Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль механосенсорного канала MscL в восприятии стрессовых сигналов клетками Synechocystis

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Люкевич, Александр Анатольевич

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Структура и локализация механосенсорных каналов.

1.1.1. Идентификация и выделение MscL.

1.1.2. Данные кристаллографии о структуре MscL.

1.2. Механизм работы механосенсорного канала.

1.2.1. Модель работы канала.

1.2.2. Функционирование канала как дополнительного клапана для сброса тургорного давления в стрессовых условиях.

1.3. Механосенсорные каналы MscL других организмов.

1.4. Анализ экспрессии генов с помощью ДНК-микроэррей (DNA microarray).

1.4.1. Введение.

1.4.2. Применение микрочипов в изучении микроорганизмов.

1.4.3. Метод ДНК-микроэррей.

1.4.4. Математический анализ данных.

1.4.5. Проблемы, возникающие при использовании микрочипов (цианочипов).

Глава 2. Объекты и методы исследований.

2.1. Штаммы цианобактерий.

2.2. Условия культивирования.

2.3. Определение интенсивности роста культур.

2.4. Экспериментальные условия культивирования.

2.5. Анализ экспрессии генов с помощью ДНК-микроэррей.

2.6. Анализ экспрессии генов с помощью Нозерн-блоттинга.

2.7. Пробы для Нозерн-гибридизации.

2.8. Определение состава жирных кислот.

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Механосенсорный канал Мвс!- ЗупесИосуэИз.

3.2. Получение мутанта АтэсЬ.

3.3. Морфологическая характеристика мутанта Атвс.

3.4. Ростовые характеристики культур.

3.5. Изменение состава жирных кислот при адаптации к пониженным температурам.

3.6. Анализ экспрессии генов и Атэс!- в условиях стресса с помощью ДНК-микроэррей.

3.6.1. Контрольные эксперименты.

3.6.2. Сравнение экспрессии генов у мутантного штамма и дикого типа при оптимальных (контрольных) условиях роста.

3.6.3. Холодовой стресс.

3.6.4. Тепловой стресс.

3.6.5. Гиперосмотический стресс 0,5М и 1М сорбитом.

3.6.6. Солевой стресс (0,5М МаС1).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль механосенсорного канала MscL в восприятии стрессовых сигналов клетками Synechocystis"

Фотосинтезирующие организмы постоянно подвергаются воздействию различных факторов окружающей среды, в связи с чем они вынуждены довольно быстро реагировать на их изменение. Механизмы восприятия и передачи стрессовых сигналов интенсивно изучаются. В настоящее время установлено, что восприятие сигналов об изменении температуры у цианобактерий связано с мембранами клетки (Los & Murata 1999). Изменение физических свойств мембраны приводит к запуску каскада ответных реакций, направленных на поддержание ее оптимального состояния и, следовательно, на сохранение сопряженных с ней жизненно важных реакций, таких как фотосинтез и дыхание (Murata & Wada 1995, Los et al. 1997).

Пресноводная цианобактерия Synechocystis является очень удобным объектом для подобных исследований, так как сочетает в себе свойства бактериальной и растительной клетки. Простота культивирования, генетической трансформации, а так же наличие информации о полной нуклеотидной последовательности генома, дало возможность идентифицировать сенсорные гистидиновые киназы, отвечающие за восприятие низких температур (Suzuki et al. 2000). Также удалось выявить гены, индукция которых активируется в ответ на несколько различных по своей природе стрессовых воздействий. Однако природа самого «универсального» сенсора остается неизвестной. Среди локализованных в мембране белков наиболее вероятным кандидатом на роль сенсора может быть механосенсорный ионный канал, так как его работа зависит от физического состояния мембраны (от степени ее натяжения, и, вполне вероятно, от текучести) (Sukharev et al. 1994, Sukharev 1999, Sukharev et al. 2001). В 1993 году было показано также, что механосенсорные каналы эпидермальных растительных клеток могут изменять ряд своих параметров при снижении температуры (Ding & Pickard 1993). Исследование роли механосенсорных каналов в восприятии стрессовых сигналов может оказаться, таким образом, перспективным направлением.

