Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ионов кальция в механизме гравирецепции у растений и в эффектах микрогравитации на клеточном уровне

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль ионов кальция в механизме гравирецепции у растений и в эффектах микрогравитации на клеточном уровне"

Національна Академія наук України Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

Білявська Нінель Олександрівна

УДК 576.3:550.312:851.43

РОЛЬ ІОНІВ КАЛЬЦІЮ В МЕХАНІЗМІ ГРАВІРЕЦЕПЦП У РОСЛИН ТА В ЕФЕКТАХ МІКРОГРАВІТАЦІЇ НА КЛІТИННОМУ РІВНІ

Спеціальність 03.00.22, - Клітинна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі клітинної біології та анатомії Інституту ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України.

Науковий консультант - доктор біологічних наук, професор

Кордюм Єлвавета Львіана, завідувач відділом клітинної біології та. анатомії Інституту ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України.

Офіційні опоненти:

• доктор біологічних наук Демків Орест Теодорович, завідувач відділом

Інституту екології Карпат НАН України;

• доктор біологічних наук Родіонова Наталія Василівна, завідувач

відділом Інституту зоології ім. І.І.Шмальгаузена НАН України;

• доктор біологічних наук Горовий Леонтій Федорович, завідувач

відділом Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН

Провідна установа: Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться “28 ” 1998 р. о годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.19.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, 252143, Київ, вул. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, вул. Заболотного,

України.

148.

Автореферат розісланий “ ¿6 ” ^ &£> е а-НА 1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук

Тарасенко Л.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Накопичені протягом останнього десятиріччя дані біологічних досліджень дозволяють розглядати іони кальцію як фундаментальнім та універсальний регулятор внутрішньоклітинного метаболізму [Berridge, 1995; Carafoli, 1987]. Завдяки своїм особливим якостям, а саме, низькій щільності заряду, слабкій гідратованості та здатності утворювати численні комплексні сполуки, іони кальцію можуть бути структуруючим елементом та видозмінювати конформацію макромолекул. Зміни у внутрішньоклітинній концентрації цього іону є вирішальним сигналом, що ініціює послідовність біохімічних реакцій у синергічному спряженні певного стимулу з відповідною реакцією в усіх типах клітин живих організмів [Bush, 1993; Kretsinger, 1990].

В організмах вищих рослин серед процесів, які опосередковуються іонами кальцію, значна увага приділяється вивченню гравітропізму, тобто, орієнтації органів рослини відносно вектора сили тяжіння. Показано, що при зміні положення рослини відносно цього вектора відбувається перерозподіл іонів кальцію як між нижньою та верхньою частинами її органів [Arslan-Cerim, 1966; Gehring et al., 1990; Moore, 1985], так і на клітинному рівні [Moore, 1986; Slocum, Roux, 1983]. Механізм участі цих іонів у послідовних етапах гравітропізму ще до кінця не з’ясовано. Так, залишається відкритим питання про шляхи передачі гравітаційного стимулу від місця його сприйняття до зони, де відбувається гравітаційний згин, недостатньо досліджено внутрішньоклітинні механізми поширення Саг+-сигналів, відсутня концепція гравірецепції за участю іонів Са2т. З’ясування таких питань необхідне не тільки для вирішення фундаментальної біологічної проблеми - ролі гравітації в еволюції живого на Землі, але й проблем, які стоять перед космічною фітобіологією.

Освоєння людством космічного простору і перспективи довгострокових міжпланетних польотів викликало потребу створення контрольованих екологічних систем життєзабезпечення членів екіпажів космічних кораблів. Як регенеранти кисню та джерело необхідних для організму людини різноманітних поживних речовин рослини є постійним компонентом таких систем життєзабезпечення. У зв’язку з цим нагальною необхідністю стало вивчення впливу факторів космічного польоту на рослинні організми. Серед завдань, що стоять перед космічною біологією, першочерговими були і залишаються дослідження впливу окремих факторів польоту, зокрема мікрогравітації, на структурно-функціональну організацію рослинної клітини. Комплексні дослідження, що проводяться вже більше 20 років в Інституті ботаніки НАН України під керівництвом проф. Є.Л.Кордюм, започаткували розвиток

космічної клітинної біології. Так, було встановлено суттєві відмінності в метаболізмі рослинної клітини в умовах змін гравітаційного навантаження, зокрема у Са2+-балансі, фізико-хімічних властивостях мембран, перекисному окисленні ліпідів та ін. [Когіїушп, 1997]. Таким чином, дослідження в галузі космічної клітинної біології сприяють вирішенню фундаментальних біологічних проблем і з'ясуванню на клітинному рівні адаптаційних можливостей організмів в умовах мікрогравітації, що закладає теоретичні основи для розробки та удосконалення контрольованих екологічних систем життєзабезпечення людини у космічному польоті.

ЗВ’ЯЗОК ДИСЕРТАЦІЙНОЇ РОБОТИ З НАУКОВИМИ ПРОГРАМАМИ. ПЛАНАМИ. ТЕМАМИ. Узагальнені в дисертаційній роботі матеріали були отримані у відповідності з планами наукових робіт відділу клітинної біології і анатомії Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України за темами:

• “Реакції рослинних клітин та їхні адаптивні можливості при зміні сили тяжіння”, 1980-1984 рр. (N8 8007149);

• “Клітинні механізми адаптації до основних факторів космічного польоту”, 19851988 рр. (№ 01.85.0 000554);

• “Сенсорно-реактивні системи рослинної клітини в процесах клітинного росту і диференціювання в умовах зміни геофізичних факторів та космічного польоту”, 1989-1991 рр. (№ 01.89.0 036499);

• “Біологія клітини в умовах мікрогравітації: методологія діагностування фізіоло-го-біохімічного та імунологічного стану біологічних систем”, 1993-1997 рр. (програма “Космобіологія” № 0193И 32386).

Мета та завдання досліджень. Метою даної роботи було з’ясування закономірностей впливу гравітації та мікрогравітації на гравісенсорні клітини і розробка уявлень про функціонування механізму гравірецепції у рослин за участю іонів кальцію на основі власних та критичного узагальнення літературних даних.

