Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль киназы р38α и фосфатазы Wip1 в опухолеобразовании

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль киназы р38α и фосфатазы Wip1 в опухолеобразовании"

На правах рукописи

Роль киназы р38а и фосфатазы \Vipl в опухолеобразовании.

03.00.03 молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург, в Национальном институте рака при Национальных институтах здоровья, Бетезда, США, и в Институте молекулярной и клеточной биологии, Сингапур.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор

Поспелов Валерий Анатольевич Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

кандидат медицинских наук Булавин Дмитрий Викторович Институт молекулярной и клеточной Биологии, Сингапур

доктор биологических наук член-корреспондент РАН Томилин Николай Викторович Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

кандидат биологических наук Филатов Михаил Валентинович Институт ядерной физики РАН Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Санкт-Пе1 ербургский

государственный университет

Биолого-почвенный факультет

Защита состоится 25~ марта 2005 года в 14 час. на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан «. .» февраля 2005 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

И.И.Марахова

z/ttbos

/<T¿?? 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Одним из важнейших направлений молекулярной и клеточной биологии является изучение механизмов канцерогенеза и поиск новых путей терапии опухолей. Идентификация перспективных молекулярных мишеней имеет большое значение для разработки новых, более эффективных методов терапии рака Исследования последних лет показали, что киназа р38 (представитель семейства митоген-активируемых протеин-киназ - МАПК), принимает участие в важнейших клеточных процессах - пролиферации, апоптозе, старении и дифференцировке, нарушение которых является причиной опухолевой трансформации. Имеются многочисленные данные, полученные в экспериментах in vitro, указывающие на антипролиферативную и проапоптотическую роль р38 киназы (Bulavin et al. 1999; Casanovas et al 2000), а также некоторые свидетельства ее опухолесупрессорной активности in vivo (Bulavin et al. 2002).

Киназы р38 относятся к групппе стресс-активируемых протеинкиназ, которые активируются в ответ на разнообразные стрессовые воздействия - ультрафиолетовое облучение и у-радиация, действие различных химических агентов, осмотический шок, тепловое и механическое воздействие К активации МАПК р38 приводят также удаление ростовых факторов, воздействие воспалительных цитокинов и некоторых митогенов, повышение экспрессии ряда онкогенов. В клетках млекопитающих идентифицировано четыре изоформы р38 киназы - p38cc/CSBP/SAPK2a, p38ß/SAPK2b, p38y/SAPK3/ERK6 и p388/SAPK4, две из которых - р38а и p38ß, экспрессируются во всех тканях. Принимая во внимание также тот факт, что полная инактивация р38о летапьна, можно предположить, что именно эта изоформа наиболее важна для всего организма

Субстратами для р38а являются важнейшие белки, участвующие в регуляции клеточного цикла и апоптоза Так, р38а может фосфорилировать и стабилизировать один из основных опухолевых супрессоров - белок р53 (Bulavin et al 1999), а также одну из его мишеней - ингибитор циклин-зависимых киназ p21Wlf1 (Kim et al. 2002) В то же время р38а негативно регулирует некоторые активаторы клеточного цикла - циклин D1 (Lavoie et al 1996, Casanovas et al. 2000), активаторные фосфатазы циклин-зависимых киназ Cdc25A (Goloudina et al 2003), Cdc25B и Cdc25C (Bulavin & Fornace 2004).

Для активации p38 in vivo важнейшее значение имеют вышестоящие киназы МАПК каскада - МККЗ и МККб (Brancho et al. 2003). Они фосфорилируют остатки треонина и тирозина в последовательности Thr-X-Tyr, присутствующей в активаторной петле киназного домена р38, что приводит к ее активации Негативная регуляция р38 киназ на посттрансляционном уровне осуществляется протеий-фф$^щэдн>^^£фарилирующими треониновый или тирозиновый активаторные ами! окислМКЯНОШНД или рба из них В

SttKJtA

инактивации р38 принимают участие фосфатаза РР2Са, фосфатазы семейства DPS (МКР) и недавно описанная фосфатаза Wip1 Последняя представляет наибольший интерес, поскольку ее экспрессия носит р53-зависимый характер и может, таким образом, осуществлять обратную связь в регуляции стабильности р53 (Takekawa et al 2000) Роль этой фосфатазы в инактивации р38 киназы in vivo и в туморогенезе недостаточно изучена Известно, что ген PPM1D, кодирующий фосфатазу Wipi, амплифицирован в некоторых опухолях человека, что приводит к нарушению опухоль-супрессирующей функции р53 (Bulavin et al. 2002). Идентификация гена PPM1D у мыши и получение мышей с нокаутом по этому гену сделало возможным изучение роли фосфатазы Wip1 и киназы р38а (далее р38) в туморогенезе in vivo.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в изучении роли фосфатазы Wip1 и киназы р38 в регуляции клеточной пролиферации и канцерогенезе. В связи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1 Разработать и охарактеризовать клеточную модель для изучения роли киназы р38 в супрессии канцерогенеза

2. Получить мышей с инактивацией киназы р38 и провести анализ их чувствительности к развитию некоторых опухолей, в частности, полипоэу кишечника

3 Получить мышей с предрасположенностью к полипозу кишечника и одновременной инактивацией Wip1 для изучения влияния активации р38 каскада на развитие этой формы опухолей

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Конститутивная активность р38 каскада, вызванная инактивацией фосфатазы Wip1 или активацией киназы МККб, приводит к значительному снижению способности трансформированных клеток образовывать опухоли.

2. Способность фибробластов Wipl"'", трансформированных различными онкогенами, к образованию опухолей снижается за счет повышения уровня р16тК4 -ингибитора активности циклин-киназных комплексов, и белка p19ARF

3 Подавление туморогенеза при инактивации фосфатазы Wip1 не зависит от опухолевого супрессора р53.

4. Мыши с нокаутом гена PPM1D устойчивы к аденоматозному полипозу кишечника, вызванного мутацией в гене АРС (АРСт1")

Научная новизна.

Впервые установлено, что инактивация фосфатазы Wip1 в трансформированных

эмбриональных ■фиброблаетах'мыши снижает способность клеток образовывать опухоли

í A)frjr<¡>¡ .„.'•¡■а при пересадке бестимуснудаэд>|щам.

* ч* «и?

ímm i.« ■ - - - -

Показано, что наблюдаемое подавление туморогенеза обусловлено повышением уровня ингибитора активности циклин-киназных комплексов pl6INK4 и белка p19ARF, причем действие последнего не опосредовано через р53, что говорит о существовании дополнительных опухоль-супрессорных функций у p19ARF.

Обнаружено, что активация р38 каскада в клетках HeLa с индуцибельной экспрессией киназы МККб незначительно влияет на пролиферацию клеток in vitro, но достаточна для опухолевой супрессии in vivo.

Впервые показано, что инактивация фосфатазы Wip1 вызывает устойчивость к полипозу кишечника у мышей с мутацией APCf1".

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные данные свидетельствуют о важной роли киназы р38 в супрессии опухолегенеза in vivo Один из механизмов этого эффекта - повышение уровня белков p16INK4 и p19ARF за счет усиления их транскрипции Эти факты расширяют существующие представления о функциях р38 и говорят о необходимости поиска новых мишеней р38 и регуляторных путей, в которые может бьггь вовлечена эта киназа. Зависимость супрессорной способности р38 от p19ARF в отсутствие р53 подразумевает существование у белка p19ARF дополнительных функций, не зависимых от р53. Важное практическое значение имеет выявленный в работе противоопухолевый эффект инактивации фосфатазы Wip1, которая может оказаться перспективной мишенью при терапии рака.

Отсутствие выраженного влияния активации р38 на пролиферацию и апоптоз in vitro при сильном опухоль-супрессорном действии in vivo показывает, что для скринирования противораковых средств требуется использование методов in vivo или разработка новых тестов для клеточных культур Широко используемые сейчас методы оценивают, в основном, уровень пролиферации и апоптоза, отсеивая, таким образом, потенциально перспективные соединения, не влияющие на эти параметры

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано три печатные работы Основные положения доложены и обсуждены на научных семинарах лаборатории Молекулярных основ дифференцировки клетки Института цитологии РАН, лаборатории Базовых исследований Национального института рака при Национальных институтах здоровья (США, Бетезда) и лаборатории Контроля клеточного цикла и туморогенеза Института молекулярной и клеточной биологии (Сингапур)

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов и списка цитируемой литературы,

содержащего Z&(> публикаций. Работа изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована 22- рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Мыши. Для скрещиваний использовались мыши чистой линии C57BL6/J (МАРК14- р38а нокин с заменой треонина 180 и тирозина 182 на аланин и фенилаланин соответственно, приводящей к инактивации киназы), а также мыши смешанного происхождения с нокаутом по гену PPM1D (PpmlcT1); с нонсенс-мутацией кодона 850 в гене АРС (АРС™'"); с нокаутом по локусу CDKN2A (p16INK4"'", p19ARF"''); с частичным нокаутом гена CDKN2A (р16||ЧК4''-) и с нокаутом по гену TRP53 (р53 '").

Для анализа влияния нокаута по гену РРМЮ на развитие полипоза кишечника, мышей Ppmlcf1' скрещивали с мышами с мутацией по гену АРС для получения гетерозигот. Затем гетерозигот скрещивали между собой и отбирали группы Ppmlcf'*АРС4' и Ppmld1' АРСДля получения гетерозигот МАРК14с удаленной neo кассетой, мышей МАРК14 скрещивали с трансгенными мышами, несущими ген рекомбиназы Сге под промотором Е1А, экспрессия с которого осуществляется во всех тканях Активация рекомбиназы Сге приводит к вырезанию фрагмента ДНК по последовательностям LoxP, специфически распознаваемыми этой рекомбиназой, Поскольку ген устойчивости к неомицину (пео-кассета) был фланкирован указанными последовательностями, у мышей с генотипом МАРК14"'Сге он был удален При дальнейшем скрещивании отбирали мышей с генотипом МАРК14*1', вырезанной neo кассетой и отсутствием Сге рекомбиназы Для проверки влияния частичной инактивации киназы р38 на процесс туморогенеза у мышей с мутацией АРС"", полученных гетерозигот МАРК14*'~ с вырезанной neo кассетой скрещивали с гетерозиготными мышами APCf*" для получения двойных гетерозигот, и группы M А PK 14*' АРС1' и МАРК14*'*АРС*'быпи отобраны для последующего анализа.

Для анализа туморогенности клеток m vivo использовали бестимусных мышей Balb/CanNCr-nu.