Целью настоящего исследования являлось изучение механосенсорного канала MscL пресноводной цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 как возможного сенсора, чувствительного к ряду стрессовых воздействий, ведущих к значительным изменениям физических свойств мембран (высоко- и низкотемпературные стрессы, гиперосмотический и солевой стрессы). Исходя из дели работы были поставлены задачи:

1. Получить мутанта Synechocystis с инактивированным механосенсорным каналом.

2. Исследовать влияние мутации по гену mscL на ростовые характеристики клеток Synechocystis в различных стрессовых условиях.

3. Выяснить влияние мутации на накопление ненасыщенных жирных кислот в ответ на понижение температуры.

4. Исследовать влияние мутации на активацию или репрессию генов в различных стрессовых условиях.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Люкевич, Александр Анатольевич

Заключение.

Изучение регуляторных путей стрессового ответа и адаптации занимает одно из центральных мест в мире научных исследований. Идентифицирован ряд сенсоров у бактерий и растительных клеток, воспринимающих сигнал о различных стрессах. Вместе с тем накапливаются данные о сходстве ответов клеток на ряд стрессов, таких как осмотический и солевой, осмотический и тепловой стрессы, по некоторому, довольно значительному, набору генов. Также изучается значимость некоторых ионов и соединений в регуляции стрессовых ответов - а именно ионов Са и циклических нуклеотидов (цАМФ).

До настоящего времени считалось, что механосенсорный канал МвсЬ участвует в регуляции объема клетки, активируясь при гипоосмотическом шоке. Роль МвсЬ в ответах клетки на другие внешние воздействия, а также его роль в регуляции экспрессии генов в стрессовых условиях не изучалась.

Мы предприняли попытку выяснения данных вопросов впервые и обнаружили, что МвсЬ является важным компонентом регуляторных цепей в клетках Вупескосунйъ при различных стрессовых воздействиях. По всей видимости, им присуща не только функция защиты клеток от повреждения цитоплазматической мембраны при значительном возрастании тургорного давления, но также и регуляторная функция. Мутантный штамм 8упескосуяШ, не имеющий механосенсорного канала, изменил ответ на ряд стрессовых воздействий.

Холодовой, тепловой и гиперосмотический стрессы вызывают значительные изменения в физических свойствах мембранах. Подобные изменения может воспринимать механосенсорный канал. Однако молекулярный механизм, регулирующий передачу сигнала, а также остальные компоненты регуляторной цепи остаются невыясненными. Вероятно, при изменении физического состояния мембраны изменяется ток ионов через МзсЬ (вполне вероятно, что ионов кальция), что может фиксировать другой компонент цепи передачи сигнала (например, гипотетическая протеин-киназа) и передавать сигнал дальше на компоненты, отвечающие за регуляцию транскрипции генов.

Механосенсорный канал МчсЬ, вероятно, является одним из компонентов цепи регуляции экспрессии генов, кодирующих белки фикобилисом, реакционных центров фотосистемы I и фотосистемы II, в ответ на понижение и повышение температуры, а также в ответ на повышение осмолярности среды. Причем в случае холодового стресса он работает как репрессор транскрипции, а в случае теплового и гиперосмотического стрессов, возможно, участвует в поддержании оптимального уровня транскрипции.

МбсЬ вовлечен в регуляцию экспрессии генов, кодирующих так называемые белки теплового шока, а именно БпаК, ОгоЕЬ, ОгоЕ8, и супероксиддисмутазы, вовлеченной в защиту клетки при окислительном стрессе, при тепловом и гиперосмотическом стрессах. Таким образом, мы показали, что механосенсорный канал вовлечен в систему регуляции общего стрессового ответа клетки.

