Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль лидерной последовательности гена алкогольдегидрогеназы кукурузы в регуляции трансляции мРНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль лидерной последовательности гена алкогольдегидрогеназы кукурузы в регуляции трансляции мРНК"

На правах рукописи

МАРДАНОВА ЕВГЕНИЯ СЕРГЕЕВНА

Роль лидерной последовательности гена алкогольдегидрогеназы кукурузы в регуляции трансляции мРНК

(03 00 03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2008

003446998

Работа выполнена в лаборатории систем молекулярного клонирования Центра «Биоинженерия» Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Равин Николай Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Карпова Ольга Вячеславовна

доктор биологических наук Голденкова-Павлова Ирина Васильевна

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии имени В.А Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится «JОКУПЛОрЯ 2008 г в // часов на заседании Совета Д 501 001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени M В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А H Белозерского, ауд 536

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М В. Ломоносова

Автореферат разослан « {I »МИМЛ^Я 2008г.

Ученый секретарь р.

диссертационного совета

кандидат биологических наук Г\ ""*"" И. А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Успехи в области генетической инженерии растений, исследования фундаментальных механизмов экспрессии растительных генов, открыли новые возможности в использовании растений в качестве биофабрик для получения рекомбинантных белков, в том числе белков медицинского назначения, таких как антитела, вакцины и тп Производство целевых белков в растениях имеет существенные преимущества по сравнению с использующимися в настоящее время для этих целей системами экспрессии на основе клеток животных, дрожжей или бактерий Культивирование растений не требует больших затрат, за счет чего стоимость целевых белков, выделяемых из растений, оказывается существенно ниже стоимости аналогичных продуктов, полученных в других экспрессионных системах Кроме того, использование растений вместо микроорганизмов или клеток животных исключает риск передачи человеку патогенов или токсинов Использование трансгенных растений в качестве «биофабрик» является одним из приоритетов все большего числа международных биотехнологических компаний Однако широкое использование этого подхода сдерживается в настоящее время низкой эффективностью систем экспрессии Наряду с эффективностью транскрипции, уровень экспрессии генов растений может регулироваться на стадии трансляции мРНК Эффективные трансляционные энхансеры могут, во-первых, повысить уровень экспрессии целевого гена, а во-вторых, обеспечить его специфическую трансляцию в определенных тканях или в определенных условиях внешней среды

Существенной проблемой при создании растений - «биофабрик» является достижение высокого уровня экспрессии целевых генов в условиях роста растений, отличающихся от нормальных (например, гипоксия, обусловленная затоплением, повышенная или пониженная температура, засуха и другие стрессы) Проблема экспрессии в стрессовых

условиях связана со снижением эффективности трансляции большинства растительных (а также чужеродных) мРНК, что, соответственно, приводит и к снижению выхода целевого продукта Разработка технологий эффективной экспрессии генов в стрессовых условиях необходима также для конструирования трансгенных растений, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам, поскольку «анти-стрессовый» продукт должен эффективно синтезироваться именно в этих условиях

Целью настоящей работы является создание системы, обеспечивающей эффективную трансляцию мРНК и экспрессию целевого гена в растениях в стрессовых условиях Для создания этой системы мы использовали в качестве трансляционного энхансера лидерную последовательность мРНК гена алкогольдегидрогеназы кукурузы, adhl, эффективно транслирующегося в условиях гипоксии

Кроме обычного механизма кэп-зависимой трансляции, у эукариот в некоторых случаях реализуется и механизм внутренней инициации трансляции, направляемой сайтом внутренней посадки рибосом (IRES -internal ribosome entry site) Впервые IRES был обнаружен у вируса полиомиелита Позднее IRES-сайты были обнаружены в РНК других вирусов, а также в ряде клеточных мРНК В основном белки, транслируемые с таких клеточных мРНК, являются регуляторными (некоторые ростовые факторы, транскрипционные и трансляционные факторы и др.) В настоящее время активно обсуждается гипотеза, согласно которой кэп-независимая внутренняя инициация трансляции у эукариот может являться одним из способов экспрессии генов, который функционирует в случаях, когда эффективность нормальной кэп-зависимой трансляции снижается, например, при вирусной инфекции, в стрессовых условиях, канцерогенезе и апоптозе

Мы предположили, что adh обеспечивает эффективную трансляцию мРНК в стрессовых условиях вследствие наличия в ней IRES-сайта Гипотеза о том, что adh обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции

мРНК, была проверена экспериментально в настоящей работе и подтверждена, вклад IRES по сравнению с обычной кэп-зависимой инциацией трансляции был определен количественно Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является характеристика лидерной последовательности гена adhl алкогольдегидрогеназы кукурузы (adh) в качестве трансляционного энхансера, активного в стрессовых условиях, и сайта внутренней инициации трансляции Практической целью работы является создание системы, обеспечивающей эффективную трансляцию мРНК и экспрессию целевого гена в растениях в стрессовых условиях Задачи работы

1 Анализ влияния adh в 5' НТО мРНК на уровень экспрессии целевого гена в стрессовых условиях в клетках растений Nicotiana benthamiana

2 Изучение эффективности функционирования adh в качестве сайта внутренней инициации трансляции в системах трансляции in vitro

3 Оценка эффективности функционирования adh в качестве сайта внутренней инициации -фансляции in vivo в клетках растений Nicotiana benthamiana

4 Оценка вклада внутренней инициации трансляции в общую эффективность трансляции мРНК, содержащей adh, в клетках растений Nicotiana benthamiana в нормальных и в стрессовых условиях

Научная новизна и практическая значимость работы

Установлено, что лидерная последовательность мРНК гена adhl является трансляционным энхансером, эффективным в стрессовых условиях Ее присутствие в 5' НТО мРНК обеспечивает уровень экспрессии целевого гена в условиях гипоксии и теплового шока, сопоставимый с уровнем экспрессии в аэробных условиях, в то время как эффективность трансляции большинства мРНК значительно снижается

Показано, что adh является IRES-сайтом и обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции мРНК in vivo и in vitro, что позволяет использовать

adh в качестве межцистронной области при экспрессии бицистронных конструкций в растениях Однако в результате выполнения работы установлено, что эффективность внутренней инициации трансляции, обеспечиваемой adh, составляет менее 1% от общего уровня трансляции мРНК как при нормальных условиях, так и при условиях теплового шока Таким образом, эффективная трансляция содержащей adh мРНК в стрессовых условиях происходит не за счет внутренней инициации трансляции

Практическая значимость работы состоит в разработке метода, обеспечивающего эффективную трансляцию мРНК и экспрессию целевого гена в растениях в стрессовых условиях за счет включения трансляционного энхансера adh в кассету экспрессии между промотором и целевым геном Апробация работы

Полученные в диссертации результаты были представлены автором на следующих международных и российских конференциях "Системная биология и биоинженерия" (Москва, 2005), "Генетика в России и мире", (Москва, 2006), "Биология - наука XXI века " (Пущино, 2006), "Translation Control and Non-Coding RNA Meeting" (Новые Грады, Чехия, 2006), "Ломоносов-2007" (Москва, 2007), "Gene expression and analysis" (Манчестер, Великобритания, 2008) Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 91 странице машинописного текста и включают 26 рисунков и 10 таблиц Диссертация состоит из разделов "Введение", "Цели и задачи работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список публикаций по теме диссертации", "Список цитируемой литературы", который содержит 4 отечественных и 132 иностранных источника

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Лидерная последовательность мРНК гена айМ кукурузы обеспечивает эффективную трансляцию мРНК в клетках растений Нкойапа ЪеШкапйапа в стрессовых условиях

Для определения влияния лидерной последовательности мРНК гена ас0г1 кукурузы (далее - ас1И) на эффективность трансляции были сконструированы рекомбинантные бинарные векторы, содержащие репортерные кассеты экспрессии Первая из них содержала асНя между промотором 358 РНК вируса мозаики цветной капусты (промотор 35Б) и репортерным геном ^р, за которым следует терминатор транскрипции повТ Синтезируемая с 358 промотора мРНК в этом случае содержит айН в составе 5' НТО Вторая репортерная конструкция имела аналогичную структуру, но не содержала айк Схемы рекомбинантных векторов рМШРР и рКИасШСЬТ, а также последовательности, находящиеся между 35Б промотором и геном показаны на Рис 1

Зависимость уровня экспрессии репортерного гена от наличия асНг в лидерной последовательности мРНК определяли, вводя экспрессионные репортерные конструкции в клетки N ЬеМИатшпа с помощью агроинфильтрации Следует подчеркнуть, что весь белок СБР синтезируется именно в растительной клетке, а не в агробактериях, поскольку ген ^р содержал интрон в своей кодирующей области

Листья N ЬепЛатшпа инфильтрировали равными количествами агробактерий, содержащих рекомбинантные бинарные векторы р1ЧКасШСРР и рМКСРР Через сутки после инфильтрации (на этот момент синтез СРР не наблюдался ни для одной из конструкций) часть листьев отрезали и переносили в сосуды с водой, воспроизводя условия гипоксии, часть - на 42°С (тепловой стресс), часть - на 12°С (холодовой стресс), остальные листья инкубировали при комнатной температуре Использованная нами модель гипоксии (погружение в воду) широко

используется в работах по изучению механизмов регуляции экспрессии генов в растениях в условиях пониженного содержания кислорода (Subbaiah et al., 1994; Nakazono et al., 2000; Der Straeten et al, 2001; Subbaiah et al., 2001) и отражает реальную ситуацию затопления, в которой растения могут испытывать гипоксию в естественных условиях. Пробы растительной ткани из зон агроинфильтрации отбирали спустя 3 суток после агроинокуляции. Предварительную оценку уровня синтеза GFP проводили, визуально оценивая интенсивность флуоресценции при освещении поверхности листа ультрафиолетом.

pNRGFP

pNRadhGFP

Iw adh,_m а

--*T-ŒZ}|-1

pNRadhGFP(-35S)

Iadh,_|B ,

--сю|-h

Ri nosT LB

Рисунок 1.

