Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль мембранных транспортных белков в регуляции продукции цефалоспорина C у Acremonium chrysogenum

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Роль мембранных транспортных белков в регуляции продукции цефалоспорина C у Acremonium chrysogenum"

005533160

ДУМИНА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

Роль мембранных транспортных белков в регуляции продукции цефалоспорина С у Асгетопшт сЬгузодепит

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 СЕН 2013

Москва, 2013

005533160

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центре «Биоинженерия» Российской академии наук

Ведущая организация:

Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится «8» октября 2013 г. в 15.30 на заседании Совета Д 501.001.21 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, аудитория М-1. Тел.8(495)939-54-83, эл. почта npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ. Автореферат разослан «2» сентября 2013 г.

Ученый секретарь

Научные руководители:

кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич кандидат биологических наук Жгун Александр Александрович

Официальные оппоненты:

Егоров Сергей Николаевич

доктор биологических наук, доцент, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова, кафедра молекулярной биологии, доцент Ураков Валерий Николаевич кандидат биологических наук, Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики

диссертационного совета

к.б.н. Пискункова Нина Федоровна.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Цефалоспорины — обширный класс антибиотиков с мощным бактерицидным действием, низкой токсичностью, широким терапевтическим диапазоном. Субстанцией для получения более 30 наименований полусинтетических цефалоспоринов 5 поколений является природный бета-лактамный антибиотик цефалоспорин С (цефС), продуцируемый аскомицетом Асгетотит скгузо§епит.

На протяжении последних тридцати лет был достигнут значительный прогресс в селекции промышленных штаммов А. chrysogenum -суперпродуцентов данного антибиотика, идентификации генов, контролирующих биосинтез цефС, и исследовании характера их регуляции.

Путь биосинтеза цефС хорошо изучен, насчитывает 6 ферментативных стадий, катализируемых продуктами генов «раннего» - рсЬАВ, рсЬС, се/Л1, се/Л2 - и «позднего» - се/Е7г, се/О - кластеров биосинтеза антибиотика.

На внутриклеточном уровне биосинтез цефС строго компартментализован. Эффективность процессов внутриклеточного транспорта интермедиатов и экспорта цефС из клетки вносит существенный вклад в общий уровень продукции антибиотика, соотношение выхода конечного продукта и его промежуточных форм в процессе ферментации.

Гены мембранных транспортеров, вовлеченных в процессы транспорта цефС и его интермедиатов, являются перспективными мишенями для создания рекомбинантных штаммов А. chrysogenum с улучшенными производственными характеристиками. Особый интерес представляет белок СеП', относящийся к обширному классу МББ транспортеров. СеП" осуществляет перенос бета-лактамов через плазматическую мембрану продуцента по принципу Н+-антипортера.

Другой перспективной мишенью генетических манипуляций, направленных на улучшение биосинтеза цефС, является Н+-АТФаза

з

плазмалеммы PMA. Функцией белка является формирование на плазмалемме электрохимического градиента протонов, используемого для всех процессов транспорта метаболитов посредством Н+-симпортного, Н+-антипортного механизмов. Таким образом, Н+-АТФаза должна играть существенную роль в энергообеспечении процессов синтеза и транспорта цефС.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей диссертационной работы является изучение роли мембранных транспортеров - Н+-АТФазы плазмалеммы РМА1 и предполагаемого транспортера цефалоспорина С CefT в регуляции продукции бета-лактамов у Acremonium chrysogenum.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:

1. Определить хромосомную локализацию и характер экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефалоспорина С у высокопродуктивного штамма А. chrysogenum ВКМ F-4081D и штамма дикого типа АТСС 11550.

2. Создать системы экспрессии CefT из А. chrysogenum, РМА1 из Saccharomyces cerevisiae в виде их гибридов с флуоресцентными белками, изучить функциональную активность и субклеточную локализацию CefT-TagCFP и PMAl-TagYFP в модельном объекте S. cerevisiae.

3. Создать системы экспрессии CefT-TagCFP и PMAl-TagYFP для А. chrysogenum, оптимизировать процедуру агробактериального переноса кассет экспрессии в штамм ВКМ F-4081D.

4. Получить рекомбинантные cefT-клоны А. chrysogenum ВКМ F-4081D, провести их молекулярно-генетическую характеристику. Изучить влияние экспрессии CefT-TagCFP на биосинтез цефалоспорина С.

5. Получить рекомбинантные pmal-клоны А. chrysogenum ВКМ F-4081D, провести их молекулярно-генетическую характеристику. Исследовать функциональную активность PMAl-TagYFP, изучить влияние экспрессии РМА1 на биосинтез цефалоспорина С.

Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе работы был определен характер хромосомного полиморфизма и выявлены закономерности экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефС для штаммов А. chrysogenum, различающихся в 100 раз и более по уровню продукции антибиотика. Полученные данные расширяют существующие представления о механизмах регуляции биосинтеза бета-лактамных антибиотиков у А. скгузо^епит, молекулярно-генетических отличиях промышленных штаммов А. chrysogenum, определяющих их способность к супер продукции цефС.

Разработан подход для изучения функциональной активности и особенностей субклеточной локализации мембранного белка СеГГ в гетерологичной модельной системе 5. сегеушае. Метод универсален и может быть использован для структурно-функционального анализа других МБ'Б транспортеров грибов, участвующих в процессах экспорта биологически-активных вторичных метаболитов.

Разработана и оптимизирована процедура трансформации высокопродуктивного штамма А. chtysogenum ВКМ Р-408Ш методом агробактериального переноса (АТМТ). С помощью АТМТ впервые получены трансформанты высокопродуктивного штамма Л. chrysogenum ВКМ Р-408Ш с конститутивной экспрессией функционально-активных гибридов мембранных транспортных белков СсГГ и РМА1 слитых с флуоресцентными белками ТавСРР, Та§УРР.

Показано, что дополнительная экспрессия CefГ-TagCFP в высокопродуктивном штамме А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш приводит к изменению профиля биосинтеза цефС: повышению содержания в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов интермедиатов биосинтеза цефалоспорина и снижению выхода конечного продукта, подтверждая тем самым данные о широкой субстратной специфичности СеП, установленные на модельной системе дрожжей-сахаромицетов.

В процессе экспериментальной работы были сконструированы новые универсальные экспрессионные вектора, позволяющие осуществлять агробактериальный перенос и конститутивную экспрессию целевых генов в клетках А. chrysogenum, а также других видов нитчатых грибов.

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Результаты работы получены лично автором или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на всероссийской научной школе для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии» (Москва, 2009 г); 14-ой, 15-ой, 16-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010, 2011, 2012 г); «5-ом Хорватском конгрессе по микробиологии с международным участием» (Примоштен, 2012 г), Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ «Биологические механизмы» (Санкт-Петербург, 2013 г).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них в рецензируемых журналах - 2, в российских и иностранных журналах, входящих в перечень ВАК - 2, тезисы докладов на международных конференциях и семинарах — 2, тезисы докладов на российских научных конференциях — 6, получен 1 патент на изобретение РФ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и включают 49 рисунков и 10 таблиц. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список цитируемой литературы», который содержит 221 ссылку, в том числе 214 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Сравнительный молекулярно-генетический анализ штаммов А. chrysogenum - штамма дикого типа АТСС 11550 и высокопродуктивного ВКМ F-4081D

Селекция и многораундовый химический мутагенез штаммов А. chrysogenum привели к многократному повышению биосинтеза цефС: от 100 мг/л для штамма дикого типа АТСС 11550 до 25 г/л для современных промышленных продуцентов. При этом биохимические, физиологические и молекулярно-генетические отличия промышленных штаммов А. chrysogenum, приводящие к усилению продукции цефС, остаются во многом неизученными.