Генотипирование. Генотипирование мышей производили в возрасте 21 дня с помощью ПЦР Образец ткани лизировали в течение 8-12 часов при 50°С в 100 мкп буфера следующего состава-100 мМ TRIS-HCI, 200 мМ NaCI, 0.2% SDS, 5 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл протеиназы К (Promega), затем добавляли 300 мкл воды и инкубировали при 100°С в течение 10 минут для инактивации протеиназы К 1 мкп лизата использовали для ПЦР со специфическими праймерами (последовательности и условия реакции представлены в диссертации).

Подсчет полипов и взятие проб тканей. Подсчет полипов у мышей с мутацией в гене АРС производили в возрасте 120 и 300 дней. Кишечник удаляли, отделяли слепую кишку (caecum), тонкий и толстый кишечник, промывали фосфатным буфером и вскрывали продольно. Часть кишки (0,5 - 1 см) использовали для приготовления лизата Остальной

кишечник фиксировали в 4% формалине с 0,5% метиленовым синим в течение 5-10 минут, после чего производили подсчет полипов с помощью инвертированного микроскопа (Olympus) Образцы тканей брали у мышей того же возраста, что и для подсчета полипов Ткани для биохимического анализа немедленно замораживали в сухом льду Образцы для гистологического анализа фиксировали в 4% растворе формалина в фосфатном буфере Для оценки скорости пролиферации в тканях, за два часа до забивки мышам вводили внутрибрюшинно раствор бромдезоксиуридина (Zymed) из расчета 50 мг/кг

Оценка туморогенности. Для оценки способности культуры клеток образовывать опухоли in vivo, 10е клеток ресуспендировапи в 0,5 мл фосфатного буфера и вводили подкожно в область бедра 6-8 недельным бестимусным самцам Balb/CanNCr-nu Во всех экспериментах контрольные инъекции делали в правое бедро Мышей регулярно проверяли на развитие опухолей и забивали через 15-28 дней после инъекции, оценивали количество и размер опухолей, для чего их извлекали, взвешивали и при необходимости подвергали дальнейшему анализу

Клеточные линии и их культивирование. Клеточные линии содержали при 37°С в инкубаторах с увлажняемой атмосферой, содержащей 5% С02, используя стандартные методики.

Эмбриональные фибробласты мыши получали из эмбрионов возраста 13,5 дней Эмбрионы извлекали в стерильных условиях, измельчали, пропуская несколько раз через щприц, и помещали на 5 минут при 37°С в С02 инкубатор в 0.125% растворе трипсина в фосфатном буфере, содержащем 0 1% ЭДТА Затем клеточную суспензию помещали на 15 см культу ральные чашки со средой DM EM (Gibco), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, L-глутамин и антибиотик-антимикотик (Gibco).

Кожные фибробласты получали из кожи новорожденных мышат по следующей методике: в асептических условиях удаляли голову и конечности, снимали кожу и помещали в 2.5 мл среды DMEM без сыворотки, с антибиотиком и глутамином содержащей 2 5 ед/мл диспазы (Sigma) Инкубировали в течение 12 часов при 4°С, затем переносили образцы в среду DMEM без сыворотки, содержащую 3 ед/мл коллагеназы I типа (Sigma), и инкубировали на шейкере при 37°С в течение 30 минут После окончания инкубации добавляли 5 объемов среды DMEM с 10% сывороткой. Затем отделяли дерму от эпидермиса, ресуспендировали клетки пипетированием или протиранием через нейлоновое сито (BD) и осаждали центрифугированием 5 минут при 1500 оборотов в минуту. После этого осадок ресуспендировали в DMEM с 10% сывороткой и помещали на 15 см культуральные чашки.

Ретровирусная инфекция. Для получения вирусных частиц, клетки линии Phoenix-Eco трансфецировали плазмидой pBabe-puro, содержащей кДНК различных онкогенов Использовали следующие плазмиды pBabe-puro-HrasV12, содержащая кДНК

активированного Hras; pBabe-puro-NeuT, экспрессирующая активированную форму Erbb2 крысы с мутацией кодона 664 приводящей к замене валина на глутамин; pBabe-puro-cMyc и pBabe-puro-E1A, кодирующая ген Е1А аденовируса человека Ad5 Трансфекция производилась с использованием реагента Lipofectamin 2000 (GIBCO/lnvitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя. Через два дня после трансфекции среду, содержащую вирусные частицы, собирали, фильтровали через 20 мкм фильтр и добавляли полибрен (Sigma) до концентрации 4 мкг/мл Эту среду использовали для инфекции эмбриональных фибробластов мыши. После инфекции клетки подвергали селекции в течение 6 дней на среде DMEM, содержащей пуромицин (2 мкг/мл). Устойчивые кпоны переносили на 96-луночную чашку, и по достижении надлежащей плотности пересевали для получения лизатов и проверки на экспрессию соответствующих онкогенов с помощью иммуноблоттинга

Получение клеточной линии, стабильно экспрессирующей YKK6. MTS-тест. Для

получения клеточной линии, индуцибельно экспрессирующей МКК6, использовали клетки HeLa Tet-on (Clontech) Для трансфекции использовали плазмиду pTRE2-puro, куда нами была клонирована кДНК активированной формы МКК6 Трансфекцию проводили с использованием реагента Lipofectamin 2000 (GIBCO/lnvitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя После трансфекции клетки инкубировали в течение 8 дней на среде DMEM содержащей пуромицин (2 мкг/мл) для селекции устойчивых клонов, в геномную ДНК которых произошла интеграция плазмиды В результате селекции было отобрано 48 клонов. Эти клоны были посеяны на 6-луночные культуральные чашки и инкубированы 24 часа со средой DMEM, содержащей доксициклин (5 мкг/мл) После инкубации клоны были собраны и с помощью иммуноблоттинга проанализированы на экспрессию МКК6. Три клона (8, 20 и 44) были отобраны для последующих экспериментов

Для оценки скорости пролиферации и уровня апоптоза мы использовали колориметрический MTS-тест (MTS реагент - 3-(4,5-dimethylthiazoi-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium inner salt). Для этого клоны 8, 20 и 44 высевали по 500 клеток на лунку на 96-луночную культуральную чашку После 24 часов инкубации осуществляли индукцию доксицикпином (5 мкг/мл), и каждые последующие 24 часа оценивали уровень потребления MTS растущими клетками (добавляли 10% раствор MTS в среде DMEM и после 1 ч инкубации в С02 инкубаторе замеряли поглощение при длине волны 490 нм на спектрофотометре EMax Micoplate Reader) Эксперимент повторяли трижды.

Приготовление ядерных экстрактов. Для приготовления ядерных экстрактов клетки лизировали в буфере следующего состава- 10 мМ HEPES рН 7 9, 1 5 мМ MgCI2, 10 мМ KCI, О 4% NP40, 0 5 мМ дитиотриэйтол (ДТТ), 20 мМ бета-глицерофосфат Na, 0.2 мМ PMSF, ингибиторы протеаз и фосфатаз (Sigma) Ядра осаждали центрифугированием 15 минут при 2000 об/мин, и ресуспендировапи в 50 мкл буфера следующего состава- 20 мМ HEPES рН

7 9, 25% глицерол, 420 мМ NaCI, 1 5 мМ MgCI2, 0 2 мМ ЭДТА, 0 5 мМ дитиотриэйтол (ДТТ), 20 мМ бета-глицерофосфат Na, 0 2 мМ PMSF, ингибиторы протеаз и фосфатаз (Sigma), и инкубировали на шейкере в течение 30 минут при 4°С После этого лизат центрифугировали 10 минут при 15600 об/мин при 4°С и использовали для иммуноблоттинга

Иммуноблоттинг, иммунопреципитация, in vitro киназная проба и электрофорез.

Клетки лизировали в буфере следующего состава- 10 мМ TRIS-HCI pH 8.0, 150 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА, 1% NP-40, 0 5% TRITON Х-100, 20 мМ бета-глицерофосфат Na, 0.2 мМ PMSF, коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз (Sigma) Пробы для электрофореза приготовляли по методу Лэммли

Для иммунопреципитации в клеточные лизаты добавляли соответствующие первичные антитела и инкубировали при постоянном перемешивании 2 часа После этого лизаты инкубировали 2 часа в присутствии Протеин-Сефарозы (Amersham) Все инкубации проводили при 4°С После промывки в лизирующем буфере иммунные комплексы промывали в киназном буфере следующего состава 20 мМ HEPES pH 7 9, 20 мМ MgCI2, 25 мМ ß-глицерофосфэт Na Киназные реакции проводили в 50 мкл киназного буфера, содержащего 10% глицерин, 1 мМ дитиотриэйтол (ДТТ), 50 мкМ немеченный АТФ, 5 цС| [32Р]АТФ и 2 мкг субстрата - GST-pRb (для киназ Cdk4 и Cdk6) или гистон Н1 (для Cdk2). Реакции инкубировали 20 минут при 30°С и затем останавливали добавлением 2-кратного буфера для нанесения и кипячением в течении 5 минут.

Белки разделяли при помощи денатурирующего SDS-электрофореза в полиакриламидном геле Гели, содержащие радиоактивные пробы, высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой Kodak Х-ОМАТ AR. Перенос белков с геля и иммуноблоттинг проводили по стандартной методике, описанной ранее (Тимофеев & Поспелов 2003) Были использованы следующие антитела- к циклину D1, р16, р27, р38, Cdk2, Cdk4, Cdk6, pRb, APC, бета-катенину, МКК6 (Santa Cruz Biotechnology); фосфо-р38, фосфо-НБр27, фосфо-pRb (Ser780) (Cell Signaling Technology); p53, p21, Mdm2 (Oncogene Research Products), p19 (Abeam), COX2 (Cayman Chemicals); c-Myc (Delta Biolabs)

Иммуногистохимия. Парафинизированные срезы обрабатывали в соответствии с рекомендациями производителей наборов для окраски антителами на бромдезоксиуридин (Zymed Brdu Staining Kit) или детектирования апоптоза (Chemicon ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit) Перед окраской другими антителами слайды инкубировали в цитратном буфере (10 мМ цитрат Na, 0 05% Tween-20, pH 6.0) при 95°С в течение 20 минут для демаскирования антигена. Инкубацию с первичными антителами (на бета-катенин, циклин D1, р16 и СОХ2, в разбавлении 1:100) проводили в 3% растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) с 0 05% Tween-20 и 0 1% Triton Х-100 в течение 1 часа при комнатной температуре После этого препарат промывали и инкубировали 30 минут со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена Сигнал

s

визуализировали, используя диаминобензидин (ДАБ, Zymed) Затем проводили окрашивание гемотоксилином и эозином (Zymed), дегидрирование препарата и фиксацию раствором для долговременной фиксации (Vector)

Иммунофлуоресценция. Для иммунофлуоресценции клетки высевали на покровные стекла в 6-луночные культурапьные чашки Через 24 часа инкубации клетки в течение 20 минут фиксировали ледяным раствором 3% параформапьдегида в фосфатном буфере Инкубацию с первичными антителами (на бета-катенин, циклин D1, р16 и с-Мус в разведении 1 • 100) проводили в течение 1 часа при комнатной температуре в растворе БСА с 0 05% Tween-20 и 0.1% Triton Х-100 Затем в течение 30 минут клетки инкубировали при комнатной температуре со вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями Су2 и СуЗ Препараты помещали на предметные стекла, предварительно зафиксировав средой для временной фиксации (Vecta Shield), содержащей краситель DAPI для визуализации ядер Препараты анализировали и фотографировали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss

РЕЗУЛЬТАТЫ

Трансформированные эмбриональные фибробласты с инактивацией фосфатазы Wip1 (Ppmld') имеют пониженную туморогенность при введении бестимусным

мышам.