Возможность полной инактивации механосенсорного канала указывает на то, что при оптимальных условиях культивирования он не является необходимым для жизни ЗупескосуяШ. Высоко- и низкотемпературный, а также гиперосмотический стрессы подавляли рост мутантного штамма Зупескосуяйя сильнее, чем рост штамма дикого типа, что свидетельствует об участии МзсЬ в регуляции стрессовых ответов в клетках.

Замедленная динамика накопления полиненасыщенных жирных кислот в клетках мутантного штамма показывает участие МвсЬ в регуляции десатурации при холодовом стрессе.

Мутация по механосенсорному каналу МвсЬ привела к снижению уровня индукции генов, активируемых низкими и высокими температурами, а также гиперосмотическим стрессом, и не повлияла на экспрессию генов, индуцируемых солевым стрессом. Мутация по механосенсорному каналу МэсЬ привела к сильному подавлению экспрессии генов, вовлеченных в фотосинтез, при тепловом стрессе.

Механосенсорный канал М^сЬ вовлечен в систему регуляции ответа клетки на стрессовые воздействия, вызывающие изменения физического состояния мембраны.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Люкевич, Александр Анатольевич, Москва

1. Ajouz B, Berrier C, Garrigues A, Besnard M, Ghazi A (1998) Release of thioredoxin via the mechanosensitive channel MscL during osmotic downshock of Escherichia coli cells. J Biol Chem 273: 26670-26674

2. Andresen MC, Yang M (1992) Gadolinium and mechanotransduction of rat aortic baroreceptors. Am J Physiol 262: H1415-H1421

3. Arfin SM, Long AD, Ito ET, Tolleri L, Riehle MM, Paegle ES, Hatfield GW (2000) Global gene expression profiling in Escherichia coli Kl2. The effects of integration host factor. J Biol Chem 275: 29672-29684

4. Bassett DE, Jr., Eisen MB, Boguski MS (1999) Gene expression informatics—it's all in your mine. Nat Genet 21:51-55

5. Berrier C, Besnard M, Ajouz B, Coulombe A, Ghazi A (1996) Multiple mechanosensitive ion channels from Escherichia coli, activated at different thresholds of applied pressure. J MembrBiol 151: 175-187

6. Berrier C, Garrigues A, Richarme G, Ghazi A (2000) Elongation factor Tu and DnaK are transferred from the cytoplasm to the periplasm of Escherichia coli during osmotic downshock presumably via the mechanosensitive channel mscL. J Bacteriol 182: 248-251

7. Blount P, Schroeder MJ, Kung C (1997) Mutations in a bacterial mechanosensitive channel change the cellular response to osmotic stress. J Biol Chem 272: 32150-32157

8. Blount P, Sukharev SI, Moe PC, Schroeder MJ, Guy HR, Kung C (1996) Membrane topology and multimeric structure of a mechanosensitive channel protein of Escherichia coli. EMBO J 15: 4798-4805

9. Chang G, Spencer RH, Lee AT, Barclay MT, Rees DC (1998) Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel. Science 282: 2220-2226

10. Cho RJ, Campbell MJ, Winzeier EA, Steinmetz L, Conway A, Wodicka L, Wolfsberg TG, Gabrielian AE, Landsman D, Lockhart DJ, Davis RW (1998) A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Mol Cell 2: 65-73

11. Cruickshank CC, Minchin RF, Le Dain AC, Martinac B (1997) Estimation of the pore size of the large-conductance mechanosensitive ion channel of Escherichia coli. Biophys J 73: 1925-1931

12. Ding JP, Pickard BG (1993) Modulation of mechanosensitive calcium-selective cation channels by temperature. Plant J 3: 713-720

13. Franco A, Jr., Winegar BD, Lansman JB (1991) Open channel block by gadolinium ion of the stretch-inactivated ion channel in mdx myotubes. Biophys J 59: 1164-1170