Сравнительная характеристика продуцентов А. chrysogenum с различным уровнем антибиотикобразования (рис. 1 А, Б) - штамма дикого типа АТСС 11550 и высокопродуктивного штамма ВКМ F-4081D - в данной работе позволила выявить регуляторные изменения в штаммах, связанные с биосинтезом цефС, а также перспективные «мишени» для дальнейшего улучшения свойств продуцентов методами генетической инженерии.

Рисунок 1. ВЭЖХ-анализ супернатантов культуральной жидкости штаммов А. chrysogenum. А - АТСС 11550; Б - ВКМ Р-408Ш. Стрелками указан пик, соответствующий времени выхода цефалоспорина С.

Важнейшими промышленными характеристиками высокопродуктивного штамма А. chrysogenum ВКМ Б-408Ш, полученного многоступенчатым химическим мутагенезом являются: 1) полная прототрофность; 2) низкий уровень промежуточных форм метаболизма цефС (дезацетил- и дезацетокси-

предшественников). А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш обладает рядом характерных физиологических и морфологических отличий от штамма дикого типа АТСС 1 1550 - замедление скорости роста, редукция воздушного мицелия, существенное снижение конидиеобразования, изменения в микроморфологии и белковом составе клеточных стенок.

Молекулярное кариотипирование штаммов А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш и АТСС 11550 методом пульс-электрофореза в контролируемом гомогенном электрическом поле выявило различия между ними в размерах средних и легких хромосом: увеличение размера в области Ш-У хромосом, появление легкой хромосомы 2.1 м.п.н. Данный тип хромосомного полиморфизма у ВКМ Р-408Ш не связан с изменением локализации и копийности генов биосинтеза и транспорта цефС. Кластер «ранних генов» локализован на хромосоме VI (4.4 м.п.н.), кластер «поздних генов» - на хромосоме II (2.3 м.п.н.) (рис. 2 А-Г). Оба кластера представлены в виде одной копии на геном А. chrysogenum ВКМ Р-408113 по результатам ПЦР-РВ.

Рисунок 2. Молекулярное кариотипирование штаммов А. chrysogenum. А, В — электрофореграммы разделения хромосом А. chrysogenum. Дорожки: 1, 14-5. cerevisiae YPH857; 2, 4, 6, 8, 10, 12 -А. chrysogenum ВКМ F-4081D; 3, 5, 7, 9, 11, 13 - А. chrysogenum АТСС 11550. Б — Саузерн-гибридизация разделенных пульс-электрофорезом хромосом А. chrysogenum (рис. А) с зондом на ген cefT. Г - Саузерн-гибридизация разделенных пульс-электрофорезом хромосом А. chrysogenum (рис. В) с зондом на ген cefEF. Стрелками обозначены хромосомы штаммов А. chrysogenum, с которыми гибридизуются пробы на «ранние» и «поздние» гены биосинтеза цефС.

Сравнение уровня транскрипции генов биосинтеза методом ПЦР-РВ показало, что штамм BKMF-4081D характеризуется 2-370-кратным

увеличением экспрессии данных генов относительно штамма дикого типа АТСС 11550, также для BKMF-4081D изменена их временная динамика (рис. 3 А-Е).

1 Л

■ I

ЯГ2 !!

I ezzz3.

га

04

о.г |

ZZEZ

Рисунок 3. Экспрессия генов биосинтеза в штаммах А. chrysogenum в точках 0 (I), 48 (II), 120 ч (III). Нормализованная экспрессия рсЬАВ (А), рсЬС (Б), cefDl (В), cefl)2 (Г), cefEF (Д), ce/G (Е) в А. chrysogenum-, 1-3 - АТСС 11550, 4-6 - ВКМ F-4081D.

Наиболее значительно различие в уровнях экспрессии «поздних» генов. Уровень транскрипции ceflEF в точках 48, 120 ч ферментации в штамме ВКМ F-4081D увеличен в 157-370 раз по отношению к штамму дикого типа АТСС 11550; cefG - в 23-82 раза.

Анализ экспрессии транспортных генов показал, что уровень транскрипции cefP в высокопродуктивном штамме снижен в 2-25 раз, ceflA-увеличен в 6-23 раза в различных временных точках ферментации.

9

Экспрессия cefT в ВКМ F-4081D на начальных этапах культивирования выросла в 2-7 раз, однако в точке 120 ч штаммы не демонстрируют отличий в его экспрессии (рис. 4 А-В).

1 2 3 4 5 6

Рисунок 4. Экспрессия генов транспорта бета-лактамов в штаммах A. chrysogenum в точках 0 (I), 48 (II), 120 ч (III). Нормализованная экспрессия се/Р (А), се/М (Б), cefT (В) в A. chrysogenum-, 1-3 - АТСС 11550, 4-6 - ВКМ F-4081D.

Проведенный сравнительный молекулярно-генетический анализ высокопродуктивного штамма A. chrysogenum ВКМ F-4081D и штамма дикого типа АТСС 11500 показал: увеличение продукции цефС связано не с изменениями хромосомной локализации и копийности генов биосинтеза бета-лактамов, а с увеличением в 2-370 раз их уровня транскрипции.

Создание систем экспрессии мембранных транспортеров CefT-TagCFP, PMAl-TagYFP для модельного объекта S. cerevisiae

Задача изучения внутриклеточной компартментализации и

функционирования исследуемых белков РМА1, CefT непосредственно на

клетках А. chrysogenum осложняется рядом методических проблем:

гетерогенность мицелия, низкая скорость роста продуцента, сложность

получения мембранных фракций, неизученность генома А. chrysogenum, др.

ю

Перспективной альтернативой является использование дрожжей-сахаромицетов как гетерологичного модельного объекта.

Для создания системы экспрессии РМА1-Та§УРР в 5. сегеутае на основе центромерной плазмиды рУСр2Н8Е-РМА1 сконструировали вектор р2Е№6, где рта1-1а%¥РР экспрессировался под контролем термоиндуцибельного НБЕ промотора (рис. 5 А).

Для изучения возможности экспрессии в дрожжевой клетке функционально-активного гибрида СеП", слитого с флуоресцентным белком Та§СРР, исследования характера его субклеточной локализации в клетке сахаромицетов была сконструирована панель эписомных и центромерных челночных векторов 5. се^еук/ое, несущих сплайсированную кДНК копию гена cefГ-tagCFP под контролем термоиндуцибельного НБЕ (рис. 5 Б) или конститутивных gpdA, ТйНЗ промоторов. Использование различных промоторов и типов экстрахромосомной дрожжевой ДНК в разработанных системах позволило существенно варьировать степень и временной характер экспрессии исследуемого гена.

