0,033: ранговый тест ANOVA). Данный показатель наиболее существенно возрастал к 6 минуте после микроинъекции гастрин-рилизинг пептида - с 0,74 ± 0,03 мл в исходном состоянии до 0,82 ± 0,04 мл (р<0,05: парный t-тест).

Параллельно с дыхательным объемом статистически значимо возрастала амплитуда интегрированной электромиограммы наружных межреберных мышц (р = 0,048: ранговый тест ANO VA), но не диафрагмы (р = 0,108: ранговый тест ANOVA). Кроме того, тенденция к росту амплитуды интегрированной кривой для наружных межреберных мышц в целом была выражена сильнее, чем для диафрагмы. Её максимальное увеличение наблюдалось на 5 минуте после введения исследуемого нейропептида (на 21,21 ±7,85%: р<0,05: парный t-тест).

Одновременное увеличение частоты и глубины дыхания в данных экспериментальных условиях привело к росту вентиляции лёгких (р = 0,009: ранговый тест ANOVA). В течение первых трех минут после воздействия нейропептида минутный объем дыхания прогрессивно нарастал с 55,99 ± 1,70 мл/мин в исходном состоянии до 69,25 ± 3,45 мл/мин на третьей минуте (р<0,05: парный t-тест).

В экспериментах с микроинъекциями 10"5 М гастрин-рилизинг пептида в ростральный отдел вентральной дыхательной группы не было обнаружено статистически значимого влияния данного пептида на паттерн внешнего дыхания и биоэлектрическую активность инспираторных мышц. Вместе с тем, стоит отметить умеренную тенденцию к прогрессивному снижению дыхательного объема (с 0,61 ± 0,07 мл в исходном состоянии до 0,56 ± 0,07 мл на 60 минуте; р = 0,155: парный t-тест) и амплитуды интегрированной ЭМГ диафрагмы (на 7,2% к 60 минуте; р = 0,157: парный t-тест), после введения гастрин-рилизинг пептида в данный отдел дыхательного центра (р = 0,281: тест ANOVA и р = 0,029: тест ANOVA, соответственно). При этом биоэлектрическая активность наружных межреберных мышц (р = 0,871: ранговый тест ANOVA), частота дыхания (р = 0,658: ранговый тест ANOVA) и минутный объем дыхания (р = 0,916: тест ANOVA) сохраняли относительную стабильность.

Микроинъекции 10"5 М гастрин-рилизинг пептида в каудальный отдел вентральной дыхательной группы также не вызывали статистически значимых изменений дыхания. В исходном состоянии минутный объем дыхания составлял 52,35 ± 2,44 мл/мин. Наиболее выраженная тенденция к росту данного показателя выявлена на 30 минуте после микроинъекции, когда его величина составила 60,02 ± 5,62 мл/мин (р = 0,074: ранговый t-тест). Подобная тенденция зарегистрирована и в отношении частоты дыхания, возросшей с 72,13 ± 3,76 мин"1 в исходном состоянии до 74,40 ± 3,62 мин"1 на 30 минуте (р = 0,426: ранговый t-тест). Дыхательный объем (р = 0,203: ранговый тест ANOVA), биоэлектрическая активность диафрагмы (р = 0,404: тест ANOVA) и наружных межреберных мышц (р = 0,917: ранговый тест ANOVA) оставались

относительно стабильными на протяжении всего времени наблюдения.

2. Влияние микроинъекций гастрин-рилизинг пептида в ядро солитарного тракта на рефлекс Геринга-Брейера В данных экспериментах исследовали влияние микроинъекций 10"5 М гастри-рилизинг пептида в ядро солитарного тракта на выраженность рефлекса Геринга-Брейера. Проведённые эксперименты показали, что воздействие 10"5 М гастрин-рилизинг пептида на область ядра солитарного тракта оказывает ингибирующее влияние на проявление рефлекса Геринга-Брейера.

Установлено, что раздувание легких на фоне действия введенного пептида приводит к укорочению временного интервала от начала воздействия до появления последующего вдоха и, соответственно, к снижению нормализованной длительности выдоха и, следовательно, укорочению продолжительности экспираторных остановок дыхания вследствие раздувания

35 30 25 20 15 10 5 0

Телих/ТЕ. И

10

15

-•-иЦСЖ

-¡О-'М

легких.