Досягнення вказаної мети забезпечувалося вирішенням таких конкретних завдань:

• вивчення дії факторів космічного польоту на гравірецепторні клітини коренів вищих рослин та на їхній кальцієвий баланс;

• визначення впливу симульованої мікрогравітації (горизонтальне кліностатуван-ня) на структуру та деякі показники кальцієвого балансу гравірецепторних клітин;

• аналіз ультраструктурних та цитохімічних змін у статоцитах, які корелюють з агравітропізмом коренів рослин внаслідок дії модифікаторів кальцієвого балансу;

• розробка методу корекції кальцієвого балансу в умовах мікрогравітації за допомогою блокагорів кальцієвих каналів;

з

• розробка теоретичних уявлень про функціонування механізму гравірецепції у

рослин за участю іонів кальцію.

Наукова новизна та практична цінність роботи. Розроблено концепцію гравірецепції у рослин, що включає Са2+ як важливий чинник у механізмі сприйняття сили тяжіння гравісенсорними клітинами вищих рослин. Вперше показано, що дія факторів космічного польоту здійснюється за участю механізмів, що призводять до перенасичення клітин вищих рослин кальцієм, модифікуючи структуру та функції мембран. З’ясовано, що моделювання умов мікрогравітації на горизонтальних клінос-татах спричинює на клітинному рівні зміни в ультраструктурі і локалізації вільного та слабо зв’язаного кальцію та Са2+-активованих АТФаз у гравісенсорних клітинах коренів. Вперше було проведено цитологічний та цитохімічний порівняльний аналіз клітин колумели в умовах впливу певних модифікаторів різних ланок Са2+-балансу. На основі вивчення дії блокаторів кальцієвих каналів на гравірецепторні клітини в умовах кліностагування запропоновано метод корекції Са2+-балансу за допомогою таких препаратів.

Результати досліджень було використано при підготовці 73-го тому серії “Проблемы космической биологии”. Отримані дані використовуються при читанні курсу з фізіології рослин на кафедрі біології природничого факультету Національного університету “Кисво-Могилянська Академія”.

Встановлені закономірності мають цінність для відпрацювання методичних заходів космічного рослинництва, включаючи використання блокаторів кальцієвих каналів, для запобігання втрат рослинного матеріалу та для відбору найстійкіших видів рослин за критерієм їхньої Са2+-чутливості.

Апробація роботи. Матеріали дисертації обговорювалися на засіданнях відділу клітинної біології і анатомії та Вченої ради Інституту ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України (Київ, 1984-1997 рр.), на Ювілейній сесії, присвяченій 75-річчю Інституту ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України (Київ, 1996), республіканських науково-технічних конференціях з електронної мікроскопії (Кишинів, 1986, 1990), 8-му та 9-му Сабінінських семінарах (Москва, 1986, 1987), симпозіумі

“Ультраструктура рослинної клітини” (Київ 1988), конференціях з анатомії та морфології рослин (Санкт-Петербург, 1984, 1997), 2-4 симпозіумах “Клітинні механізми адаптації” (Карадаг, 1985; Чернігів, 1988, 1991), 10-ій Конференції з космічної біології і авіакосмічної медицини (Москва, 1994, 1998), а також були представлені на 25-31 сесіях Міжнародного комітету з космічних досліджень (СОБРАН.), (Грац, 1984; Тулуза, 1986; Еспоо, 1988; Гаага, 1990; Вашингтон, 1992; Гамбург, 1994; Бір-

мінгем, 1996; Нагойя, 1998), 35 і 38 конгресах Міжнародної федерації астронавтики (IAF) (Лозанна, 1984; Брайтон, 1987).

Особистий внесок автора полягає у створенні концепції напрямку досліджень, постановці завдань, визначенні методів, проведенні експериментальних робіт, інтерпретації та узагальненні отриманих результатів.

Публікації результатів досліджень. Матеріали дисертації відображено у 42 публікаціях, серед яких розділ у книзі, огляд у провідному фаховому виданні світу, статті в наукових журналах і збірках, матеріалах вітчизняних та міжнародній нарад, конференцій, симпозіумів та конгресів. 15 робіт опубліковано в реферованих фахових журналах, з яких 10 написано без співавторів.

СТРУКТУРА РОБОТИ. Дисертаційна робота складається зі вступу, восьми розділів, підсумкової частини, висновків та списку цитованої літератури (905 бібліографічних посилань). Дисертацію викладено на 313 сторінках машинописного тексту, включаючи 20 таблиць, 58 рисунків та 146 електронних мікрофотографій.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Вступ містить відомості про важливість та актуальність розробки питань, що стосуються гравітропізму рослин, як частини фундаментальної проблеми стосовно ролі гравітації в еволюції живих організмів. Обгрунтовується доцільність використання для вивчення механізму гравірецепції інгібіторного підходу, за яким рослини не сприймають гравітаційний стимул внаслідок дії певних факторів хімічної або фізичної природи. Обговорюється провідна роль іонів Саг+ як вторинного месендже-ра в регуляції багатьох клітинних реакцій. Зосереджено увагу на необхідності розробки теоретичних уявлень щодо механізмів, які спричинюють розвиток гравітро-пічної реакції, оскільки це важливо також для з’ясування механізмів впливу факторів космічного польоту, насамперед мікроіравітації, на ріст та розвиток рослин.

Розділ 1. Матеріал та методи дослідження

Об’єктом дослідження були корені паростків гороху (Pisum sativum L.) двох сортів, Уладовський та Піонер. Вибір останнього зумовлено невеликими розмірами рослин, що має принципове значення для вирощування у приладах з обмеженими розмірами, які використовувалися у космічному експерименті. В умовах стаціонарного контролю набубнявіле насіння загортали у трубочки з вологого фільтру-

вального паперу та ставили у склянки (діаметр - 3 см, висота - 20 см), куди доливали по 10 мл 0,01 мМ розчину СаСЬ на дистильованій воді. Вкриті парафілмовою плівкою склянки загортали у чорний папір, створюючи затемнення. Ріст паростків відбувався протягом 5 або 7 діб при контрольованій температурі 23 ± 1°С.