2Н5Е рта! Г

—-I 2Н5Е р] акюч 1 | акаок г \ 1авСЯ> 1-Т ГР6К [—^

А Б .....

Рисунок 5. Схемы кассет экспрессииpmal-tagYFP (А), ее/Г-1а^СЕР (Б).

Исследование субклеточной локализации PMAl-TagYFP, СеГГ-TagCFP в модельном объекте сеге\>1$'ше

Создание систем совместной экспрессии транспортера СеП" и мажорного белка дрожжевой мембраны РМА1 упростило задачу изучения особенностей локализации гетерологичного белка в сегеш/ае.

В трансформантах штамма 5. сегечЫае УРН857, полученных с помощью центромерного вектора pZEN35, содержащего ген cefГ-tagCFP под контролем gpdA промотора, по данным флуоресцентной микроскопии, присутствовал сигнал Та§СРР, локализованный в плазматической мембране.

и

Мембранная локализация исследуемого белка была подтверждена в опытах по коэкспрессии CeíT-TagCFP и PMAl-TagYFP под контролем термоидуцибельного HSE промотора. Было показано, что значительная часть PMAl-TagYFP корректно локализуется в мембранных рафтах типа Р размером 40-70 нм, другая часть колокализована с CefT-TagCFP в областях плазмалеммы 200-1000 нм (рис. 6 А-Е).

в Л* t • • * 5мкм И Р ' 5 мкм

м ЕЭ ■ЩР* i ф « - 5 мкм

Рисунок 6. Коэкспрессия CefT-TagCFP (из А. chrysogenum) и PMAl-TagYFP (из 5. сегеушяе) в 5". сегег>шае УРН857. Флуоресцентный анализ образцов 51. сегеушае YPH857_CefT-TagCFP/PMAl-TagYFP: А - фотография в проходящем свете (выделена зона дальнейших исследований); Б, В - флуоресцентный анализ & сегеум/ое YPH857_CefT-TagCFP(зeлeный)/PMAl-TagYFP(кpacный), стрелками указаны зоны свечения; Г - фазовый контраст исследуемой области. Д - наложение структуры клетки в проходящем свете и флуоресценции CefГ-TagCFP (рис. Г); Е - наложение структуры клетки в проходящем свете (рис. Г) и наложения флуоресценции СеП"Л^СРР и РМА1-TagYFP (рис. Б, В).

Разработка системы функционального анализа белка-транспортера цефалоспорина С CefT-TagCFP в Л1, сегег 'и'ше

Транспортер МР8 суперсемейства СеП" А. chrysogenum является белком мультилекарственной устойчивости (МГЖ). В геноме 5. сеге\чя1ае Б288С обнаружено 28 генов МОЯ-МЕБ белков (ЫеИзвеп ег а1., 1997), среди которых ?/>о7, 1ро2, 1роЗ, д<1г2, дс1гЗ. Штаммы, мутантные по этим генам, отличаются повышенной чувствительностью к ряду токсичных соединений (Тоткоп ег а1., 2001; Тепгаго ег а1., 2005; иетига е1 а1., 2005). С целью комплементации функции данных транспортеров исследуемым белком

получили трансформанты серии S. cerevisiae В Y4741 AMDR-MFSCefT-TagCFP. При определении степени их чувствительности к ряду предполагаемых субстратов выявили способность гетерологично экспрессируемого CefT-TagCFP к частичной комплементации функций MFS транспортеров Qdr3, ТроЗ.

Трансформанты, полученные с использованием конструкции pZEN35d (промотор HSE), проявляли устойчивость к повышенным концентрациям спермидина (0.4 мМ), бромистого этидия (5 мкг/мл) по сравнению с реципиентными штаммами (рис. 7). Экспрессия cefT с сильного конститутивного промотора TDH3 после трансформации вектором pZEN35e была токсична для клетки (рис. 7) и не обеспечивала формирования фенотипа устойчивости.

кл./мл

10*

2x105

10s

5x105

Рисунок 7. Анализ устойчивости штаммов S. cerevisiae, экспрессирующих CefT-TagCFP к бромистому этидию. 1 - S. cerevisiae BY4741 Aybr043c_pRS426 (К-); 2-4 -S. cerevisiae BY4741 Aybr043c_HSE-CefT-TagCFP (индуцибельный промотор); 5-6 -S. cerevisiae BY4741 Aybr043c_TDH3-CefT-TagCFP (конститутивный промотор); 7-S. cerevisiae BY4741 Ayprl56cj>RS426 (K-); 8-10 - S. cerevisiae BY4741 Ayprl56c_HSE-CefT-TagCFP (индуцибельный промотор).

Совокупность полученных данных свидетельствует в пользу того, что сконструированный нами гибридный белок CefT-TagCFP проявляет свойства MFS MDR транспортера в дрожжевой клетке, а также сохраняет специфическую мембранную локализацию при гетерологичной экспрессии в S. cerevisiae.

Создание систем экспрессии мембранных транспортеров CefT-TagCFP, PMAl-TagYFP для A. chrysogenum

Кассета экспрессии целевых генов для A. chrysogenum была сконструирована на основе промотора гена глицеральдегид фосфат дегидрогеназы Aspergillus nidulans (gpdA), терминатора гена фосфоглицерат киназы S. cerevisiae (PGK1), разделенных участком полилинкера, доминантного селективного маркера гена гигромицин-В фосфотрансферазы Escherichia coli (hph) под контролем промотора trpC A. nidulans.

Векторы для трансформации A. chrysognum pZEN31, pZEN33, pZEN36c были сконструированы на основе вектора TagCFP-N либо бинарного вектора pCAMBIA1300 (Hajdukiewicz et al., 1994) и содержали системы экспрессии гибридных белков ccfT-tagCFP; pmal-tagYFP (рис. 8 А-В).

А :'(4>__________ _Е

\{9pdA || | togCfP ^ 3iSar |l hph ^J t'pc gpdA jj ^ '"^Ц K**» ^^'V-f-

ctfT ctfT

В <=ü (Г>

Tf^ÜTyj JSS. [J~>P*~|-| vpc [•] gpdA | рта 1 | юртр"^ [^M^jt-

Рисунок 8. Схемы кассет экспрессии cejT-tagCFP, pmal-tagYFP. А - pZEN31; Б -pZEN33; В - pZEN36c.

Получение рекомбинантных штаммов А. chrysogenum

Первоначальный этап задачи получения рекомбинантных штаммов А. chrysogenum заключался в отработке вариантов генетической трансформации культуры.

Основной способ трансформации мицелиальных грибов в мировой практике - метод, основанный на получении протопластов. На данный момент для А. chrysogenum разработаны методики по протопластированию штамма дикого типа АТСС 11550, лабораторного штамма А. chrysogenum СЮ, др. Однако высокопродуктивные штаммы обладают рядом характерных физиологических и морфологических отличий, что

усложняет решение проблемы трансформации и требует тщательной оптимизации методики.

Эффективной альтернативой выступила трансформация методом агропереноса, где донором для переноса экспрессионных кассет в клетки А. chrysogenum является промежуточный реципиент Agrobacterilm Ште/аЫет.