Анализ полученных данных (рис. 2.1) показал, что в целом форма графика зависимости

нормализованной продолжительности выдоха от давления раздувания лёгких сохранилась прежней и на фоне действия гастрин-рилизинг пептида, при этом, однако, произошло смещение графика вниз 20 см [НгО] по сравнению с контрольным, т.е. в сторону меньших значений нормализованной длительности выдоха. Статистически значимые различия величины нормализованной продолжительности выдоха после введения гастрин-рилизинг гормона по сравнению с контролем обнаружены при использовании избыточного давления раздувания лёгких 5, 10, 15 и 20 см вод.ст (рис. 2.1). При раздувании легких данными уровнями избыточного давления нормализованная продолжительность выдоха снижалась, соответственно, с 4,92 ± 0,55 (в контрольных измерениях) до 3,47 ± 0,30 (р<0,01: парный 1-тест), с 11,01 ± 1,79 (в контрольных измерениях) до 7,11 ± 0,77 (р<0,01: парный 1-тест), с 19,03+2,23 (в контрольных измерениях) до 13,05+1,61 (р<0,001: знаковый ранговый тест Уилкоксона) и с 27,69 ± 2,02 (в контрольных измерениях) до 22,64 + 2,23 (р<0,001: парный 1-тест). При этом в среднем снижение

Рис. 2.1. Влияние

микроинъекций 105 М гастрин-рилизинг пептида в ядро солитарного тракта на рефлекс Геринга-Брейера. По оси ординат: нормализованная длительность выдоха (Те. шм/Те. ¡„); По оси абсцисс: давление раздувания лёгких (см [НгО])

нормализованной длительности экспирации по сравнению с контролем в опытной группе составило 29,5; 35,4; 31,4 и 18,24%, соответственно.

Таким образом, одним из важных механизмов влияния данного пептида на глубину дыхания, проявлявшегося в условиях локального воздействия гастрин-рилизинг пептида на область ядра солитарного тракта, является модуляция им данного рефлекса.

3. Влияние микроинъекций гастрин-рилизинг пептида в ядро солитарного тракта на вентиляторную чувтвительность к гиперкапнии

В настоящем разделе изучалось влияние микроинъекций гастрин-рилизинг пептида в ядро солитарного тракта на выраженность вентиляторных реакций на гиперкапнию. Для этого в экспериментах с возвратным дыханием регистрировали реакции интегрального показателя активности наружных межрёберных мышц после инъекций гастрин-рилизинг пептида или искусственной цереброспинальной жидкости (контроль) в ядро солитарного тракта на фоне дыхания крыс гиперкапнически-гипероксической газовой смесью с начальным составом: 5% С02 и 95% 02.

В процессе возвратного дыхания происходило постепенное повышение концентрации С02 во вдыхаемом воздухе и, соответственно, возрастало значение интегрального показателя активности наружных межреберных мышц, рассчитываемого как произведение максимальной амплитуды залпов активности на ЭМГ наружных межреберных мышц и частоты дыхания. Как правило, данный показатель достигал наивысшего значения к концу 30-минутной экспозиции гиперкапнической смесью, когда концентрация углекислого газа становилась наибольшей.

Полученные в ходе исследования значения максимальных изменений интегрального показателя биоэлектрической активности наружных межреберных мышц и динамика изменений концентрации углекислого газа, позволили вычислить линейную корреляцию между этими показателями. Как по данным контрольных наблюдений, так для опытов с введением гастрин-рилизинг пептида, были построены графики аппроксимирующих функций (у = 10534,64 + 1059,34 х и у = 12980,63 + 586,58 х, соответственно), факторный и результирующий признаки которых положительно коррелировали с высоким уровнем статистической значимости: коэффициент корреляции Пирсона г составил 0,436 (р<0,001) и 0,294 (р<0,001), соответственно (рис. 3.1).