Для выяснения того, как инактивация гена РРМЮ может повлиять на трансформацию эмбриональных фибробластов, вызванную онкогенной экспрессией, мы получили эмбриональные фибробласты мыши Ppmld* и дикого типа Было установлено, что эмбриональные фибробласты Pprnhf" имеют сниженную скорость пролиферации и обнаруживают признаки преждевременного клеточного старения Уже на 2-3 пассаже эти клетки имели сниженную скорость пролиферации, и деление прекращалось после 6-7 пассажей Трансформированные онкогенами Ad5 Е1А 12S + Hrasl эмбриональные фибробласты как дикого типа, так и с нокаутом по гену РРМЮ, не отличались по скорости пролиферации (Рис 1а, б) Чтобы проверить, изменяется ли способность экспрессирующих онкогены фибробластов Ppmld'" образовывать опухоли по сравнению с трансформированными МЭФ дикого типа, мы инъецировали подкожно суспензии обеих клеточных линий бестимусным мышам, и по истечении 28 дней проверили их на наличие опухолей У всех мышей (15/15), инъецированных трансформированными фибробластами дикого типа, развились опухоли, тогда как инъекции трансформированных онкогенами МЭФ Ppmldпривели к образованию опухолей только в двух случаях (2/15), причем эти опухоли были как минимум в 10 раз меньше, чем образованные трансформантами с фосфатазой Wip1 дикого типа Аналогичные эксперименты были проведены с фибробластами, инфицированными ретровирусами, экспрессирующими пары онкогенов Hrasl V12 и Мус или Hrasl V12 и Erbb2 Ни в одном случае мы не наблюдали развития опухолей в местах

инъекции трансформированных фибробластов РртМ* , тогда как трансформированные МЭФ Ррт1 сГА образовали опухоли во всех случаях (Рис 1в) Таким образом, было установлено, что эмбриональные фибробласты мыши с инактивацией фосфатазы \Мр1 характеризуются дефектами пролиферации и значительно сниженной способностью к образованию опухолей при трансформации парами онкогенов Ас)5 Е1А 12Э + Нгав1, Нгаз1 VI2 + Мус или НгавГ VI2 + ЕгЬЬ2.

35£ з-

!"

I ч

Ï 1.5-

I 1

05

Ppmfd-1-WT 2/15

количество опухолей

Hiasl * Мус Hiasl + &М2

Ppmtd-I-

1 2 3 4 5 6

Пассажи

Ppmld-t-

0/5

0/5

Рис.1. Снижение способности трансформированных эмбриональных фибробластов с инактивацией фосфатазы Wip1 (Ppmlcf'') образовывать опухоли.

(а) МЭФ дикого типа и Ppmld'' начиная со второго пассажа высевали на чашки и подсчитывали количество клеток через каждые три дня, перед следующим пассажем

(б) МЭФ дикого типа и Ppmhî'' на ранних пассажах трансформировали онкогенами Ad5 E1A+Hras1 и анализировали пролиферацию с помощью MTS теста

(в) Balb/CanNCr-nu мыши, инъецированные подкожно суспензией МЭФ, экспрессирующих различные пары онкогенов Цифрами обозначено число мышей, развивших опухоли, числитель - инъекции трансформантов Ppmlcr'' (левое бедро) знаменатель - трансформированные клетки дикого типа (правое бедро)

В эмбриональных фибробластах с инактивацией фосфатазы Wip1 (Ppmlcf'') повышено содержание p16INK4, p19ARF, р53 и ряда других белков, участвующих в регуляции клеточного цикла.

Как уже упоминалось, р38 может фосфорилировать и стабилизировать р53 Так как фосфатаза Wip1 является негативным регулятором р38, мы ожидали, что поскольку в клетках с инактивацией гена Ppmld'' активность р38 киназы повышена, это могло привести к накоплению и активации р53. Иммуноблоттинг показал, что в трансформированных онкогенами Ad5 Е1А 12S+Нга$1 фибробластах Ppmlcf'' количество белка р53 действительно несколько выше, чем в трансформированных фибробластах дикого типа Кроме того, повышено было и содержание белков, экспрессия которых регулируется р53 - это p21Waf1 и

Mdm2 (Рис 2a) Помимо этого, в Ppmld* клетках был несколько повышен и уровень ингибитора циклин-зависимых киназ p27Klp1, тогда как содержание ингибитора p16IN,a и белка p19ARF было существенно выше, чем в трансформированных клетках дикого типа (Рис 26) Поскольку в Wipl"'' фибробластах наблюдалось накопление ингибиторов циклин-зависимых киназ, регулирующих активность киназ Cdk2, Cdk4 и Cdk6, мы ожидали, что активность этих киназ может быть снижена Для проверки этого предположения, киназы были иммунопреципитированы с помощью соответствующих антител и инкубированы с субстратами' гистоном Н1 для Cdk2 и GST-Rb для Cdk4 и Cdk6 После инкубации включение меченого фосфата определяли с помощью авторадиографии Как видно из Рис 2в, несмотря на высокое содержание белков р27 и р21, ингибирующих Cdk2, активность этой киназы не снижалась, как и активность киназы Cdk6 В то же время активность киназы Cdk4 была существенно ниже, чем в трансформированных фибробластах дикого типа На основании этих данных мы сделали предположение, что уменьшение способности трансформантов Ppmhf' к образованию опухолей in vivo обусловлено, по крайней мере, отчасти, повышенной экспрессией p16INK4.

В

ИП Cdk2 НН1 Cdk2

ИП Cdk4, GST-Rb Cdk4

ИП Cdk6, GST-Rb Cdk6

p53

p21

Mdm2

e

$ I

E £

? I

Рис.2. Накопление p53, pie""44 и p19ARF в эмбриональных фибробластах Ppmld1'.

(а) Анализ содержания белка р53 и регулируемых им р21 и Mdm2 в МЭФ дикого типа и Ppmhf', экспрессирующих E1A+Hras1 Для определения уровня р53 использовали ядерные экстракты

(б) Иммуноблоттинг белков, участвующих в регуляции клеточного цикла, в лизатах МЭФ дикого типа и Ppmhf'', экспрессирующих E1A+Hras1 Для определения уровня p19ARF использовали ядерные экстракты

(в) Активность киназ Cdk2, Cdk4 и Cdk6 в лизатах МЭФ дикого типа и Ppmhf'", экспрессирующих E1A+Hras1 Показано также содержание этих киназ в клеточных лизатах.

Снижение способности трансформантов Ppmld* образовывать опухоли ¡n vivo зависит от p16INfu и р19* .

Мы решили проверить, какой из возможных механизмов снижения туморогенности in vivo функционирует в отсутствие Wip1 - р53-зависимый или действующий через p16INM и р19ARF.

Если бы инактивация Wip1 препятствовала опухолевой трансформации на фоне делеции гена TRP53 или CDKN2A, это свидетельствовало бы о том, что данный ген не играет ключевой роли в защите от туморогенеза Для выяснения этого вопроса мы получили эмбриональные фибробласты с генотипами Тгр5&', Cdkn2a~'~, Ppm1d''Trp53~'' и Ppmltf' Cdkn2aJ' Эти фибробласты не проявляли черт преждевременного старения, не отличались по своим способностям к пролиферации in vitro от клеток Ppm1<f/,'Trp53~'~ и Ppm1tf'*Cdkn2a и продолжали расти в культуре после многочисленных пассажей, демонстрируя признаки имморталиэации (Рис За, для Cdkn2a'1- данные не показаны) Для полной трансформации клеток TrpSJ1' и Cdkn2a'1' достаточно экспрессии одного онкогена Мы трансформировали фибробласты PpmlcT1' и Ppmld"'' с делецией генов TRP53 и CDKN2A различными онкогенами - Hrasi, Мус или ЕгЬЬ2 Трансформированные таким образом клетки вводили подкожно бестимусным мышам Balb/CanNCr-nu Ни в одном случае в течение 4 недель опухоли не развились в месте инъекции клеток Ррт1<^'Тгр53экспрессирующих онкогены Hrasi (0/5), Мус (0/5) или ЕгЬЬ2 (0/5), тогда как клетки Ррт1сГ'*Тгр53'1', трансформированные теми же онкогенами, развили опухоли во всех случаях (15/15) (Рис 36) Напротив, фибробласты Ррт 1 (f'CDKN2A'A, трансформированные онкогенами Hrasi, Мус или ЕгЬЬ2, в течение 3 недель после инъекций образовали опухоли с той же частотой, что и трансформанты Ррт1 <f'*CDKN2A(10/10 для Hrasi, 5/5 для Мус, 5/5 для Erbb2), Рис.Зв Из полученных данных мы сделали вывод, что, несмотря на активацию р53 в отсутствие в клетках фосфатазы Wip1, для защиты от формирования опухолей in vivo р53-зависимый каскад не имеет существенного значения Первостепенная роль в этом, по-видимому, принадлежит тумор-супрессорам p16INK4 и pl^^.