Вплив модифікаторів Са2+-балансу на клітинному рівні вивчали на паростках, які росли протягом 4 діб у темряві, як і в стаціонарному контролі, а потім, зливши розчин СаСЬ, у склянки доливали на 12 годин або на одну добу (LiCl) по 10 мл розчину однієї з таких речовин: егіленглікольтетраацетат (ЕГТА, “Serva”, Німеччина), ЬаС1з(“хч”, Союзреактив, Росія), рутеній червоний (“Serva”, Німеччина), Са2+-іоно-фор А23187 ("Sigma", США), хлорпромазин (“Serva”, Німеччина), LiCl (“хч”, Союзреактив, Росія), метоксиверапаміл (D600, "Knoll", Німеччина), нікардипін ("Sigma”, США). Для визначення виливу інгібіторів на ріст та гравітропізм коренів паростки обробляли розчинами різних концентрацій протягом 5 діб, потім поміщали їх у вологу камеру в горизонтальному положенні на 3 години. В експериментах по вивченню комбінованої дії блокаторів Са2+-каналів та кліностатування розчини інгібіторів вносили у склянки за допомогою шприців за 12 годин до закінчення обертання паростків на кліностаті.

Кліностатування проводили на горизонтальних кліностатах, які оберталися зі швидкістю 2 об/хв протягом 5 або 7 діб. У кожному варіанті досліду брали по 12 рослин, з 3-кратною повторністю.

Протягом космічного експерименту на борту орбітальної станції “Салзот-6” рослини гороху с. Піонер вирощували на 1,5 % агаризованому середовищі в модифікованих умовах (середовище без мінеральних солей, темнота). Експеримент проводився у приладі “Орієнтація”, що мав три вегетаційні контейнери, в кожному з яких знаходилося по 6 насінин гороху. Набубнявіле насіння висаджували на агар за 10 годин до старту космічного корабля [Платонова и др., 1983]. Після 7-добового польоту прилад доставили на Землю, через 24 години у лабораторних умовах корені паростків фіксували у 2, 5 % розчині глутаральдегіду.

Матеріал для електронно-мікроскопічного дослідження фіксували глутаральде-гідом (2,5 %) та осмієвою кислотою (1 %), обезводнювали та заливали у суміш смол епон-аралдіт за загальноприйнятою методикою. Ультратонкі зрізи готували на ультрамікротомі LKB-III (Швеція), контрастували розчином уранілацегату та розчином цитрату свинцю. Матеріал вивчали в електронних мікроскопах JEM-100В і JEM-1200EX (“Jeol”, Японія) при напрузі 60 або 80 кВ.

Цитохімічне визначення локалізації вільного і слабко зв’язаного кальцію проводили за методом піроантимонатної преципітації (Tandler et al, 1970]. Специфічність

продукту реакції визначали за допомогою обробки ультратонких зрізів 10 мМ розчином ЕГТА на 0,1 М какодилатному буфері, pH 7,8, протягом 3-4 годин при 40°С.

Локалізацію Са2+-активованих АТФаз визначали за методом Вакштейна-Мейсель в модифікації Беліцер та співавторів [Belitser et al., 1982]. У контролях до реакції використовували такі інкубаційні середовища: 1) без АТФ або 2) з добавкою 5 мМ ортованадату натрію, інгібітора Са2+-АТФази плазмалеми. Зрізи контрастували 1 % розчином уранілацетату протягом 15 хв.

Ідентифікацію плазмалеми та її похідних проводили за допомогою специфічного фарбування фосфорновольфрамово-хромовою кислотою [Freundlich, Robards, 1974].

Для визначення складу Са2+-звязуючих центрів мембран зрізи експонували на краплях 1)10 мМ розчину ЕГТА протягом 2 год при 40°С (вміст кальцію), 2) 1% розчином фосфоліпази A ("Sigma", США) протягом 2 год при 37°С (вміст фосфолі-підів), 3) 1 % розчином протеінази К ("Sigma", США) протягом 2 год при 37°С (вміст білку).

Морфометричний аналіз проводили за методом Кисельової та співавторів (1974). Популяційну щільність органел визначали за кількістю їх профілів на випадкових зрізах 30 клітин колумели у кожному варіанті досліду. Результати кількісних вимірів обробляли стандартними статистичними методами [Лакин, 1990].

Розділ 2. Універсальна роль кальцію в регуляції клітинного метаболізму

Проаналізовано дані літератури щодо ролі іонів кальцію як вторинного месец-джера у численних процесах внутрішньоклітинного метаболізму. Зосереджено увагу на тому, що, завдяки своїм унікальним властивостям, кальцій може зв’язуватися з молекулами сполук різних класів за рахунок не тільки валентних, але і численних координаційних зв’язків. Підкреслено, що система Са2+-гомеостазу може сприймати зовнішні та внутрішньоклітинні сигнали різної природи, які виникають внаслідок дії фізичних, хімічних або біотичних факторів, далі їх реалізує через локальні підвищення внутрішньоклітинної концентрації цих іонів і може передавати такі сигнали на значні відстані. Скоординована взаємодія усіх компонентів системи підтримання Са2+-балансу, включаючи механізми активного та пасивного транспорту, антипорту і зв’язування із Са2+-залежними білками, в першу чергу, кальмодупіном, є основою регуляторної дії кальцію, що визначає його універсальну роль у метаболізмі клітини. Проаналізовано методи визначення вмісту кальцію. Зазначено, що універсальність Са2+-месенджерової функції дозволяє розглядати її як можливий компонент механізму гравірецепції у рослин.

Розділ 3. Кальцій та гравітропічна компетенція рослин

У цьому розділі проаналізовані експериментальні дані щодо участі кальцію в гравітропізмі рослин. У ряді робіт було показано існування транс-органних переміщень кальцію внаслідок гравітропічної стимуляції рослин [Arslan-Cerim, 1966; Bode, 1959; Gehring et al., 1990; Goswami, Audus, 1976; Migliaccio, Galston, 1987; Miyazaki et al., 1986; Moore et al., 1987; Roux et al., 1983]. На клітинному рівні було виявлено посилення цитохімічної реакції на кальцій на дистальних кінцях статоци-тів вже через 5 хвилин після гравістимуляції коренів кукурудзи [Moore, 1986]. Виходячи з результатів цих та інших експериментів, що стосуються ролі кальцію в гравітропізмі, зроблено висновок, що хоча природу гравітропічного сигналу ще не встановлено, проте є усі підстави вважати, що цей вторинний месенджер відіграє ключову роль у гравітропізмі рослин. Остаточне з’ясування цієї проблеми, очевидно, залежить не тільки від чіткого контролю та визначення умов проведення експериментів, але і від розвитку нових підходів. У зв’язку з цим нами визначено як адекватний та інформативний саме інгібіторний підхід, оскільки він дозволяє усувати гравітро пічну компетенцію рослин, використовуючи модулятори кальцієвого гомеостазу та інгібітори систем його підтримання, а також проводячи експерименти в умовах шкрогравітації та кліностатування.