Регрессионный анализ не выявил статистически значимых различий между двумя экспериментальными группами в значении параметра "Ь" линейных регрессий, соответствующего точке пересечения аппроксимирующего графика линейной корреляции с осью ординат, т.е. для концентрации С02 во вдыхаемом воздухе, равной нулю. Эти значения для контрольных экспериментов и для экспериментов с микроинъекциями 10" М вИР составили, соответственно, 12307,70+1040,91 и 14470,18+1244,92 (различия между группами статистически незначимы: р>0,170, парный 1-тест). В то же время, коэффициенты регрессии, характеризующие наклон прямых относительно оси абсцисс, были больше в контроле по сравнению с данными.

полученными в опытах с введением СИР: соответственно, 820,07+134,96 и 414,84+96,07 (различия между группами статистически значимы: р<0,005, парный М-ест). Это указывает на менее выраженный прирост интегрального показателя активности наружных межрёберных мышц при нарастании выраженности гиперкапнического стимула после микроинъекций гастрин-рилизинг пептида в ядро солитарного тракта по сравнению с аналогичным приростом в контрольных экспериментах, что свидетельствует об ослаблении вентиляторной чувствительности к гиперкапнии под влиянием исследуемого вещества.

В данных экспериментальных условиях на протяжении всего периода наблюдения динамика изменений частоты дыхания в экспериментах с микроинъекциями искусственной цереброспинальной жидкости и гастрин-рилизинг пептида практически не различалась. Об этом говорит отсутствие статистически значимых различий коэффициентов регрессии (-1,892+0,533 и -1,745+0,298; р=0,764: парный, Ьтест) для графиков зависимости частоты дыхания от содержания С02 во вдыхаемом воздухе (рис. 3.1).

А Б

Рис. 3.1. Зависимость изменений интегрального показател биоэлектрической активности наружных межреберных мышц (А) и частот] дыхания (Б) от концентрации С02 во вдыхаемом воздухе в условия микроинъекции в ядро солитарного тракта 10"5 М гастрин-рилизинг пептид (п=10) и искусственной цереброспинальной жидкости (контроль, п=10 Черные точки и черная линия регрессии - данные, полученные экспериментах с микроинъекциями Ю"5 М вИР, белые точки и пунктирна линия регрессии - в экспериментах с микроинъекциями искусственно цереброспинальной жидкости

В то же время, было обнаружено статистически значимое различие для контрольной и опытной групп наблюдений в значении коэффициента регрессии между амплитудой залпов активности интегрированной ЭМГ наружных межреберных мышц и содержанием С02 во вдыхаемом воздухе. Значения коэффициента регрессии составили 12,068±1,275 для контрольных опытов и

9.642+1,607 для экспериментов с инъекциями 10'5 М вЯР (различие между группами статистически значимо: р = 0,029, парный 1-тест). Учитывая существование жёсткой зависимости между максимальной амплитудой залпов на интегрированной ЭМГ инспираторных мышц и величиной дыхательного объема [ЕуашсЬ Л а1., 1976], можно сделать заключение о том, что описанное выше относительное снижение интегрального показателя биоэлектрической активности наружных межреберных мышц, возникшее под действием вИР, определялось влиянием исследуемого нейропептида на дыхательный объем, но не на частоту дыхания.

Таким образом, полученные данные показывают, что микроинъекции 10"5 М гастрин-рилизинг пептида в ядро солитарного тракта ослабляют вентиляторную чувствительность к гиперкапнии. Это свидетельствует о вовлечении исследуемого нейропептида в модуляцию центральной хемочувствительности к углекислому газу на уровне дорсальной респираторной группы.

ВЫВОДЫ

1. Анализ данных, полученных в экспериментах с микроинъекциями гастрин-рилизинг пептида в различные структурно-функциональные отделы дыхательного центра (дорсальная дыхательная группа, комплекс Бётцингера, комплекс пре-Бётцингера, ростральная и каудальная вентральные респираторные группы), показал, что данный пептид способен оказывать непосредственное влияние на функцию бульбарного дыхательного центра. При этом дыхательные эффекты исследуемого нейропептида реализуются на уровне дорсальной респираторной группы и комплекса пре-Бётцингера.

2. Введение 10"5 и 10"8 М гастрин-рилизинг пептида в вентролатеральное ядро солитарного тракта приводят к возрастанию дыхательного объема, амплитуды интегрированной кривой наружных межреберных мышц и диафрагмы и, менее выраженному, снижению частоты дыхания. Микроинъекции Ю'10 М гастрин-рилизинг пептида оказались подпороговыми и не вызывали изменений внешнего паттерна дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц.