Для оптимизации АТМТ А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш варьировали следующие параметры: генотип реципиентного штамма А. Ште/айет, состав сред для кокультивирования, длительность и температура процесса, тип используемых мембранных фильтров, тип кокультивируемых клеток (артроспоры, конидиоспоры, мицелий).

Трансформацию А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш методом АТМТ в оптимизированных условиях проводили путем кокультивирования препарата мицелия А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш и клеток А. Ште/аыет АСЬО. Совместную инкубацию суспензии мицелия продуцента и А. Ште/аает АОЪО проводили методом глубинного культивирования в жидкой минимальной среде при низких оборотах с последующим высевом на селективные пластинчатые среды. Трансформационную смесь переносили на фильтры НуЬопс! N на СМ-чашки, инкубировали в течение 2 суток при 25°С в темноте.

Методом АТМТ было получено 26 трансформантов высокопродуктивного штамма А. chrysogenum ВКМ F-4081D_Cef-TagCFP, 137 рекомбинантных клонов А. chrysogenwn ВКМ Р-408Ш_РМА1-Та§¥РР.

Молекулярный анализ рекомбинантных клонов А. chrysogenum ВКМ Е-408№_СеГГ-ТаеСРР, А. сИгу^епит ВКМ Р-408Ш РМА1-ТайУЕР

Молекулярный анализ рекомбинантных клонов А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш_СеГГ-ТавСРР, А. chrysogenum ВКМ Р-408т_РМА1-ТавУРР, отобранных на селективной среде с гигромицином В, проводили методом ПЦР на наличие кассеты экспрессии с праймерами Ну§1/Ну§2,

15

gpdA_F/AcrCefTExlR, GKR1_N/GKF1_N, отсутствие плазмидной Npt3F/Npt3R и агробактериальной Virl/Vir2 контаминации (рис. 9 А-Е).

123466? 1 ! S t S 5 ? t 1 2 3 4 i S ?

2 4 6 10 11 25 te К-К* 2 4 5 10 11 SO Ш К. К" i 4 В 15 и » № К- X*

Рисунок 9. Молекулярный анализ рекомбинантных клонов A. chrysogenum ВКМ F-4081D.

А, Г - ПЦР-анализ, подтверждающий присутствие последовательности гена tagCFP, tagYFP: 1-4 - A. chrysogenum ВКМ F-408 lDCefT-TagCFP, 2-20 - A. chrysogenum ВКМ F-4081 D_PM А1 -TagYFP; 5, Mr - Mr (1 kb DNA ladder); 6, K- - A. chrysogenum В KM F-4081D; 7 - pZEN33; K+-pZEN36c.

Б, Д — ПЦР-анализ, исключающий контаминацию последовательностями npt-гена: 1-4 -A. chrysogenum ВКМ F-4081 D_CefT-TagCFP, 2-20 -A. chrysogenum ВКМ F-4081D РМА1-TagYFP; 5, Mr - Mr (1 kb DNA ladder); 6, K- - A. chrysogenum BKM F-4081D, 7 -

A. tumefaciens AGLO; 8 - pZEN33, K+ - pZEN36c.

B, E - ПЦР-анализ, исключающий контаминацию последовательностями v;>-reHOB A. tumefaciens: 1-4 — A. chrysogenum ВКМ F-4081D_CefT-TagCFP, 2-20 - A. chrysogenum BKM F-4081D_PMA1-TagYFP; 5, Mr - Mr (1 kb DNA ladder); 6, K- - A. chrysogenum BKM F-4081D; 7, К +-A. tumefaciens AGLO.

Хромосомная интеграция кассет экспрессии для отобранных по результатам ПЦР клонов была доказана методом Саузерн-гибридизации (рис. 10 А-Б) с зондом на меченый альфа-Р32с!АТР ПЦР-фрагмент, соответствующий последовательностям tagCFP, 1а^УРР (рис. 10 А-Б).

Рекомбинантные клоны А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш_СеГГ-Та§СРР, А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш_РМА1-Та£УРР отобрали для последующего изучения роли исследуемых белков в регуляции продукции цефС в высокоактивном штамме А chrysogenum ВКМ Р-408Ш.

А 1234567 Б 123456789 10

Sil -1

: -i Щ Hp --1 '*

—Г Ü Шй -1 . •

- . •

Рисунок 10. Саузерн-блот анализ рекомбинантных клонов A. chrysogenum. А -ВКМ F-4081 D_CefT-TagCFP: 1 - 1 kb DNA ladder, 2-7 - рестрикция ДНК Age I: 2 -A. chrysogenum BKM F-4081D; 3 - pZEN33; 4 - A. chrysogenum ATCC 11550, 5-7 -A. chrysogenum BKM F-4081 D_CefT-TagCFP. Б - BKM F-408 ID PMAl-TagYFP: 1-3, 5-10 - рестрикция ДНК AsiAl, 4 - 1 kb DNA ladder, 1,2 - A. chrysogenum BKM F-408 ID, 3 -pZEN36c, 5-10 - A. chrysogenum BKM F-4081D_PMAl-TagYFP.

Метаболическая инженерия A. chrysogenum: роль мембранного транспортера PMAl-TagYFP в регуляции продукции цефалоспорина С

Изучение экспрессии эндогенного рта в контрольных штаммах А. chrysogenum ATCC 11550 и BKM F-4081D методом ПЦР-РВ показало однонаправленную динамику: уровень экспрессии гена закономерно возрастал на протяжении культивирования (рис. 11 А). При этом экспрессия рта для штамма дикого типа была существенно выше, чем для высокопродуктивного BKM F-4081D: в 11-12 раз на стадии посевной культуры, в 2-3 раза на стадии ферментации. Обнаруженная дефектность высокопродуктивного штамма А. chrysogenum BKM F-4081D по синтезу Н+-АТФазы была скорректирована в pmal-клонах, где наблюдали рост экспрессии эндогенного рта (рис. 11 А).

Конститутивную экспрессию гетерологичной Н+-АТФазы РМА1 в A. chrysogenum BKM F-4081D осуществляли в виде ее N-концевого гибрида с желтым флуоресцентным белком. Экспрессию гена pmal-tagYFP в рекомбинантных клонах подтвердили ПЦР-РВ с селективными праймерами на негомологичную зону гетерологичного pmal (рис. 11 Б).

Рисунок 11. Экспрессия рта, рта1 в штаммах A. chrysogenum в точках О (I), 48 (II), 120 ч (III). А — нормализованная экспрессия рта в А. chrysogenum: 1-3 - АТСС 11550, 4-6 - ВКМ F-4081D, 7-9 - ВКМ F-4081D_PMAl-TagYFP; Б - нормализованная экспрессия pmal в А. chrysogenum: 1-3 -ВКМ F-4081D, 4-6-ВКМ F-4081D_PMAl-TagYFP.

Флуоресцентная микроскопия PMAl-TagYFP в рекомбинантных клонах А. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMAl-TagYFP показала локализацию гетерологичной Н+-АТФазы в плазматической мембране продуцента (рис. 12 А-В).

Рисунок 12. Экспрессия PMAl-TagYFP (из 5'. cerevisiae) в А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш. А - фотография в проходящем свете; Б, В - флуоресцентный анализ А. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMAl-TagYFP (зеленый). В - наложение структуры клетки в проходящем свете (рис. А) и флуоресценции РМА1Л^УРР (рис. Б).