Розділ 4. Структурно-функціональні особливості гравірецепторних клітин коренів

Систематизовано сучасні уявлення про гравірецепторні клітини, структуру та функції окремих органел, компартментів і включень у статоцитах різних органів рослини. Констатується, що статоцит будь-якого органу та виду рослин у нормі характеризується полярним розміщенням амілопластів на фізично нижньому полюсі клітини.

Проведене нами ультраструктурне вивчення статоцитів коренів гороху дозволило виявити такі їхні особливості, як відсутність чашовидного комплексу цистерн ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) на дистальному полюсі та наявність контактів оболонок седиментуючих амілопластів нижнього шару з плазмалемасомами дистального полюсу. Показано, що в процесі диференціювання статоцитів спостерігається їхнє збільшення в аксіальному напрямку, зростання чисельності й розмірів амілопластів, їхнє осідання на фізично нижчу сторону клітини, зменшення щільності рибосом, зменшення розміру ядерця, потовщення та ущільнення клітинної оболонки, збільшення популяції мітохондрій, диктіосом і мікрогілець (табл.1).

Таблиця І

Популяційна щільність органел у статоцитах коренів гороху на стадиях развитку

Тип клітин 4-Органели Кількість органел на зрізі клітини (популяційна щільність по відношенню до амілопластів)

Амілопласти Мітохондрії Диктіосоми Мікротільця

Статоцити, що дифе- 4,9 ± 0,1 14,4 ± 1,1 1,1 +0,1 1,0 ±0,1

ренціюються (1) (3). (0,4) . (0,2)

Функціонуючі 7,4 ±0,4 42,8 ± 3,8 6,8 ±0,5 2,4 ±0,2

статоцити . ....01 (б) (0.3) ...

За допомогою електронно-цитохімічного методу показано, що вільний і слабко зв’язаний кальцій локалізується у статоцитах гороху в стромі, внутрішній мембранній системі і в оболонці амілопластів. У ядрах преципітат реакції виявлявся в нуклео-плазмі та на ядерцях. Поодинокі гранули піроантимонату кальцію маркували ЕР та мітохондрії. У клітинній оболонці статоцитів преципітат реакції був неоднорідним за формою і розміром. У гіалоплазмі клітин гранули осаду не зустрічалися.

У статоцитах коренів гороху стаціонарного контролю продукт цитохімічної реакції, що виявляє Са2*-активовані АТФази, спостерігався на плазмалемі. Скупчення гранул преципітату інтенсивно маркували плазмодесми та гаїазмалемасоми. У ядрах гранули осаду виявлено як на хроматині, так і на компонентах ядерця. У конт-ролях до цитохімічної реакції (без АТФ або в присутності 5 мМ ванадату натрію) преципітат не зустрічався на мембранних структурах, проте він маркував хроматин та ядерця, що може свідчити про неспецифічну реакцію ядерних структур, що містять надлишок фосфатів, які вступають у реакцію з іонами свинцю. Наведені дані були основою для подальшого вивчення впливу умов, за яких пригнічується граві-тропізм, на ультраструктуру та цитохімічні особливості клітин колумели коренів.

Розділ 5. Ультраструктура та стан кальцієвого балансу у статоцитах під дією модифікаторів кальцієвого гомеостазу

Ми виходили з концепції, що гравітаційний стимул ініціює виникнення і передачу Са2+-сигнала у статоцитах. Модифікація або інгібування систем підтримання Са2+-гомеосгазу за допомогою специфічних хімічних речовин повинні були викликати пригнічення гравітропічної реакції дослідних рослин, що і було доведено нашими експериментами. Концентрації розчинів модифікаторів було підібрано за таким принципом, щоб вони суттєво не впливали на ріст та розвиток паростків і в той же час зберігали інгібуючий ефект на гравітропізм.

5.1.ЕГТА. Етіленгліколь-(Р-аміноефір)Лг,Лг,Лг;Лг-тетраацетат, сполука із ряду полі-глікольполіоцтових кислот, так званих комплексонів, являє собою чотирьохосновну кислоту, найважливішою ознакою якої є її здатність утворювати стійкі водорозчинні комплексні сполуки з двохвалентними металами, особливо з іонами Са2\ Завдяки своєму зарядові, розміру та гідрофільності, ЕГТА-Са2+-хелат не проникає через плазмалему у клітини і знижує концентрацію позаклітинного кальцію [Robertson, Potter, 1984]. Нами показано, що концентрація ЕГТА 10*5 М найменше впливає на ріст коренів гороху, проте інгібує гравітропізм.

Електронно-мікроскопічні дослідження клітин колумели коренів гороху після 12-годинної обробки 10'5М ЕГТА виявили такі зміни в ультраструктурі клітин, як хаотичний розкид амілопластів по усьому об’єму клітини, вакуолізація клітин (1/3-1/2 частина від об’єму клітини), надмірна везикуляція трансполюсних цистерн диктіосом. Вивчення матеріалу з піроантимонатною реакцією в клітинах колумели показало значне зменшення загальної кількості продукту реакції, який виявлявся у стромі амілопластів, нуклеоплазмі та на периферії ядерця, у мітохондріях, вакуолях, диктіосомах, цистернах ЕР, периплазмі та в невеликій кількості у клітинній оболонці і іноді у гіалоплазмі. Продукт цитохімічної реакції, що ідентифікує локалізацію Са2+-активованкх АТФаз, виявлено на плазмалемі, плазмодесмах, кристах міто-хондрій, компактному хроматині та компонентах ядерець.

5.2. Солі лантану. Іон лантану розглядається як антагоніст екстраклітинного кальцію, завдяки більшій щільності його заряду та більшій кількості координаційних зв’язків, ніж у кальцію; має значення також те, що заміщення кальцію лантаном супроводжується зменшенням довжини зв’язку та збільшенням координаційного числа (Martin, Richardson, 1979]. Вважається, що лантан конкурентно витісняє кальцій з поверхневих Саг+-зв’язуючих центрів і міцно зв’язує їх [Abe, Takeda, 1988], а також ефективно взаємодіє з центром зв’язування в середині Са2+-каналу [Sanguinetti, Jurkiewicz, 1990].