3. Установлено, что локальное воздействие гастрин-рилизинг пептида на уровне ядра солитарного тракта ингибирует рефлекс Геринга-Брейера. Таким образом, важным механизмом респираторной активности этого пептида на уровне дорсальной дыхательной группы является модуляция им данного рефлекса.

4. Локальное воздействие гастрин-рилизинг пептида на вентролатеральный отдел ядра солитарного тракта ослабляет вентиляторную чувствительность к гиперкапнии, что указывает на участие данного нейропептида в модуляции центральной хемочувствительности к углекислому газу на уровне дорсальной респираторной группы.

5. Показано, что микроинъекции 10"5 М гастрин-рилизинг пептида в комплекс пре-Бётцингера вызывают увеличение частоты дыхания, главным

образом, за счет укорочения экспираторной фазы, и незначительное возрастание дыхательного объема. Введение 10"8 М гастрин-рилизинг пептида не вызывало изменений паттерна внешнего дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц. Таким образом, гастрин-рилизинг пептид способен оказывать непосредственное влияние на механизмы респираторного ритмогенеза структурами комплекса пре-Бётцингера.

6. При воздействии 10"5 М гастрин-рилизинг пептида на ростральный и каудальный отделы вентральной дыхательной группы, а также комплекс Бётцингера респираторных реакций не наблюдалось. Это свидетельствует об отсутствии заметной роли данных отделов дыхательного центра в опосредовании респираторной активности гастрин-рилизинг пептида.

Список публикаций по теме диссертации

Публикации в журналах, рекомендованных БАК РФ

1. Алиев A.A. Гастрин-рилизинг пептид - потенциальный участник бульбарных механизмов регуляции дыхания /A.A. Алиев // Вестник Самарского государственного университета. 2011. Т. 83. №2. С. 209-215.

2. Алиев A.A. Респираторные реакции на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в ядро солитарного тракта / A.A. Алиев, И.О. Петряшин, А.Н. Инюшкин // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2012. Т. 98. № 5. С. 598609.

3. Алиев A.A. Влияние микроинъекций гастрин-рилизинг пептида в комплекс пре-бетцингера на показатели дыхания крыс / A.A. Алиев, А.Н. Инюшкин // Вестник Самарского государственного университета. 2012. Т. 97. №6. С. 167-173.

Публикации е других изданиях

4. Алиев A.A. Респираторные эффекты микроинъекций GRP на уровне ядра солитарного тракта /A.A. Алиев // Биология - наука XXI века: материалы 15 международной Пущинской школы-конференцим молодых учёных. Пущино, 2011. С. 175-176.

5. Алиев A.A. Влияние микроинъекций гастрин-рилизинг пептида в область ядра солитарного тракта на показатели дыхания крыс /A.A. Алиев // Конференция молодых учёных «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды»: материалы. С.-Пб, 2010. С. 6-7.

6. Алиев A.A. Реакции дыхания на микроинъекции гастрин-рилизинг-пептида в область ядра солитарного тракта /A.A. Алиев // Наука, образование, медицина: материалы ежегодной Российской научно-практической конференции. Самара: Изд-во «Инсома-пресс», 2011. С. 196-198.

7. Алиев A.A. Реакции дыхания на введение гастрин-рилизинг пептида в комплекс пре-Бётцингера крыс /A.A. Алиев // Актуальные проблемы химии и биологии: материалы Всероссийской молодежной конференции. Пущино, 2012. С. 96-97.

8. Алиев A.A. Респираторные эффекты на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в комплекс пре-Бётцингера крыс /A.A. Алиев // И межвузовская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых: тезисы докладов. Самара: Изд-во «Инсома-пресс», 2012. С. 30-31.

9. Алиев A.A. Реакции дыхания на введение гастрин-рилизинг пептида в область локализации дорсальной респираторной группы крыс /A.A. Алиев // Биология - наука XXI века: материалы 16 международной Пущинской школы-конференции молодых учёных. Пущино, 2012. С. 397-398.