Чтобы проверить, какой из продуктов локуса CDKN2A наиболее важен для реализации отмеченного противоопухолевого эффекта, мы использовали мышей с частичной инактивацией гена CDKN2A, у которых отсутствовал только pí6"VM (р16Из этих мышей были получены эмбриональные фибробласты Ppmlcf' р16^' и Ррт1с^'*р16^' В эти фибробласты методом вирусной инфекции были перенесены пары онкогенов Е1А+Hras1 или Hrasi+Мус Трансформированные таким образом клетки вводили подкожно бестимусным мышам и анализировали развитие опухолей По истечении трех недель с момента инъекции, все трансформированные клетки р1&'~ с активной фосфатазой Wip1 образовали опухоли, опухоли также развились в месте инъекции клеток Ppm1cït'p16/~, трансформированных онкогенами E1A+Hrasí Необходимо отметить, что в последнем случае опухоли были минимум в три раза меньше, чем образованные клетками Ppm1<f'*p1& ' (РисЗг) Опухоли не образовались при введении клеток РртЫ1 р16~А, экспрессирующих онкогены HrasHMyc. Таким образом, было установлено, что оба продукта гена CDKN2A -p16INK4 и р1 9ahf участвуют в защите от опухолеобразования in vivo при инактивации фосфатазы Wip1, причем plí^ играет ведущую роль при обеспечении этой защиты в случае трансформации онкогенами Hras1+Myc.

10 S 8

I 6-|

9

S 4

I

I 2A

0

£1A+Hrasi HrasHMyc

Trp53-i-

Ppm10-l-TrpSZ-<-e. .,»,.,.«

"'«>—e

WT '-o

012345678

Пассажи

1-

0.5

Hms1

Ww

Егььг

Нпа1

Мус

0/5 0/5

Рис.3. Снижение туморогенности трансфорантов Ppmld*" обусловлено накоплением p16INK< и p19ARF.

(а) Эмбриональные фибробласты дикого типа, Trp5j'' и Ppm1cfl'Trp5Jl'l со второго пассажа высевали на чашки и анализировали пролиферацию с помощью MTS теста перед каждым новым пассажем

(б) Balb/CariNCr-nu мыши были инъецированы подкожно суспензией МЭФ Ppm1d'~Trp53' и Тгр53'~, трансформированных различными онкогенами Цифрами обозначено число мышей, развивших опухоли через 21 день после инъекций, числитель - инъекции трансформантов Ppmld* TrpSSí1 (левое бедро), знаменатель - трансформанты ТгрбЗ(правое бедро)

(в) Balb/CanNCr-nu мыши были инъецированы подкожно суспензией МЭФ Ppm1d'~Cdkn2a"'" и Cdkn2á'", трансформированных различными онкогенами Цифрами обозначено число мышей, развивших опухоли через 21 день после инъекций числитель - инъекции трансформантов Ppmld1'Cdkn2a"1' (левое бедро) знаменатель - трансформанты Cdkn2a+ (правое бедро)

(г) Balb/CanNCr-nu мыши были инъецированы подкожно суспензией МЭФ Ppmld1" р16* и р1В*, трансформированных различными онкогенами (по 5 мышей на каждый онкоген) На графике показан вес опухолей, образованных трансформантами pier"" и Ppmld'" р16*" Анализ опухолей проводили через 21 день после инъекций.

Активация МКК6 снижает способность клеток HeLa к образованию опухолей у

бестимусных мышей.

Для того, чтобы проверить, как активация р38 влияет на клетки, полученные из опухоли человека, мы использовали клетки линии HeLa, где р53 и pRb инактивированы

белками папилломавируса человека Была получена клеточная линия, стабильно экспрессирующая активированную форму МККб при индукции доксициклином (5 мкг/мл). Несколько отобранных клонов с высоким уровнем индукции МККб были проверены на активацию р38 с помощью вестерн-блоттинга с антителами на фосфорилированную р38 и фосфорилированный белок Нвр27, являющийся маркером активации р38 Активация р38 при добавлении доксицикпина в ростовую среду была обнаружена во всех протестированных клонах (Рис.4а) Поскольку известна роль р38 как активатора апоптоза и негативного регулятора клеточного цикла, мы решили проверить, как активация р38 влияет на пролиферацию и апоптоз в клетках НеЬа, зкспрессирующих МККб Мы использовали МТБ тест, который применим для анализа обоих параметров. Обнаружено, что одни клоны по скорости пролиферации в присутствии и отсутствии доксицикпина лишь незначительно отличаются от исходной Не1_а Те1-оп (Рис 46) В то же время у других клонов было обнаружено снижение пролиферативной активности, что согласуется с литературными данными об участии р38 в регуляции клеточного цикла. Примечательно, что даже незначительная активация р38 (клон 8) была достаточна, чтобы снизить скорость пролиферации

Оптическая плотность при 490 чм

Рис.4. Анализ клеток Не1_а ТеЮп, зкспрессирующих активированную киназу МКК6.

(а) Вестерн-блоттинг лизатов, полученных из клеток НеЦа ТеЮп, без индукции и при индукции экспрессии киназы МККб Индукция осуществлялась добавлением доксициклина в культуральную среду (5мкг/мл)

(б) Пролиферация клеток Не1_а ТеЮп, без индукции и при индукции экспрессии киназы МККб доксициклином, была проанализирована с помощью МТБ-теста

клеток Чтобы проверить, как активация р38 влияет на способность человеческих раковых клеток образовывать опухоли, использовали тест на туморогенность. Для инъекций использовали клоны 20 (пролиферация снижалась при добавлении доксициклина), 44 (пролиферация не менялась) и исходные клетки Не1_а Те1-оп (С1огЛес11) После инъекции мыши получали доксицикпин в питьевой воде (1 мг/мл) в течение всего времени наблюдения Анализ опухолей проводили на 15-й день У всех мышей (10/10), получивших инъекции Не!_а Те1-оп в правое бедро, развились опухоли. В то же время только у половины

мышей (5/10), инъецированных МКК6 экспрессирующей HeLa, развились опухоли (Рис 5а) Важно отметить, что оба клона с одинаковой частотой образовали опухоли, независимо от их пролиферативной активности, но эти опухоли были существенно меньше, чем образованные исходной HeLa Tet-on (Рис 56) Таким образом, мы показали, что активация р38 в человеческих раковых клетках HeLa приводит к снижению их способности образовывать опухоли in vivo, несмотря на отсутствие строгой корреляции со снижением скорости пролиферации in vitro, что сходно с картиной, наблюдавшейся в трансформированных МЭФ с нокаутом по Wip1 Как и в фибробластах W¡p''"p53J", в HeLa при индукции МКК6 этот эффект достигается не через р53-зависимый путь, так как в этих клетках р53 функционально инактивирован продуктом гена Е6 вируса папилломы человека Кроме того, в отличие от фибробластов Wip"'", где снижение способности к образованию опухолей в значительной степени обусловлено накоплением p16INK4 и обусловленным этим гипофосфорилированием белка Rb, этот путь, по-видимому, также нефункционален в клетках HeLa, поскольку продукт другого вирусного гена - Е7 инактивирует Rb Каков молекулярный механизм, лежащий в основе наблюдаемой опухолевой супрессии в данном случае, предстоит выяснить, но можно предположить, что в нем также задействован белок р1 9arf, как это установлено для трансформированных МЭФ

а б

MtLaTMOft МККбсрси-44 HeLSTMOn HeU Tel On МККвихкго Heu Та) On

нет 1.50 нет 0,10

0 07 1,06 0,06 034

0,01 0 27 0,06 1,82

нет 038 016 1 38

нет 1 00 нет 010

Рис.5. Активация МКК6 в клетках HeLa Tet-On подавляет рост опухолей.

(а) Клетки HeLa Tet-On, экспрессирующие МКК6, инъецировали подкожно в левое бедро самцов Balb/CanNCr-nu, исходные клетки HeLa Tet-On - в правое бедро Мыши получали доксициклин с питьевой водой (1мг/мл)

(а) Вес опухолей, образованных в результате инъекций клеток HeLa Tet-On, экспрессирующих МКК6 и исходный HeLa Tet-On «Нет» - отсутствие опухоли Анализ проводили на 15 день после инъекции

Мыши с нокаутом по гену фосфатазы Wip1 устойчивы к полипозу кишечника, вызванного мутацией АРС"'".

Поскольку было установлено, что инактивация фосфатазы Wip1 повышает устойчивость клеток к опухолевой трансформации и защищает от развития опухолей молочной железы, вызванной у мышей экспрессией онкогенов ЕгЬЬ2 и Hrasl (Bulavin et al 2004), мы решили проверить, может ли отсутствие Wip1 повышать резистентность к другим

типам опухолей В качестве модели мы выбрали мышей с мутацией АРС™1" (mouse intestinal neoplasia) У мышей с этой мутацией нарушена трансляция белка АРС (adenomatous polyposis coli), так как наличие нонсенс-кодона в положении 850 приводит к тому, что синтезируется укороченный полипептид Продукт гена АРС играет важную роль в регуляции Wnt-зависимого сигнального пути Одна из его функций заключается в уменьшении количества свободного бета-катенина - транскрипционного фактора, который высвобождается из клеточной мембраны при активации лигандом Wnt соответствующих рецепторов В отсутствии лиганда Wnt белок АРС участвует в формировании мультимерного комплекса, включающего в себя аксин, киназы GSK3-6eTa и СК1, который связывает свободный бета-катенин и способствует его убиквитинированию и протеасомной деградации При активации Wnt каскада этот деструктивный комплекс инактивируется, и бета-катенин перемещается в ядро, где принимает участие в активации транскрипции ряда генов, участвующих в регуляции клеточного цикла - в частности, CCND1 (кодирующего циклин D1) и онкогена с-Мус В результате мутаций в гене АРС, приводящих к утрате или нарушениям доменов, отвечающих за взаимодействие белка АРС с бета-катенином или другими компонентами комплекса, происходит накопление бета-катенина При этом наблюдается конститутивная активация экспрессии зависимых от бета-катенина генов, что вызывает неопластические процессы, в первую очередь - в эпителии кишечника У человека мутации в гене АРС и последующая потеря гетерозиготности, главным образом, приводят к развитию полипоза кишечника (FAP - Familial Adenomatous Polyposis) и раку толстого кишечника. Патологическая картина у мышей с мутацией АРС1™1 сходна с таковой у человека, с той разницей, что у мыши полипы развиваются преимущественно в тонком кишечнике, тогда как у человека - в толстом кишечнике

Мы анализировали мышей дикого типа с мутацией АРС"1" и мышей с инактивацией гена Ppmld, несущих ту же мутацию. Вскрытие, забор образцов тканей и подсчет полипов производили в возрасте 120 и 300 дней. Две группы по десять мышей были оставлены для оценки максимальной продолжительности жизни Все участвовавшие в эксперименте мыши были дважды генотипированы (в процессе отбора и после эвтаназии) и выборочно проверены на наличие мутации в гене PPL2A, продукт которого приводит к снижению числа полипов у мышей АРСВсе использованные нами в этих экспериментах мыши имели инактивирующую мутацию в гене PPL2A, поскольку происходили от нескольких пар мышей, гомозиготных по этой мутации.