Схемы репортерных конструкций, использованных для характеристики adh в качестве трансляционного энхансера. Показаны области Т-ДНК рекомбинантных бинарных векторов pNRGFP, pNRadhGFP и pNRadhGFP (-35S), а также последовательности мРНК, синтезируемых с 35S промотора, начиная с 5'-концов. Первые два кодона гена gfp выделены курсивом, нуклеотидная последовательность adh выделена серым, GATT мотивы подчеркнуты._

Количественное определение уровня экспрессии в

агроинокулированных листьях проводили с помощью Вестерн-блот анализа. Интенсивности полос, соответствующих ОБР, количественно определяли, анализируя цифровую фотографию с помощью программы ТЖА-РсВав. Результаты, представленные на Рис.2, в целом согласуются с данными визуального анализа флуоресценции вРР.

А В

Рисунок 2. Вестерн-блот анализ уровней экспрессии вРР.

(A) Вестерн-блот анализ белковых препаратов из растительной ткани с использованием антител к ОБР. Препараты были выделены из растений, инфильтрированных агробактериями, содержащими векторы рЫЯасШСРР или рК1ЮРР в следующих условиях:

1 - рИНасШОРР, 72 ч в аэробных условиях,

2 - рМ1ШРР, 72 ч в аэробных условиях,

3 - рЫНасШСРР, 24 ч в аэробных условиях + 48ч под водой,

4 - рМЛвРР, 24 ч в аэробных условиях + 48ч под водой,

5 - рЫЯасШСРР, 24 ч в аэробных условиях + 48ч при 42С,

6 - рЖОРР, 24 ч в аэробных условиях + 48ч при 42С,

7 - р№а<№ОРР, 24 ч в аэробных условиях + 48ч при 12С,

8 - рК1ЮРР, 24 ч в аэробных условиях + 48ч при 12С.

(B) Количественная оценка уровней синтеза ОРР, основанная на сравнении интенсивностей полос для нескольких экспериментов, с учетом различий в количестве суммарного белка. За единицу принят уровень синтеза йрр в растениях, инфильтрированных агробактериями, содержащими вектор рН1ЮРР в аэробных условиях. Приведены средние результаты 3-х независимых экспериментов.

Так, было установлено, что наличие аМ в 5' НТО мРНК практически не влияет на уровень экспрессии в аэробных условиях Однако в условиях гипоксии и при 42°С уровень экспрессии ОБР в случае рН1ЮРР снижался в 5-10 раз В то же время наличие а6Я\ обеспечивало уровень экспрессии вБР в условиях гипоксии и при 42°С, сопоставимый с уровнем экспрессии в аэробных условиях В случае же холодового стресса (12°С) синтез ОБР снижался примерно в 2 раза независимо от наличия ас!}1

Общее количество синтезируемого ОБР отражает как процессы трансляции мРНК, так и ее содержание в клетке, обусловленное уровнем транскрипции и/или стабильностью мРНК Поэтому для определения того, какой из этих факторов определяет обнаруженные нами различия в содержании вБР, был проведен эксперимент по сравнению концентраций мРНК %/р Уровни соответствующей РНК были определены с помощью полуколичественного ОТ-ПЦР, в результате чего было установлено, что наличие асНг не влияет содержание мРНК в растительной клетке

Мы провели дополнительный контрольный эксперимент, показавший, что последовательность асИг г:е является промотором Его необходимость обусловлена тем, что гипотетическая промоторная активность асНг, сохраняющаяся в стрессовых условиях, а не эффективная трансляция мРНК, могла бы объяснять сохраняющийся высокий уровень синтеза вБР в этих условиях С этой целью нами был сконструирован бинарный вектор р№1асШОРР (-358), отличающийся от рЫЯасШСРР отсутствием 35Б промотора (Рис 1) Количество ОБР в агроинфильтрированных листьях определяли с помощью Вестерн-блот анализа (Рис 3) В результате было установлено, что удаление 35Б промотора снижает продукцию вРР по меньшей мере в 100 раз (предел чувствительности при иммунодетекции вБР) Таким образом, гипотетическая промоторная активность если она вообще имеется, не может вносить заметный вклад в наблюдаемый нами уровень экспрессии СБР.

Вестерн-блот анализ белковых препаратов, выделенных из растений, инфильтрированных агробактериями, содержащими векторы рЫЯасШСРР (358) (дорожки 1-2) или рШаШЮРР (дорожки 3-7). Количества суммарного белка: 30 мкг (дор. 1), 15 мкг (дор. 2), 3 мкг (дор. 3), 1.5 мкг (дор. 4), 0.6 мкг (дор. 5), 0.3 мкг (дор. 6)._

Рисунок 3. Анализ возможной промоторной активности adh.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что 5' НТО adhl может обеспечивать эффективную трансляцию мРНК в условиях гипоксии не только в протопластах кукурузы, но в гетерологичной системе, т.е. клетках табака. Следовательно, клеточные факторы, связывающиеся со специфическими последовательностями, присутствующими в лидерной последовательности гена adhl, являются в значительной степени универсальными, а не видоспецифическими. Это позволяет, в свою очередь, предположить, что и эти специфические последовательности могут быть консервативными у представителей различных видов растений.

2. Эффективность функционирования adh в качестве IRES в системе трансляции in vitro

На данном этапе работы мы проанализировали способность adh обеспечивать внутреннюю инициацию трансляции в системе трансляции in vitro. Для этого мы провели эксперименты по получению и трансляции бицистронных мРНК, содержащих adh между двумя репортерными генами. Синтез продукта второго гена бицистронной конструкции указывает на внутреннюю инициацию трансляции, обеспечиваемую фрагментом, помещенным между первым и вторым генами.

Для получения больших количеств бицистронных РНК был использован метод транскрипции in vitro с помощью Т7 РНК-полимеразы.

Первым этапом работы является конструирование векторов, обеспечивающих продукцию бицистронной РНК - асИг - шс1А (и соответствующих контролей) с Т7 промотора Конструирование вектора, содержащего -аЗИ - игсМ, проводили на основе вектора

рТ7ЬСРР1срОи8 (ОогоЫюу е(а1, 2002) Этот вектор содержит Т7 промотор, ген ^¡р, последовательность П1Е8ср148 (П1Е8ср148 - сайт внутренней инициации трансляции из вируса мозаики крестоцветных), ген шсЫ, а также инвертированный повтор перед геном способный образовывать шпилечную структуру в мРНК, препятствующую движению рибосом по мРНК и трансляции расположенного за ней гена Допеку et а\, 1998) Такая шпилечная структура была введена для исключения возможности трансляции шсЫ в результате реинициации трансляции после достижения рибосомой терминирующего кодона гена Для

конструирования аналогичного вектора с айк в плазмиде рТ7ЬОРР1срСиБ 111Е8ср148 замещали на последовательность ас!И Схематическая карта полученной плазмиды рТ7ЬОРРас1ЬОи8 показана на Рис 4 Для получения отрицательного контроля использовали вектор рТ7ЬСРРОТХС118 (ОогокЬоу et а1, 2002), отличающийся от рТ7ЬСРР1срСи8 только межгенной областью, - вместо ЖЕ8ср148 расположен полилинкер, не обеспечивающий внутреннюю инициацию трансляции.