10. Алиев A.A. Реакции дыхания на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в область локализации дорсальной респираторной группы крыс /A.A. Алиев // VII сибирский съезд физиологов: тезисы докладов. Красноярск, 2012. 688 с.

Список сокращений ГАМК - гамма - аминомасляная кислота Tj - длительность инспирации Те - длительность экспирации ДО (V,) - дыхательный объем МОД (V;) - минутный объем дыхания ЧДД (f) - частота дыхательных движений иЦСЖ - искусственная цереброспинальная жидкость ЭМГ - электромиограмма GRP - гастрин-рилизинг пептид

Подписано в печать 24.05.2013. Формат 60 х 84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем - 1,5 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ №. 64

Отпечатано в типографии «Инсома-пресс» 443080, г. Самара, ул. Санфировой, 110А, оф. 22А, тел. 222-92-40, E-mail: insoma@bk.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алиев, Артём Алиевич, Самара

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

04201360191 На правах рукописи

/

Алиев Артём Алиевич

ЗНАЧЕНИЕ ГАСТРИН-РИЛНЗИНГ ПЕПТИДА В БУЛЬВАРНЫХ МЕХАНИЗМАХ РЕГУЛЯЦИИ ДЫХАНИЯ

03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Инюшкин А.Н.

Самара-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. Структурно-функциональная организация дыхательного центра.........16

1.2. Роль нейропептидов в центральных механизмах регуляции

дыхания................................................................................................22

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ 39

2.1. Экспериментальные животные. Наркоз.........................................39

2.2. Операционная подготовка..........................................................39

2.3. Микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в структуры мозга............41

2.4. Регистрация паттерна дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц...............................................................................44

2.5. Исследование рефлекса Геринга-Брейера........................................45

2.6. Исследование вентиляторной реакции на гиперкапнию.....................46

2.7. Статистическая обработка результатов..........................................49

2.8. Вещества, использованные в работе..............................................49

ГЛАВА 3. РЕАКЦИИ ВНЕШНЕГО ДЫХАНИЯ И БИОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИНСПИРАТОРНЫХ МЫШЦ НА МИКРОИНЪЕКЦИИ ГАСТРИН-РИЛИЗИНГ ПЕПТИДА В РАЗЛИЧНЫЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОТДЕЛЫ ДЫХАТЕЛЬНОГО ЦЕНТРА 50

3.1. Реакции на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в область ядра солитарного тракта.................................................................................50

3.2. Реакции на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в комплекс Бётцингера..........................................................................................61

3.3. Реакции на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в область комплекса пре-Бётцингера........................................................................65

3.4. Реакции на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в ростральный и

каудальный отделы вентральной дыхательной группы...................................71

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ МИКРОИНЪЕКЦИЙ ГАСТРИН-РИЛИЗИНГ ПЕПТИДА В ЯДРО СОЛИТ АРНОГО ТРАКТА НА РЕФЛЕКС ГЕРИНГА-БРЕЙЕРА 78

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ МИКРОИНЪЕКЦИЙ ГАСТРИН-РИЛИЗИНГ ПЕПТИДА В ЯДРО СОЛИТ АРНОГО ТРАКТА НА ВЕНТИЛЯТОРНУЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ГИПЕРКАПНИИ 83

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 90

ВЫВОДЫ 111

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 113

ВВЕДЕНИЕ Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время физиология дыхания, благодаря использованию современных экспериментальных методик, располагает точными и достоверными данными о локализации и взаимном расположении структурно-функциональных областей дыхательного центра. В результате внутриклеточной регистрации биоэлектрической . активности дыхательных нейронов в комбинации с другими нейрофизиологическими методами удалось вплотную подойти к пониманию природы дыхательного ритмогенеза. Тем не менее, механизмы нейрохимического обеспечения деятельности дыхательного центра, основанные на разнообразии медиаторов, нейромодуляторов, на специфических синаптических взаимодействиях нейронов различных типов, требуют дальнейшего изучения. Данные о нейрохимической организации дыхательного центра являются важным шагом к пониманию особенностей функционирования дыхательного центра, механизмов его взаимодействия с центрами других физиологических функций.

