Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Двухкомпонентные системы регуляции ответа цианобактерии Synechocystis на гиперосмотический и солевой стрессы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Двухкомпонентные системы регуляции ответа цианобактерии Synechocystis на гиперосмотический и солевой стрессы"

На правах рукописи

ШУМСКАЯ Мария Анатольевна

ДВУХКОМПОНЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ РЕГУЛЯЦИИ ОТВЕТА ЦИАНОБАКТЕРИИ БУШСИОСУБПБ НА ГИПЕРОСМОТИЧЕСКИЙ И СОЛЕВОЙ СТРЕССЫ

03.00.12 - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2004

ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ БЕСПЛАТНЫЙ ' ЭКЗЕМПЛЯР

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ внутриклеточной рефляции Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН, г. Москва и в Лаборатории клеточной регуляции Национального Института общей биологии, г. Оказаки, Япония.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор Лось Дмитрий Анатольевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Новикова Галина Викторовна

доктор биологических наук Еланская Ирина Влазимировна

ВЕД УЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт биоорганической химии им. МЛ!.Шемякина и Ю.А.Овчишшкова

Зашита состоится «1» июня 2004 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета К 002210.01 при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (095) 977-80-18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «22» апреля 2004 г.

Учбный секретарь

Диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В ответ на стрессовые воздействия организмы регулируют экспрессию множества генов, что позволяет им адаптироваться к меняющимся условиям среды. Гены, экспрессия которых изменяется в результате стресса, в основном хорошо известны, однако механизмы восприятия и передачи стрессового сигнала до сих пор мало изучены. Известно, что у бактерий большую роль в восприятии и передаче стрессовых сигналов играют двухкомпонентные системы, состоящие из гистидин-киназ и регуляторов ответа (Egger et al., 1997; Wood, 1999).

Участие двухкомпонентных систем автотрофной цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 в регуляции ответа на абиотические стрессы до сих пор остается малоизученным. Известно, что гистидин-киназа 33 (ШкЗЗ) является сенсором холодового и гиперосмотического стрессов (Mikami et al., 2002). Кроме того, показано, что Hik33, а также Hik34, Hikl6 и Hik41 являются сенсорами солевого стресса (Marin et al., 2003). Однако, регуляторы ответа, принимающие сигналы от этих гистидин-киназ, все еще оставались неизвестными.

Анализ экспрессии генов при стрессах у мутантов по регуляторам ответа и гистидин-киназам с помощью методов слот-блота и ДНК-микрочипов позволяет идентифицировать возможных участников двухкомпонентных систем, воспринимающих и передающих стрессовые сигналы.

Цели и задачи работы. Целью работы являлась идентификация двухкомпонентных систем регуляции, участвующих в восприятии и передаче сигналов при гиперосмотическом и солевом стрессах, в клетках Synechocystis. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Получение библиотеки мутантов, дефектных по генам, кодирующим регуляторы ответа.

2. Исследование экспрессии генов у мутантов под действием гиперосмотического и солевого стрессов.

3. Идентификация сенсорных гистидин-киназ и принимающих от них сигналы регуляторов ответа, отвечающих за экспрессию генов под воздействием гиперосмотического и солевого стрессов.

Научная новизна. Впервые идентифицированы регуляторы ответа, входящие в состав двухкомпонентных систем регуляции ответа на солевой и гиперосмотический стрессы. Предложена схема восприятия и

j РОС национальная j библиотека

09 %

^^-- - *

передачи сигналов при солевом и гиперосмотическом стрессах с участием пяти двухкомпонентных систем регуляции.

Научно-практическое значение. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов развития ответа на гиперосмотический и солевой стрессы. Идентификация компонентов, осуществляющих передачу сигналов в клетке, является одним из важнейших шагов на пути к пониманию молекулярных механизмов работы регуляторных систем организма.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на Международных симпозиумах по Молекулярной генетике и биотехнологии. (Москва, 2001) по фототрофным прокариотам (Токио, 2003), на Всероссийском съезде генетиков (Москва, 2004), на Съезде японского общества физиологов растений (Токио, 2004).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Объекты и методы исследований, Результаты и их обсуждение, Заключение, Выводы, Литература. Работа изложена на 90 страницах машинописного текста, включает 14 рисунков, 5 таблиц; список литературы включает 107 наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы цианобактерий. Штаммы цианобактерии БупескосузШ 8р. РСС 6803 были предоставлены Национальным Институтом Общей Биологии (№ВВ, Оказаки, Япония) и Московским Государственным Университетом, кафедра Генетики. Мутантные штаммы АКге1-42 с инактивированными генами регуляторов ответа были получены путем сайт-специфического мутагенеза с использованием кассеты устойчивости к антибиотику спектиномицину (Бр) или канамицину (Кт). Штаммы мутантов БупескосузШ 8р. РСС 6803 по гистидин-киназам НШ-Н1к43 также были предоставлены Национальным Институтом Общей Биологии (№ВВ, Оказаки, Япония).

Конструирование рекомбинантных штаммов. Нами были сконструированы 24 рекомбинантных штамма БупескосузШ, дефектных по генам, кодирующим регуляторы ответа. Амплификация фрагментов, включающих в себя гены регуляторов ответа с фланкирующими областями, проводилась из геномной ДНК БупескосузШ при помощи соответствующих- праймеров (нуклеотидные последовательности

приведены в диссертации) ДНК-полимеразой AmpliTaqGold (Perkin Elmer, США). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) включала в себя предварительную денатурацию ДНК (2 мин, 95°С), и 30 циклов, состоящих из последовательных стадий: денатурации ДНК (1 мин, 95°С), отжига праймеров (1 мин, 55-57°С) и синтеза цепи ДНК (2 мин, 72°С); с последующим дополнительным синтезом цепи ДНК в течение 10 мин при 72°. Полученные в результате ПЦР фрагменты ДНК были клонированы в векторе pT7Blue-T/A (Novagen, США). Для мутантов ARrel8, ARre31, ARie37 и ARie39 кассета устойчивости к спектиномицину была получена из плазмиды pAL (Prentki et al., 1984) Для остальных мутантов кассета устойчивости к канамицину была получена из плазмиды pUC4KIXX (Pharmacia). Кассеты были клонированы по сайтам рестрикции, находящимся в кодирующих районах генов (Рис. 1).

Рестрикция и лигирование ДНК проводились ферментами фирмы TaKaRa (Япония) и Fermentas (Литва), согласно протоколам фирм-изготовителей.

Km

В

Рис. 1. Конструирование мутантов с разрушенными генами регуляторов ответа (пример). (1) Гены пе31 (А), гтвЦБ), гтв17{В) и гтеЗ(Г) были амплифицированы с использованием специфических праймеров (указаны черными стрелками) Кассеты устойчивости к антибиотику были вставлены в сайты соответствующих рестриктаз. (2) Электрофорез амплифици-роеанных фрагментов ДНК при проверке степени сегрегации хромосом для проверки мы использовали те же праймеры, что и в случае конструирования мутантов В диком типе размер амплификата соответствует длине гена гте, а в мутанте он больше на 1400-1600 нуклеотидов, в зависимости от вставленной в него кассеты устойчивости к антибиотику.