Для полученных клонов было выявлено существенное снижение внутриклеточного содержания АТФ в 1.5-2.0 раза по отношению к контрольному штамму ВКМ Р-40810, что свидетельствует о его активном гидролизе при дополнительной экспрессии Н+-АТФазы.

ВЭЖХ-анализ супернатантов культуральной жидкости клонов А. скгу*о£епит ВКМ Р-4081 С_РМА1 -Та§УР'Р показал снижение уровня биосинтеза цефС относительно контрольного штамма (рис. 13 А-В, табл. 1).

г

цефС

/ цефС

/ 1 /

К1.. и И кЖг... ЛлА-

цефС

Рисунок 13. ВЭЖХ-анализ супернатантов культуральной жидкости штаммов А. сИгуБО^епит. А - ВКМ Р-408Ю; Б, В - ВКМ Р-4081РРМА 1 -TagYFP. Стрелками указан пик, соответствующий времени выхода цефалоспорина С.

Таблица 1. ВЭЖХ-анализ супернатантов культуральной жидкости штаммов

А. сЬгузо^епит ВКМ Р-4081Р_РМА1-ТавУРР.

Образец А. chtysogenum Среднее содержание цеф С

мкг/мл отношение к контролю, %

ВКМ Р-40810 4580 100.0

ВКМ Р-40810 РМА1-ТЭЕУРР Р2 2589 56.5

ВКМ Р-4081И РМА1-Та§УРР Р6(1) 1324 28.9

ВКМ Р-408Ш PMAl-TagYFP Р6(2) 1222 26.7

ВКМ Р-4081Б РМА1-Таь'УРР Р20(1) 3815 83.3

ВКМ Р-408 т РМА1-ТавУРР Р20(2) 3534 77.2

Сравнительный анализ уровня транскрипции генов биосинтетических кластеров цефалоспорина в А. chrysogenum ВКМ Е-4081 Г)РМ А1 -Та§УРР и контрольном штамме показал, что для низкоактивного клона с уровнем продукции антибиотика 1222 мг/л их экспрессия снижена, для высокоактивного клона с биосинтезом цефС 3815 мг/л наблюдается колебание экспрессии относительно контрольного уровня А. скгухо%ет1т ВКМ Р-40810. В анализируемых клонах уровни биосинтеза цефС и транскрипции рсЬАВ, рсЬС, се/ЕИ, се/С коррелировали: для клона с продукцией 3815 мг/л их экспрессия увеличена в 2-5 раз по сравнению с клоном с уровнем биосинтеза 1222 мг/л.

Анализ А. скгуно^епит ВКМ F-4081D_PMAl-TagYFP показал, что повышенная экспрессия Н+-АТФазы обладает в целом негативным эффектом на продукцию цефС, который обусловлен снижением необходимого уровня внутриклеточного АТФ, дополнительно расходуемого на работу

гетерологичной Н+-АТФазы, и изменением временной динамики и уровня транскрипции генов биосинтетических кластеров.

Метаболическая инженерия А. скгу^о^епит'. роль мембранного транспортера СеП-Та§СРР в регуляции продукции цефалоспорина С

Исследование уровня экспрессии се/Г в А. chrysogenum АТСС 11550 и ВКМ Р-408Ш показало возрастающую динамику для штаммов в процессе культивирования. Уровень транскрипции се/Г для ВКМ Р-408Ш на начальных этапах ферментации увеличен в 2-7 раз, однако в точке 120 ч штаммы не демонстрируют отличий в его транскрипции (рис. 14 А).

Анализ экспрессии се/Т в клонах А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш_Се1Т-TagCFP показал увеличение уровня транскрипции гена в 2-8 раз по сравнению с контрольным штаммом ВКМ Р-408Ш (рис. 14 А). Суммарный прирост экспрессии се/Т в рекомбинантных клонах подтвердили анализом уровня транскрипции гена гибридного белка ce/Г-tagCFP с праймерами на 3'-концевую зону се/Г и 5'-зону tagCFP (рис. 14 Б).

А

1,5 -- ПШ 1

CZ II

12 3 4 5S789 I ! 3 f S I

Рисунок 14. Экспрессия cejT, се/Г-tagCFP в штаммах А. chrysogenum в точках 0 (I), 48 (II), 120 ч (III). А - нормализованная экспрессия се/Г в А. chrysogenum: 1-3 -АТСС 11550, 4-6 - ВКМ F-4081D, 7-9 - ВКМ F-4081D_CefT-TagCFP; Б -нормализованная экспрессия ceJT-tagCFP в А. chrysogenum: 1-3 - ВКМ F-4081D, 4-6 -ВКМ F-4081D_CefT-TagCFP.

ВЭЖХ-анализ А. chrysogenum ВКМ F-4081D_CefT-TagCFP показал снижение уровня синтеза целевого метаболита цефалоспорина С до 7 % по сравнению с исходным штаммом. Данный эффект сопряжен с ростом содержания в культуральной жидкости предшественников цефС — дезацетил,

дезацетоксицефалоспорина С на 5-7 % и сохранением, таким образом, общего баланса бета-лактамов (рис. 15 А-Г).

Рисунок 15. ВЭЖХ-анализ супернатантов культуральной жидкости штаммов А. chtysogenum ВКМ Р-408Ш_СеГГ-Та§СРР. 1 - дезацетилцефалоспорин С, 2 -дезацетоксицефалоспорин С, 3 - цефалоспорин С. А. сИ^о^епит: А - ВКМ Р_408Ш, Б-Г -ВКМ Р-408Ю_СеГГ-ТаёСРР.

ПЦР-РВ показал изменение профиля и уровня транскрипции генов биосинтетических кластеров цефС в клонах А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш_СеГГ-Та§СРР относительно контрольного штамма ВКМ Р-408Ш.

Эффект незначительного снижения транспорта цефС и повышения секреции промежуточных форм его биосинтеза говорят о невысокой субстратной специфичности транспортера СеГГ, что характерно для МР8-МГЖ белков. При конститутивной экспрессии се/Г наблюдали повышение проницаемости мембраны и увеличение транспорта интермедиатов цефалоспорина, что приводило к снижению их внутриклеточного пула.

Эти данные, а также результаты исследования активности СеГГ в гетерологичной системе дрожжей-сахаромицетов свидетельствуют в пользу способности изучаемого белка осуществлять экспорт структурно-родственных Р-лактамов, а также полиаминов, бромистого этидия, органических кислот, и, видимо, целого ряда других соединений. Различия в эффектах повышенной экспрессии СеП", оказываемой на биосинтез

цефалоспорина С для штамма дикого типа, умеренных продуцентов и полученных нами результатов для высокоактивного штамма, соответствуют современным представлениям о характере регуляции процессов биосинтеза и транспорта цефС в ходе антибиотикообразования у А. chrysogenum.

ВЫВОДЫ

1. Хромосомный полиморфизм у высокоактивного штамма А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш не связан с изменением локализации и копийности генов биосинтеза и транспорта цефалоспорина С.

2. Уровень транскрипции генов биосинтеза цефалоспорина С для А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш повышен в 2-370 раз относительно штамма дикого типа А. chrysogenum АТСС 11550.