Важнейшей группой эндогенных химических регуляторов, принимающих активное участие в механизмах взаимодействия нейронов дыхательного центра, являются нейропептиды. Представляя обширную группу нейромодуляторов, они вовлечены в тонкую регуляцию физиологических функций, в том числе дыхания. Интерес к этим биологически активным веществам вызван их распространенностью в центральной нервной системе, их полифункциональностью и плейотропностью, а также перспективами их использования в медицине, что определяет необходимость детального изучения полного спектра физиологической активности нейропептидов [Ашмарин с соавт., 1999; Strand, 2003; Egleton et al., 2005; Merighi et al., 2011].

В настоящее время активно изучаются центральные эффекты пептидов бомбезинового семейства, в частности, гастрин-рилизинг пептида. Показано участие данного нейропептида в регуляции аппетита [Ladenheim et al., 2002],

температуры тела [Tsushima et al., 2003], в реализации стрессорных реакций [Merali et al., 2002], грумингового поведения и локомоторной активности у грызунов [Masui et al., 1993]. Получены данные о вовлечении гастрин-рилизинг пептида в механизмы памяти и обучения за счет модуляции высвобождения ГАМК на уровне ядра солитарного тракта и структур миндалевидного комплекса [Shumyatsky et al., 2002; Kamichi et al., 2005].

Поводом для изучения участия гастрин-рилизинг пептида в центральных механизмах регуляции дыхания послужили результаты иммуногистохимических исследований. Согласно им, в области ядра солитарного тракта, входящей в состав бульбарного дыхательного центра, наблюдается относительно высокий уровень экспрессии специфических рецепторов к гастрин-рилизинг пептиду [Kamichi et al., 2005], матричной РНК пептида [Wada et al., 1990] и самого эндогенного гастрин-рилизинг пептида [King et al., 1989].

В отдельных работах получены данные о том, что аналог гастрин-рилизинг пептида бомбезин вызывает респираторные эффекты при микроинъекциях в область ядра солитарного тракта наркотизированных крыс [Глазкова с соавт., 2003; Инюшкин, Глазкова, 2005]. Однако бомбезин обладает практически одинаковой аффинностью как к ВВЬ так и ВВ2 рецепторам, тогда как гастрин-рилизинг пептид является преимущественным агонистом ВВ2 подтипа, и его респираторные эффекты могут определяться, в первую очередь, экспрессией ВВ2 подтипа рецепторов в функционально-специфичных областях дыхательного центра. К тому же, в отличие от бомбезина, выделенного у амфибий, гастрин-рилизинг пептид, наряду с нейромедином В, является специфичным для млекопитающих эндогенным нейропептидом [Wada et al., 1990], поэтому исследование на теплокровных животных центральных респираторных эффектов данного представителя нейропептидов бомбезинового семейства выглядит более адекватным.

Цели и задачи исследования: целью работы явилось изучение роли и физиологических механизмов участия гастрин-рилизинг пептида в центральной регуляции дыхания.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Идентифицировать отделы дыхательного центра, играющие наиболее важную роль в реализации респираторных эффектов гастрин-рилизинг пептида.

2. Определить характер респиратерньгх-реакций~на~Мйкроинъекции гастрин-рилизинг пептида в ядро солитарного тракта и их зависимость от концентрации исследуемого вещества.

3. Изучить роль гастрин-рилизинг пептида в реализации рефлекса Геринга-Брейера на уровне ядра солитарного тракта.

4. Исследовать влияние микроинъекций гастрин-рилизинг пептида в область ядра солитарного тракта на выраженность вентиляторных реакций на гиперкапнию.

5. Выяснить особенности респираторных реакций на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в отдел дыхательного центра, играющий важную роль в ритмогенезе дыхания - комплекс пре-Бётцингера.

6. Установить характер респираторных реакций на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в ростральный и каудальный отделы вентральной респираторной группы и комплекс Бётцингера.

Научная новизна работы. В данном исследовании впервые изучены респираторные эффекты на микроинъекции различных концентраций гастрин-рилизинг пептида в структурно-функциональные отделы бульбарного дыхательного центра. Показано участие исследуемого нейропептида в центральных механизмах регуляции дыхания.