14. Golub TR (2001) Genome-wide views of cancer. N Engl J Med 344: 601-602

15. Gribskov M, Fana F, Harper J, Hope DA, Harmon AC, Smith DW, Tax FE, Zhang G (2001) PlantsP: a functional genomics database for plant phosphorylation. Nucleic Acids Res 29: 111-113

16. Gu L, Liu W, Martinac B (1998) Electromechanical coupling model of gating the large mechanosensitive ion channel (MscL) of Escherichia coli by mechanical force. Biophys J 74: 2889-2902

17. Gullingsrud J, Kosztin D, Schulten K (2001) Structural determinants of MscL gating studied by molecular dynamics simulations. Biophys J 80: 2074-2081

18. Gustin MC, Zhou XL, Martinac B, Kung C (1988) A mechanosensitive ion channel in the yeast plasma membrane. Science 242: 762-765

19. Hamill OP, Lane JW, McBride DW, Jr. (1992) Amiloride: a molecular probe for mechanosensitive channels. Trends Pharmacol Sei 13: 373-376

20. Harrington CA, Rosenow C, Retief J (2000) Monitoring gene expression using DNA microarrays. Curr Opin Microbiol 3: 285-291

21. Heller RA, Schena M, Chai A, Shalon D, Bedilion T, Gilmore J, Woolley DE, Davis RW (1997) Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays. Proc Natl Acad Sei U S A 94:2150-2155

22. Herbaud ML, Guiseppi A, Denizot F, Haiech J, Kilhoffer MC (1998) Calcium signalling in Bacillus subtilis. Biochim Biophys Acta 1448: 212-226

23. Hihara Y, Kamei A, Kanehisa M, Kaplan A, Ikeuchi M (2001) Dna microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell 13: 793-806

24. Howard J, Roberts WM, Hudspeth A J (1988) Mechanoelectrical transduction by hair cells. Annu Rev Biophys Biophys Chem 17: 99-124

25. Hoyer J, Kohler R, Distler A (1998) Mechanosensitive Ca2+ oscillations and STOC activation in endothelial cells. FASEB J 12: 359-366

26. Jacobs KB, Wedig GC, Schnell AH, Witte JS, Elston RC (1999) Model-based and modelfree multipoint genome-wide linkage analysis of alcoholism. Genet Epidemiol 17 Suppl 1: S175-S180

27. Kanzaki M, Nagasawa M, Kojima I, Sato C, Naruse K, Sokabe M, Iida H (1999) Molecular identification of a eukaryotic, stretch-activated nonselective cation channel. Science 285: 882-886

28. Kim D (1992) A mechanosensitive K+ channel in heart cells. Activation by arachidonic acid. J Gen Physiol 100: 1021-1040

29. Kiseleva LL, Serebriiskaya TS, Horvath I, Vigh L, Lyukevich AA, Los DA (2000) Expression of the gene for the delta9 acyl-lipid desaturase in the thermophilic cyanobacterium. J Mol Microbiol Biotechnol 2: 331-338

30. Klusener B, Boheim G, Liss H, Engelberth J, Weiler EW (1995) Gadolinium-sensitive, voltage-dependent calcium release channels in the endoplasmic reticulum of a higher plant mechanoreceptor organ. EMBO J 14: 2708-2714

31. Kohler R, Distler A, Hoyer J (1999) Increased mechanosensitive currents in aortic endothelial cells from genetically hypertensive rats. J Hypertens 17: 365-371

32. Matsushita O, Jung CM, Okabe A (1995) Identification of the gene encoding a mechanosensitive channel MscL homologue in Clostridium perfringens. Gene 165: 147148

33. Maurer JA, Elmore DE, Lester HA, Dougherty DA (2000) Comparing and contrasting Escherichia coli and Mycobacterium tuberculosis mechanosensitive channels (MscL). New gain of function mutations in the loop region. J Biol Chem 275: 22238-22244