AlbVIA

На первом этапе с помощью транскрипции т vitro с Т7 РНК полимеразой были получены препараты РНК, содержащие изучаемые бицистронные конструкции В качестве матриц использовали ДНК линеарированных плазмид pT7hGFPIcpGUS, pT7hGFPadhGUS,

pT7hGFPadhGUS

adh

Ecl136ll

| Рисунок 4 Схема ; кассеты экспрессии в векторе

j pT7hGFPadhGUS

pT7hGFPGTXGUS После проведения транскрипции in vitro и получения препаратов бицистронных мРНК, их транслировали in vitro в трансляционной системе ретикулоцитов кролика с помощью набора фирмы Promega Продукт второго гена бицистронной РНК, глюкуронидазу (GUS) определяли флуориметрически

Как видно из полученных результатов (Табл 1), adh обеспечивает эффективную внутреннюю инициацию трансляции мРНК в системе ретикулоцитов кролика, причем уровень синтеза GUS составляет примерно 76% от величины, полученной в случае IREScpI48

Таблица 1 Определение активности GUS при трансляции бицистронных мРНК in vitro в трансляционной системе ретикулоцитов кролика

Активность GUS (RLU) Вектор, использованный для получения РНК

pT7hGFPadhGUS pT7hGFPIcpGUS pT7hGFPGTXGUS

эксперимент 1 246 318 22

эксперимент 2 212 289 21

эксперимент 3 248 320 26

среднее значение 235 ± 20 309 ± 17 23 ±3

3. Эффективность функционирования adh в качестве IRES in vivo в клетках Nicoíiana benthamiana

Для тестирования способности последовательности adh обеспечивать внутреннюю инициацию трансляции мРНК in vivo, в клетках растений Nicotiana benthamiana, нами были проведены эксперименты по экспрессии бицистронных конструкций, содержащих adh между двумя репортерными генами, gfp и uidA Синтез продукта второго гена бицистронной конструкции указывает на внутреннюю инициацию трансляции, обеспечиваемую фрагментом, помещенным между первым и вторым геном

Высокий уровень синтеза бицистронной РНК был достигнут за счет использования фитовирусной системы экспрессии Для этого бицистронная кассета экспрессии была клонирована в векторе рУХск-вРР (Кошагоуа е( а1, 2006) на основе генома Х-вируса картофеля (ХВК) таким образом, что фрагмент генома ХВК, содержащий тройной блок генов и ген белка оболочки, был замещен клонируемой последовательностью Рекомбинантная последовательность ХВК находилась между 35Б промотором и терминатором в пределах Т-ДНК области бинарного вектора рВШ19 Доставка рекомбинантного вирусного генома в растительные клетки осуществлялась с помощью агроинфильтрации При инфекции клеток растений бактериями А Ште/аыепз, содержащими рекомбинантный бинарный вектор, участок Т-ДНК вектора, содержащий вирусный геном, переносится в ядро клетки, вирусная РНК транскрибируется с 35Б промотора, а затем ее репликация и транскрипция происходит в цитоплазме Транскрипция, инициируемая с первого промотора субгеномной РНК ХВК, приводит к продукции бицистронной ^р-шйА РНК на высоком уровне

В качестве основы для создания рекомбинантного вектора была использована плазмида рА8151, в которой был клонирован геном ХВК под контролем 358 промотора В геноме ХВК участок, включающий тройной блок генов и ген белка оболочки, был заменен конструкцией -П1Е8ср148 - шс1А (ОогоИюу е/ а1, 2002) Для конструирования аналогичного вектора, содержащего ас1И, этой последовательностью заменяли ГОЕ8ср148, в результате чего был получен вектор рА7248асШ

Плазмиду рА&151, содержащую ЖЕ8ср148 между и икМ, использовали в качестве положительного контроля, в качестве отрицательного контроля - плазмиду рА8175, содержащую между генами д/р и шс1А участок полилинкера Плазмиды рА8151 и рА8175 были любезно предоставлены М В Скулачевым (Кафедра вирусологии Биологического факультета МГУ) Схемы векторов показаны на Рис 5

Sgp1

pA8151

AAGTAA GC™TCGATTTCGAACCCGGGGTAtXB«t1S®tCeSn

1................."....................

шшш; ATGGTA

AAGTAA gcttgamgaaagaaagamgaaagaaagaaagaaactgcagaaagaa

agaaagaaagaaagaaagaaagaaagaattc ATGGTA

Рисунок 5 Схема репортерных конструкций, использованных для определения эффективности функционирования adh в качестве сайта внутренней инициации трансляции т vivo в клетках растений Nicotiana benthamiana Показаны области Т-ДНК рекомбинантных бинарных векторов pA7248adh, рА8151, рА8175 5' - 5' нетранслирусмая область ХВК, 3' - 3' нетранслируемая область ХВК, RDRP - РНК зависимая РНК полимераза ХВК, Sgpl - первый субгеномный промотор ХВК 35S - промотор, 35S-T - терминатор РНК вируса мозаики цветной капусты LB и RB - левая и правая границы Т-ДНК Первые два кодона гена uidA и последние два кодона гена gfp выделены курсивом, нуклеотидные последовательности adh и IREScpl48 выделены серым_

Экспрессионные векторы рА7248асШ, рА8151, рА8175 вводили в клетки ШсоПапа ЪепЛатшпа с помощью агроинфильтрации На одном листе одновременно находились зоны агроинокуляции, соответствующие всем трем конструкциям Пробы растительных тканей отбирали через 3 суток после заражения Предварительно качественно оценивали

интенсивность флуоресценции GFP, которая во всех трех случаях была приблизительно одинаковой. Затем количественно определяли уровень синтеза GUS, анализируя белковые препараты, выделенные из зон агроинфильтрации. Результаты измерений представлены на Рис. 6. Отметим, что весь GUS синтезировался именно в растительных клетках, а не в агробактериях, поскольку использованный ген uidA содержал интрон в пределах кодирующей последовательности.

Рисунок б. Результаты определения GUS в листьях растений, инфильтрированных агробактериями, содержащими репортерные вектор л pA7248adh (1), рА8151 (2) и рА8175 (3). Активность GUS определяли флуориметричсски за единицу принимали значение, полученное для рА8151.

Полученные результаты показывают, что в случае экспрессионных конструкций gfp-adh- uidA и gfp - IRESepl48 - uidA белок GUS синтезируется практически на одном уровне, в то время как в отрицательном контроле GUS практически не синтезируется. Таким образом, полученные данные свидетельствую в пользу того, что adh обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции мРНК, причем ее эффективность сравнима с таковой для IREScpl48.

Альтернативными объяснениями наблюдаемой продукции GUS, не предполагающими внутреннюю инициацию трансляции, могли бы быть повышенное накопление бицистронной мРНК, содержащей adh, и/или обусловленное наличием adh образование моноцистронной мРНК uidA. Мы провели ряд контрольных экспериментов для проверки этих альтернативных объяснений.

В первом контрольном эксперименте мы сравнивали уровни накопления бицистронных мРНК в агроинфильтрированных листьях Результаты полуколичественного ОТ-ПЦР анализа свидетельствуют о том, что количество мРНК GUS для всех трех конструкций приблизительно одинаковое Таким образом, синтез GUS, наблюдаемый в случае конструкций gfp-adh- uidA и g$b-IREScpl48- uidA не может быть объяснен более высоким содержанием их мРНК в клетке по сравнению с отрицательным контролем

Также был проведен контрольный эксперимент, подтверждающий, что порледовательность adh не является специфическим сайтом расщепления мРНК, чувствительным к действию каких-то клеточных нуклеаз В противном случае могла бы образовываться моноцистронная мРНК, содержащая только ген uidA, которая могла бы транслироваться по стандартному механизму сканирования С этой целью была сконструирована плазмида pA7248adh_del (из pA7248adh удалили гены uidA и gfp), обеспечивающая синтез более короткой и удобной для анализа мРНК, содержащей adh Соответствующий вирусный экспрессионный вектор вводили в клетки Nicotiana benthamiana с помощью агроинфильтрации Препарат РНК выделяли из растительной ткани и анализировали методом Нозерн-блот, зонд синтезировали на 3' нетранслируемый участок мРНК В случае расщепления РНК в пределах adh можно было ожидать появления, наряду с полноразмерной мРНК, дополнительных РНК меньшей длины Однако в результате Нозерн-блот анализа (Рис 7) была обнаружена единственная полоса, соответствующая полноразмерной мРНК, что свидетельствует об отсутствии специфической деградации РНК в пределах последовательности adh Эти данные также подтверждают отсутствие криптического промотора в adh, который приводил бы к образованию моноцистронной мРНК uidA

Третий возможный механизм, который может приводить к образованию моноцистронной мРНК, содержащей ген uidA, - это

сплайсинг мРНК. Если донорный сайт расположен в гене gfp, а рецепторный сайт - в adh, вырезание такого "интрона" приведет к удалению стоп кодона gfp. В результате может образоваться объединенная открытая рамка считывания, кодирующая гибридный белок, содержащий часть GFP, объединенную с GUS. Структуру мРНК анализировали с помощью ОТ-ПЦР с использованием пары нраймеров, один из которых расположен в начале гена gfp, а второй - на расстоянии 0.8 т.п.н., в начале гена uidA. Сплайсированная мРНК продуцировала бы более короткие ПЦР фрагменты, которые амплифицировались бы легче. Однако мы наблюдаем только единственную полосу ожидаемого размера, что свидетельствует об отсутствии сплайсированных вариантов мРНК (Рис. 7).

Таким образом, исключив все альтернативные объяснения продукции GUS в бицистронном тесте, мы можем сделать вывод о том, что последовательность adh обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции in vivo в клетках Nicotiana benthamiana.

ЗООЬр

55bp

Рисунок 7.

(A) Кезерн-блот анализ РНК, выделенной из N. ЬепЛатгапа, инфильтрированных агробактериями с вектором рА7248ас!11_(1е1.