Обнаружено, что активность гастрин-рилизинг пептида реализуется, главным образом, на уровне дорсальной респираторной группы и, в меньшей степени, комплекса пре-Бётцингера. Установлено, что специфика реакций со стороны паттерна внешнего дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц, определяется не только концентрациями гастрин-рилизинг пептида, но также функциональными особенностями исследуемых отделов мозга. В частности, характерной реакцией на микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в комплекс пре-Бётцингера, ритмогенерирующий отдел дыхательного центра,

являлся рост частоты дыхания, в то время как дыхательный объем изменялся незначительно. При этом в экспериментах с введением нейропептида в ядро солитарного тракта возрастал дыхательный объем и незначительно снижалась частота дыхания.

Впервые получены данные, указывающие на участие гастрин-рилизинг пептида в модуляции центральной хемочувствительности к углекислому газу на уровне дорсальной респираторной группы. Показано, что микроинъекции данного пептида в ядро солитарного тракта ослабляют вентиляторную чувствительность к гиперкапнии. Полученные в работе результаты впервые продемонстрировали участие гастрин-рилизинг пептида в механизмах передачи афферентации, поступающей в ядро солитарного тракта от рецепторов растяжения легких. Показано, что локальное воздействие пептида на эту область ствола мозга оказывает ингибирующее влияние на проявление рефлекса Геринга-Брейера. Этот эффект может лежать в основе модулирующего влияния гастрин-рилизинг пептида на глубину дыхания.

Теоретическое и практическое значение работы. Исследования центральной респираторной активности гастрин-рилизинг пептида ранее не проводились. В литературе достаточно полно освещены вопросы экспрессии, фармакологии, связывания и структуры специфических рецепторов к гастрин-рилизинг пептиду, однако его функциональное значение, в частности, на уровне бульбарного отдела ствола мозга до настоящего времени оставалось неясным. Результаты работы, раскрывающие роль и механизмы участия гастрин-рилизинг пептида и его рецепторов в деятельности дыхательного центра важны для понимания нейрохимических закономерностей респираторного ритмогенеза и регуляции паттерна дыхания.

Полученные данные об особенностях центральной респираторной активности гастрин-рилизинг пептида, о характере респираторных реакций на микроинъекции пептида в различные структурно-функциональные отделы дыхательного центра, о модуляции им рефлекса Геринга-Брейера и вентиляторной чувствительности к гиперкапнии являются существенным вкладом

в понимание физиологических механизмов действия данного нейропептида на бульбарном уровне.

Результаты настоящей работы могут использоваться при разработке лекарственных препаратов на основе аналогов пептидов бомбезинового семейства для центральной коррекции дыхательных нарушений, а также препаратов, участвующих в регуляции защитных дыхательных рефлексов (например, противокашлевые средства центрального действия). Сравнительно недавно было продемонстрировано периферическое действие бомбезин-родственных пептидов и их специфических рецепторов в реализации легочных хеморефлексов, кашле, бронхоспазме и гиперсекреции слизи в дыхательных путях [Gu, Lee, 2005].

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Среди бульбарных структур, входящих в состав дыхательного центра, главную роль в опосредовании респираторных эффектов гастрин-рилизинг пептида играют дорсальная респираторная группа и комплекс пре-Бётцингера.

2. Микроинъекции гастрин-рилизинг пептида в область дорсальной респираторной группы и комплекс пре-Бётцингера приводят к изменениям паттерна внешнего дыхания, биоэлектрической активности наружных межреберных мышц и диафрагмы.

3. На уровне ядра солитарного тракта гастрин-рилизинг пептид повышает чувствительность нейронов к афферентным сигналам, поступающим от медленно адаптирующихся рецепторов растяжения легких, что приводит к ингибированию рефлекса Геринга-Брейера.

4. Локальное воздействие гастрин-рилизинг пептида на вентролатеральный отдел ядра солитарного тракта ослабляет вентиляторную чувствительность к гиперкапнии, что указывает на участие данного нейропептида в модуляции центральной хемочувствительности к углекислому газу на уровне дорсальной респираторной группы.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на XV Конференции молодых учёных «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды» (Санкт-Петербург, институт физиологии им. Павлова РАН, 2010); XV и XVI международных Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пушино, 2011, 2012); XXXV, XXXVI и XXXVII Научных конференциях молодых учёных и специалистов СамГУ (Самара, 2010, 2011, 2012); Ежегодной Всероссийской научно-практической конференции «Наука. Образование. Медицина» (Самара, СМИ "Реавиз", 2011); II межвузовской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Самара, СМИ "Реавиз", 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 статьи в журналах, включённых в перечень рецензируемых научных журналов и изданий.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурно-функциональная организация дыхательного центра