>111709, V.I3291 Ф1Ш гте17-г ire!

пе17-Г

Km

Г

, sí/0650 , , ггсЗ-г ггсз-f

Трансформация клеток цианобактерий.' Трансформацию клеток Synechocystis проводили методом Вильямса (Williams, 1988). Клетки из 100 мл интенсивной культуры, осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 2 мл среды BG11. К суспензии добавляли 5-10 мкг ДНК, инкубировали 4 ч в темноте, затем Л 0 ч на свету. После этого клетки высевали на чашки с агаризованной средой BG11, содержащей 5 мкг мл*1 спектиномицина или канамицина. Первичные клоны последовательно пересевали с увеличением концентрации антибиотика от 5 до 20 мкг мл"1 (при селекции на спектиномицине) и до 25 мкг мл"1 (при селекции на канамицине). Полученные рекомбинантные штаммы растили на среде, содержащей 20 мкг мл"1 спектиномицина или 25 мкг мл*1 канамицина.

Сегрегацию хромосом в мутантных штаммах ARre проверяли ПЦР с использованием фермента ExTaq DNA Polymerase (TaKaRa). Условия реакции были следующими: предварительная денатурация ДНК (2 мин, 95°С); 30 циклов, состоящих из денатурации ДНК (1 мин, 95°С), отжига праймероВ'О мин, 55-57°С) и синтеза цепи ДНК (5-6 мин, 72°С); дополнительный синтез ДНК (10 мин, 72°С). Для проверки использовали пары праймеров, специфичных для каждого гена регулятора ответа. Информация о сконструированных мутантах доступна в сети Интернет (www.kazusa.or.jp/cyano/Synechocystis/mutant).

Условия культивирования. Культуры цианобактерий поддерживали на агаризованной среде BG11 (с содержанием агарозы Л %), забуференяой 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,5 (Stainer et al., 1971) на чашках Петри при температуре 34°С и постоянном освещении люминесцентными лампами интенсивностью 70 мкМ квантов света м'йс" \ Мутантные штаммы поддерживали на среде с добавлением спектиномицина до конечной концентрации 20 мкг мл"1 или канамицина - до концентрации 25 мкг мл-1.

Интенсивные культуры выращивали в сосудах в жидкой среде BG11, забуференной 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, при температуре 34°С, постоянном освещении лампами накаливания интенсивностью 70 мкМ квантов света M' V1 И аэрации стерильной газо-воздушной смесью, обогащенной СОг до концентрации 1%. Клетки растили в данных условиях до ОПтзо= 0,3-0,4 (контрольные условия) и затем проводили эксперименты по солевому и гиперосмотическому стрессам.

Экспериментальные условия. Экспериментальные условия гиперосмотического стресса создавались добавлением к среде культивирования 5М раствора сорбита в среде BG11 до конечной концентрации 0,5М. Выбор данного вещества для создания

гипреосмотических условий связан с тем, что сорбит не токсичен для клеток, не проникает внутрь и не взаимодействует с клеточными рецепторами.

Экспериментальные условия солевого стресса создавали добавлением к среде культивирования 5М раствора NaCl в BG11 до конечной концентрации 0,5М. Длительность экспериментов составляла 20 мин.

Выделение РНК. Выделение общей клеточной РНК проводили согласно общепринятой методике. Для этого 50 мл суспензии клеток Synechocystis (ОПтзо= 0,3-0,4) фиксировали с помощью добавления равного объема охлажденного этанола, содержащего 5% фенола. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об мин"1 при 4°С (центрифуга К-23, Германия). Осадок ресуспендировали в 1 мл буфера ТЕ 50/100 (50 тМ Трис-HCl, рН 7.5, 100 тМ ЭДТА), переносили в пробирки типа эппендорф, осаждали центрифугированием, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. Перед выделением нуклеиновых кислот осадок ресуспендировали в 0,6 мл STE (50 тМ Трис-HCl, рН 8, 5 тМ ЭДГА, 50 тМ NaCl, 0,5 % SDS) буфера и инкубировали с 0,55 мл фенола, насыщенного ТЕ, 10 мин при 65°С. Затем смесь центрифугировали в течение 3-5 мин, супернатант отделяли и трижды обрабатывали смесью фенола с хлороформом (1:1). Нуклеиновые кислоты осаждали двойным объёмом этанола, растворяли в воде и обрабатывали свободной от РНКазы ДНКазой I (Nippon Gene, Япония), согласно рекомендациям производителя, для освобождения от геномной ДНК, после чего дважды обрабатывали смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (25:24:1). РНК осаждали из раствора двойным объемом этанола.

Слот-блот гибридизация. В экспериментах использовали по 10 мкг общей клеточной РНК, денатурированной при 65°С 10 мин. РНК наносили на нейлоновую мембрану Hybond N (Ameisham Pharmacia Biotech, Швеция) с помощью вакуумного аппарата PR 648 Slot Blot Filtration Manifold (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция), согласно рекомендациям производителя.

Мембрану с нанесенной РНК гибридизовали с несколькими зондами. В качестве зондов использовались ПЦР-продукты генов, индуцируемых исследуемыми стрессами. В случае солевого стресса использовалиж/г1544, dnaK-2(slW170),slrO967n htrA (sir1204),в случае гиперосмотического стресса помимо названных зондов использовали также hspA (sill514) иfabG (sll0330). Изготовление меченого зонда, гибридизацию и отмывку мембраны проводили с помощью набора AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-star (Amersham

Pharmacia Biotech, Швеция), согласно рекомендациям производителя. Детекцию сигнала производили с помощью люминисцентного анализатора LAS-1000 (Fuji Photo Film, Япония).

Нозерн-блот гибридизация. В экспериментах использовали по 15 мкг общей клеточной РНК, которую денатурировали, а затем разделяли электрофорезом в 1,2%-агарозном геле, содержащем формальдегид, и переносили на нейлоновую мембрану Hybond N (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция). Приготовление меченого зонда, гибридизацию, отмывку мембраны и детекцию сигнала проводили так же, как и в экспериментах по слот-блот гибридизации. Для контроля равномерности нанесения образцов на мембрану проводили гибридизацию с генами 16S рибосомальной РНК (16S rRNA) и субъединицы В РНКазы Р (гпрВ).

Анализ экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов (DNA microarray). Для реакции обратной транскрипции использовали следующую реакционную смесь: 100 ед. обратной транскриптазы AMV Reverse Transcriptase XL (TaKaRa Co. Ltd., Киото, Япония), lx реакционный буфер, смесь дезоксирибонуклеотидилтрифосфатов с низким содержанием dCTP (2 шМ dCTP, 5 mM dTTP, 5 тМ dGTP, 5 тМ АТР), 3 тМ СуЗ-dGTP (или Cy5-dCTP), (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция), 300 пМ случайного гексамерного праймера, 100 ед. ингибитора РНКаз (RNasin I, TaKaRa Co. Ltd., Киото, Япония), 20 ми-общей РНК. СуЗ и Су5 - флуорофоры с различными спектрами поглощения и эмиссии. РНК, выделенную из контрольного образца, метили Cy5-dCTP, выделенную из экспериментального образца - СуЗ-dCTP. Реакцию обратной транскрипции проводили при 42°С 2 ч. Не включившиеся в цепь кДНК нуклеотиды удаляли путем гель-фильтрации на колонках Centri-Sep (Princeston Separations, США) (Kanesaki et al., 2002; Yamaguchi et al., 2002). Полученную меченую кДНК освобождали от РНК щелочным гидролизом (200 mM NaOH 40 минут при 65°С) с последующей нейтрализацией щелочи 3 М ацетатом натрия (рН 5,5) и переосаждением этанолом (Heller et al., 1997; Ye et al., 2000).