(B) ОТ-ПЦР детекция РНК, выделенной из N. ЬепЛат1апа, инфильтрированных агробактериями с вектором рА7248асН1. ПЦР - продукты были получены с помощью праймеров СРР-РСЯ-1 и §^-1, в качестве матрицы использовали к-ДНК (дорожка 2). ПЦР - продукты не были детектированы в реакции без обратной транскрипции (дорожка 3).__________

4. Количественная оценка вклада внутренней инициации в трансляцию моноцистронной мРНК, содержащей adh в 5' НТО

Представленные выше данные показывают, что adh может обеспечивать внутреннюю инициацию трансляции как in vivo, в клетках

растений, так и в бесклеточной системе трансляции in vitro Однако остается открытым вопрос о том, какой реально вклад, по сравнению с «обычной» кэп-зависимой инициацией трансляции, в общую эффективность трансляции вносит внутренняя инициация в случае нормальной моноцистронной РНК, содержащей adh в 5' НТО

4.1 Оценка эффективности внутренней инициации трансляции, обеспечиваемой adh, т vivo в клетках растений Nicotiana benthamiana при нормальных условиях.

Для сравнения эффективности внутренней инициации трансляции, обеспечиваемой adh, с кэп-зависимой инициацией трансляции, нами были проведены эксперименты по экспрессии ряда моноцистронных конструкций в клетках Nicotiana benthamiana Набор конструкций включал четыре рекомбинантных вирусных вектора на основе ХВК, аналогичные pA7248adh (Рис 8) Первый вектор, pAGUS, содержит ген uidA после субгеномного промотора Sgpl ХВК, уровень синтеза GUS отражает кэп-зависимую инициацию трансляции Вектор pAadhGUS содержит последовательность adh между субгеномным промотором и геном uidA, активность GUS в данном случае представляет сумму кэп-зависимой и внутренней инициации трансляции, обеспечиваемой adh Для блокирования кэп-зависимой, но не внутренней инициации трансляции, в кассеты экспрессии непосредственно после промотора вводили инвертированный повтор длиной 60 пн В мРНК этот повтор образует шпилечную структуру, блокирующую движение рибосомы по мРНК и, таким образом, кэп-зависимую трансляцию Третий вектор, phAadhGUS, аналогичен pAadhGUS, но содержит инвертированный повтор перед последовательностью adh, в этом случае синтез GUS отражает только IRES - зависимую инициацию трансляции Четвертый вектор pAhGUS содержал инвертированный повтор между субгеномным промотором и геном gus и использовался в качестве отрицательного контроля

pAGUS

RB 35S

uidA

I

35S-T LB

TCTAGAACTAGTGGATCC ATOBTA

pAadhGUS

pAhadbGUS

pAhGUS

RB 35S

-fc^D-MI—I

~JI—----35S-7 LB

ssoscccc Атеатл

Рисунок 8

Схемы репортерных

конструкций,

использованных для

определения

эффективности

внутренней инициации

трансляции

Показаны области Т-ДНК рекомбинантных бинарных векторов рАОШ, рАасШСШ, рАЬаёЬСиЗ, рАЬОДО 5' и 3' - нетранслируемые области генома ХВК Первые два кодона гена ш<М выделены курсивом, последовательность ас!Ь выделена серым,

последовательность инвертированного повтора, образующего шпильку в мРНК, подчеркнута

Репортерные векторы вводили в клетки Nicotiana benthamiana с помощью агроинфильтрации На одном листе одновременно находились зоны агроинокуляции, соответствующие всем четырем конструкциям Пробы растительных тканей отбирали через 4 суток после заражения и количественно определяли уровень синтеза GUS, отражающий эффективность трансляции мРНК в каждом случае Полученные результаты показали, что эффективность ай№-зависимой внутренней инициации составляет около 0 3% от обычной кэп-зависимой инициации трансляции в клетках N benthamiana в нормальных условиях (Табл 2)

Таблица 2 Сравнение эффективности внутренней инициации и кэп-зависимой инициации по механизму сканирования при трансляции моноцистронных мРНК in vivo

вектор Кэп-зависимая инициация трансляции Внутренняя инициация трансляции, обеспечиваемая adh Эффективность трансляции мРНК (%)

pAGUS + - (100)

pAadhGUS + + 99±12

pAhadhGUS - + 0 31±0 03

pAhGUS - - 0 045±0 005

Эффективность трансляции мРНК определяли по уровню синтеза GUS в листьях, инфильтрированных агробактериями с репортерными вирусными векторами Активность GUS определяли флуориметрически, за единицу (100%) принимали значение, полученное для pAGUS Концентрации мРНК для всех конструкций по данным полуколичественного ОТ-ПЦР были приблизительно одинаковыми_

4.2 Оценка эффективности внутренней инициации трансляции, обеспечиваемой adh, in vivo в клетках растений Nicotiana benthamiana в условиях теплового шока.

Полученные нами результаты показывают, что в нормальных условиях вклад внутренней инициации в трансляцию обычной моноцистронной мРНК, содержащей adh в 5' НТО, крайне незначителен Однако, поскольку adh обеспечивает эффективную трансляцию мРНК ш vivo при стрессовых условиях, таких как гипоксия и тепловой шок, в то время как эффективность кэп-зависимой инициации трансляции значительно снижается, можно предположить, что вклад внутренней трансляции, обеспечиваемой adh, в общую трансляцию будет более существенным в этом случае

Для проверки этого предположения в дополнение к pNRadhGFP и pNRGFP были созданы две репортерные конструкции Первая плазмида, pNRhadhGFP, содержит инвертированный повтор перед последовательностью adh, образующий шпильку в мРНК, блокирующую

кэп-зависимую инициацию трансляции Вторая, pNRhGFP, отличается от рИШтсШСРР отсутствием последовательности ас/Л (Рис. 9)

В отличие от вирусных векторов, описанных выше, данные плазмиды не содержат элементов генома Х-вируса картофеля и не реплицируются в агробактериальной клетке При транскрипции с 35Б промотора образуются мРНК с различными 5' НТО, содержащие ген Соответствующие экспрессионные векторы вводили в клетки ~Nicotia.no. ЬепЛаппапа с помощью агроинфильтрации На одном листе одновременно находились зоны агроинокуляции, соответствующие всем четырем конструкциям Через сутки после инфильтрации (на этот момент синтез вРР не наблюдался ни для одной из конструкций) часть листьев отрезали и переносили на 42°С (тепловой стресс), остальные листья инкубировали при комнатной температуре Пробы растительных тканей отбирали через 3 суток после заражения Количественное определение уровня экспрессии вРР в агроинокулированных листьях проводили с помощью Бестерн-блот анализа (Рис 10)

рЫКааЬбРР

ЯВ ЗбБ р^СРР

~~д*Г~Н1—Ь

Моэ-Т 1.В

жпЧМ-

ЯВ 35Э N03-1 1-В

Инвертированный

рЫ^аствРР

повтор

КВ 35Э

Ыоэ-Т 1.В

рЫР!НОРР

ГР О

Иов-Т Ш

Рисунок 9

Схема репортерных

конструкций, использованных для оценки эффективности внутренней инициации

трансляции, обеспечиваемой ас!к, в клетках растений ШсоШпа ЬепЛатшпа в стрессовых условиях (42°С) Показаны области Т-ДНК рекомбинантных бинарных векторов р^а<М]РР,

рМ1ШЕР, рЫЮшсШОРР,

рИШ^Р

1 2 ~ 3 ~ 4 " ] Рисунок 10.

0 ! Вестерн-блот анализ уровней! 20 С | экспрессии вИР.

| Препараты белков выделены из { ! листьев, инкубированных при\ 42°С ^ ноРмальных условиях (20°С) или при ! | 42°С. Листья были инфильтрированы I 10цд 10,ид Юцд Юцд | агробактериями, содержащими ;

| рекомбинантные векторы: 1 -! ! р\Кас!11(11;Р: 2 - рХКСН Р; 3 -! | р\К'аа«!1(Н:Р; 4 - рХЯЬШФ. | I Количества суммарного белка | ■ показаны на рисунке. I

Зцд Зцд Юцд Юцд

Полученные результаты показывают, что в нормальных условиях уровень синтеза GFP не зависит от наличия adh в 5' НТО в случае векторов pNRGFP и pNRadhGFP. Введение в мРНК шпильки, блокирующей кэп-зависимую трансляцию, резко снижает синтез GFP (ниже предела иммунодетекции). Эти результаты полностью согласуются с данными, полученными с использованием вирусных векторов - продуцентов GUS.

В условиях теплового шока синтез GFP снижается в отсутствии adh в 5' НТО (pNRGFP) и сохраняется практически неизменным, если лидерная последовательность мРНК содержит adh. Однако при блокировании кэп-зависимой трансляции синтез GFP не детектировался ни в присутствии, ни в отсутствии adh. Таким образом, эффективная работа adh в качестве трансляционного энхансера в условиях теплового шока не обусловлена высокоэффективной внутренней инициацией трансляции.