В настоящее время общепринятым является положение о том, что первостепенная роль в регуляции дыхания отводится бульбарному дыхательному центру. М.В.Сергиевский в своей работе [Сергиевский, 1950] определяет дыхательный центр как ограниченный участок в центральной нервной системе, где происходит окончательное формирование дыхательного импульса, в результате чего создаётся координированная деятельность мышц, обеспечивающих для организма потребную величину газообмена.

Данная структура, включающая нейронные элементы, физиологически определяемые в мозговом стволе, и их скопления в функционально-специфических отделах продолговатого мозга, формируют выходы спинальным мотонейронам, активирующим инспираторные и экпираторные дыхательные мышцы, а также к черепным мотонейронам, контролирующим дыхательные пути [Сергиевский с соавтор., 1993; Пятин, Никитин, 1998; Zheng et al., 1991, 1992а, 1992b; Bianchi et al., 1995].

Эксперименты, проведенные на наркотизированных животных, а также опыты in vitro, получившие популярность с усовершенствованием микроэлектродной техники, позволили идентифицировать в продолговатом мозге нейроны, проявляющие ритмическую активность, синхронизированную с фазами дыхательного цикла [Пятин, Никитин, 1998; Ramirez, Zuperku et al., 2002]. Эти нейроны, объединённые в респираторную нейронную сеть, являются клеточной основой дыхательного центра. Дыхательные нейроны концентрируются в двух основных респираторных областях, получивших название дорсальной дыхательной группы (ДРГ), находящейся в вентролатеральном отделе ядра солитарного тракта (ЯСТ), и вентральной дыхательной колонны, локализованной в вентролатеральном отделе продолговатого мозга. В каудальной части колонны

и

выделяют вентральную дыхательную группу (ВРГ), включающую ростральный и каудальный отделы [Сафонов, Чумаченко, Ефимов, 1980; Сергиевский с соавтор., 1993; Инюшкин, Меркулова, 1998; Bianchi et al., 1995]. Ростральнее находятся комплекс пре-Бётцингера и комплекс Бётцингера [Kalia et al., 1979; Ramírez, Richter, 1996]. Эти скопления нейронов взаимосвязаны и вместе со специфическими респираторными афферентами отвечают за автоматический контроль дыхания, а также за адаптивные реакции дыхания, возникающие в ответ на разнообразные изменения окружающей среды и гомеостаза.

Свой вклад в модуляцию функций бульбарного дыхательного центра вносят также дополнительные нейронные группы мозгового ствола, промежуточного и переднего мозга. Они включают респираторные нейроны дорсолатеральной части моста, которые иногда обозначаются как понтинная респираторная группа [Bianchi et al., 1995; Feldman, Smith, 1995], нейроны околоводопроводного серого вещества среднего мозга (ОСВ), а также нейроны гипоталамуса, миндалины и коры больших полушарий. Нейроны ОСВ непосредственно проецируются к респираторным нейронам каудальной части продолговатого мозга, а также модулируют дыхание опосредованно, после синаптического переключения проекций в дорсолатеральном и вентролатеральном отделах варолиева моста [Hayward, Castellanos et al., 2004; McCrimmon et al., 2004; Subramanian, Balnave, 2008]. Имеются свидетельства о причастности к механизмам регуляции дыхания дорсомедиальных [McDowall, Horiuchi et al., 2007], каудальных ядер гипоталамуса [Horn, Dillon, 1999; Horn, Kramer, 2000], миндалины [Акопян с соавтор., 1991; Adamyan, Akopyan, 2006] и коры [Horn, Waldrop, 1998]. Эти отделы мозга являются источником афферентации для различных отделов дыхательного центра.

Нейронные элементы продолговатого мозга, регулирующие сокращения дыхательных мышц, проявляют залповую активность во время инспирации, либо во время экспирации, что приводит к изменению объема легких. Они включают бульбоспинальные нейроны, проецирующиеся к спинному моз