Цианочипы версии 1.4 (CyanoCHIP v. 1.4) были предоставлены компанией TaKaRa. Микрочипы прегибридизовали в буфере, содержащем, 4х SSC, 0,2% SDS, 5х раствор Денхардта, 100 нг мл*1 ДНК спермы лосося, при температуре 65 °С 1 ч. Гибридизацию проводили при тех же условиях в течение 12 ч. Гибридизованные чипы отмывали в 2х SSC (lx SSC содержит 150 mM NaCl и 15 тМ цитрата натрия) при комнатной температуре, 2х SSC 10 мин при 60°С, затем в 0,2х SSC и

0,1% SDS 10 мин при 60°С и в 0,2 х SSC 2 мин при комнатной температуре.

Микрочипы сканировали на сканере GMS418 (Affimetiix, США) с последующим анализом интенсивности сигналов индивидуальных генов при помощи программы AutoGene V. 4.1 software (BioDiscoveiy, Лос-Анджелес, США). Интенсивность сигнала каждого гена нормализовали по сумме интенсивностей сигналов всех генов за исключением генов рРНЬС Затем рассчитывали изменения в количестве транскрипта каждого гена по отношению к общему уровню мРНК. Все эксперименты проводили в двух повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Конструирование библиотеки мутантов, дефектных по генам регуляторов ответа. Для идентификации регуляторов ответа, принимающих участие в двухкомпонентных системах, которые контролируют ответ на солевой и гиперосмотический стрессы, мы создали библиотеку мутантов, дефектных по генам rrel-rre42.

Всего геноме Synechocystis было найдено 45 генов регуляторов ответа (42 гена в хромосоме и 3 — в плазмидах цианобактерии). Восемнадцать штаммов, дефектных по генам, кодирующим регуляторы ответа, были получены на Кафедре генетики МГУ (Москва). Нами было завершено конструирование делеционных мутантов по регуляторам ответа, закодированным в хромосоме.

Нам удалось успешно инактивировать практически все гены гге. Исключение составили гены rre23, rre25 и гге2б. В случае генов регуляторов ответа 23 и 26 нам не удалось достичь полной сегрегации хромосом цианобактерии, и у мутантов всё еще оставались копии гена дикого типа. В случае гена гге25 мутанта получить не удалось. Это говорит о том, что данные гены являются необходимыми для жизнедеятельности Synechocystis в нормальных условиях.

Анализ экспрессии генов мутантов по Rre при солевом и гиперосмотическом стрессе с помощью слот-блот и нозерн-блот гибридизации. Для того чтобы идентифицировать регуляторы ответа, принимающие участие в передаче сигнала солевого и гиперосмотического стресса на соответствующие гены стрессовых ответов, мы провели скрининг библиотеки мутантов под воздействием стрессов методом слот-блот гибридизации. В качестве гибридизационных зондов использовали фрагменты генов, индуцируемых солевым и гиперосмотическим стрессами у дикого типа. Мы выбрали гены slrO967> slrl544, htrA и dnaK-2, в случае

гиперосмотического стресса использовали также кярЛ и ген /аЬО, который индуцируется только гиперосмотическим стрессом (Рис. 2,3).

Рис. 3. Слот-блот анализ экспрессии генов у мутантов по регуляторам ответа при гиперосмотическом стрессе. Ж- дикий тип; AR^e^le - мутанты по регуляторам ответа.

При гибридизации образцов РНК с зондом dnaK-2 было обнаружено, что под действием солевого и гиперосмотического стрессов почти у всех мутантов экспрессия этого гена была на том же уровне, что и у дикого типа.

Исключение составлял мутант ARrel, у которого индукция экспрессии этого гена не наблюдалась (рис.2). Это означает, что продукт гена rrel необходим для индукции экспрессии dnaK-2 при солевом и гиперосмотическом стрессе.

Известно, что индукция dnaK-2 при солевом стрессе также контролируется гистидин-кшшой Hik34 (Marin et al., 2003). На этом этапе исследований был сделан вывод, что, по-видимому, НПс34 и Rrel составляют единую двухкомпонентную систему, необходимую для передачи сигнала солевого стресса и индукции экспрессии гена dnaK-2. Поскольку при гиперосмотическом стрессе в мутанте ARrel индукция dnaK-2 также отсутствует (не показано), мы предположили, что двухкомпонентная система Hik34/Rrel также участвует в ответах клетки на гиперосмотический стресс.

При гибридизации мембран с зондом sir 1544 было обнаружено, что экспрессия этого гена при солевом стрессе отсутствует у мутанта ARre31. Предположительно, Rre31 является партнером Hik33, контролирующей экспрессию гена sir 1544при солевом стрессе (Marin et al., 2003). При гиперосмотическом стрессе у ARie31 отсутствует экспрессия генаfabG, контролируемого в этих условиях НйсЗЗ (Kanesaki et al., 2002). По-видимому, пара Hflc33/Rie31 является единой двухкомпонентной системой, регулирующей ответы на солевой и гиперосмотический стрессы.

Аналогичные выводы были сделаны для Rrel7, у которого отсутствовала экспрессия гена slrO967 при обоих стрессах, и пары гистидин-киназ Hikl6/Hik41, которые регулируют экспрессию этого гена в условиях солевого стресса (Marin et al., 2003). По-видимому, Hikl6/Hik41 и Rrel7 могут составлять одну регуляторную систему, контролирующую индукцию экспрессиигенаs/rO967.

При скрининге мутантов по Rre с использованием зонда htrA, мы обнаружили отсутствие экспрессии этого гена у мутанта ARre3, однако гистидин-киназа, контролирующая экспрессию этого гена, была на тот момент неизвестна.

Поиск гистидин-киназы - партнера для Rre3. Для поиска гистидин-киназы - партнера Rre3, мы воспользовались результатами экспериментов с дрожжевой двугибридной системой (Tabata, 2003; Sato et al., 2003), позволяющей экспериментально выявить возможные белок-белковые взаимодействия. Эта система была недавно разработана для

белков Synechocystis в Институте исследования ДНК (Kazusa DNA Research Institute, Япония). Согласно результатам, полученным с применением этой системы, белком, взаимодействующим с белком Rre3, может являться HfldO.