выводы

1 5' нетранслируемая область мРНК гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (adh) обеспечивает эффективную трансляцию мРНК при гипоксии и тепловом шоке в клетках растений Nicotiana benthamiana

2 Adh обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции мРНК in vitro в бесклеточной системе трансляции ретикулоцитов кролика

3 Adh обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции мРНК in vivo в клетках растений Nicotiana benthamiana

4 Эффективность внутренней инициации трансляции мРНК, содержащей adh в 5'-нетранслируемой области, более чем в 100 раз ниже эффективности кэп-зависимой инициации трансляции этой мРНК в растениях Nicotiana benthamiana как в нормальных условиях, так и при тепловом шоке

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Марданова Е С, Замчук J1А, Равин Н В (2007) Лидерная последовательность гена алкогольдегидрогеназы кукурузы обеспечивает эффективную трансляцию мРНК в растениях в стрессовых условиях Молекулярная биология, 41, 1002 - 1008

2 Равин Н В , Марданова Е С , Котляров Р Ю , Новиков В К, Атабеков И Г, Скрябин К Г (2008) Определение полной нуклеотидной последовательности генома нового штамма X вируса картофеля и создание на его основе вирусного вектора для продукции целевых белков в растениях Биохимия 73, 56 - 63

3 Mardanova Е S , Zamchuk L А, Skulachev М V, Ravin N V (2008) "The 5' untranslated region of the maize alcohol dehydrogenase gene contains an internal nbosome entry site" Gene 420, 11-16

4 Mardanova E S , Zamchuk L A , Ravin N V (2008) "Contribution of internal initiation to translation of cellular mRNAs containing IRESs" Biochemical Society Transactions 36, 694 - 697

5 Мищенко (Марданова) E С (2005) Лидерная последовательность гена алкогольдегидрогеназы кукурузы является сайтом внутренней инициации трансляции и обеспечивает эффективную трансляцию мРНК в условиях гипоксии Тезисы Международной школы-конференции молодых ученых "Системная биология и биоинженерия ", стр 110, г Москва

6 Мищенко (Марданова) Е С, Замчук Л А, Равин H В (2006) Лидерная последовательность гена алкогольдегидрогеназы кукурузы обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции мРНК в стрессовых условиях Международная конференция "Генетика в России и мире", стр. 128, г Москва

7 Мищенко (Марданова) Е С (2006) Внутренняя инициация трансляции, обеспечиваемая лидерной последовательностью гена алкогольдегидрогеназы кукурузы Тезисы X Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наукаXXI века", стр 31, г Пущино

8 Mishchenko (Mardanova) E S , Zamchuk L A, Ravin N V (2006) Adh, the leader sequence of maize alcohol dehydrogenase gene, provides efficient translation of mRNA under stress conditions and acts as internal nbosome entry site Abstracts of the "Translation Control and Non-Coding RNA Meeting", p 38, Novi Grady, Chech Republic

9 Котляров P Ю, Марданова E С (2007) Расшифровка генома нового высокопатогенного штамма Х-вируса картофеля "Ока-2" и клонирование кДНК копии его генома Материалы XIV Международной Конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2007", стр 14, Москва

10 Mardanova ES, Zamchuk LA, Ravin NV (2008) Contribution of internal initiation to translation of mRNA containing the leader sequence of maize ahcohol dehydrogenase gene Abstracts of "Gene expression and analysis ", p 8, Manchester, Great Britain

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г Москва, Ленинский пр-т, д 37А Тираж 100 экз 2008 год

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марданова, Евгения Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Лидерная последовательность мРНК гена adhl кукурузы обеспечивает эффективную трансляцию мРНК в клетках растений Nicotiana benthamiana в стрессовых условиях.

2. Изучение эффективности функционирования 5' НТО adhl в качестве IRES в системах трансляции in vitro.

3. 5' НТО adhl обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции мРНК in vivo в клетках Nicotiana benthamiana.

4. Количественная оценка вклада внутренней инициации в трансляцию моноцистронной мРНК, содержащей adh в 5' НТО.

5. Оценка эффективности внутренней инициации трансляции, обеспечиваемой adh, in vivo в клетках растений Nicotiana benthamiana в условиях теплового шока.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль лидерной последовательности гена алкогольдегидрогеназы кукурузы в регуляции трансляции мРНК"

Успехи в области генетической инженерии растений, исследования фундаментальных механизмов экспрессии растительных генов, открыли новые возможности в использовании растений в качестве биофабрик для получения рекомбииангных белков, в том числе белков медицинского назначения, таких как антитела, вакцины и т.п. Производство целевых белков в растениях имеет существенные преимущества по сравнению с использующимися в настоящее время для этих целей системами экспрессии на основе клеток животных, дрожжей или бактерий. Культивирование растений не требует больших затрат за счет чего стоимость целевых белков, выделяемых из растений, оказывается существенно ниже стоимости аналогичных продуктов, полученных в других экспрессионных системах. Можно создать условия, при которых целевые белки будут накапливаться в определенных компартментах растения (эндоплазматический ретикулум, хлоропласты или клеточные стенки) и/или хранится долгое время в семенах, клубнях или корнеплодах. Кроме того, использование растений вместо микроорганизмов или клеток животных исключает риск передачи человеку патогенов или токсинов. Использование трансгенных растений в качестве «биофабрик» является одним из приоритетов все большего числа международных биотехнологических компаний. Однако широкое использование этого подхода сдерживается в настоящее время низкой эффективностью систем экспрессии. Причинами этого могут являться, в числе прочих факторов, низкая эффективность трансляции мРНК чужеродных генов и проявление явления посттранскрипционного умолчания генов (posttranscriptional gene silencing, PTGS).

Наряду с эффективностью транскрипции, уровень экспрессии генов растений и эукариот вообще может регулироваться на стадии трансляции мРНК. Эффективные трансляционные энхансеры могут, во-первых, повысить уровень экспрессии целевого гена, а во-вторых, обеспечить его специфическую трансляцию в определенных тканях или в определенных условиях внешней среды.

Существенной проблемой при создании растений - «биофабрик» является достижение высокого уровня экспрессии целевых генов в условиях роста растений, отличающихся от нормальных (например, гипоксия, обусловленная затоплением, повышенная или пониженная температура, засуха и другие стрессы). Проблема экспрессии в стрессовых условиях связана со снижением эффективности трансляции большинства растительных (а также чужеродных) мРНК, что, соответственно, приводит и к снижению выхода целевого продукта. Разработка технологий эффективной экспрессии генов в стрессовых условиях необходима также для конструирования трансгенных растений, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам, поскольку «анти-стрессовый» продукт должен эффективно синтезироваться именно в этих условиях.

Целью настоящей работы является создание системы, обеспечивающей эффективную трансляцию мРНК и экспрессию целевого гена в растениях в стрессовых условиях. Для создания этой системы мы использовали в качестве трансляционного энхансера лидерную последовательность гена алкогольдегидрогеназы кукурузы, adhl, эффективно транслирующегося в стрессовых условиях.

Кроме обычного механизма кэп-зависимой трансляции, у эукариот в некоторых случаях реализуется и механизм внутренней инициации трансляции, направляемой сайтом внутренней посадки рибосом (IRES -internal ribosome entry site). Впервые IRES был обнаружен у вируса полиомиелита. Позднее IRES-сайты были обнаружены в РНК других вирусов. Кроме вирусных, известен ряд клеточных мРНК, для которых характерна внутренняя инициация трансляции. В основном белки, транслируемые с этих мРНК, являются регуляторными (некоторые ростовые - факторы, транскрипционные и трансляционные факторы и др.). В настоящее время активно обсуждается гипотеза, согласно которой кэп-независимая внутренняя инициация трансляции у эукариот может являться является одним из способов экспрессии генов, который функционирует в случаях, когда эффективность нормальной кэп-зависимой трансляции снижается, например, при вирусной инфекции, в стрессовых условиях, канцерогенезе и апоптозе.

Мы предположили, что adh обеспечивает эффективную трансляцию мРНК в стрессовых условиях вследствие наличия в ней IRES-сайта. Гипотеза о том, что adh обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции мРНК, была проверена экспериментально в настоящей работе и подтверждена, вклад IRES по сравнению с обычной кэп-зависимой инициацией трансляции был определен количественно.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью настоящей работы является характеристика лидерной последовательности гена алкогольдегидрогеназы кукурузы, adhl, в качестве трансляционного энхансера, активного в стрессовых условиях, и сайта внутренней инициации трансляции. Практической целью работы является создание системы, обеспечивающей эффективную трансляцию мРНК и экспрессию целевого гена в растениях в стрессовых условиях.

При этом были поставлены следующие задачи:

1. Анализ влияния 5' НТО гена adhl кукурузы на уровень экспрессии целевого гена в стрессовых условиях в клетках растений Nicotiana benthamiana.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Марданова, Евгения Сергеевна

выводы

5' нетраслируемая область мРНК гена алкогольдегидрогеназы кукурузы adhl обеспечивает эффективную трансляцию мРНК при гипоксии и тепловом шоке в клетках растений Nicotiana benthamiana.

Adh обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции мРНК in vivo в клетках растения Nicotiana benthamiana.

Adh обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции in vitro в бесклеточной системе трансляции ретикулоцитов кролика RRL.

Эффективность внутренней инициации трансляции мРНК, содержащей adh в 5' нетранслируемой области, более чем в 100 раз ниже эффективности кэп-зависимой инициации трансляции этой мРНК в растениях Nicotiana benthamiana как в нормальных условиях, так и при тепловом шоке.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Марданова Е.С., Замчук JI.A., Равин Н.В. (2007). Лидерная последовательность гена алкогольдегидрогеназы кукурузы обеспечивает эффективную трансляцию мРНК в растениях в стрессовых условиях. Молекулярная биология, 41, 1002 -1008.