34. McCraith SM, Kahn M (2001) Genome wide screening for inhibitors of protein kinases. Cell Mol Biol Lett 6: 471

35. Moe PC, Blount P, Kung C (1998) Functional and structural conservation in the mechanosensitive channel MscL implicates elements crucial for mechanosensation. Mol Microbiol 28: 583-592

36. Murata N, Wada H (1995) Acyl-lipid desaturases and their importance in the tolerance and acclimatization to cold of cyanobacteria. Biochem J 308 (Pt 1): 1-8

37. Nakamaru Y, Takahashi Y, Unemoto T, Nakamura T (1999) Mechanosensitive channel functions to alleviate the cell lysis of marine bacterium, Vibrio alginolyticus, by osmotic downshock. FEBS Lett 444: 170-172

38. Niculescu AB, III, Segal DS, Kuczenski R, Barrett T, Hauger RL, Kelsoe JR (2000) Identifying a series of candidate genes for mania and psychosis: a convergent functional genomics approach. Physiol Genomics 4: 83-91

39. Nilius B, Eggermont J, Voets T, Buyse G, Manolopoulos V, Droogmans G (1997) Properties of volume-regulated anion channels in mammalian cells. Prog Biophys Mol Biol 68: 69-119

40. Norris V, Grant S, Freestone P, Canvin J, Sheikh FN, Toth I, Trinei M, Modha K, Norman RI (1996) Calcium signalling in bacteria. J Bacteriol 178: 3677-3682

41. Owan I, Burr DB, Turner CH, Qiu J, Tu Y, Onyia JE, Duncan RL (1997) Mechanotransduction in bone: osteoblasts are more responsive to fluid forces than mechanical strain. Am J Physiol 273: C810-C815

42. Peterson LE, Barnholtz JS, Page GP, King TM, de Andrade M, Amos CI (1999) A genome-wide search for susceptibility genes linked to alcohol dependence. Genet Epidemiol 17 Suppl 1: S295-S300

43. Pomposiello PJ, Bennik MH, Demple B (2001) Genome-wide transcriptional profiling of the Escherichia coli responses to superoxide stress and sodium salicylate. J Bacteriol 183: 3890-3902

44. Reifarth FW, Clauss W, Weber WM (1999) Stretch-independent activation of the mechanosensitive cation channel in oocytes of Xenopus laevis. Biochim Biophys Acta 1417:63-76

45. Richmond T, Somerville S (2000) Chasing the dream: plant EST microarrays. Curr Opin Plant Biol 3: 108-116

46. Schleyer M, Schmid R, Bakker EP (1993) Transient, specific and extremely rapid release of osmolytes from growing cells of Escherichia coli K-12 exposed to hypoosmotic shock. Arch Microbiol 160: 424-431

47. Schreiber S, Hampe J, Eickhoff H, Lehrach H (2000) Functional genomics in gastroenterology. Gut 47: 601-607

48. Smoot LM, Smoot JC, Graham MR, Somerville GA, Sturdevant DE, Migliaccio CA, Sylva GL, Musser JM (2001) Global differential gene expression in response to growth temperature alteration in group A Streptococcus. Proc Natl Acad Sei U S A 98: 1041610421

49. Stanier RY, Kunisawa R, Mandel M, Cohen-Bazire G (1971) Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacterid Rev 35: 171 -205

50. Su X, Wachtel RE, Gebhart GF (2000) Mechanosensitive potassium channels in rat colon sensory neurons. J Neurophysiol 84: 836-843

51. Sukharev S (1999) Mechanosensitive channels in bacteria as membrane tension reporters. FASEB J 13 Suppl: S55-S61

52. Sukharev S, Durell SR, Guy HR (2001) Structural models of the MscL gating mechanism. Biophys J 81: 917-936

53. Sukharev S, Betanzos M, Chiang CS, Guy HR (2001) The gating mechanism of the large mechanosensitive channel MscL. Nature 409: 720-724