Нозерн-блот анализ. Для подтверждения предположения о возможном партнерстве Rrel/Hik34, Rrel7/Hikl6/Hik41, Rre31/Hk33 и Rre3/HiklO, был проведен нозерн-блот анализ экспрессии индуцируемых стрессом генов у мутантов по исследуемым гистидин-киназам и регуляторам ответа. В качестве гибрвдизационных проб использовали фрагменты тех же генов, которые мы применяли в экспериментах по слот-блоту. Результаты нозерн-блоттинга полностью подтвердили предположение о том, что Rrel/Hik34, Rrel7/Hikl6/Hik41, Rre31/Hik33 и Rre3/HiklO являются партнерами, составляющими пять двухкомпонентных систем, которые принимают участие в регуляции ответа на солевой и гиперосмотический стресс.

Анализ экспрессии генов мутантов по Rгe при солевом и гиперосмотическом стрессе с помощью ДНК-микрочипов. Для

выявления всего спектра генов, контролируемых найденными нами двухкомпонентными системами, экспрессия генов при солевом и гиперосмотическом стрессе у мутантов по Н1к и Яге была исследована с помощью ДНК-микрочипов. Полученные результаты можно суммировать следующим образом (полные данные приведены в диссертации):

1. Профили экспрессии генов при солевом и гиперосмотическом стрессах в мутантах АНге31 И ДШкЗЗ совпадают. В этих мутантах при солевом стрессе не индуцируется экспрессия 7 генов, среди которых гены кНА, кliB, ЫС и ген, кодирующий альтернативный сигма-фактор РНК-полимеразы, sigD. При солевом стрессе Яге31 и Шк33 регулируют одни и те же гены и, следовательно, составляют одну двухкомпонентную систему. При гиперосмотическом стрессе в этих мутантах не индуцируется экспрессия 12 генов: шести генов, индуцируемых солевым стрессом, и шести генов, индуцируемых только гиперосмотическим стрессом (например,,/аЬО). При гиперосмотическом стрессе Яге31 и Шк33 также регулируют одни и те же гены и составляют одну двухкомпонентную систему.

2. Профили экспрессии генов в мутантах ДКге1 и ДН1к34 совпадают лишь частично. В мутанте ДКге1 при солевом стрессе не наблюдается индукция 21 гена, находящегося также под контролем Шк34. В эту группу входят гены кspA, dnaK-2, §гоЕЫ (индуцируемые также и при тепловом стрессе) и другие. На основании этого можно заключить, что Шк34 и Яге1 составляют одну двухкомпонентную систему.

Однако, в условиях солевого стресса у ДКге1 нарушена также индукция 5 генов, для которых сенсорная гистидин-киназа неизвестна -например, sigB, кодирующий сигма-фактор РНК-полимеразы. Вероятно, Яге1 способен взаимодействовать не только с Шк34, но и с другой какой-то другой гистидин-киназой, что даёт ему возможность регулировать экспрессию разных групп генов. Данные, полученные с использованием дрожжевой двугибридной системы показывают, что вероятным партнером Яге1 может являться Шк2. К сожалению, инактивация гена Шк2 у мутанта АН1к2, который мы использовали в работе, оказалась неполной - в хромосоме мутанта всё еще присутствует копия гена дикого типа (соотношение копий мутантного гена к копиям гена дикого типа по данным ПЦР-анализа составляет 3:7). Благодаря наличию работающих копий гена Ык2 мутант

демонстрировал фенотип дикого типа. В связи с этим мы можем лишь предполагать, что вероятным партнером для Кге1 может являться Шк2.

В условиях гиперосмотического стресса под контролем двухкомпонентных систем И1к34/Кге1 и предполагаемой Шк2/Кге1 находятся 17 и 5 генов, соответственно. Некоторые из них перекрываются с генами, находящимися под контролем этой системы в условиях солевого стресса.

3. У мутантов ДКге17 и АНШ6/АН1к41 при солевом и гиперосмотическом стрессе нарушена индукция двух генов - sllO939 и slrO967. На основании этого можно сделать вывод о том, что Кге17 и пара Шк16/Шк41 являются единой регуляторной системой, контролирующей экспрессию этих двух генов при обоих стрессах.

4. У мутантов АИгеЗ и ДШк10 при солевом и гиперосмотическом стрессах нарушена индукция гена Ш^. Это означает, что КгеЗ и И1сЮ составляют одну двухкомпонентную систему, регулирующую экспрессию этого гена при обоих стрессах.

Кроме того, обнаружено, что индукция большой группы генов при стрессах не изменилась у исследуемых мутантов. Среди генов этой группы - индуцируемые обоими стрессами glpD и ggpS, продукты которых принимают участие в метаболизме глицерина, необходимого для адаптации клетки к стрессовым условиям; rlpA, индуцируемый при гиперосмотическом стрессе; индуцируемый солевым стрессом ndhR, кодирующий важный транскрипционный регулятор. Это означает, что в регуляции экспрессии всех этих генов принимают участие еще не найденные нами двухкомпонентные системы. Возможно также, что их экспрессия управляется неизвестным механизмом, не связанным с двухкомпонентными системами. Общая схема регуляции ответа на солевой и гиперосмотический стресс у Synechocystis представлена на Рис. 4.

Взаимодействие регуляторных систем, контролирующих экспрессию генов при солевом и гиперосмотическом стрессах. Из

вышеприведенных данных можно заключить, что регуляцию ответа на солевой и гиперосмотический стрессы осуществляют пять двухкомпонентных систем: И1к33/Яге31, И1к34/Яге1, ИкЮ/Яге3 и И1к16/И1к41/Яге17. Однако, данные, полученные с применением ДНК-микрочипов, свидетельствуют о том, что при солевом и гиперосмотическом стрессах эти двухкомпонентные системы регулируют разные группы генов. Сравнение генов, находящихся под контролем двухкомпонентных систем при этих двух стрессах, представлено на Рис. 5.

Рис. 5. Взаимодействие регуляторных систем, контролирующих экспрессию

генов при солевом и гиперосмотическом стрессах

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате скрининга библиотеки мутантов, дефектных по регуляторам ответа, под действием солевого и гиперосмотического стресса нам удалось найти недостающие звенья в цепях двухкомпонентных систем, контролирующих ответ на эти стрессы -Rrel, Rre3, Rrel7, Rre31.

С помощью ДНК-микрочипов мы исследовали генную экспрессию при солевом стрессе у мутантов по регуляторам ответа и гистидин-киназам, являющихся сенсорами солевого стресса (Marin et al., 2003). Таким образом, установлено, что регуляторы ответа составляют с гистидин-киназами следующие двухкомпонентные системы: Hik33/Rre31, Hikl6/Hik41/Rrel7, Hik34/Rrel, Hik2/Rrel и Hikl0/Rre3. Возможная связь Rrel с двумя различными гистидин-киназами, Hik34 и Hik2, позволяет предположить, что гистидин-киназы и регуляторы ответа не являются жёсткими парами. Один регулятор ответа может взаимодействовать с несколькими гистидин-киназами и наоборот.