У результаті дії ІО5 М LaCh .протягом 12 год у клітинах колумели коренів спостерігалися такі зміни на ультраструктурному рівні: 1) амілопласти розташовувалися навколо ядра, яке займало, як правило, центральне положення; 2) вакуом займав значний об’єм клітини (до 50 %); 3) зростала чисельність органел апарату Го-льджі; 4) з’являлися електронно-щільні включення гранулярної форми в клітинній оболонці та в периплазмі.

При вивченні матеріалу з піроантимонатною реакцією встановлено, що її преципітат був присутній в усіх компартментах клітин коренів, оброблених LaCb. У ядрі осад маркував нуклеоплазму та компоненти ядерець, в амілопластах - строму, в мі-

тохондріях - матрикс, у диктіосомах - зрідка у везикулах Гольджі та в середині цистерн, як і в ЕР. У вакуолях преципітат виявлено як на тонопласті, так і в середині органел. Великого розміру осад спостерігався на клітинній оболонці; не виключено, що такі відкладення являють собою конгломерати солей, в складі яких, крім солей лантану, присутній піроантимонат кальцію. Осад різного розміру виявлявся в гіалоплазмі клітин колумели. Са2+-АТФазну реакцію в клітинах колумели рослин, оброблених LaCb, виявлено на шіазмалемі, тонопласті, компактному хроматині та ядерцях.

Беручи до уваги дані щодо вивільнення із диктіосом значної кількості кальцію під дією лантану, які отримано на клітинах тварин [Zha et al., 1995], можна припустити, що ці іони, проникаючи у клітини рослин, також можуть викликати зростання внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію за рахунок цього депо.

5.3. Рутеній червоний. Ця речовина являє собою комплексний аміачний хлорид рутенію. Взаємодіючи з від’ємно зарядженими групами білків, рутеній червоний посилює їхню електронну щільність [Khan et al., 1990].

Електронно-мікроскопічне дослідження клітин колумели коренів гороху, які експонувалися протягом 12 год у розчині і О’5 М рутенію червоного, виявило втрату полярності розташування амілопластів на дистальному полюсі, значну вакуоліза-цію клітин, посилену везикуляцію диктіосом, потоншення клітинної оболонки.

Кальцій, ідентифікований за допомогою піроантимонатної реакції, спостерігався в усіх компартментах клітини в помірній кількості: в нуклеоплазмі та на обох компонентах ядерець, у мітохондріях, у сіромі та на периферії крохмальних зерен амілопластів, на тонопласті вакуолей, у диктіосомах та каналах ЕР гранулярного типу. Зовні клітин преципітат виявлявся на периферії клітинної оболонки і у перипла-змі. Осад піроантимонату кальцію в невеликій кількості був присутній у гіалоплазмі клітин. Преципітат реакції на Са2+-АТФазу було виявлено на шіазмалемі, плазмодесмах, компактному хроматині та ядерцях клітин.

5.4. Са2*-іонофоп А23187. Карбоксильний кислий антибіотик А23187 (кальцімецін), який вперше був одержаний з Streptomyces chartre, широко використовується у біологічних дослідженнях завдяки своїй здібності утворювати стабільні комплекси з двохвалентними катіонами та транспортувати їх через біологічні мембрани, підвищуючи таким чином внутрішньоклітинну концентрацію Са2+.

При дії 10 мМ іонофору протягом 12 год на паростки гороху виявлено такі порушення ультраструктури клітин колумели: перерозподіл амілопластів, які гуртувалися в основному навколо ядер; видовження клітин колумели; значна вакуоліза-

ція, що досягала 1/3 об’єму клітини; розширення периплазми; гіпертрофія везикул Гольджі; потоншення клітинної оболонки.

Аналіз розподілу іонізованого кальцію в клітинах колумели під дією А23187 показав високу інтенсивність цитохімічної реакції. Преципітат у великій кількості спостерігався у гіалоплазмі, на шіазмалемі, у матриксі мітохондрій, у цистернах ЕР, диктіосом та везикулах Гольджі, у стромі і в оболонці амілопластів, у клітинній оболонці і в периплазмі, у иуклеоплазмі ядер і на компонентах ядерець. Локалізацію Са2+-АТФаз у клітинах колумели коренів, оброблених іонофором, виявлено на шіазмалемі, хроматині ядер та ядерцевих компонентах, на кристах частини мітохондрій.

5.5. Хлорпромазин. Антагоніст Са2+-зв’язуючого білку кальмодуліну — хлорпрома-зин — відноситься до групи амфіпатичних хімічних сполук фенотиазинів, які зв’язуються з кальмодулінами із різних джерел, особливо в присутності Са2+. Таке зв’язування змінює конформацію кальмодуліну та інгібує його активацію ефектор-них ферментів [Roufogalis, 1982].

Для з’ясування на клітинному рівні ролі кальмодуліна у гравічутливості рослин нами вивчався вплив 12-годинної обробки 10 мМ хлорпромазину. Показано, що амілопласти розсіювалися по усьому об’єму клітин колумели; вакуолярний ком-партмент займав біля третини об’єму клітини, у деяких вакуолях виявлено електронно-щільні утворення; спостерігалися розширення цистерн ЕР та перинуклеар-ного простору; зменшувався об’єм крохмалю в амілопластах; зростала щільність гіалоплазми.

Виявлено локалізацію піроантимонату кальцію у стромі та в периферичному ре-тикулумі амілопластів, у вакуолях, диктіосомах, ЕР, периплазмі та клітинній оболонці. У мітохондріях виявлено гетерогенність реакції окремих органел: від повної відсутності до 10 і більше гранул на зрізі органели. В ядрі преципітатом реакції маркувалися фібрилярний компонент ядерця, ядерцевий організатор та нуклеопла-зма. У гіалоплазмі відмічена присутність дифузного піроантимонатного осаду.

Са2+АТФазну активність спостерігали у вигляді осаду фосфату свинцю на плаз-малемі, хроматині і ядерцях клітин колумели коренів гороху, оброблених хлопро-мазином; гетерогенну реакцію виявлено у мітохондріях.

5.6. Блокатори кальиієвих каналів. У лабораторних дослідженнях вживаються такі блокатори кальцієвих каналів, як похідні фенілалкіламіну (верапаміл і галопаміл, D600) і 1,4-дигідропіридину (ніфедипін, нікардипін та інші.). Вони інгібують активність потенціал-залежних Са2+-каналів за рахунок зв’язування на центрах, які знаходяться в середині мембрани, ближче до її зовнішньої поверхні [Bangalore et аі., 1994].