3. Транспортный белок СеП"-Та§СРР при экспрессии в модельной системе 5. cerevisiae локализуется в районах плазмалеммы диаметром 200-1000 нм и способен комплементировать функции ортологичных МБ 8 транспортеров сахаромицетов.

4. Оптимизирован метод агробактериальной трансформации в высокоактивный штамм А. chrysogenum. Получена коллекция рекомбинантных штаммов ВКМ Р-408Ш с CefT-TagCFP из А. chrysogenum и РМА1-ТадУРР из Я. сегеу1$1ае.

5. РМА1-Та§УРР локализуется в плазматической мембране А. chrysogemm ВКМ Р-408Ш, повышение уровня экспрессии РМА1 в трансформантах негативно коррелирует с уровнями внутриклеточного АТФ и продукцией цефалоспорина С.

6. Конститутивная экспрессия Сс1Т-Та§СРР в А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш приводит к увеличению экспорта интермедиатов цефалоспорина С при сохранении базового уровня продукции бета-лактамов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, опубликованы 2 статьи по материалам диссертации:

1. Думина М.В., Жгун A.A., Домрачева А.Г., Новак М.И., Эльдаров М.А. Хромосомный полиморфизм штаммов Acremonium chrysogenum -продуцентов цефалоспорина С // Генетика. 2012. Т.48. №8. С. 918 - 926.

2. Думина М.В., Жгун A.A., Керпичников И.В., Домрачева А.Г., Новак М.И., Валиахметов А.Я., Кнорре Д.А., Северин Ф.Ф., Эльдаров М.А., Бартошевич Ю.Э. Функциональная характеристика MFS транспортера бета-лактамных антибиотиков CefT в Acremonium chrysogenum и Saccharomyces cerevisiae II Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т.49. № 4, с. 372 -381.

Получен 1 патент РФ: 1. Жгун A.A., Носков В.В., Керпичников И.В., Эльдаров М.А., Думина М.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК pZEN16 для переноса и экспрессии генов в мицелиальном грибе Acremonium chrysogenum II Патент РФ № 2434944 от 27.11.2011.

Опубликовано 8 тезисов докладов на российских и международных конференциях:

1. Думина М.В., Домрачева А.Г., Новак М.И., Эльдаров М.А., Бартошевич Ю.Э., Жгун A.A. Разработка подходов для получения рекомбинантных штаммов Acremonium chrysogenum с повышенной экспрессией гена мембранного транспортера цефалоспорина С CefT // Всероссийская научная школа для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии». Звенигород, 2009. С. 33-34.

2. Жгун A.A., Бартошевич Ю.Э., Домрачева А.Г., Новак М.И., Чумаленко H.JL, Думина М.В., Керпичников И.В., Носков В.Н., Эльдаров М.А. Изучение молекулярного контроля биосинтеза цефалоспорина С в мицелиальном грибе Acremonium chrysogenum II Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы». Москва, 2009. С. 18.

3. Думина М.В., Домрачева А.Г., Новак М.И., Бартошевич Ю.Э., Эльдаров М.А., Валиахметов А.Я., Жгун A.A. Мембранная топология транспортера цефалоспорина С (CefT) из Acremonium chrysogenum в клетках

23

S.cerevisiae, слитого с циановым флуоресцентным белком // 14-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология

- наука XXI века». Пущино, 2010. С. 131.

4. Думина М.В., Домрачева А.Г., Новак М.И., Бартошевич Ю.Э., Эльдаров М.А., Валиахметов А.Я., Жгун А.А. Исследование функциональной активности MFS транспортера из штамма продуцента цефалоспорина С Acremonium chrysogenum II 15-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2011. С. 290.

5. Думина М.В., Домрачева А.Г., Новак М.И., Бартошевич Ю.Э., Эльдаров М.А., Жгун А.А. Исследование хромосомного полиморфизма штаммов Acremonium chrysogenum II 15-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология — наука XXI века». Пущино, 2011. С. 31.

6. Думина М.В., Жгун А.А, Валиахметов А.Я., Домрачева А.Г., Новак М.И., Эльдаров М.А., Бартошевич Ю.Э. Конститутивная экспрессия Н+-АТФазы S. cerevisiae в штамме Acremonium chrysogenum - продуценте цефалоспорина С: влияние на выход цефалоспорина и его интермедиатов, биохимические и физиологические эффекты // 16-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология — наука XXI века». Пущино, 2012. С. 254.

7. Maria Dumina, Alexander Zhgoun, Marina Novak, Alia Domratcheva, Mikhail Eldarov, Yuri Bartoshevitch. Comparative analysis of expression levels of cephalosporin С biosynthesis and transport genes in laboratory and industrial strains of Acremonium chrysogenum II 5-th Croatian Congress of Microbiology. Primoshten, 2012. P. 58.

8. M. Dumina, A. Zhgun, A. Domratcheva, M. Novak, D. Knorre, F. Severin, M. Eldarov, Y. Bartoshevitch. Metabolic engineering of cephalosporin С producer

- Acremonium chrysogenum: overexpression of MFS transporter CefT changes biosynthesis profile of beta-lactam compounds // Federation of European Biochemical Societies Congress 2013 «Mechanisms in Biology», 2013. P. 611.

Заказ № 27-Р/08/2013 Подписано в печать 19.08.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1.2

МГ^. "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

и. ' / www.cfr.ru ; е-таИ:т/о@ф.ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Думина, Мария Владимировна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ЦЕНТР «БИОИНЖЕНЕРИЯ» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На права)уэукописи

04201361274

ДУМИНА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА РОЛЬ МЕМБРАННЫХ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОДУКЦИИ ЦЕФАЛОСПОРИНА С у АСЯЕМОМиМ CHRYSOGENUM

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: кандидат биологических наук, с.н.с

Эльдаров Михаил Анатольевич кандидат биологических наук, н.с. Жгун Александр Александрович

Москва, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................9

1.1 Цефалоспорин С: открытие, химическая структура, механизм действия антибиотика, продуцируемого Асгетотит chrysogenum.............................................................................9

1.2 Краткая характеристика А сгетотит chrysogenum - продуцента цефалоспорина С. 12

1.3 Биосинтез цефалоспорина С............................................................................................15

1.3.1 Кластеры генов биосинтеза цефалоспорина С........................................................15

1.3.2 «Ранние» стадии биосинтеза цефалоспорина С......................................................16

1.3.3 «Поздние» стадии биосинтеза цефалоспорина С....................................................22

1.4 Роль мембранных белков в биосинтезе Р-лактамов................................................................................................................................23

1.4.1 Компартментализация реакций биосинтеза (3-лактамов........................................23

1.4.2 Роль мембранного транспортера CefP в биосинтезе цефалоспорина С у А. chrysogenum.....................................................................................................................26

1.4.3 Роль мембранного транспортера СеШ в биосинтезе цефалоспорина С у А. chrysogenum.....................................................................................................................28

1.4.4 Роль мембранного транспортера СеП^ в биосинтезе цефалоспорина С у А. скгуз^епит.....................................................................................................................31

1.5 Молекулярные основы функционирования белков мультилекарственной устойчивости Се1Т, СеШ, Се1Р.............................................................................................37