Совокупность полученных данных позволяет утверждать, что гиперосмотический и солевой стрессы воспринимаются одними и теми же двухкомпонентными системами. Однако различия в группах генов, регулируемых этими системами, означают, что эти сенсорные системы дифференцируют сигналы солевого и гиперосмотического стресса. Тем не менее, регуляция двухкомпонентными системами при разных стрессовых воздействиях сходных групп генов предполагает наличие универсальной общей компоненты в восприятии солевого и гиперосмотического стрессов. Возможно - это изменение физических свойств мембраны, связанное с уменьшением объема клеток на начальных стадиях солевого и гиперосмотического стрессов, что может являться сигналом активации мембранных гистидин-киназ Hik33, Hikl6 и HiklO. Цитоплазматическая гибридная гистидин-киназа Hik41, по-видимому, принимает сигнал от Hikl6 и передает его на Rrel7, а сигналом активации внутриклеточной Hik34, вероятно, могут служить цитоплазматические факторы.

Двухкомпонентные системы, исследованные в нашей работе, контролируют только часть генов, индуцируемых солевым и гиперосмотическим стрессами. Это говорит о том, что на данном этапе мы обнаружили не все двухкомпонентные системы регуляции и, кроме того, множество генов может регулироваться без участия двухкомпонентных систем. Механизмы регуляции экспрессии этих генов требуют дальнейшего изучения.

выводы

1. Создана библиотека делеционных мутантов БупееНоеузИз, дефектных по генам, кодирующим регуляторы ответа (Кте).

2. Идентифицированы регуляторы ответа, контролирующие экспрессию генов, индуцируемых при солевом и гиперосмотическом стрессе.

3. Идентифицированы 5 двухкомпонентных систем восприятия и передачи сигналов при солевом и гиперосмотическом стрессах: Шк33/Кге31, Н1к16/Н1к41/Кге17, Н1к34/Кге1, И1к2/Кге1 и ШкЮ/КгеЗ.

4. Эти двухкомпонентные системы воспринимают сигналы солевого и гиперосмотического стрессов, но распознают их как различные сигналы.

5. Возможная связь Кге1 с двумя различными гистидин-киназами, Шк34 и Шк2, позволяет предположить, что гистидин-киназы и регуляторы ответа не являются жесткими парами. Один регулятор ответа может взаимодействовать с несколькими гистидин-киназами и наоборот.

6. Предложена схема восприятия и передачи сигналов при солевом и гиперосмотическом стрессах с участием пяти двухкомпонентных систем регуляции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Shoumskaya M, Lyukevich A., Bedbenov V.S., Los D.A. (2001) Fingerprinting of Spirulina genome after gamma irradiation. Abstr. Internal Symp. on Molecular genetics and Biotechnology, Moscow, Russia, November 22-24,2001. p. 136

2. Shoumskaya ML, Suzuki S., Shapiguzov A., Piven I, Zinchenko V.V., Los D.A., Murata N. (2003) A mutant library of response regulators in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. Abstr. 11 International Symposium on Phototrophic Prokaryotes, Tokyo, Japan, August 24-29, 2003. p. 135.

3. Kanesaki Y., Yamamoto H., Paithoonrangsarid K., Shoumskaya M., Suzuki I., Murata N. (2004) Four histidine kinases are main sensors of hydrogen peroxide-stress signals in Synechocystis" Abstr. 45th Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiologistis, Tokyo, Japan, March, 27-29,2004. p. s53

4. Paithoonrangsarid K., Shoumskaya M., Kanesaki Y., Los D., Zinchenko V., Sato S., Tanticharoen M., Suzuki I., Mikami K., Murata N. (2004) Two-component system involved in hyperosmotic signal transduction in Synechocystis sp. PCC6803" Abstr. 45 Annual Meeting ofthe Japanese Society of Plant Physiologistis, Tokyo, Japan, March, 27-29, 2004. p. s53

5. Шумская М., Шапигузов А., Сузуки Ш., Зинченко В.В., Мурата Н., Лось ДА. (2004) Библиотека мутантов по респонс-регуляторным белкам цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Тезисы Докл. Симпозиума «Генетика и селекция микроорганизмов» в рамках 3-го съезда ВОГИС, Москва, Россия,7 июня 2004 г.

6. Paithoonrangsarid К., Shoumskaya M., Kanesaki Y., Yamamoto H., Los D.A., Zinchenko V., Satoh S., Tanticharoen M., Mikami K., Suzuki I., Murata N. (2004) Five two-component systems are involved in perception and transduction of hyperosmotic signals in the transcriptional regulation of gene expression in Synechocystis. Proc. Natl. Acad. Set USA (submitted).

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 19.04.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,25. Тираж 120 экз. Заказ 444. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.ВЛомоносова.

913144

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шумская, Мария Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 двухкомпонентные системы.

Организм и стресс.б

Открытие двухкомпонентных систем.

Строение двухкомпонентной системы. Механизм передачи сигнала.

Разнообразие доменов Hik и Rre.

Каким образом Hik и Rre удается специфически взаимодействовать?.

1.2 Участие двухкомпонентных систем в регуляции ответов на стрессы.

Несколько сенсоров могут активировать один и тот же сигнальный путь.

Взаимодействие между разными двухкомпонентными системами.

Участие фосфатаз в передаче сигнала.

Транскрипционные и пост-транскрипционные механизмы регуляции.

1.3 Регуляция ответа на некоторые абиотические стрессы.

Осмотический стресс.

Солевой стресс.

1.4 Восприятие абиотических стрессов у Synechocystis sp. РСС

Изученные двухкампонентные системы.

Регуляция ответа на солевой и гиперосмотический стрессы.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Штаммы цианобактерий.

2.2 Конструирование рекомбинантных штаммов.

2.3 Трансформация клеток цианобактерий.

2.4 Условия культивирования.

2.5 Экспериментальные условия.

2.6 Выделение РНК.

2.7 Слот-блот гибридизация.

2.8 Нозерн-блот гибридизация.

2.9 Анализ экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов (DNA microarray).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Конструирование библиотеки мутантов, дефектных по генам регуляторов ответа.

3.2 Анализ экспрессии генов мутантов по Rre при солевом стрессе с помощью слот-блот и нозерн-блот гибридизации.

Слот-блот анализ.

Поиск гистидин-киназы - партнера для Rre3.

Нозерн-блот анализ.

3.3 Анализ экспрессии генов мутантов по Rre при солевом стрессе с помощью ДНК-микрочипов.

3.4 Анализ экспрессии генов мутантов по Rre при гиперосмотическом стрессе с помощью слот-блот и нозернгибридизации.

Слот-блот анализ.

Нозерн-блот анализ.

3.5 Анализ экспрессии генов мутантов по Rre при гиперосмотическом стрессе с помощью ДНК-микрочипов.

3.6 Взаимодействие регуляторных систем, контролирующих экспрессию генов при солевом и гиперосмотическом стрессах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Двухкомпонентные системы регуляции ответа цианобактерии Synechocystis на гиперосмотический и солевой стрессы"

В ответ на стрессовые воздействия организмы регулируют экспрессию множества генов, что позволяет им адаптироваться к меняющимся условиям среды. Гены, экспрессия которых изменяется под воздействием стрессовых факторов, в основном хорошо известны, однако механизмы восприятия и передачи стрессового сигнала до сих пор мало изучены.