Вивчення статоцитів коренів гороху, оброблених блокаторами Са-каналів D600 і нікардипіном, виявило хакі морфологічні відмінності від клітин колумели коренів стаціонарного контролю, як втрата полярності та значна вакуолізація. Ультраструктура окремих органел практично не змінювалася у порівнянні з контролем. Встановлено присутність тісних контактів між зовнішніми мембранами оболонок амілопластів і мітохондрій після обробки D6Q0, а також посилену продукцію везикул Гольджі після обробки нікардипіном.

Проведене цитохімічне дослідження локалізації вільного і слабко зв’язаного кальцію в статоцитах коренів гороху, що експонувалися в розчинах кожного із блокаторів протягом 12 год, показало присутність продукту реакції у більшості органел. В гіалоплазмі виявлено лише невелику кількість гранул піроантимона-ту кальцію, зокрема після обробки нікардипіном ця кількість була мінімальною, натомість у клітинній оболонці - вище, ніж у варіанті з галопамілом. Встановлено, що після обробки D600 преципітат реакції специфічно локалізувався в основному на фібрнлярному компоненті ядерець на відміну від варіанту з нікардипіном та контролем, де осад рівномірно маркував усе адерце.

При дії галопамілу преципітат реакції на Са2+-АТФазу інтенсивно маркував плазмалему, хроматин та ядерця. В деяких випадках гранули фосфату свинцю спостерігали на кристах мітохондрій. Ці дані співпадають з результатами біохімічного дослідження Са2+-АТФазної активності плазмалеми колеоптилів кукурудзи, оброблених верапамілом (Маркова и др. 1995). При обробці нікардипіном преципітатом маркувалась не тільки плазматична мембрана, але й периферичний шіастидний ретикулум амілопластів, а також хроматин і компоненти ядерець. Нами відмічалося, що інтенсивність реакції плазмалеми значно поступалася такій у варіанті з галопамілом. Не виключено, що похідні дигідропіридину. накопичуючись у мембранах та взаємодіючи з мембранними білками, змінюють характер білок-білкових та білок-ліпідних зв’язків і тим самим спричинюють неспецифічний вплив на молекули Са2+-АТФаз [Spedding, 1985]..

5.7. Солі літію. Вони використовуються як інгібітор одного з етапів фосфоінозито-льного циклу, а саме, дефосфорилювання інозитол-1-фосфату за допомогою ферменту інозитолмонофосфатази [Gillaspy et al., 1995].

Добова обробка коренів гороху 5 мМ розчином хлориду літію на клітинному рівні викликала зміни в просторовому розташуванні амілопластів, що свідчило про втрату полярності статоцитами. Амілопласти виявляли тенденцію збиратися у групи. Мітохондрії мали конденсовану конфігурацію, для якої були характерні віднос-

но щільний матрикс та розширені крисги, що свідчить про стан активної продукції АТФ [Ченцов, 1984]. Вакуолі займали до 50% об’єму клітини.

Інтенсивність цитохімічної реакції на вільний і слабко зв’язаний кальцій була помірною. Са2+-піроантимонатні гранули виявлено у багатьох органелах, однак найбільша їхня кількість була присутня у ядрі, мітохондріях, амілопластах, перип-лазмі й вакуолях. Обмежена кількість осаду знаходилася у гіалоплазмі клітин.

Вивчення локалізації Са2+-АТФаз у клітинах колумели, оброблених хлоридом літію, показало відсутність відмінностей від стаціонарного контролю, тобто, преципітат маркував плазмалему, хроматин та ядерця.

Таким чином, отримані нами дані щодо впливу модифікаторів кальцієвого балансу на ультраструктуру статоцитів показали, що ці клітини втрачають притаманну їм у стаціонарному контролі полярність, а також у них з’являється добре розвинутий вакуолярний компартмент, який займає значну частину клітини. При вивченні дії вказаних речовин на локалізацію вільного і слабко зв’язаного кальцію нами виявлено різного ступеня порушення, які стосуються, перш за все, появи продукту цитохімічної реакції в гіалоплазмі клітин; згідно інтенсивності піроантимо-натної реакції в клітинах колумели модифікатори, які використовувалися у дослідженнях, можна розташувати у такий ряд:

А23187 » LaCbs хлорпромазин = рутеній червоний >LiCl = D600 > ткарднпін = ЕГТА

Активність системи відкачки іонів кальцію на плазмалемі практично не зазнавала суттєвих змін (за виключенням варіанту з нікардипіном) в умовах проведення експериментів, що використовувалися нами. Констатується, що зміни в ультраструктурних і цитохімічних характеристиках статоцитів, які виявляються внаслідок дії модифікаторів Са2+-гомеостазу і корелюють з агравітропізмом коренів вищих рослин, є незаперечним доказом того, що іони кальцію відіграють важливу роль у механізмах, які відповідають за гравітропічну функцію вищих рослин.

Розділ 6, Ультраструктура та стан кальцієвого балансу в статоцитах під дією космічного польоту та кліностатування

На Землі неможливо створити умови, за яких не діяла б сила тяжіння. Цей факт підкреслює важливість експериментів, які проводяться на борту космічних апаратів як контролі до наземних гравітаційних експериментів. Часткове відтворення ефектів мікрогравігації на Землі досягається за допомогою горизонтальних кліностатів, постійне обертання яких не дозволяє рослині сприйняти гравітаційний стимул та відповісти на нього.

6.1. Космічний політ. У космічному експерименті, що проводився протягом 7 діб на орбітальній станції “Салют-6” в приборі “Орієнтація”, середня довжина коренів паростків гороху с. Піонер досягала 65 мм і висота стебла - 85 мм, тоді як у стаціонарному контролі ці значення становили відповідно 52 мм і 40 мм [Платонова и др., 1983], що свідчило про стимуляцію у цьому експерименті росту паростків, особливо їх надземної частини.