54. Sukharev SI, Blount P, Martinac B, Blattner FR, Kung C (1994) A large-conductance mechanosensitive channel in E. coli encoded by mscL alone. Nature 368: 265-268

55. Sukharev SI, Blount P, Martinac B, Kung C (1997) Mechanosensitive channels of Escherichia coli: the MscL gene, protein, and activities. Annu Rev Physiol 59: 633-657

56. Sukharev SI, Martinac B, Arshavsky VY, Kung C (1993) Two types of mechanosensitive channels in the Escherichia coli cell envelope: solubilization and functional reconstitution. Biophys J 65: 177-183

57. Sukharev SI, Schroeder MJ, McCaslin DR (1999) Stoichiometry of the large conductance bacterial mechanosensitive channel of E. coli. A biochemical study. J Membr Biol 171: 183-193

58. Sukharev SI, Sigurdson WJ, Kung C, Sachs F (1999) Energetic and spatial parameters for gating of the bacterial large conductance mechanosensitive channel, MscL. J Gen Physiol 113: 525-540

59. Sullivan MJ, Sharma RV, Wachtel RE, Chapleau MW, Waite LJ, Bhalla RC, Abboud FM (1997) Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circ Res 80: 861-867

60. Suzuki I, Kanesaki Y, Mikami K, Kanehisa M, Murata N (2001) Cold-regulated genes under control of the cold sensor Hik33 in Synechocystis. Mol Microbiol 40: 235-244

61. Suzuki I, Los DA, Kanesaki Y, Mikami K, Murata N (2000) The pathway for perception and transduction of low-temperature signals in Synechocystis. EMBO J 19: 1327-1334

62. Tao H, Bausch C, Richmond C, Blattner FR, Conway T (1999) Functional genomics: expression analysis of Escherichia coli growing on minimal and rich media. J Bacteriol 181: 6425-6440

63. Torrecilla I, Leganes F, Bonilla I, Fernandez-Pinas F (2000) Use of recombinant aequorin to study calcium homeostasis and monitor calcium transients in response to heat and cold shock in cyanobacteria. Plant Physiol 123: 161-176

64. Trombe MC, Clave C, Manias JM (1992) Calcium regulation of growth and differentiation in Streptococcus pneumoniae. J Gen Microbiol 138 ( Pt 1): 77-84

65. Wiggs JL, Allingham RR, Hossain A, Kern J, Auguste J, DelBono EA, Broomer B, Graham FL, Hauser M, Pericak-Vance M, Haines JL (2000) Genome-wide scan for adult onset primary open angle glaucoma. Hum Mol Genet 9: 1109-1117

66. Wilkinson NC, Gao F, Hamill OP (1998) Effects of mechano-gated cation channel blockers on Xenopus oocyte growth and development. J MembrBiol 165: 161-174

67. Williams JG, Szalay AA (1983) Stable integration of foreign DNA into the chromosome of the cyanobacterium Synechococcus R2. Gene 24: 37-51

68. Wodicka L, Dong H, Mittmann M, Ho MH, Lockhart DJ (1997) Genome-wide expression monitoring in Saccharomyces cerevisiae. Nat Biotechnol 15: 1359-1367

69. Ye RW, Tao W, Bedzyk L, Young T, Chen M, Li L (2000) Global gene expression profiles of Bacillus subtilis grown under anaerobic conditions. J Bacteriol 182: 4458-4465

70. Zhang Y, Lefort J, Kearsey V, Lapa e Silva JR, Cookson WO, Vargaftig BB (1999) A genome-wide screen for asthma-associated quantitative trait loci in a mouse model of allergic asthma. Hum Mol Genet 8: 601-605

71. Zou S, Meadows S, Sharp L, Jan LY, Jan YN (2000) Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 13726-13731