2. Равин Н.В., Марданова Е.С., Котляров Р.Ю., Новиков В.К., Атабеков И.Г., Скрябин К.Г. (2008). Определение полной нуклеотидной последовательности генома нового штамма X вируса картофеля и создание на его основе вирусного вектора для продукции целевых белков в растениях. Биохимия 73, 56-63.

3. Mardanova E.S., Zamchuk L.A., Skulachev M.V., Ravin N.V. (2008). "The 5' untranslated region of the maize alcohol dehydrogenase gene contains an internal ribosome entry site". Gene 420, 11 - 16.

4. Mardanova E.S., Zamchuk L.A., Ravin N.V. (2008). "Contribution of internal initiation to translation of cellular mRNAs containing IRESs". Biochemical Society Transactions 36, 694 - 697.

5. Мищенко (Марданова) E.C. (2005). Лидерная последовательное^ гена алкогольдегидрогеназы кукурузы является сайтом внутренней инициации трансляции и обеспечивает эффективную трансляцию мРНК в условиях гипоксии. Тезисы Международной школы-конференции молодых ученых "Системная биология и биоинэ/сенерия", стр. 110, г. Москва.

6. Мищенко (Марданова) Е.С., Замчук Л.А., Равин Н.В. (2006). Лидерная последовательность гена алкогольдегидрогеназы кукурузы обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции мРНК в стрессовых условиях. Международная конференция "Генетика 6 России и мире ", стр. 128, г. Москва.

7. Мищенко (Марданова) Е.С. (2006). Внутренняя инициация трансляции, обеспечиваемая лидерной последовательностью гена алкогольдегидрогеназы кукурузы. Тезисы X Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наукаXXIвека", стр. 31, г. Пущино.

8. Mishchenko (Mardanova) E.S., Zamchuk L.A., Ravin N.V. (2006). Adh, the leader sequence of maize alcohol dehydrogenase gene, provides efficient translation of mRNA under stress conditions and acts as internal ribosome entry site. Abstracts of the "Translation Control and Non-Coding RNA Meeting", p. 38, Novi Grady, Chech Republic.

9. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. (2007). Расшифровка генома нового высокопатогенного штамма Х-вируса картофеля "Ока-2" и клонирование кДНК копии его генома. Материалы XIV Международной Конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2007", стр. 14, Москва.

10. Mardanova E.S., Zamchuk L.A., Ravin N.V. (2008). Contribution of internal initiation to translation of mRNA containing the leader sequence of maize ahcohol dehydrogenase gene. Abstracts of the "Gene expression and analysis", p. 8, Manchester.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марданова, Евгения Сергеевна, Москва

1. Агол В.И. 2001. Трансляционный контроль фенотипа пикорнавирусов. Мол биол. 35, 691 -701.

2. Комарова Т.В., Скулачев М.В., Зверева А.С., Шварц A.M., Дорохов Ю.Л., Атабеков И.Г. 2006. Новый вирус-век гор для эффективной продукции целевых белков в растениях. Биохимия, 71, 1043-1049.

3. Спирин А.С. 1996. Регуляция трансляции мРНК-связывающими факторами у высших эукариот. Успехи биол. химии 36, 3 48.

4. Шварц A.M., Комарова Т.В., Скулачев М.В., Зверева А.С., Дорохов Ю.Л., Атабеков И.Г. 2006. Стабильность мРНК в растениях зависит от длины З'-нетранслируемой области. Биохимия 71, 1377 1384.

5. Andino R., Boddeker N., Silvera D., Gamarnik A.V. 1999. Intracellular determinants of picornavirus replication. Trends Microbiol. 7, 76 82.

6. Apuya N.R., Zimmerman J.L. 1992. Heat shock gene expression is controlled primarily al the translational level in carrot cells and somatic embryos. Plant Cell. 4, 657 665.

7. Bailey-Serres J. 1999. Selective translation of cytoplasmic mRNAs in plants. Trends Plant Sci 4, 142- 148.

8. Bailey-Serres J., Dawe R.K. 1996. Both 5' and 3' sequences of maize ADH1 mRNA are required for enhanced translation under low-oxygen conditions. Plant Physiol. 112, 685695. с

9. Bailey-Serres J., Freeling M.1990. Hypoxic stress-induced changes in ribosomes of maize seedling roots. Plant Physiol 94, 1237 1243.

10. Belsham G.J., Sonenberg N. 1996. RNA-protein interactions in regulation of picornavirus RNA translation. Microbiol Rev. 60, 499 511.

11. Bernstein J., Sella O., Le S., Elroy-Stein O. 1997. PDGF2/c-j/j mRNA Leader Contains a Differentiation-linked Internal Ribosomal Entry Site (D-IRES). J Biol Chem. 272, 9356 -9362.

12. Bert A.G., Grepin R., Vadas M.A., Goodall G.J. 2006. Assessing IRES activity in the HIF-lo and other cellular 5' UTRs. RNA 12, 1074 1083.

13. Bonnal S., Boutonnet C., Prado-Lourenco L., and Vagner S. 2003. IRESdb: the Internal Ribosome Entry Site database. Nucleic Acids Res. 31, 427 428.

14. Branco-Price С., Kawaguchi R., Ferreira R.B., Bailey-Serres J. 2005. Genome-wide Analysis of Transcript Abundance and Translation in Arabidopsis Seedlings Subjected to Oxygen Deprivation. Ann. Bot. 96, 647 660.

15. Browing, K.S. 1996. The plant translation apparatus, Plant Mol. Biol. 32, 107 143.

16. Browning K.S., Humphreys J., Hobbs W., Smith G.B., Ravel J.M. 1990. Determination of the amounts of the protein synthesis initiation and elongation factors in wheat germ. J. Biol Chem 265,17967- 17973.

17. Butler W., Cook L., Vayda M.E. 1990. Hypoxic stress inhibits multiple aspects of the potato tuber wound response. Plant Physiol. 93, 265 270.

18. Cevallos R.C., Sarnow P. 2005. Factor-independent assembly of elongation-competent ribosomes by an internal ribosome entry site located in an RNA vims that infects penaeid shrimp. J Virol. 79, 677 683.

19. Clemens M.J. 2001. Initiation factor eIF2 alpha phosphorylation in stress responses and apoptosis. Prog. Mol. Subcell. Biol. 27, 57 89.

20. Clemens M.J., Bushell M., Jeffrey I.W., Pain V.M., Morley S.J. 2000. Translation initiation factor modifications and the regulation of protein synthesis in apoptotic cells. Cell Death Differ. 7, 603 615.

21. Coldwell M.J., Mitchell S.A., Stoneley M., MacFarlane M., Willis A.E. 2000. Initiation of Apaf-1 translation by internal ribosome entry. Oncogene 19, 899 905.

22. Cuesta R., Xi Q., Schneider RJ. 2000. Adenovirus-specific translation by displacement of kinase Mnkl from cap-initiation complex eIF4F. EMBO J. 19, 3465 3474.

23. Curtis D., Lehmann R., Zamore P.D. 1995. Translational regulation in development. Cell 81, 171 178.

24. De Gregorio E., Preiss T. Hentze M. 1999. Translation driven by an eIF4G core domain in vivo. EMBO J. 18, 4865 4874.

25. Der Straeten D., Zhou Z., Prinsen E., van Onckelen H.A., van Montagu M.C. 2001. A comparative molecular-physiological study of submergence response in lowland and deepwater rice. Plant Physiol. 125, 955 968.

26. Dordas С., Hasinoff В.В., Igamberdiev A.U., Manac'h N., Rivoal J., Hill R.D. 2003. Expression of a stress-induced hemoglobin affects NO levels produced by alfalfa root cultures under hypoxic stress. Plant J. 35, 763 770.

27. Dordas C., Rivoal J., Hill R.D. 2003. Plant haemoglobins, nitric oxide and hypoxic stress. Ann. Bot. 91, 173- 178.

28. Drew M.C. 1997. Oxygen deficiency and root metabolism: injury and acclimation under hypoxia and anoxia. Annu Rev Plant Physiol. Plant Mol Biol. 48, 223 250.

29. Fennoy S.L., Bailey-Seires J. 1995. Post-transcriptional regulation of gene expression in oxygen deprived roots of maize. Plant J. 7, 287 295.

30. Fennoy S.L., Nong Т., Bailcy-Serres J. 1998. Transcriptional and post-transcriptional processes regulate gene expression in oxygen deprived roots of maize. Plant J. IS, 727 -735.

31. Fernandez J., Yaman I., Sarnow P., Snider M.D., Hatzoglou M. 2002. Regulation of Internal Ribosomal Entry Site-mediated Translation by Phosphorylation of the Translation Initiation Factor eIF2ct. J Biol Chem. 277, 19198 19205.

32. Fukao Т., Bailey-Serres J. 2004. Plant responses to hypoxia is survival a balancing act? Trends Plant Sci 9, 449 - 456.