Было установлено, что средняя выживаемость у мышей АРСсоставляла 168 5 дней, тогда как лишь одна мышь Ppmld^APC""" погибла в возрасте 160 дней Ни одна мышь Ppm1cfl*APCmi" не дожила до 300-дневного возраста, тогда как 90% мышей из группы Ppmhf1 АРСт'" преодолели этот возрастной барьер (Рис 6а). Кроме того, АРС"' мыши с нокаутом по гену Ppmld образуют значительно меньше полипов, чем мыши дикого типа -среднее количество полипов для первых составляет 6 3, тогда как для вторых 61.2 - на

особь (Рис 66) Данные были проверены статистическими методами и показали высокую степень достоверности (Р<О 0001) Мы также сравнили количество полипов у мышей разных возрастов внутри группы Ppm1d'"APCfni" Несмотря на разницу в возрасте более чем в 2 5 раза (120 против 300 дней), количество полипов у старых мышей не было сильно увеличено (в среднем 17 5 полипа на особь) и оставалось значительно меньшим, чем у мышей дикого типа с мутацией АРС"1" (Рис.бв)

Мы также проанализировали, как инактивация одной аллели гена МАРК14, кодирующего киназу р38а, может повлиять на развитие полипоза кишечника у мышей АРС""" Для этого гетерозиготные мыши МАРК14*1' были скрещены с мышами АРС"'" и полученные двойные гетерозиготы МАРК14"'АРС"'" и гетерозиготы MAPK14*'*APCmn использовались для подсчета полипов через 120 дней после рождения Мышей с функциональной инактивацией обеих аллелей МАРК14 получить не удалось, так как они погибали на ранних сроках эмбрионального развития из-за плацентарных нарушений, характерных для инактивации р38 в результате двойного нокаута по генам, кодирующим киназы МККЗ и МКК6.

110-1

10090' № 7060' 5040302010-О-

тг

■ АРС"™

■ PfmU'APC™

100

I......

200

Дни

'I

300

400

PpmtfAPd"'

Рис.6. Анализ выживаемости и количества полипов у мышей Ррт1сГ'*АРСГ1п и Ррт1 d1' APCf'".

(а) График выживаемости В группах было по 10 мышей Средняя выживаемость АРС"1" мышей составила 168 5 дней, тогда как 9 из 10 мышей Ррт^'АРС™1" преодолели 300-дневный возраст

(б) Среднее количество полипов на особь, подсчитанное в возрасте 120 дней У мышей АРС""" оно составило 61 2, у Ppirilt^'APCf"" - 6 3 (Р<0.0001)

(в) Сравнение количества полипов у мышей Ppm1d'~APCtm" разных возрастных групп - 120 и 300 дней Среднее количество полипов у старых мышей остается существенно меньше, чем у мышей дикого типа 17 5 против 61.2 (Р<0.0001)

Двойные гетерозиготы МАРК14*1'АРСтт образовывали в среднем даже меньше полипов, чем мыши с р38 дикого типа (104 9 против 131 8), однако эта разница не была статистически достоверной (Р=0 17). Таким образом, частичная инактивация киназы р38 не оказывала влияния на развитие полипоза кишечника у мышей АРС"'" Это не вызывает удивления, так как было показано, что даже инактивация таких мощных опухолевых

супрессоров, как p53 или p16INK4/p19ARF не приводила к существенному увеличению количества полипов на той же мышиной модели (Halberg et al 2000, Gibson et al. 2003)

Мы проверили, как распределены полипы по кишечнику в зависимости от генотипа мышей Как уже упоминалось, по литературным данным, большая часть полипов у мышей АРСт1п образуется в тонком кишечнике У мышей дикого типа, как и у гетерозигот по нокину гена МАРК14 имеется тенденция к накоплению полипов преимущественно в двух отделах тонкого кишечника, а именно в тощей кишке (jejunum) и подвздошной кишке (ileum), тогда как немногочисленные полипы у Ppm1tf'~ мышей распределялись более равномерно по всему тонкому кишечнику.

Кроме того, мы проверили, как размеры полипов зависят от генотипа У мышей одинакового возраста проце^ное соотношение количества полипов разных размеров мало отличается для разных генотипов, за исключением мышей Ppmhf1' возрастом 120 дней, у которых преобладают мелкие полипы (менее 2 мм диаметром). У значительно более старых мышей Ppmhf1' (средний возраст 300 дней) наблюдается рост числа больших полипов Это говорит о том, что инактивация гена Ppmld препятствует появлению новых полипов, но если процесс образования опухоли все-таки начался, то отсутствие фосфатазы Wlp1 уже не имеет критического значения для ее роста

Мы решили выяснить, на какой из процессов, важных для развития опухоли -пролиферацию или апоптоз клеток эпителия кишечника, влияет инактивация фосфатазы Wip1 Были использованы парафинизированные срезы тотального препарата кишечника мышей дикого типа и Wip1-нокаут с мутацией APCт и без нее Гистологические препараты обрабатывали как описано в материалах и методах Пролиферативный и апоптотический индексы для эпителиальных клеток у мышей всех исследованных генотипов не обнаружили сколько-нибудь существенного различия Кроме того, на препаратах, полученных из тех же мышей, мы проверили содержание и локализацию бета-катенина Как и ожидалось, количество бета-катенина в клетках мышей с мутацией АРС1" было повышено, но мы не нашли различий по этому критерию между мышами с нокаутом Ppmhf1' и с геном PPM1D дикого типа.

Чтобы попытаться выявить молекулярный механизм, лежащий в основе наблюдаемой устойчивости к полипозу, мы анализировали содержание белков, участвующих в регуляции клеточного цикла, а также ряда других, экспрессия которых регулируется бета-катенином. Анализ проводили с помощью вестерн-блоттинга лизатов кишечника мышей дикого типа и нокаутов по Wip1 в комбинации с мутацией АРС"'" и без нее, а также клеточных лизатов и ядерных экстрактов первичных дермальных фибробластов, полученных из кожи мышей с такими же генотипами.

Драматических различий в содержании проанализированных белков нам обнаружить не удалось, однако уровень содержания белка p27KIP1 - ингибитора Cdk2, был понижен в дермальных фибробластах с генотипом Ppmhf''АРС'" по сравнению с клетками

PpmltfAPC""", тогда как в клетках Ppm1cf'~ количество белка р27К|Р1 было выше, чем в дермальных фибробластах дикого типа В клетках Ppmltf1' несколько повышен уровень другого ингибитора циклин-зависимых киназ - p21w"" , та же тенденция обнаруживается и при сравнент клеток АРСт1п и Ppm1d'~APCmln, что сходно с данными для р53 Сходные результаты в отношении этих белков получены и для лизатов тканей кишечника В то же время уровень pie""" и p19ARF не различался ни в ядерных экстрактах, ни в клеточных лизатах (в тканевых лизатах обнаружить эти белки с помощью вестерн-блоттинга не удалось) Мы ожидали снижения содержания бета-катенина в клетках Ppm1df'\ поскольку известно об ускорении деградации бета-катенина при активация р53 Однако мы не обнаружили различия в содержании бета-катенина ни в ядерных экстрактах, ни в клеточных лизатах Не было зафиксировано и смижеми? содержания белков, экспрессия которых зависит от бета-катенина - с-Мус и СОХ-2, однако циклина D1 в лизатах клеток с нокаутом по гену PPM1D было меньше, чем в клетках с активной фосфатазой Wip1 (Рис 7а) В пробах же, полученных из разных отделов кишечника (jejunum, ileum и colon) были выявлены некоторые различия в содержании бета-катенина и с-Мус - в кишечнике мышей с нокаутом Ррт1сГ' уровень этих белков был несколько понижен (Рис. 76).

ядро клет лизат

Рис.7. Содержание белков - регуляторов клеточного цикла и мишеней бета-катенина в дермальных фибробластах и тканях кишечника мышей дикого типа и Ppmld1' с мутацией АРС?'" и без нее.

(а) Вестерн-блот ядерных экстрактов и клеточных лизатов, полученных из дермальных фибробластов

(б) Вестерн-блот лизатов, полученных из трех отделов кишечника (jejunum, ileum и colon) мышей дикого типа, ДРС""", Ppmlcf1' и РртК^'АРС"1"

Мы проверили также внутриклеточную локализацию бета-катенина, циклина D1 и с-

Мус в дермальных фибробластах с помощью иммунофлуоресценции Хотя в клетках с

мутацией ДРС""" наблюдалась некоторое накопление бета-катенина в ядре, существенных

различий в локализации этого белка между Ppmlcf'АРС"1" и клетками Ppmlcf'*APCmi" мы не

обнаружили, тогда как для с-Мус отмечались несколько меньшее содержание этого белка в клетках Ppmld1' и его более строгая ядерная локализация в клетках Ppm1d''APCml". Различий в количестве и локализации циклина D1 обнаружить не удалось.