Таблиця 2

Вплив умов космічного польоту на розміри клітин колумели, основних органел та їх

популяційні щільності

Умови проведення досліду Параметр 4 Стаціонарний контроль Космічний політ

І тип II тип

Довжина сггатоцитів (мкм) 25,34+ 1,81 17,61 ± 0,85 (0,999) 20,12 ± 1,59 (0,95)

Ширина статоцитів (мкм) 14,88 ±0,22 12,92 ±0,82 (0,95) 14,37 ± 1,49

Кількість амілопластів/ профіль клітини 7,41+0,46 6,58 ± 0,48 6,30 ± 0,49

Довжина амілопласту (мкм) 2,77 + 0,08 2,65 + 0,15 2,78 + 0,16

Ширина амілопласту (мкм) 2,15 + 0,06 2,12 ±0,14 2,27 ±0,11

Кількість мітохондрій/ профіль клітини 42,83 + 3,82 29,16 ±2,01 (0,999) 34,86 ± 3,22 (0,999)

Довжина мітохондрії (мкм) 0,62 ±0,01 0,60 ± 0,05 0,60 ± 0,03

Ширина мітохондрії (мкм) 0,55 ±0,08 0,42 ± 0,03 0,42 ±0,01

Кількість диктіосом/ профіль клітини 6,83 + 0,46 6,50 + 0,26 5,41 ±0,18 (0,999)

Кількість мікротілець/ профіль клітини 2,41 ± 0,20 4,01 ±0,16 (0,999) 4,01 ±0,18 (0,999)

Примітка: в дужках вказано рівень достовірності різниці у порівнянні з контролем

У зв’язку з високим ступенем гетерогенності клітинних реакцій нами було виділено три типи ультраструктурних змін у клітинах колумели коренів гороху, що зазнали впливу факторів космічного польоту. Перший тип характеризувався відносно невеликими розмірами клітин (табл. 2), особливою ознакою яких була заокругленість їхньої форми. Амілопласти, як і ядра, не мали певної локалізації. Відмічено незначне зменшення кількості амілопластів, об’єму, що зайнято крохмалем (до 56 % в порівнянні з 76 % у стаціонарному контролі), редукцію внутрішньої мембранної системи, зменшення кількості і розмірів пластоглобул. Крім того, мали місце злипання оболонок сусідніх амілопластів та формування масивних конгломератів; у місцях контактів оболонок амілопластів виявлено глобулярні утворення, які спо-

стерігапися і на мембранах інших органел. Зустрічалися численні розриви оболонок пластид.

Відмічено значну вакуолізацію клітин ко ігумени. У ядрах виявлено генералізова-ну конденсацію хроматину; ядерця містили переважно гранулярний компонент. Нечисленну популяцію мітохондрій представлено органелами конденсованої конфігурації з щільним матриксом та вузькими кристами; у деяких випадках на зовнішніх мембранах виявлено електронно-щільні глобули. Збільшувалась порівняно із стаціонарним контролем кількість мікротілець на зріз клітини (див. табл. 2), на мембранах яких також відмічено присутність таких глобул. Дані щодо інтенсивності маркування мембран органел глобулами (Са2+-зв’язуючими центрами мембран) представлено у табл. 3.

Таблиця З

Локалізація Саг+-зв’язуючих центрів мембран в умовах космічного польоту

Клітинні структури Тип реакції

І II III

Плазмалема ± +++

Ядерна оболонка ± +++ +++

Оболонка пластиди + +++

Оболонка мітоховдрії + - +++

Ендоплазматичний ретикулум - +++ +++

Тонопласт вакуолей - - +++

Примітка: Кількість (+) відповідає інтенсивності маркування елекіроннощільними глобулами, (-) — їх відсутності на мембранах, (±)—присутності у деяких структурах Для даного типу змін було характерним потоншення клітинної оболонки, очевидно, за рахунок пригнічення синтезу целюлози [Месіакім, 1996]. У цьому матеріалі також були відсутні профілі мікротрубочок, які приймають участь у транспорті везикул Гольджі з матеріалом для синтезу геміцелюлоз Зіаеіієііп, 1991]. Осо-

бливою ознакою клітин була присутність відокремлених зон гіалоплазми, що займали значну частину об’єму клітини і включали тонку сітку з дрібними везикулами, на якій розташовувалися численні рибосоми. Органели, в основному пухирці Гольджі або канали ЕР, спостерігалися по периферії таких зон.

Для другого типу змін також була характерною втрата полярності розташування амілопластів і зниження в них вмісту крохмалю у порівнянні з контролем. Особливою ознакою цих клітин була присутність численних електронно-щільних глобул, які маркували різні мембранні елементи клітин (див. табл. 3). За допомогою обробок зрізів клітин розчинами ЕГТА, фосфоліпази та протеінази доведено, що такі

глобули є Са2+-зв’язуючими центрами мембран, які містять іони Са2+, Са2+-зв’язуючі білки та фосфоліпіди.

Найбільш вражаючі зміни ультраструктури клітин колумели були притаманні третьому типу. Відмічено відсутність плазмалеми, диктіосом, мікротілець, порушення інтактності амілопластів та ядер, в останніх виявлено компактизацію хроматину та дезінтеграцію структури ядерець. Спостерігалось потоншення клітинної оболонки та незначна вакуолізація клітин. Найменше пошкоджень виявили у мітохондріях, які мали електрошю-щільний матрикс, вузькі нечисленні кристи і щільні мембрани оболонок; виявлено випадки злипання сусідніх органеяі у конгломерати. Характерною ознакою цих клітин було перенасичення усіх мембранних структур Са2+-зв’язуючими центрами мембран (див. табл. 3). Представлені дані свідчать про деструкцію клітин, очевидно, внаслідок неконтрольованого проникнення іонів Са2+, що підтверджено наявністю великої кількості Са2+-зв’язуючих центрів на мембранах.

Таким чином, за модифікованих умов у даному космічному польоті для усіх типів клітинних змін загальною рисою була залежність від акумуляції Са2+ у вигляді Са2+-зв’язуючих центрів мембран, кількість яких збільшувалося від першого до третього типу.

6.2. Горизонтальне кліностатуванпя. Постійне обертання рослини, розташованої паралельно осі горизонтального кліностату, позбавляє ЇЇ спроможності реагувати на гравістимуляцію. Обертання рослин гороху протягом 5 діб на горизонтальних кліностатах суттєво не впливало на ростові показники паростків, відмічено лише тенденцію до вкороченім коренів.