33. Gallie D.R. 1993. Posttranscriptional regulation of gene expression in plants. Annu. Rev. Plant Physiol Plant. Mol Biol 44, 77- 105.

34. Gallie D.R. 2001. Cap-Independent Translation Conferred by the 5' Leader of Tobacco Etch Virus Is Eukaryotic Initiation Factor 4G Dependent. J. Virol 75, 12141 12152.

35. Gallie D.R., Caldwell С., Pitto L. 1995. Heat shock disrupts cap and poly(A) tail function during translation and increases mRNA stability of introduced reporter mRNA. Plant Physiol. 108, 1703- 1713.

36. Gallie, D.R. 1998. A tale of two termini: a functional interaction between the termini of an mRNA is a prerequisite for efficient translation initiation, Gene 216, 1 — 11.

37. Geigenberger, P. 2003. Response of plant metabolism to too little oxygen. Curr Opin. Plant Biol. 6, 247 256.

38. Gerlitz G., Jagus R., Elroy-Stein O. 2002. Phosphorylation of initiation factor-2 alpha is required for activation of internal translation initiation during cell differentiation. Eur. J. Biochem. 269, 2810-2819.

39. Gingras A.C., Raught В., Sonenberg N. 1999. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu. Rev. Biochem. 68, 913 963.

40. Gingras A.C., Svitkin Y., Belsham G.J., Pause A., Sonenberg N. 1996. Activation of the translational suppressor 4E-BP1 following infection with encephalomyocarditis virus and poliovirus. Proc. Natl. Acad. Sci U. S A. 93, 5578 5583.

41. Goessling L.S., Mascotti D.P., Thach R.E. 1998. Involvement of Heme in the Degradation of Iron-regulatory Protein 2. J. Biol. Chem. 273, 12555 12557.

42. Gradi A., Imataka II., Svitkin Y.V., Rom E., Raught В., Morino S., Sonenberg N. 1998. A Novel Functional Human Eukaryotic Translation Initiation Factor 4G. Mol. Cell Biol. 18, 334-342.

43. Han В., Dong Z., Zhang J. 2003. Tight Control of Platelet-derived Growth Factor B/c-sis Expression by Interplay between the 5'-Untranslated Region Sequence and the Major Upstream Promoter. J. Biol. Chem 278, 46983 46993.

44. Hellen C.U., Sarnow P. 2001. Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules. Genes Dev. 15, 1593-1612.

45. Henis-Korenblit S„ Shani G., Sines Т., Marash L., Shohat G., Kimchi A. 2002. The caspase-cleaved DAP5 protein supports internal ribosome entry site-mediated translation of death proteins. PNAS 99, 5400 5405.

46. Henis-Korenblit S., StrumpfN.L., Goldstaub D., Kimchi A. 2000. A Novel Form of DAP5 Protein Accumulates in Apoptotic Cells as a Result of Caspase Cleavage and Internal Ribosome Entry Site-Mediated Translation. Mol. Cell Biol 20, 496 506.

47. Hennecke M., Kwissa M., Metzger K., Oumard A., Kroger A., Schirmbeck R., Reimann J., Hauser H. 2001. Composition and arrangement of genes define the strength of IRES-driven translation in bicistronic mRNAs. Nucleic Acids Res. 29, 3327 3334.

48. Hernandez G., Vazquez-Pianzola P., Sierra J.M., Rivera-Pomar R. 2004. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA 10, 1783 1797.

49. Hershey, J. W. В., and Merrick, W. C. (2000) in Translational Control of Gene Expression (Sonenberg, N., Hershey, J. W. В., and Mathews, M. В., eds) pp. 33 38, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY

50. Holcik M., Gordon B.W., Korneluk R.G. 2003. The Internal Ribosome Entry Site-Mediated Translation of Antiapoptotic Protein XIAP Is Modulated by the Heterogeneous Nuclear Ribonucleoproteins CI and C2. Mol Cell. Biol. 23, 280 288.

51. Holcik M., Korneluk R.G. 2000. Functional Characterization of the X-Linked Inhibitor of Apoptosis (XIAP) Internal Ribosome Entry Site Element: Role of La Autoantigen in XIAP Translation. Mol. Cell. Biol. 20, 4648 4657.

52. Holcik M., Sonenberg N. 2005. Translational control in stress and apoptosis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6,318-327.

53. Holcik M„ Yeh C., Korneluk R.G., Chow T. 2000. Translational upregulation of X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) increases resistance to radiation induced cell death. Oncogene 19, 4174-4177

54. Hunt P.W., Klok E.J., Trevaskis В., Watts R.A., Ellis M.H., Peacock W.J., and Dennis E.S. 2002. Increased level of hemoglobin 1 enhances survival of hypoxic stress and promotes early growth in Arabidopsis thaliana. PNAS 99, 17196 17202.

55. Jang S.K., Krausslich H.G., Nicklin M.J., Duke G.M., Palmenberg A.C., Wimmer E. 1988. A segment of the 5' nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA directs internal entry of ribosomes during in vitro translation. J. Virol. 62, 2636 — 2643.

56. Jefferson R.A. 1987. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol Rep. 5, 387 405.

57. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. 1987. GUS fusions: p-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901 3907.

58. Johannes G., Carter M.S., Eisen M.B., Brown P.O., Sarnow P. 1999. Identification of eukaryotic mRNAs that are translated at reduced cap binding complex eIF4F concentrations using a cDNA microarray. PNAS 96, 13118 13123.

59. Joshi C.P., Nguyen H.T. 1995. 5' untranslated leader sequences of eukaryotic mRNAs encoding heat shock induced proteins. Nucleic Acids Res. 23, 541 549.

60. Kertesz S., Kerenyi Z., Merai Z., Bartos I., Palfy Т., Barta E. and Silhavy D. 2006. Both introns and long З'-UTRs operate as c/s-acting elements to trigger nonsense-mediated decay in plants. Nucleic Acids Res 34, 6147 6157.

61. Klolc E.J., Wilson I.W., Wilson D., Chapman S.C., Ewing R.M., Somerville S.C., Peacock W.J., Dolferus R., Dennis E.S. 2002. Expression profile analysis of the low-oxygen response in Arabidopsis root culture. Plant Cell 14, 2481 2494.

62. Kohler U., Donath M., Mendel R.R., Cerff R., Hehl R. 1996. Intron-specific stimulation of anaerobic gene expression and splicing efficiency in maize cells. Mol Gen Genet. 251, 252-8.

63. Komar A. A., Hatzoglou M. 2005. Internal Ribosome Entry Sites in Cellular mRNAs: Mystery of Their Existence. J Biol. Chem. 280, 23425 23428.

64. Koncz C., Schell J. 1986. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet 204, 383 396.

65. Kozak M. 1999. Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene 234, 187208.

66. Kozak M. 2001. New ways of initiating translation in eukaryotes? Mol Cell Biol 21,1899 1907.

67. Kozak M. 2003. Alternative ways to think about mRNA sequences and proteins that appear to promote internal initiation of translation. Gene 318, 1-23.

68. Kozak M. 2005. Second look at cellular mRNA sequences said to function as internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res 33, 6593 — 6602.

69. Kozak M. 2006. Rethinking some mechanisms invoked to explain translational regulation in eukaryotes.Gene 382, 1 11.

70. Kozak M. 2007. Lessons (not) learned fiom mistakes about translation. Gene 403,194 -203.

71. Kuyumcu-Martinez N.M., Van Eden M.E., Younan P., Lloyd R.E. 2004. Cleavage of Poly(A)-Binding Protein by Poliovirus 3C Protease Inhibits Host Cell Translation: a Novel Mechanism for Host Translation Shutoff. Mol. Cell. Biol. 24, 1779 1790

72. Lin J.J., Daniels-McQueen S„ Patino M.M., Gaffield L., Walden W.E., Thach R.E. 1990. Derepression of ferritin messenger RNA translation by hemin in vitro. Science 247, 74 -77.

73. Lin J.J., Patino M.M., Gaffield L., Walden W.E., Smith A., Thach R.E. 1991. Crosslinking of Hemin to a Specific Site on the 90-kDa Ferritin Repressor Protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 88, 6068-6071.

74. Liu Z., Dong Z., Han В., Yang Y., Liu Y., Zhang J. 2005. Regulation of expression by promoters versus internal ribosome entry site in the 5'-untranslated sequence of the human cyclin-dependent kinase inhibitor p27kipl. Nucleic Acids Res. 33, 3763 3771.

75. Macejak D.G., Sarnow P. 1991. Internal initiation of translation mediated by the 5' leader of a cellular mRNA. Nature 353, 90 94.

76. Merrick W.C., Ilershey J.W.B. 1996. The pathway and mechanism of eukaryotic protein synthesis. In Translational Control, eds. Hershey J.W.B., Mathews M.B. and Sonenberg N., (Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. New York), pp. 31-69.

77. Miskimins W.K., Wang G., Flawkinson M., Miskimins R. 2001. Control of Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p27 Expression by Cap-Independent Translation. Mol. Cell. Biol. 21,4960-4967.