1.5.1 МБ8 МБЯ транспортеры...........................................................................................37

1.5.2 Создание градиента Н+ Н+-АТФазой РМА1............................................................48

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................................57

2.1 Компьютерное моделирование........................................................................................57

2.2 Штаммы и плазмиды.........................................................................................................57

2.2.1 Штаммы, используемые в работе.............................................................................57

2.2.2 Плазмиды....................................................................................................................58

2.3 Микробиологические среды и условия культивирования штаммов............................60

2.4 Генно-инженерные методики...........................................................................................61

2.4.1 Общие молекулярно-генетические методы.............................................................61

2.4.2 Выделение геномной ДНК........................................................................................62

2.4.3 Проведение ПЦР........................................................................................................62

2.5 Конструирование плазмид................................................................................................65

2.5.1 Создание кассет экспрессии CefT-TagCFP..............................................................65

2.5.2 Создание кассет экспрессии РМА1-Та§УРР...........................................................67

2.6 Получение рекомбинантных штаммов............................................................................68

2.6.1 Трансформация нативных клеток 5". сегеушае плазмидной ДНК.........................68

2.6.2 Приготовление и прямая трансформация компетентных клеток А. Ште/аЫет . 69

2.6.3 Трансформация Л. chrysogenwn................................................................................69

2.7 Анализ рекомбинантных штаммов 8. сегеу1$1ае_СъТ1-ТщСТР, Я. сегеУ1ыае_РМА1-ТавУБР.....................................................................................................................................71

2.7.1 Флуоресцентная микроскопия 5'. cerevisiae_CefT-TagCFP, сегеУ1Э1ае_РМА1-ТавУБР.................................................................................................................................71

2.7.2 Исследование функциональной активности 5. сегеушае_Се1Т-Та§УРР методом диффузии дисков в агар......................................................................................................71

2.7.3 Исследование функциональной активности 5". cerevшae_CefT-TagYFP методом спот-анализа.........................................................................................................................72

2.8 Анализ рекомбинантных штаммов А. chry.sogenum_CefT-Ta.gCFP, А. chrysogenum_PM.Al-Ta.gYFV..............................................................................................72

2.8.1 Молекулярный анализ клонов..................................................................................72

2.8.2 ВЭЖХ-анализ.............................................................................................................73

2.8.3 Определение содержания внутриклеточного АТФ.................................................73

2.9 Молекулярное кариотипирование А. chrysogenum........................................................73

2.10 Анализ экпрессии генов..................................................................................................74

2.10.1 Получение препаратов тотальной, матричной РНК.............................................74

2.10.2 ПЦР-анализ в реальном времени............................................................................75

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................................................76

3.1 Сравнительный молекулярно-генетический анализ штаммов А. chrysogenum -штамма дикого типа АТСС 11550 и высокопродуктивного ВКМ Р-408Ш......................76

3.1.1 Хромосомный полиморфизм штаммов А. chrysogenum АТСС 11550, ВКМ Р-408Ш................................................................................................................................77

3.1.2 Хромосомная локализация генов биосинтеза цефалоспорина С...........................81

3.1.3 Анализ экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефалоспорина С в штаммах А. сЬгуь^епит АТСС 11550, ВКМ Р-408Ш....................................................................82

3.2 Создание систем экспрессии мембранных транспортеров Се1Т-Та£СРР, РМА1-TagYFP для модельного объекта 5. сегст/бше......................................................................88

3.3 Исследование субклеточной локализации РМА1-ТадУРР, СеГГ-ТавСРР в модельном объекте 5. сегеушае................................................................................................................90

3.4 Разработка системы функционального анализа белка-транспортера цефалоспорина С СеГГ-Та§СРР в 5. сегеушае....................................................................................................92

3.5 Создание систем экспрессии мембранных транспортеров Се:ГГ-Та§СРР, РМА1-Та§УРР для А. chrysogenum....................................................................................................95

3.6 Получение рекомбинантных штаммов A. chrysogenum ВКМ F-4081D_CefT-TagCFP,

A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMAl-TagYFP....................................................................97

3.7 Молекулярный анализ рекомбинантных клонов A. chrysogenum ВКМ F-408lD_CefT-TagCFP, A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMAl-TagYFP.........................101

3.8 Метаболическая инженерия A. chrysogenum: роль мембранного транспортера РМА1-TagYFP в регуляции продукции цефалоспорина С...........................................................103

3.9 Метаболическая инженерия A. chrysogenum: роль мембранного транспортера CefT-TagCFP в регуляции продукции цефалоспорина С............................................................108

ВЫВОДЫ...................................................................................................................................113

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................................................114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................116

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Цефалоспорины - обширный класс антибиотиков с мощным бактерицидным действием, низкой токсичностью, широким терапевтическим диапазоном. Субстанцией для получения более 30 наименований полусинтетических цефалоспоринов 5 поколений является природный (3-лактамный антибиотик цефалоспорин С (цефС), продуцируемый аскомицетом Acremonium chrysogenum.

На протяжении последних тридцати лет был достигнут значительный прогресс в селекции промышленных штаммов A. chrysogenum — суперпродуцентов данного антибиотика, идентификации генов, контролирующих биосинтез цефС и исследовании характера их регуляции.

Путь биосинтеза цефС хорошо изучен, насчитывает 6 ферментативных стадий, катализируемых продуктами генов «раннего» - pcbAB, pcbC, cefDl, cefD2 — и «позднего» - cefEF, cefG - кластеров биосинтеза антибиотика.

На внутриклеточном уровне биосинтез цефС строго компартментализован. Эффективность процессов внутриклеточного транспорта интермедиатов и экспорта цефС из клетки вносит существенный вклад в общий уровень продукции антибиотика, соотношение выхода конечного продукта и его промежуточных форм в процессе ферментации.

Гены мембранных транспортеров, вовлеченных в процессы транспорта цефС и его интермедиатов, являются перспективными мишенями для создания рекомбинантных штаммов A. chrysogenum с улучшенными производственными характеристиками. Особый интерес представляет белок CefT, относящийся к обширному классу MFS транспортеров. CefT осуществляет перенос (3-лактамов через плазматическую мембрану продуцента по принципу Н+-антипортера.

Другой перспективной мишенью генетических манипуляций, направленных на улучшение биосинтеза цефС, является НГ^-АТФаза плазмалеммы РМА. Функцией белка является формирование на плазмалемме электрохимического градиента

протонов, используемого для всех процессов транспорта метаболитов посредством Н+ -симпортного, н+ -антипортного механизмов. Таким образом, Н -АТФаза должна играть существенную роль в энергообеспечении процессов синтеза и транспорта цефС.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей диссертационной работы является изучение роли мембранных транспортеров - КГ-АТФазы плазмалеммы РМА1 и предполагаемого транспортера цефалоспорина С Се1Т в регуляции продукции (3-лактамов у Асгетотит chrysogenum.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:

1. Определить хромосомную локализацию и характер экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефалоспорина С у высокопродуктивного штамма А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш и штамма дикого типа АТСС 11550.