Интересно отметить также, что уровень циклооксигеназы 2 (СОХ-2) - фермента, участвующего в синтезе простагландинов, в дермальных фибробластах Ppmld1' APCmm был несколько повышен по сравнению с клетками Ppm1d"*APCМожно предположить, что увеличение количество СОХ-2 в этом случае связано с повышенной активностью р38 в клетках с нокаутом по Wip1, поскольку участие р38 киназы в позитивной регуляции СОХ-2 неоднократно описано в литературе (Chun et al 2004) Несмотря на повышение экспрессии СОХ-2 в дермальных фибробластах, в тканях кишечника у мышей с нокаутом по гену Ppmld уровень содержания циклооксигеназы-2 не отличался от такового у мышей дикого типа, за исключением толстого кишечника, где мыши Ppmld1' APCmln имели более высокое содержание СОХ-2.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы показали, инактивация фосфатазы Wip1 в трансформированных МЭФ приводит к подавлению образования ими опухолей in vivo в тесте на туморогенность То, что механизм опухолевой супрессии может быть реализован через активацию р38, подтверждается сходным снижением способности к опухолеобразованию у клеток HeLa при активации МКК6 - киназы, являющейся регулятором активности р38 киназы Обнаруженный нами механизм подавления туморогенеза включает в себя активацию нескольких опухоль-супрессорных путей, по крайней мере отчасти опосредованных через p16,NK4 и p19ARF но не зависящих от р53 Эксперимент с фибробластами Ppmld1'р16 ', трансформированными онкогенами Hrasi и Мус, которые образовывали опухоли меньшего размера, чем трансформанты р1б', говорит о равном вкладе p16,NK4 и p19ARF в супрессию канцерогенеза. Подавление опухолеобразования не зависит от р53, поскольку трансформированные фибробласты Ppm1<f'p53''~ не образовывали опухоли у бестимусных мышей

В силу того, что трансформация МЭФ некоторыми онкогенами не требует активности циклина D1 и Cdk4, только повышение уровня р16 может быть недостаточно для предотвращения опухолевой трансформации, хотя в некоторых случаях, как например при экспрессии онкогенов Erbb2 или Hrasi в эпителии молочной железы мыши, увеличение содержания p16INK4, вызванное инактивацией Wip1, достаточно для защиты трансгенных мышей от рака молочной железы Однако, как и в случае нокаута по гену CCND1 (кодирующему циклин D1), накопление p16INK4 не защищает от рака молочной железы, вызванного суперэкспрессией онкогена Wnt На этом фоне особенно интересно выглядят полученные нами данные о подавлении опухолеобразования, вызванного мутацией АРС" Это говорит о способности Wipl-зависимых факторов либо подавлять активацию бета-катенинового каскада, либо какие-то нижележащие элементы этого каскада То, что супрессия туморогенеза не наблюдается при суперэкспресии Wnt в тканях молочной

железы, можно объяснить несколькими причинами Во-первых, избыток лиганда Wnt активирует не только канонический бета-катениновый путь Известен еще один, менее изученный каскад, затрагивающий кальциевый сигналинг и приводящий к активации Jun-киназы Возможно, существуют и другие, неизвестные пока пути В условиях активации нескольких митогенных путей, зависимые от Wip1 супрессорные механизмы могут оказаться просто недостаточными Вторая возможность - в тканях молочной железы регуляция транскрипции с TCF промотора, активируемая бета-катенином, может осуществляться с вовлечением дополнительных факторов, не супрессируемых при инактивации Wip1 фосфатазы, хотя известно, что мутация АРСувеличивает предрасположенность к развитию карциномы молочной железы у мышей, а бета-катенин играет большую роль как в формировании молочной железы, так и в образовании опухолей в этом органе. Однако здесь уместно заметить, что повышение экспрессии циклина D1 в тканях молочной железы при конститутивной активации бета-катенина не только не необходимо, но и ослабляет опухолегенную способность последнего, тогда как в случае рака толстого кишечника человека и полипоза у мышей циклину D1 отводят роль одного из ведущих факторов туморогенеза Судя по полученным нами данным, механизм опухолевой супрессии не затрагивает элементы каскада, связанные с деградацией бета-катенина - GSK3ß и СК1 Хотя нельзя полностью исключить участие р53 зависимого пути, можно предположить, что супрессия осуществляется за счет подавления цикпина D1 и его комплексов с киназой Cdk4 (через p16INK4).

Отсутствие Wip1, приводящее к активации р38, может влиять на активность TCF-зависимого промотора и через вовлечение транскрипционного фактора НВР1 Недавно было показано, что НВР1 - транскрипционный репрессор и ингибитор клеточного цикла, подавляет экспрессию циклина D1 и других Wnt зависимых генов за счет связывания с TCF промотором Киназа р38 способна фосфорилировать НРВ1 по серину 401, что увеличивает стабильность белка, блокируя его протеасомную деградацию Накопление НВР1 приводит к подавлению перехода G1-S.

Негативная регуляция циклина D1 может осуществляться и по TCF-независимому пути - киназа р38 способна подавлять экспрессию циклина D1 как на транскрипционном, так и на пост-транскрипционном уровнях (Lavoie et al. 1996; Casanovas et al 2000). Несмотря на то, что нам не удалось обнаружить существенных различий в количестве циклина D1 между образцами тканей кишечника мышей АРС1" с нокаутом по гену Ppmld и дикого типа, возможно, в данном случае даже небольшое изменение уровня экспрессии этого гена вносит вклад в супрессию туморогенеза. Кроме того, недавно появилось сообщение о том, что p19ARF может подавлять транскрипционную активность с-Мус по р53-независимому механизму, при этом не затрагивая его функции как транскрипционного репрессора и способность с-Мус вызывать апоптоз (Qi et al 2004) Наконец, супрессорный эффект также

может быть опосредован подавлением других позитивных регуляторов пролиферации -таких, как семейство фосфатаз Cdc25.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что активация р38 МАПК (посредством ингибирования фосфатазы Wip1) и ее влияние на регуляторы клеточного цикла, в частности, экспрессию локуса CDKN2A, может послужить основой для разработки новых методов терапии некоторых форм рака. Использование малотоксичных ингибиторов фосфатазы Wip1 позволило бы сделать лечение более избирательным и избежать серьезных побочных эффектов, вызываемых большинством применяемых противораковых препаратов, характеризующихся высокой цитотоксичностью

ВЫВОДЫ

1 Инактивация гена фосфатазы Wip1 (Ppmlcf'') подавляет способность клеток МЭФ, трансформированных комплементирующими парами онкогенов E1A+Hras1, Hras1+cMyc и Hras1+Erbb2, образовывать опухоли

2 Подавление опухолеобразования обусловлено накоплением ингибитора p16INK4, вызывающим снижение активности комплексов циклин D1/Cdk4, а также белка p19ARF

3 Активация киназы МКК6 в раковых клетках человека HeLa, приводящая к активации р38 киназы, снижает способность клеток к опухолеобразованию

4 Опухоль-супрессорный эффект при инактивации Wip1 или активации киназы р38 не зависит от р53

5 Инактивация гена фосфатазы W¡p1 {Ppmld') у мышей приводит к устойчивости к полипозу кишечника, вызванного мутацией АРС'".

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Тимофеев О В , Поспелова Т.В , Поспелов В А Функции p21W8f в норме и при стрессе Молекулярная биология 2004, 38(3), 371-385

2 Bulavin, D V, Phillips, С , Nannenga, В , Timofeev, О., Donehower, L А, Anderson, С. W, Appelle, E., and Fornace, A J, Jr. Inactivatlon of the Wip1 phosphatase inhibits mammary tumorigenesis through p38 MAPK-mediated activation of the p16(lnk4a)-p19(Arf) pathway Nat.Genet. 2004; 36(4):343-350.

3 Timofeev, О V , Ting Yi Lee, Bulavin D V A subtle change in p38 МАРК activity is sufficient to suppress in vivo tumorigenesis. Cell Cycle 2005, 4(1), 49-51.

Список использованной литературы

Brancho D , Tanaka.N , Jaeschke.A, Ventura,J J , Kelkar.N , Tanaka.Y , Kyuuma.M , Takeshita.T Flavell.RA & Davis,R J 2003 Mechanism of p38 MAP kinase activation in vivo GenesDev 17,1969-1978

Bulavin.D V, Demidov,0 N , Saito.S , Kauraniemi.P, Phillips,С , Amundson.S A, Ambrosino.C , Sauter.G Nebreda.A R , Anderson,С W, Kalliomemi.A., Fornace.A J , Jr &Appella,E 2002 Amplification of PPM1D in human tumors abrogates p53 tumor-suppressor activity Nat Genet 31,210-215

Bulavin.DV &Fornace,AJ p38 MAP kinase's emerging role as a tumor suppressor 92 2004 Advances in Cancer Research, Elsevier Publishers, (eds Klein and Vande Woude) RefType Generic

Bulavin.D V, Phillips,С , Nannenga.B , Timofeev.O , Donehower.L A, Anderson,С W, Appella.E & Fornace A J Jr 2004 Inactivation of the Wip1 phosphatase inhibits mammary tumorigenesis through p38 MAPK-mediated activation of the p16(lnk4a)-p19(Arf) pathway Nat. Genet 36,343-350

Bulavin.D V, Saito.S , Hollander,M C„ Sakaguchi.K , Anderson,С W, Appella.E & Fornace,A J., Jr 1999 Phosphorylation of human p53 by p38 kinase coordinates N-terminal phosphorylation and apoptosis in response to UV radiation EMBOJ 18,6845-6854

Casanovas.O , Miro.F , Estanyol.J M , Itarte.E , Agell.N & Bachs.O 2000 Osmotic stress regulates the stability of cyclin D1 in a p38SAPK2-dependent manner J Biol Chem 275,35091-35097

Chun,К S , Kim,S H , Song.Y S & Surh.Y J 2004 Celecoxib inhibits phorbol ester-induced expression of COX-2 and activation of AP-1 and p38 MAP kinase in mouse skin Carcinogenesis 25, 713-722

Gibson,S L, Dai,С Y , Lee.H.W, DePinho.R A, Gee,M S , Lee,W M , Furth.E E , Brensinger.C & Enders.G H 2003 Inhibition of colon tumor progression and angragenesis by the Ink4a/Arf locus Cancer Res 63,742-746

Goloudina.A Yamaguchi,H Chervyakova D В Appella E , Fomace A J Jr & Bulavin D V 2003 Regulation of human Cdc25A stability by Serine 75 phosphorylation is not sufficient to activate a S phase checkpoint Cell Cycle 2,473-478

Halberg.R В , Katzung.D S , Hoff.P D , Moser.A R , Cole,С E , Lubet,R A, Donehower.L A, Jacoby.R F & Dove.W F 2000 Tumorigenesis in the multiple intestinal neoplasia mouse redundancy of negative regulators and specificity of modifiers Prac. Natl Acad Sci U S. A 97,3461-3466.

Kim.G Y , Mercer,S E , Ewton.D Z, Yan,Z, Jin,К & Fnedman.E 2002 The stress-activated protein kinases p38 alpha and JNK1 stabilize p21(Cip1) by phosphorylation. J. Biol. Chem. Я7, 29792-29802

Lavoie.J N , L'Allemain.G , Brunei,A, Muller.R & Pouyssegur.J 1996 Cyclin D1 expression is regulated positively by the p42/p44MAPK and negatively by the p38/HOGMAPK pathway J Biol Chem 271,2060820616

Тимофеев,О В & Поспелов,В A 2003 Ингибитор циклин-зависимых киназ p21/Wafl взаимодействует in vivo с онкобелками аденовирусов Ad2 и Adl2. Цитология 45,1109-1118

Qi,Y, Gregory,М А, Li,Z , Brousal.J Р , West,К & Hann.S R 2004. p19ARF directly and differentially controls the functions of c-Myc independently of p53 Nature 431,712-717

Takekawa.M , Adachi.M., Nakahata,A., Nakayama.l., ltoh,F, Tsukuda.H , Taya.Y & Imai.K 2000 p53-inducible wipl phosphatase mediates a negative feedback regulation of p38 MAPK-p53 signaling In response to UV radiation EMBOJ 19,6517-6526

Подписано в печать ОР М. <ЯШ. формат 60x84/16. Печать офсетная. Уч. печ. л. 1,5 . Тираж 100 . Заказ 50 .