Известно, что у гетеротрофных бактерий большую роль в восприятии и передаче стрессовых сигналов играют двухкомпонентные системы, состоящие из гистидин-киназ и регуляторов ответа (Egger et al., 1997; Wood, 1999).

Участие двухкомпонентных систем у фотоавтотрофных цианобактерий в регуляции ответа на абиотические стрессы до сих пор остается малоизученным. У Synechocystis sp. РСС 6803 исследованы три двухкомпонентных системы - система PhoR-PhoB (она же SphS-SphR), отвечающая за индукцию щелочной фосфатазы в результате фосфатного голодания (Hirani et al., 2001, Suzuki et al., 2004), система ManS-ManR, регулирующая систему поглощения марганца (Yamaguchi et al., 2002; Ogawa et al., 2002), и система NrsS-NrsR регулирующая систему детоксикации никеля (Lopez-Maury et al., 2002). Показано, что гистидин-киназа 33 (Hik33) является сенсором холодового (Suzuki et al., 2000), гиперосмотического (Mikami et al., 2002) и солевого (Marin et al., 2003) стрессов. Кроме того, обнаружены еще три гистидин-киназы (Hik34, Hikl6 и Hik41), отвечающие за восприятие сигнала солевого стресса (Marin et al., 2003).

Вместе с тем, регуляторы ответа, принимающие сигнал от этих гистидин-киназ, все еще остаются неизвестными. Поэтому задача идентификации регуляторов ответа и целых систем восприятия и передачи сигналов представляется очень актуальной.

В настоящей работе мы изучали роль двухкомпонентных систем регуляции в восприятии и передаче сигналов солевого и гиперосмотического стрессов и идентифицировали пять двухкомпонентных систем, воспринимающих и передающих сигналы этих двух стрессов. Для решения данной проблемы были сформулированы следующие цель и задачи исследования:

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью работы являлась идентификация двухкомпонентных систем регуляции, участвующих в восприятии и передаче сигналов при гиперосмотическом и солевом стрессах в клетках Synechocystis.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Получение библиотеки мутантов, дефектных по генам, кодирующим регуляторы ответа.

2. Исследование экспрессии генов у мутантов под действием гиперосмотического и солевого стрессов.

3. Идентификация сенсорных гистидин-киназ и принимающих от них сигналы регуляторов ответа, отвечающих за экспрессию генов под воздействием гиперосмотического и солевого стрессов.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Шумская, Мария Анатольевна

выводы

1. Создана библиотека делеционных мутантов по генам, кодирующим регуляторы ответа (Rre).

2. Идентифицированы регуляторы ответа, контролирующие экспрессию генов, индуцируемых при солевом и гиперосмотическом стрессе.

3. Идентифицированы 5 двухкомпонентных систем восприятия и передачи сигналов при солевом и гиперосмотическом стрессах: Hik33/Rre31, Hikl6/Hik41/Rrel7, Hik34/Rrel, Hik2/Rrel и Hikl0/Rre3.

4. Эти двухкомпонентные системы воспринимают сигналы солевого и гиперосмотического стрессов, но распознают их как различные сигналы.

5. Возможная связь Rrel с двумя различными гистидин-киназами, Hik34 и Hik2, позволяет предположить, что гистидин-киназы и регуляторы ответа не являются жёсткими парами. Один регулятор ответа может взаимодействовать с несколькими гистидин-киназами и наоборот.

6. Предложена схема восприятия и передачи сигналов при солевом и гиперосмотическом стрессах с участием пяти двухкомпонентных систем регуляции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате скрининга библиотеки мутантов, дефектных по регуляторам ответа, под действием солевого и гиперосмотического стресса нам удалось найти недостающие звенья цепи двухкомпонентной системы, контролирующей ответ на эти стрессы — Rrel, Rre3, Rre 17, Rre31.

С помощью ДНК-микрочипов мы исследовали генную экспрессию при солевом стрессе у мутантов по регуляторам ответа и гистидин-киназам, являющихся сенсорами солевого стресса (Marin et al., 2003). С помощью сравнения данных мы установили, что регуляторы ответа составляют с гистидин-киназами следующие двухкомпонентные системы: Hik33/Rre31, Hik34/Rrel, Hikl6/Hik41/Rrel7, Hik2/Rrel и Hikl0/Rre3.

Возможная связь Rrel с двумя различными гистидин-киназами, Hik34 и Hik2, позволяет предположить, что гистидин-киназы и регуляторы ответа не являются жёсткими парами. Один регулятор ответа может взаимодействовать с несколькими гистидин-киназами и наоборот.

Совокупность полученных данных позволяет утверждать, что гиперосмотический и солевой стрессы воспринимаются одними и теми же двухкомпонентными системами. Однако различия в группах генов, регулируемых этими системами, означают, что эти сенсорные системы дифференцируют сигналы солевого и гиперосмотического стресса. Тем не менее, регуляция двухкомпонентными системами при разных стрессовых воздействиях сходных групп генов предполагает наличие универсальной общей компоненты в восприятии солевого и гиперосмотического стрессов. Возможно - это изменение физических свойств. мембраны, связанное с уменьшением объема клеток на начальных стадиях солевого и гиперосмотического стрессов, что может являться сигналом активации мембранных гистидин-киназ Hik33, Hikl6 и HiklO. Цитоплазматическая гибридная гистидин-киназа Hik41, по-видимому, принимает сигнал от Hikl6 и передает его на Rre 17, а сигналом активации внутриклеточной Hik34, вероятно, могут служить цитоплазматические факторы.

Двухкомпонентные системы, исследованные в нашей работе, контролируют только часть генов, индуцируемых солевым и гиперосмотическим стрессами. Это говорит о том, что на данном этапе мы обнаружили не все двухкомпонентные системы регуляции и, кроме того, множество генов может регулироваться без участия двухкомпонентных систем. Механизмы регуляции экспрессии этих генов требуют дальнейшего изучения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шумская, Мария Анатольевна, Москва

1. Allakhverdiev, S.I., Sakamoto, A., Nishiyama, Y., Inaba, M. and Murata, N. (2000) Ionic and osmotic effects of NaCl-induced inactivation of photosystems I and II in Synechococcus sp. Plant Physiol. 123, 1047— 1056.

2. Bartsevich, V.V. and Pakrasi, H.B. (1995) Molecular identification of an ABC transporter complex for manganese: Analysis of a cyanobacterial mutant strain impaired in the photosynthetic oxygen evolution process. EMBOJ. 14, 1845-1853.

3. Bartsevich, V.V. and Pakrasi, H.B. (1996) Manganese transport in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. J. Biol. Chem. 271, 26057-26061.

4. Bartsevich, V.V. and Pakrasi, H.B. (1999) Membrane topology of MntB, the transmembrane protein component of an ABC transporter system for manganese in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. J. Bacteriol. 181,3591-3593.

5. Barynin, V.V., Whittaker, M.M., Antonyuk, S.V., Lamzin, V.S., Harrison, P.M., Artymiuk, P.J. and Whittaker, J.W. (2001) Crystal structure of manganese catalase from Lactobacillus plantarum. Structure 9, 725—738.