2. Создать системы экспрессии Се1Т из А. chrysogenum, РМА1 из БасскаготусеБ сегеу^ягае в виде их гибридов с флуоресцентными белками, изучить функциональную активность и субклеточную локализацию CefT-TagCFP и PMAl-TagYFP в модельном объекте & сегеугБгае.

3. Создать системы экспрессии CefГ-TagCFP и PMAl-TagYFP для А. chrysogenum, оптимизировать процедуру агробактериального переноса кассет экспрессии в штамм ВКМ Р-408Ш.

4. Получить рекомбинантные се/Г-клоны А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш, провести их молекулярно-генетическую характеристику. Изучить влияние экспрессии CefT-TagCFP на биосинтез цефалоспорина С.

5. Получить рекомбинантные рта1 -клоны А. chrysogenum ВКМ Б-408Ш, провести их молекулярно-генетическую характеристику. Исследовать функциональную активность PMAl-TagYFP, изучить влияние экспрессии РМА1 на биосинтез цефалоспорина С.

Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе работы был определен характер хромосомного полиморфизма и выявлены закономерности экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефС для штаммов А. chrysogenum, различающихся в 100 раз и более по уровню продукции антибиотика. Полученные данные расширяют существующие представления о механизмах регуляции биосинтеза (3-лактамных антибиотиков у А. chrysogenum, молекулярно-генетических отличиях промышленных штаммов А. chrysogenum, определяющих их способность к суперпродукции цефС.

Разработан подход для изучения функциональной активности и особенностей субклеточной локализации мембранного белка Се1Т в гетерологичной модельной системе б1. сегеушае. Метод универсален и может быть использован для структурно-функционального анализа других МБ 8 транспортеров грибов, участвующих в процессах экспорта биологически-активных вторичных метаболитов.

Разработана и оптимизирована процедура трансформации высокопродуктивного штамма А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш методом агробактериального переноса (АТМТ). С помощью АТМТ впервые получены трансформанты высокопродуктивного штамма А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш с конститутивной экспрессией функционально-активных гибридов мембранных транспортных белков СеГГ и РМА1, слитых с флуоресцентными белками TagCFP,

Показано, что дополнительная экспрессия CefT-TagCFP в высокопродуктивном штамме А. chrysogenum ВКМ Р-408Ш приводит к изменению профиля биосинтеза цефС: повышению содержания в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов интермедиатов биосинтеза цефалоспорина и снижению выхода конечного продукта, подтверждая тем самым данные о широкой субстратной специфичности СеГГ, установленные на модельной системе дрожжей-сахаромицетов.

В процессе экспериментальной работы были сконструированы новые универсальные экспрессионные вектора, позволяющие осуществлять

агробактериальный перенос и конститутивную экспрессию целевых генов в клетках A. chrysogenum, а также других видов нитчатых грибов.

A. chrysogenum - перспективный объект исследований, как с прикладной, так и фундаментальной точки зрения. Описанные в данной работе подходы по изучению продуцента цефС могут быть использованы в экспериментах по улучшению продуктивности, стабильности и иных производственных характеристик промышленных штаммов других видов грибов - продуцентов широкого класса ферментов и соединений для нужд пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленности.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность и сердечную признательность за чуткое наставничество, всестороннюю помощь в работе над диссертацией, ценные замечания, терпение и поддержку своим научным руководителям -Эльдарову Михаилу Анатольевичу и Жгуну Александру Александровичу, а также коллективу лаборатории биоинженерии антибиотиков - Бартошевичу Юрию Эдуардовичу, Новак Марине Иоганновне, Домрачевой Алле Георгиевне, Чумаленко Ноэмии Львовне.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Цефалоспорин С: открытие, химическая структура, механизм действия антибиотика, продуцируемого Acremonium chrysogenum

Культура A. chrysogenum была выделена из вод Сардинии (Италия) Джузеппе Бротзу [1,2] в 1945 году. Было установлено, что гриб продуцирует соединение, эффективно действующее на грамотрицательные бактерии (включая Salmonella typhi). Это объясняло феномен отсутствия вспышек брюшного тифа у населения, купающегося в море в месте сброса сточных вод. Однако структура антибиотического агента - цефалоспорина С - была впервые описана Абрахамом и Ньютоном лишь в 1961 году [3,4].

Цефалоспорин представляет собой бициклическое соединение, состоящее из ß-лактамного и дигидротиазинового колец (Рисунок 1). Оба кольца составляют 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-АЦК) - общее ядро молекулы цефалоспоринов. 7-АЦК близка по строению ядру пенициллинов — 6-аминопенициллановой кислоте (6-АПК) [5], которая также содержит ß-лактамное кольцо. В 7-АЦК могут быть замещены две боковые цепи, в 6-АПК — только одна, в связи с чем, на основе 7-АЦК можно получить значительно больше полусинтетических производных.

s

А - беталакт¡тпос колмм» В - дигисрфтнллнноьо^ клзьш»

R

¿4, ^ -s-^ "" Т V- 7&Д*

nosiiCJCHH«' dicmsmocH воатмсшекни^

Рисунок 1. Цефалоспорины: связь между химической структурой и эффектом. Воспроизводится по [6].

Антимикробная активность природных цефалоспоринов низкая, однако присоединение различных радикалов в положение 7 и в положение 3 резко усиливает их биологическую активность и устойчивость к Р-лактамазам. Таким образом, модификация химической структуры 7-АЦК приводит к существенным изменениям свойств соответствующего соединения - антибактериальной активности, параметров фармакокинетики и пр.

Удаление остатка аминоадипиновой кислоты и высвобождение 7-АЦК, удобной для последующего получения производных цефС путем химических превращений, представляет собой проблему, решаемую с помощью химических и энзиматических технологий [7,8].

Богатые возможности для получения производных цефалоспорина реакцией аллильного нуклеофильного замещения открываются за счет высокой подвижности ацетильной группы при СЗ. Таким образом, общая схема получения полусинтетических производных цефалоспоринов включает следующие стадии (Рисунок 2 А) [9]:

1) гидролиз с использованием силильной защиты;

2) нуклеофильное замещение (Ми-Н — нуклеофильный реагент);

3) электрофильное замещение (11-Х — электрофильный реагент).

Еще один способ химической модификации цефалоспоринов - перевод их в дезацетоксипроизводные — также открывает дополнительные возможности варьирования их структур [9] (Рисунок 2 Б).

Рисунок 2. Схемы получения полу синтетических производных цефалоспорина С. Воспроизводится по [9].

Антибактериальная активность цефалоспоринов, как и других Р-лактамных антибиотиков, обусловлена торможением синтеза пептидогликана, полимера, состоящего из повторяющихся дисахаридных групп, в образовании которых участвуют N-ацетилглюкозамин (NAG) и N-ацетилмурамовая кислота (NAM). Перекрестное связывание пептидогликана заключается в образовании пептидной связи между терминальным остатком боковой пептидной цепи (обычно D-аланином) с предпоследним остатком примыкающей боковой цепи (L-лизином или диаминопимелиновой кислотой) [10].

NAG- и NAM-пентапептидные остатки пептидогликанов синтезируются в цитоплазме микробной клетки и транспортируются через плазматическую мембрану. Далее эти остатки встраиваются в существующую пептидогликанную сеть (в процессе роста и деления клетки) с участием