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая, 29.

п

I

Vi

i j

i I

1

i

¿-3 22t

РНБ Русский фонд

2006-4 15633

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тимофеев, Олег Владимирович

1. Введение.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования.

1.3. Основные положения, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна работы.

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

1.6. Апробация работы.

1.7. Объем и структура диссертации.

2. Обзор литературы.

2.1. Поиск новых мишеней для терапии рака.

2.2. Митоген-активируемые протеин-киназы.

2.2.1. Основные группы МАП киназ у млекопитающих.

2.2.2. МАПК р38 — структура и функции.

2.2.3. Регуляция активности МАПК р38.

2.3. Мишени МАП киназы р38.

2.4. Антипролиферативная роль МАПК р38.

2.4.1. Участие киназы р38 в регуляции прохождения 22 контрольной точки G1/S.

2.4.2. Киназа р38 и контрольная точка G2/M.

2.4.3. МАПК р38 и митотическая контрольная точка.

2.5. р38 и апоптоз.

2.6. р38 и клеточное старение.

2.7. Фосфатаза Wipl как регулятор активности МАПК р38.

3. Материалы и методы исследований.

3.1. Мыши.

3.2. Генотипирование.

3.3. Подсчет полипов и взятие проб тканей.

3.4. Оценка туморогенности.

3.5. Клеточные линии и их культивирование.

3.6. Ретровирусная инфекция.

3.7. Получение клеточной линии HeLa с индуцибельной 43 экспрессией киназы МКК6. MTS-тест.

3.8. Приготовление ядерных экстрактов.

3.9. Иммуноблоттинг, иммунопреципитация, in vitro киназная 45 проба и электрофорез.

3.10. Иммуногистохимия.

3.11. Иммунофлуоресценция.

4. Результаты.

4.1. Трансформированные эмбриональные фибробласты с 48 инактивацией фосфатазы Wipl (Ppmld'') имеют пониженную туморогенность при введении бестимусным мышам.

4.2. В эмбриональных фибробластах с инактивацией фосфатазы 50 Wipl СPpmld^ повышено содержание pl6INK4A, pl9ARF, р53 и ряда других белков, участвующих в регуляции клеточного цикла.

4.3. Снижение способности трансформантов Ppmldобразовывать 52 опухоли in vivo зависит от р16 NK4A и pl9ARF.

4.4. Активация МКК6 снижает способность клеток HeLa к 55 образованию опухолей у бестимусных мышей.

4.5. Мыши с нокаутом по гену фосфатазы Wipl устойчивы к 59 полипозу кишечника, вызванного мутацией АРС^1'".

5. Обсуждение.

6. Выводы.

7. Список опубликованных работ по теме диссертации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль киназы р38α и фосфатазы Wip1 в опухолеобразовании"

1.1. Актуальность проблемы.

Одним из важнейших направлений молекулярной и клеточной биологии является изучение механизмов канцерогенеза и поиск новых путей терапии опухолей. Идентификация перспективных молекулярных мишеней имеет большое значение для разработки новых, более эффективных методов терапии рака. Исследования последних лет показали, что киназа р38 (представитель семейства митоген-активируемых протеин-киназ - МАПК), принимает участие в важнейших клеточных процессах - пролиферации, апоптозе, старении и дифференцировке, нарушение которых является причиной опухолевой трансформации. Имеются многочисленные данные, полученные в экспериментах in vitro, указывающие на антипролиферативную и проапоптотическую роль киназы р38 (Lavoie et al. 1996; Molnar et al. 1997; Bulavin et al. 1999; Casanovas et al. 2000; Awad et al. 2000), а также некоторые свидетельства ее опухолесупрессорной активности in vivo (Bulavin et al. 2002b).

Недавно описанная фосфатаза Wipl, специфичная в отношении МАПК р38, дефосфорилирует и инактивирует эту киназу (Takekawa et al. 2000). Роль этой фосфатазы в инактивации киназы р38 in vivo и в туморогенезе недостаточно изучена. Идентификация у мыши гена PPM1D, кодирующего фосфатазу Wipl (Choi et al. 2000), и получение мышей с нокаутом по этому гену (Choi et al. 2002) сделало возможным изучение роли Wipl в туморогенезе in vivo. Инактивация гена PPM1D приводит к конститутивной активации киназы р38, что позволяет исследовать ее роль в опухолеобразовании in vivo как на клетках, так и на модельных животных - мышах.

1.2. Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в изучении роли фосфатазы Wipl и киназы р38 в регуляции клеточной пролиферации и канцерогенезе. В связи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Разработать и охарактеризовать клеточную модель для изучения роли киназы р38 в супрессии канцерогенеза.

2. Получить мышей с инактивацией киназы р38 и провести анализ их чувствительности к развитию некоторых опухолей, в частности, полипозу кишечника.

3. Получить мышей с предрасположенностью к полипозу кишечника и одновременной инактивацией Wipl для изучения влияния активации р38 каскада на развитие этой формы опухолей.

1.3. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Конститутивная активность р38 каскада, вызванная инактивацией фосфатазы Wipl или активацией киназы МККб, приводит к значительному снижению способности трансформированных клеток образовывать опухоли.

2. Способность фибробластов Wipl"7", трансформированных различными онкогенами, к образованию опухолей снижается за счет повышения уровня pl6INK4A -ингибитора активности циклин-киназных комплексов, и белка р 19ARF.

3. Подавление туморогенеза при инактивации фосфатазы Wipl не зависит от опухолевого супрессорар53.

4. Мыши с нокаутом гена PPM1D устойчивы к аденоматозному полипозу кишечника, вызванного мутацией в гене АРС (АРС"т).

1.4. Научная новизна.

Впервые установлено, что инактивация фосфатазы Wipl в трансформированных эмбриональных фибробластах мыши снижает способность клеток образовывать опухоли при пересадке бестимусным мышам.

Показано, что наблюдаемое подавление туморогенеза обусловлено повышением уровня ингибитора активности циклин-киназных комплексов pl6INK4A и белка pl9ARF, причем действие последнего не опосредовано через р53, что говорит о существовании дополнительных опухоль-супрессорных функций у pl9ARF.

Обнаружено, что активация р38 каскада в клетках HeLa с индуцибельной экспрессией киназы МКК6 незначительно влияет на пролиферацию клеток in vitro, но достаточна для опухолевой супрессии in vivo.

Впервые показано, что инактивация фосфатазы Wipl вызывает устойчивость к полипозу кишечника у мышей с мутацией АРСт.

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные данные свидетельствуют о важной роли киназы р38 в супрессии туморогенеза in vivo. Один из механизмов этого эффекта - повышение уровня белков pl6INK4A и pl9ARF за счет усиления их транскрипции. Эти факты расширяют существующие представления о функциях р38 и говорят о необходимости поиска новых мишеней р38 и регуляторных путей, в которые может быть вовлечена эта киназа. Зависимость супрессорной способности р38 от pl9ARF в отсутствие р53 подразумевает существование у белка pl9ARF дополнительных функций, не зависимых от р53. Важное практическое значение имеет выявленный в работе противоопухолевый эффект инактивации фосфатазы Wipl, которая может оказаться перспективной мишенью при терапии рака.

Отсутствие выраженного влияния активации р38 на пролиферацию и апоптоз in vitro при сильном опухоль-супрессорном действии in vivo показывает, что для скринирования противораковых средств требуется использование методов in vivo или разработка новых тестов для клеточных культур. Широко используемые сейчас методы оценивают, в основном, уровень пролиферации и апоптоза, отсеивая, таким образом, потенциально перспективные соединения, не влияющие на эти параметры.

1.6. Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано три статьи. Основные положения доложены и обсуждены на научных семинарах лаборатории Молекулярных основ дифференцировки клетки Института цитологии РАН, лаборатории Базовых исследований Национального института рака при Национальных институтах здоровья (США, Бетезда) и лаборатории Контроля клеточного цикла и туморогенеза Института молекулярной и клеточной биологии (Сингапур).

1.7. Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов и списка цитируемой литературы, содержащего 266 публикаций. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста и иллюстрирована 22 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тимофеев, Олег Владимирович

6. ВЫВОДЫ

1. Инактивация гена фосфатазы Wipl (Ppmld1') подавляет способность клеток МЭФ, трансформированных комплементирующими парами онкогенов ElA+Hrasl, Hrasl+cMyc и Hrasl+Erbb2, образовывать опухоли.

2. Подавление опухолеобразования обусловлено накоплением ингибитора pl6INK4A, вызывающим снижение активности комплексов циклин Dl/Cdk4, а также белка P19ARF.

3. Активация киназы МКК6 в раковых клетках человека HeLa, приводящая к активации р38 киназы, снижает способность клеток к опухолеобразованию.

4. Опухоль-супрессорный эффект при инактивации Wipl или активации киназы р38 не зависит отр53.

5. Инактивация гена фосфатазы Wipl (Ppmld1') у мышей приводит к устойчивости к полипозу кишечника, вызванного мутацией АРС"'".

7. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тимофеев О.В., Поспелова Т.В., Поспелов В.А. Функции p21Waf в норме и при стрессе. Молекулярная биология 2004, 38(3): 371-385.

2. Bulavin, D. V., Phillips, С., Nannenga, В., Timofeev, О., Donehower, L. A., Anderson, С. W., Appella, E., and Fornace, A. J., Jr. Inactivation of the Wipl phosphatase inhibits mammary tumorigenesis through p38 MAPK-mediated activation of the pl6(Ink4a)-pl9(Arf) pathway. Nat.Genet. 2004; 36(4):343-350.

3. Timofeev, O.V., Ting Yi Lee, Bulavin D.V. A subtle change in p38 МАРК activity is sufficient to suppress in vivo tumorigenesis. Cell Cycle 2005, 4(1), 49-51. 1 2 3 4 5

6.

7,

8,

9.

10.

11.

12.

13.