6. Bassler, B.L. (2002) Small talk. Cell-to-cell communication in bacteria. Cell 109, 421-424

7. Bijlsma, J.J. and Groisman, Е.А. (2003) Making informed decisions: regulatory interactions between two-component systems. Trends Microbiol 11,359-366.

8. Borgstahl, G.E.O., Pokross, M., Chehab, R., Sekher, A. and Snell, E.H. (2000) Cryo-trapping the six-coordinate, distortedoctahedral active site of manganese superoxide dismutase. J. Mol. Biol. 296,951—959.

9. Bourret, R.B. and Stock, A.M. (2002) Molecular information processing: lessons from bacterial chemotaxis. J. Biol. Chem. 277,9625-9628.

10. Bremer, E. (2002) Adaptation to changing osmolarity.In: Bacillus subtilis and its closest relatives. From genes to cells, (ed. Sonenshein, A. L.,. Hoch, J. A., and Losick, R.), p. 385-391, ASM Press, Washington, D.C.

11. Burg, M.B., Kwon, E.D. and Kultz, D. (1996) Osmotic regulation of gene expression. FASEB J. 10, 1598-1606.

12. Chang, С. and Stewart, R.C. (1998) The two-component system. Regulation of diverse signaling pathways in prokaryotes and eukaryotes. Plant Physiol 117, 723-731.

13. Csonka, L.N. and Epstein, W. (1995) Osmoregulation. In: Escherichia coli and Salmonella (ed. Neidhardt, F.C.), p. 1210-1223. Washington, DC: ASM Press.

14. Dartois, V., Debarbouille, M., Kunst, F. and Rapoport, G. (1998) Characterization of a novel member of the DesS-DesU regulon affected by salt stress in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 180, 1855-1861.

15. Dolganov, N.A.M., Bhaya, D. and Grossman, A.R. (1995) Cyanobacterial protein with similarity to the chlorophyll a/b binding proteins of higher plants: evolution and regulation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 92, 636-640.

16. Egger, L.A., Park, H. and Inouye, M. (1997) Signal transduction via the histidyl-aspartyl phosphorelay. Genes Cells 2, 167-184

17. Elanskaya, I.V., Karandashova, I.V., Bogachev, A.V. and Hagemann, M. (2002) Functional analysis of the Na+/H+ antiporter encoding genes of the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. Biochemistry (Moscow) 67, 432-440.

18. Fabret, C., Feher, V.A. and Hoch, J.A. (1999) Two-component signal transduction in Bacillus subtilis: how one organism sees its world. J. Bacteriol 181, 1975-1983.

19. Falke, J.J. and Hazelbauer, G.L. (2001) Transmembrane signaling in bacterial chemoreceptors. Trends Biochem. Sci. 26, 257-265.

20. Frausto da Silva, J.J.R. and Williams, RJ.P. (1991) The Biological Chemistry of the Elements: The Inorganic Chemistry of Life. New York: Oxford University Press.

21. Hagemann, M., Richter, S. and Mikkat, S. (1997) The ggtA gene encodes a subunit of the transport system for the osmoprotective compound glucosylglycerol in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J. Bacteriol. 179, 714-720.

22. He, Q., Dolganov, N., Bjorkman, O. and Grossman, A.R. (2001) The high light-inducible polypeptides in Synechocystis PCC6803. Expression and function in high light. J. Biol. Chem. 276,306-314.

23. Hecker, M., Schumann, W. and Volker, U. (1996) Heat-shock and general stress response in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 19,417—428.

24. Heller, R.A., Schena, M., Shalon, D., Bedilion, Т., Gilmore, J., Wooley, D.E. and Davis, R.W. (1997) Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays. Proc. Natl. Acad Sci. USA 94,2150-2155.

25. Higgins, C.F., Cairney, J., Stirling, D.A., Sutherland, L. and Booth, I.R. (1987) Osmotic regulation of gene expression: ionic strength as an intracellular signal? Trends Biochem. Sci. 12, 339-344.

26. Hirokawa, Т., Boon-Chieng, S. and Mitaku, S. (1998) SOSUI: classification and secondary structure prediction system for membrane proteins. Bioinformatics 14,378-379.

27. Hoch, J.A. and Varughese, K.I. (2001) Keeping signals straight in phosphorelay signal transduction. J. Bacteriol. 183,4941-4949.

28. Hohmann, S. (2002) Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 300-372.

29. Jiang, M., Shao, W., Perego, M. and Hoch, J.A. (2000) Multiple histidine kinases regulate entry into stationary phase and sporulation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 38,535-542.

30. Kaneko, Т., Sato, S., Kotani, H., Tanaka, A., Asamizu, E., Nakamura, Y.,

31. Kanesaki, Y., Suzuki, I., Allakhverdiev, S. I., Mikami, K. and Murata, N. (2002) Salt stress and hyperosmotic stress regulate the expression of different sets of genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290,339-348.

32. Kang, С. M., Brody, M. S., Akbar, S., Yang, X. and Price, C.W. (1996). Homologous pairs of regulatory proteins control activity of Bacillus subtilis transcription factor aB in response to environmental stress. J. Bacteriol. 178,3846-3853.

33. Kim, S.H., Wang, W. and Kim, K.K. (2002) Dynamic and clustering model of bacterial chemotaxis receptors: structural basis for signaling and high sensitivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,11611-11615.

34. Koretke, K.K., Lupas, A.N., Warren, P.V., Rosenberg, M. and Brown, J.R. (2000) Evolution of two-component signal transduction. Mol. Biol. Evol. 17, 1956-1970.

35. Kriiger, E., Volker, U. and Нескег, M. (1994) Stress induction of clpC in Bacillus subtilis and involvement in stress tolerance. J. Bacteriol. 176, 3360-3367.1.rson, E.J. and Pecoraro, V.L. (1992) Manganese Redox Enzymes. New York: VCH Publishers.

36. Maeda, Т., Wurglar-Murphy, S.M. and Saito, H. (1994) A two-component system that regulates an osmosensing MAP kinase cascade in > yeast. Nature 369, 242-245.

37. Matsushita, M. and Janda, K.D. (2002) Histidine kinases as targets for new antimicrobial agents. Bioorg. Med. Chem. 10, 855-867.

38. McCleary, W.R. and Stock, J.B. (1994) Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J. Biol Chem. 269, 31567-31572.

39. Mikami, K., Kanesaki, Y., Suzuki, I. and Murata, N. (2002) The histidine kinase Hik33 perceives osmotic stress and cold stress in Synechocystis sp. PCC 6803. Mol Microbiol. 46, 905-915.

40. Miller, К J. and Wood, J.M. (1996) Osmoadaptation by rhizosphere bacteria. Annu. Rev. Microbiol 50,101-136.

41. Mizuno, Т. (1997) Compilation of all genes encoding two-component phosphotransfer signal transducers in the genome of Escherichia coli. DNA Res. 4, 161-168.

42. Mizuno, T. (1998) His-Asp phosphotransfer signal transduction. J. Biochem. 123, 555-563

43. Мок, K.C., Wingreen, N.S. and Bassler, B.L. (2003) Vibrio harveyi quorum sensing: a coincidence detector for two autoinducers controls gene expression. EMBO J. 22, 870-881.