78. Mitchell S.A., Brown E.C., Coldwell M.J., Jackson R.J., Willis A.E. 2001. Protein Factor Requirements of the Apaf-1 Internal Ribosome Entry Segment: Roles of Polypyrimidine Tract Binding Protein and upstream of N-ras. Mol. Cell. Biol. 21, 3364 3374.

79. Mitchell S.A., Spriggs K.A., Coldwell M.J., Jackson R.J., Willis A.E. 2003. The Apaf-l internal ribosome entry segment attains the correct structural conformation for function via interactions with PTB and unr. Mol. Cell 11, 757 771.

80. Mittler R., Feng X., Cohen M. 1998. Post-transcriptional suppression of cytosolic ascorbate peroxidase expression during pathogen-induced programmed cell death in tobacco. Plant Cell 10, 461 473.

81. Morrish B.C., Rumsby M.G. 2002. The 5' Untranslated Region of Protein Kinase О Directs Translation by an Internal Ribosome Entry Segment That Is Most Active in Densely Growing Cells and during Apoptosis. Mol. Cell. Biol. 22, 6089 6099.

82. Nakazono M., Tsuji H., Li Y., Saisho D., Arimura S., Tsutsumi N., Hirai A. 2000. Expression of a gene encoding mitochondrial aldehyde dehydrogenase in rice increases under submerged conditions. Plant Physiol. 124, 587 598.

83. Nevins T.A., Harder Z.M., Korneluk R.G., Holcik M. 2003. Distinct regulation of IRES-mediated translation following cellular stress is mediated by apoptotic fragments of eIF4G family members eIF4GI and p97/DAP5/NATl. J. Biol Chem. 278, 3572 3579.

84. Odell J.T., Nagy F., Chua N.-H. 1985. Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313, 810-812.

85. Oh S.K., Scott M.P., Sarnow P. 1992. Homeotic gene Antennapedia mRNA contains 5'-noncoding sequences that confer translational initiation by internal ribosome binding. Genes Dev 6, 1643- 1653.

86. Olive M.R., Walker J.C., Singh K., Dennis E.S., Peacock W.J. 1990. Functional properties of the anaerobic responsive element of the maize Adhl gene. Plant Mol Biol 15, 593 — 604.

87. Oumard A., Hennecke M., Hauser H., Nourbakhsh M. 2000. Translation of NRF mRNA is mediated by highly efficient internal ribosome entry. Mol Cell. Biol. 20, 2755 2759.

88. Pain, V.M. (1996) Initiation of protein synthesis in eukaryotic cells, Eur J Bio chem. 236, 747-771.

89. Pelletiei J., Sonenberg N. 1988. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature 334, 320 325.

90. Pestova T.V., Kolupaeva V.G. 2002. The roles of individual eukaryotic translation initiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection. Genes & Dev 16, 2906-2922.

91. Pestova T.V., Lomakin I.B., Hellen C.U. 2004. Position of the CrPV IRES on the 40S subunit and factor dependence of IRES/80S ribosome assembly. EMBO Rep. 5, 906 913.

92. Petracek M.E., Dickey L.F., Huber S.C., Thompson W.F. 1997. Light-regulated changes in abundance and polyribosome association of ferredoxin mRNA are dependent on photosynthesis. Plant Cell 9, 2291 2300.

93. Pitto L., Gallie D.R., Walbot V. 1992. Role of the leader sequence during thermal repression of translation in maize, tobacco, and carrot protoplasts. Plant Physiol. 100, 1827

94. Pramanik A., Wertheimer S.J., Schwartz J.J., Schwartz I. 1986. Expression of Escherichia coli infC: identification of a promoter in an upstream thrS coding sequence. J. Bacterial. 168, 746-751.

95. Prevot D., Darlix J.L., Ohlmann T. 2003. Conducting the initiation of protein synthesis: the role of eIF4G. Biol. Cell 95, 141 156.

96. Proud C.G. 2001. Regulation of eukaryotic initiation factor eIF2B. Prog. Mol. Subcell. Biol 26,95- 114.

97. Reinbothe S., Reinbothe C., Parthier B. 1993. Methyl jasmonateregulated translation of nuclear-encoded chloroplast proteins in barley (Hordeum vulgare L. cv. Salome). J Biol. Chem. 268, 10606- 10611.

98. Rook F., Gerrits N., Kortstee A., Kampen M., Borrias M., Weisbeek P., Smeekens S. 1998. Sucrose-specific signalling represses translation of the Arabidopsis ATB bZIP transcription factor gene. Plant J 15, 253 263.

99. Rozen F., Edery I., Meerovitch K., Dever Т.Е., Merrick W.C., and Sonenberg N. 1990. Bidirectional RNA helicase activity of eucaryotic translation initiation factors 4Л and 4F. Mol Cell Biol. 10, 1134 1144.

100. Russell D.W. and Spremulli L.L. 1979. Purification and characterisation of ribosome dissociation factor (eukaryotic initiation factor) from wheat germ. J. Biol. Chem. 254, 8796-8800.

101. Ruud K.A., Kuhlow C., Goss D.J., Browning K.S. 1998. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. Biol. Chem. 273, 10325- 10330.

102. Sachs A.B., Sarnow P, and Hentze M.W. 1997. Starting in the beginning, middle, and end: translation initiation in eukaryotes. Cell 89, 831 838.

103. Sachs M.M., Freeling M, Okimoto R. 1980 The anaerobic proteinsof maize. Cell 20, 761-767

104. Sachs M.M., Subbaiah C.C., Saab J.I.N. 1996. Anaerobic gene expression and flooding tolerance in maize. Exp. Bot. 47, 1 — 15.

105. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ed 2. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

106. Sherrill K.W., Byrd M.P., Eden M.E., Lloyd R.E. 2004. BCL-2 Translation Is Mediated via Internal Ribosome Entry during Cell Stress. J. Biol. Chem. 279, 29066 -29074.

107. Sonenberg N., Dever Т.Е. 2003. Eukaryotic translation initiation factors and regulators. Curr Opin. Struct. Biol 13, 56-63.

108. Spirin A.S. 1999. Ribosomes. Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York.

109. Stoneley M., Willis A.E. 2004. Cellular internal ribosome entry segments: structures, trans-acting factors and regulation of gene expression. Oncogene 23, 3200 3207.

110. Subbaiah C.C., Bush D.S., Sachs M.M. 1994. Elevation of cytosolic calcium precedes anoxic gene expression in maize suspension cultured cells. Plant Cell. 6, 1747 1762.

111. Subbaiah C.C., Sachs M.M. 2001. Altered patterns of sucrose synthase phosphorylation and localization preceede callose induction and root tip death in anoxic mai/e seedlings. Plant Physiol 125, 585 594.

112. Subkhankulova Т., Mitchell S.A., Willis A.E. 2001. Internal ribosome entry segment-mediated initiation of c-Myc protein synthesis following genotoxic stress. Biochem. J. 359, 183 192.

113. Thoma C., Bergamini G., Galy В., Hundsdoerfer P., Hentze M.W. 2004. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell 15, 925 935.

114. Vagner S., Galy В., Pyronnet S. 2001. Irresistible IRES. Attracting the translation machinery to internal ribosome entry sites. EMBO Rep. 2, 893 898.

115. Van Eden M.E., Byrd M.P., Sherrill K.W. and Lloyd R.E. 2004. Demonstrating internal ribosome entry sites in eukaryoticmRNAsusing stringent RNA test procedures. RNA 10, 720 730.

116. Van Eden M.E., Byrd M.P., Sherrill K.W., Lloyd R E. 2004. Translation of apoptosis protein 1 (c-IAPl)mRNAis IRES mediated and regulated during cell stress. RNA 10, 469 -481.

117. Vyas J., Elia A., Clemens M.J. 2003. Inhibition of the protein kinase PKR by the internal ribosome entry site of hepatitis С virus genomic RNA RNA (N. 7)9, 858 870.

118. Walker J.C., Howard E.A., Dennis E.S., Peacock W.J. 1987. DNA sequences required for anaerobic expression of the maize alcohol dehydrogenase 1 gene. Proc Natl Acad Sci USA 84, 6624-6428.

119. Wang Z., Weaver M., Magnuson N.S. 2005. Cryptic promoter activity in the DNA sequence corresponding to thepim-1 5'-UTR. Nucleic Acids Res. 33, 2248 2258.

120. Wilson J.E., Pestova T.V., Hellen C.U., Sarnow P. 2000. Initiation of protein synthesis from the A site of the ribosome. Cell 102, 511 520.

121. Ye X., Fong P., Iizuka N., Choate D., Cavener D.R. 1997. Ultrabithorax and Antennapedia 5' untranslated regions promote developmentally regulated internal translation initiation Mol Cell. Biol 17, 1714 1721.

122. Fernandez J., Yaman I., Mishra R., Merrick W.C., Snider M.D., Lameis W.H., Hatzoglou M. 2001. Internal ribosome entry sitemediated translation of a mammalian mRNA is regulated by amino acid availability. J. Biol. Chem 276, 12285 12291.

123. Burke Z.D., Wells Т., Carter D.A., Baler R. 2000. Use of a criptic splice donor site in the CAT-SV40 small-t antigen cassette generates alternative transcripts in transgenic rats. Transgenic Res. 9, 67 70.