14.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тимофеев, Олег Владимирович, Санкт-Петербург

1. Aberle,H., Bauer,A., Stappert,J., Kispert,A. & Kemler,R. 1997. beta-catenin is a target for the ubiquitin-proteasome pathway. EMBOJ. 16, 3797-3804.

2. Adams,R.H., Porras,A., Alonso,G., Jones,M., Vintersten,K., Panelli,S., Valladares,A., Perez,L., Klein,R. & Nebreda,A.R. 2000. Essential role of p38alpha MAP kinase in placental but not embryonic cardiovascular development. Mol. Cell 6, 109-116.

3. Ag garwal,B.B. 2004. Nuclear factor-kappaB: the enemy within. Cancer Cell 6,203-208.

4. Alt,J. R., Cleveland,J.L., Hannink,M. & Diehl,J.A. 2000. Phosphorylation-dependent regulation of cyclin D1 nuclear export and cyclin D1-dependent cellular transformation. Genes Dev. 14,3102-3114.

5. Amanullah,A., Liebermann,D.A. & Hoffman,B. 2000. p53-independent apoptosis associated with c-Myc-mediated block in myeloid cell differentiation. Oncogene 19, 2967-2977.

6. Appella,E. & Anderson,C.W. 2001. Post-translational modifications and activation of p53 by genotoxic stresses. Eur. J. Biochem. 268, 2764-2772.

7. Awad,M.M., Enslen,H., Boylan,J.M., Davis,R.J. & Gruppuso,P.A. 2000. Growth regulation via p38 mitogen-activated protein kinase in developing liver. J. Biol. Chem. 275,38716-38721.

8. Awad,M.M. & Gruppuso,P.A. 2000a. Cell cycle control during liver development in the rat: evidence indicating a role for cyclin D1 posttranscriptional regulation. Cell Growth Differ. 11, 325-334.

9. Awad,M.M. & Gruppuso,P.A. 2000b. Cell cycle control during liver development in the rat: evidence indicating a role for cyclin D1 posttranscriptional regulation. Cell Growth Differ. 11, 325-334.

10. Behr ens,J., von Kries,J.P., Kuhl,M., Bruhn,L., Wedlich,D., Grosschedl,R. & Birchmeier,W. 1996. Functional interaction of beta-catenin with the transcription factor LEF-1. Nature 382, 638-642.

11. Borisch, В., Semac,I., SoItermann,A., PaIomba,C. & Hoessli,D.C. 2001. Anti-CD20 treatments and the lymphocyte membrane: pathology for therapy. Verh. Dtsch. Ges. Pathol. 85, 161-166.

12. Bowe, D.B., Kenney,N.J., Adereth,Y. & MarouIakou,I.G. 2002. Suppression of Neu-induced mammary tumor growth in cyclin D1 deficient mice is compensated for by cyclin E. Oncogene 21,291-298.

13. Bran cho,D., Tanaka,N., Jaeschke,A., Ventura,J.J., Kelkar,N., Tanaka,Y., Kyuuma,M., Takeshita,T., Flavell,R.A. & Davis,R.J. 2003. Mechanism of p38 MAP kinase activation in vivo. Genes Dev. 17, 1969-1978.

14. Bri ght-Thomas,R.M. & Hargest,R. 2003. APC, beta-Catenin and hTCF-4; an unholy trinity in the genesis of colorectal cancer. Eur. J. Surg. Oncol. 29, 107-117.

15. Brown,N.R., Nobl e,M.E., Lawrie,A.M., Morris,M.C., Tunnah,P., Divita,G., Johnson,L.N. & Endicott,J.A. 1999. Effects of phosphorylation of threonine 160 on cyclin-dependent kinase 2 structure and activity. J. Biol. Chem. 274, 8746-8756.

16. Bulavin,D.V., Amundso n,S.A. & Fornace,A.J. 2002a. p38 and Chkl kinases: different conductors for the G(2)/M checkpoint symphony. Curr. Opin. Genet. Dev. 12, 92-97.

17. Bulavin,D.V., Hi gashimoto,Y., Popoff,I.J., Gaarde,W.A., Basrur,V., Potapova,0., Appella,E. & Fornace,A.J., Jr. 2001. Initiation of a G2/M checkpoint after ultraviolet radiation requires p38 kinase. Nature 411, 102-107.

18. Bulavin,D.V., Saito,S., H oIIander,M.C., Sakaguchi,K., Anderson,C.W., Appella,E. & Fornace,A.J., Jr. 1999. Phosphorylation of human p53 by p38 kinase coordinates N-terminal phosphorylation and apoptosis in response to UV radiation. EMBOJ. 18, 68456854.

19. Campisi, J. 2001. Cellular senescence as a tumor-suppressor mechanism. Trends Cell Biol. 11, S27-S31.

20. Camps,M., Nichols,A. & ArkinstaIl,S. 2000. Dual specificity phosphatases: a gene family for control of MAP kinase function. FASEBJ. 14, 6-16.

21. Cangi,M.G., Cukor, В., Soung,P., Signoretti,S., Moreira,G., Jr., Ranashinge,M., Cady,B., Pagano,M. & Loda,M. 2000. Role of the Cdc25A phosphatase in human breast cancer. J. Clin. Invest 106,753-761.

22. Casanovas,0., Ja umot,M., Paules,A.B., Agell,N. & Bachs,0. 2004. P38SAPK2 phosphorylates cyclin D3 at Thr-283 and targets it for proteasomal degradation. Oncogene 23, 7537-7544.

23. Casanovas,0., Miro, F., Estanyol,J.M., Itarte,E., Agell,N. & Bachs,0. 2000. Osmotic stress regulates the stability of cyclin D1 in a p38SAPK2-dependent manner. J. Biol. Chem. 275, 35091-35097.

24. Chang, L. & Karin,M. 2001. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature 410, 37-40.

25. Cheng,M., Olivier,P., Di ehl,J.A., Fero,M., Roussel,M.F., Roberts,J.M. & Sherr,C.J. 1999. The p21(Cipl) and p27(Kipl) CDK 'inhibitors' are essential activators of cyclin D-dependent kinases in murine fibroblasts. EMBO J. 18, 1571-1583.

26. Choi, J., Appella,E. & Donehower,L.A. 2000. The structure and expression of the murine wildtype p53-induced phosphatase 1 (Wipl) gene. Genomics 64, 298-306.

27. Chun,K.S., Kim,S.H., So ng,Y.S. & Surh,Y.J. 2004. Celecoxib inhibits phorbol ester-induced expression of COX-2 and activation of AP-1 and p38 MAP kinase in mouse skin. Carcinogenesis 25, 713-722.

28. Collins,L.R., Minden,A., Karin,M. & Brown,J.H. 1996. Galphal2 stimulates c-JunNH2-terminal kinase through the small G proteins Ras and Rac. J. Biol. Chem. 271, 1734917353.

29. Cui,Y„ Kim,D.S., Park,S .H., Yoon,J.A., Kim,S.K., Kwon,S.B. & Park,K.C. 2004. Involvement of ERK AND p38 MAP kinase in AAPH-induced COX-2 expression in HaCaT cells. Chem. Phys. Lipids 129,43-52.

30. Danne nberg,A.J. & Subbaramaiah,K. 2003. Targeting cyclooxygenase-2 in human neoplasia: rationale and promise. Cancer Cell 4,431-436.

31. Datta,A., Na g,A., Pan,W., Hay,N., Gartel,A.L., Colamonici,0., Mori,Y. 8c Raychaudhuri,P. 2004. Myc-ARF (alternate reading frame) interaction inhibits the functions of Мус. J. Biol. Chem. 279, 36698-36707.

32. Datta,A., Na g,A. & Raychaudhuri,P. 2002. Differential regulation of E2F1, DPI, and the E2F1/DP1 complex by ARF. Mol. Cell Biol. 22, 8398-8408.

33. Deacon, K., Mistry,P., Chemoff,J., Blank,J.L. & Patel,R. 2003. p38 Mitogen-activated protein kinase mediates cell death and p21-activated kinase mediates cell survival during chemotherapeutic drug-induced mitotic arrest. Mol. Biol. Cell 14, 2071-2087.

34. Deak,M., Clifton ,A.D., Lucocq,L.M. & Alessi,D.R. 1998. Mitogen- and stress-activated protein kinase-1 (MSK1) is directly activated by МАРК and SAPK2/p38, and may mediate activation of CREB. EMBO J. 17,4426-4441.

35. Derijard, В., Raingeaud,J., Barrett,Т., Wu,I.H., Han,J., Ulevitch,R.J. 8c Davis,R.J. 1995b. Independent human MAP-kinase signal transduction pathways defined by MEK and MKK isoforms. Science 267, 682-685.

36. Derijard, В., Raingeaud,J., Barrett,Т., Wu,I.H., Han,J., Ulevitch,R.J. & Davis,R.J. 1995a. Independent human MAP-kinase signal transduction pathways defined by MEK and MKK isoforms. Science 267, 682-685.

37. Diehl,J.A., Cheng,M., Roussel,M.F. & She rr,C.J. 1998. Glycogen synthase kinase-3beta regulates cyclin D1 proteolysis and subcellular localization. Genes Dev. 12, 3499-3511.

38. Diehl,J.A., Zind y,F. & Sherr,C.J. 1997. Inhibition of cyclin D1 phosphorylation on threonine-286 prevents its rapid degradation via the ubiquitin-proteasome pathway. Genes Dev. 11,957-972.

39. Dietrich,W.F., Lander,E.S., Smith,J.S., Moser,A.R., Gould,K.A., Luongo,C., Borenstein,N. & Dove,W. 1993. Genetic identification of Mom-1, a major modifier locus affecting Min-induced intestinal neoplasia in the mouse. Cell 75, 631-639.

40. Dimri,G.P., Itahana,K., Acosta,M. & Campisi,J. 2000. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and pl4(ARF) tumor suppressor. Mol. Cell Biol. 20,273-285.

41. Donzelli,M. & Draetta, G.F. 2003. Regulating mammalian checkpoints through Cdc25 inactivation. EMBO Rep. 4,671-677.

42. Egan,S.E. & Weinberg,R.A. 1993. The pathway to signal achievement. Nature 365, 781783.

43. Enslen,H. & D avis,R.J. 2001. Regulation of MAP kinases by docking domains. Biol. Cell 93, 5-14.

44. Enslen,H., Raing eaud,J. & Davis,R.J. 1998. Selective activation of p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase isoforms by the MAP kinase kinases MKK3 and MKK6. J. Biol. Chem. 273, 1741-1748.54