44. Mouslim, C. and Groisman, E.A. (2003) Control of the Salmonella ugd gene by three two-component regulatory systems. Mol. Microbiol. 47, 335344.

45. Nikaido, H. and Vaara, M. (1987) Outer membrane. In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and molecular biology (ed. F.C. Neidhardt), p. 7-22. Washington, DC: ASM Press.

46. Perego, M. (1998) Kinase-phosphatase competition regulates Bacillus subtilis development. Trends Microbiol. 6,366-370.

47. Perego, M. (2001) A new family of aspartyl phosphate phosphatases targeting the sporulation transcription factor SpoOA of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 42, 133-143.

48. Perego, M. and Brannigan, J.A. (2001) Pentapeptide regulation of aspartyl-phosphate phosphatases. Peptides 22, 1541-1547.

49. Perraud, A.-L., Weiss, V. and Gross, R. (1999) Signalling pathways in two-component phosphorelay systems. Trends Microbiol. 7,115-120.

50. Piggot, P. J., C. P. Moran, Jr., and P. Youngman (ed.) (1993) Regulation of bacterial differentiation. Washington, D.C.: ASM Press.

51. Posas, F., Wurgler-Murphy, S.M., Maeda, Т., Witten, E.A., Thai, T.C. and Saito, H. (1996) Yeast HOG 1 MAP kinase cascade is regulated by a multistep phosphorelay mechanism in the SLN1-YPD1-SSK1 "two-component" osmosensor. Cell 86, 865-875.

52. Prentki, P. and Krisch, H.M. (1984). In vitro insertional mutagenesis with a selectable DNA fragment. Gene 29, 303-313

53. Ray, J.M, Bhaya, D., Block, MA. and Grossman, A.R (1991) Isolation, transcription, and inactivation of the gene for an atypical alkaline phosphatase of Synechococcus sp. strain PCC 7942. J. Bacteriol. 173, 4297-4309.

54. Robinson, V.L., Buckler, D.R. and Stock, A.M. (2000) A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Str. Biol. 7, 626-633.

55. Shimizu, T.S., Le Novere, N., Levin, M.D., Beavil, A.J., Sutton, В .J. and Bray, D. (2000) Molecular model of a lattice of signalling proteins involved in bacterial chemotaxis. Nat. Cell. Biol. 2, 792-796.

56. Stall, L., Hoffmann, Т., Budde, I., Volker, U. and Bremer, E. (2003) Genome-wide transcriptional profiling analysis of adaptation of Bacillis subtilis to high salinity. J. Bacteriol. 185, 6358-6370.

57. Stanier, R.Y., Kunisawa, R., Mandel, M. and Cohen-Bazire, G (1971). Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriol. Rev. 35,171-205 .

58. Stock, A., Koshland, D.E., Jr. and Stock, J. (1985) Homologies between the Salmonella typhimurium CheY protein and proteins involved in the regulation of chemotaxis, membrane protein synthesis, and sporulation. Proc. Natl. Acad. ScL USA 82,7989-7993.

59. Stock, A.M., Robinson, V.L. and Goudreau, P.N. (2000) Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183—215.

60. Stock, J.B., Surette, M.G., Levit, M. and Park, P. (1995) In: Two-component signal transduction (ed. Hoch, J.A. and Silhavy, T.J.), p. 25—51. Washington, DC: ASM Press.

61. Stoker, N.G., Broome-Smith, J.K., Edelman, A. and Spratt, B.G. (1983) Organization and subcloning of the dacA-rodA-pbpA cluster of cell shape genes in Escherichia coli. J. Bacteriol. 155, 847-853.

62. Sutherland, L., Cairney, J., Elmore, MJ., Booth, I.R. and Higgins, C.F. (1986) Osmotic regulation of transcription: induction of the proU betaine transport gene is dependent on acclimation of intracellular potassium. J. Bacteriol. 168, 805-814.

63. Suzuki, I., Los, D.A., Kanesaki, Y., Mikami, K. and Murata, N. (2000) The pathway for perception and transduction of low-temperature signals in Synechocystis. EMBO J. 19, 1327-1334.

64. Suzuki, S., Feijani, A., Suzuki, I. and Murata, N. (2004) The SphS-SphR two component system is the exclusive sensor for the induction of gene expression in response to phosphate limitation in Synechocystis. J. Biol. Chem.219,13234-13240.

65. Tabata, S. (2003) Genome Analysis of Cyanobacteria. Oral presentation, 11th Int. Symp. Photosynthetic Procaiyotes, August 24-29, 2003. Tokyo, Japan.

66. Takase, I., Ishino, F., Wachi, M., Kamata, H., Doi, M., Asoh, S., Matsuzawa, H., Ohta, T. and Matsuhashi, M. (1987) Genes encoding two lipoproteins in the leuS-dacA region of the Escherichia coli chromosome. J. Bacteriol. 169, 5692-5699.

67. Thomason, P.A., Traynor, D., Cavet, G., Chang, W.T., Harwood, A.J. and Kay, R.R. (1998) An intersection of the cAMP/PKA and two-componentsignal transduction systems in Dictyostelium. EMBO J. 17, 2838—2845.87

68. Walderhaug, M.O., Dosch, D.C. and Epstein, W. (1987) Potassum transport in bacteria, In: Ion transport in prokaryotes (ed. B.Rosen and S.Silver), p. 85-130. New York: Academic Press.

69. Wanner, B.L. (1992) Is cross regulation by phosphorylation of two-component response regulator proteins important in bacteria? J. Bacteriol. 174,2053-2058.

70. Wanner, B.L. (1993) Gene regulation by phosphate in enteric bacteria. J, Cell. Biochem. 51; 47-54.

71. Ward, J.B. and Williamson, R. (1984) Bacterial autolysins: specificity and function. In: Microbial wall synthesis and autolysis, (ed. C. Nombela), p. 159-166, Amsterdam: Elsevier Biomedical Press.

72. Wilkinson, M.J. and Northcote, D.H. (1980) Plasma membrane ultrastructure during plasmolysis, isolation and wall regeneration: A freeze-fracture study. J. Cell Sci. 42,401-415.

73. Williams, J.GK. (1988) Construction of specific mutations in photosystem П photosynthetic reaction center by genetic engineering methods in Synechocystis PCC6803. Methods Enzymol. 167, 766-778.

74. Wood, J.M. (1999) Osmosensing by bacteria: signals and membrane-based sensors. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63,230-262.

75. Xu, Q., Porter, S.W. and West, A.H. (2003) The yeast YPD1/SLN1 complex: insights into molecular recognition in two-component signaling systems. Structure 11, 1569-1581.

76. Ye, R.W., Tao, W., Bedzyk, L., Young, Т., Chen, M. and Li, L. (2000) Global gene expression profiles of Bacillus subtilis grown under anaerobic conditions. J. Bacteriol. 182,4458-4465.

77. Zouni, A., Witt, H.T., Kern, J., Fromme, P., Krauss, N., Saenger, W. and Orth, P. (2001). Crystal structure of photosystem II from Synechococcus elongatus at 3.8 A resolution. Nature 409,739—743.