Вивчення ультраструктури клітин колумели паростків гороху, що оберталися на кліностаті (2 об/хв), показало, що головною відмінністю від стаціонарного контролю була відсутність полярності розташування амілопластів, які не виявляли певної локалізації. Кількість амілопластів на зріз клітини та їхні розміри (1,7x2,5 мкм), зменшувалися порівняно до стаціонарного контролю (табл. 4). Відносний об’єм крохмалю також знижувався до 64 % в порівнянні з 76 % у контролі. Іншою відмінною ознакою рослинних клітин, які оберталися на кліностаті, була значна вакуолізація. У цих клітинах спостерігалося об’єднання цистерн ЕР гранулярного типу в групи, які містили тісно наближені одна до одної короткі трубочки та везикули. За своєю структурою вони нагадували формування, які спостерігалися у клітинах колумели коренів кукурудзи, що виросли в умовах космічного польоту [Moore et al., 1987]. Мітохондрії, які зустрічалися значно рідше, ніж у контролі (табл. 4), мали ортодоксальну конфігурацію, лише у деяких органелах виявлялися зони лізису або

фібрилярні включення. Спостерігалися деякі відмінності в будові диктіосом, відмічено потоншення клітинних оболонок і збільшення популяції мікротілець (табл. 4).

Таблиця 4

Популяційна щільність оргаиел у статоцитах коренів гороху в умовах горизонтального кліностатуваїшя

Умови проведения досліду 4-Органели -» Кількість оргаиел на зріз клітини

Амілопласти Мітохондрії Диктіосоми Мікротільця

Стаціонарний контроль 7,4 ±0,4 42,8 + 3,8 6,8 ±0,5 2,4 ± 0,2

Г оризонтальне кліностатування 6,4 ± 0,4 (0,999) 24,5 + 2,1 (0,999) 6,0 ±0,4 3,5 ± 0,2 (0,999)

Примітка: в дужках вказано рівень достовірності різниці у порівнянні з контролем

Аналіз цитохімічних даних щодо локалізації вільного та слабко зв’язаного Са2+ показав, що продукт реакції, як правило, інтенсивно маркував клітинні органели, гіалоплазму та клітинну оболонку статоцитів. Відмічено гетерогенність в інтенсивності реакції у різних органелах.

Вивчаючи локалізацію Са2+-АТФазної активності ми встановили, що притаманна клітинам контрольного варіанту активність ферменту на плазмалемі у кліноста-тованих клітин суттєво пригноблюється, натомість продукт цитохімічної реакції виявлено на цистернах ЕР, мембранах ядерної оболонки, периферійного ретикулу-му амілопластів, цистерн диктіосом та везикул Гольджі, тоношіасті вакуолей.

6.3. Горизонтальне кліностатування в присутності блокаторів Са2*-каналів. Аналіз даних електронно-мікроскопічного дослідження показав, що в клітинах колумели паростків гороху, що росли на горизонтальному кліностаті в присутності галопа-мілу або нікардипіну, амілопласти були розсіяні по всій клітині. Кількість амілопластів була близькою до такої у стаціонарному контролі, однак їхні розміри та відносний об’єм крохмалю в них зменшувалися. Для клітин колумели з коренів обох варіантів було характерним утворення великих вакуолей, що займали значну частину клітини. При кліностатуванні в присутності нікардипіну відмічено видовження мітохондрій, більша частина яких мала ортодоксальну конфігурацію, лише іноді зустрічалися органели з розширеними кристами. Зростала відносна та абсолютна популяційна щільність мікротілець, зменшувалася товщина клітинних оболонок.

При комбінованій дії на паростки гороху кліностатування та 0600 продукт реакції на вільний та слабко зв’язаний кальцій у вигляді великих гранул виявлено в

клітинній оболонці, вакуолях та нуклеоплазмі ядер. Нечисленні середнього розміру гранули осаду маркували інтрамітохондріальний простір оболонок мітохон-дрій, зовнішню поверхню крохмальних зерен амілопластів і дуже рідко гіалоплазму клітин колумели. В умовах одночасної дії кліностатування та нікардипіну інтенсивна цитохімічна реакція спостерігалася в клітинній оболонці і в вакуолях, тоді як середнього розміру поодинокі гранули виявлено в периферичному рети-кулумі амілопластів, кристах мітохоццрій та в цистернах диктіосом, а також зрідка в гіалоплазмі цих клітин.

При сумісній дії на паростки кліностатування та Б600 продукт Са2+-АТФазної реакції в статоцитах розподілявся таким же чином, як і у контролі: преципітат інтенсивно маркував плазмалему, хроматин та ядерця; зрідка окремі гранули фосфату свинцю спостерігалися в ЕР гранулярного типу.

Реакція на Са2+-АТФазу в статоцитах при сумісній дії на паростки кліностату-вання і нікардипіну мала дещо інший характер. У цьому випадку преципітатом слабко маркувалися не тільки плазмалема, але й численні цистерни ЕР гранулярного і агранулярного типів, периферичний пластидний ретикулум амілопластів, кристи мітохондрій, цистерни та везикули деяких диктіосом, тоношіаст вакуолей, а також хроматин і компоненти ядерець. При цьому інтенсивність реакції гогазма-леми значно поступалася такій при дії 0600 і кліностатування.

Таким чином, результати електронно-мікроскопічного та електронно-цитохімічного дослідження клітин колумели кореневого чохлику рослин гороху, що експонувалися в умовах космічного польоту та горизонтального кліностатування, переконливо свідчать про те, що в статоцитах відбуваються структурно-функціональні перебудови, які, в першу чергу, пов’язані зі змінами Са2+-балансу і спрямовані на підвищення рівню цього іону у гравірецепторних клітинах. Методичним підходом, який коригує Са2+-балакс у клітинах рослин в умовах дії факторів космічного польоту, є використання блокаторів Са2+-каналів у поживних середовищах для вирощування рослинних компонентів автотрофної ланки контрольованих екологічних систем життєзабезпечення космонавтів.

Розділ 7. Агравітропізм на клітинному рівні, що індукується фізичними і хімічними факторами, та кальцій

Проведений нами аналіз ультраструктури статоцитів коренів гороху, які вирощувалися в умовах космічного польоту та кліностатування, показав що існують як загальні риси структурних перебудов різних клітинних органел при дії обох факторів, так і деякі відмінності (табл. 5).

Таблиця 5

Деякі показники органел статоцитів коренів гороху в умовах космічного польоту та кліноетатування у порівнянні з стаціонарним контролем

Оргаиелла/ показник Космічний політ Кліноетатування

Амілопласти топографія популяційна щільність вміст крохмалю строма периферичний ретику-лум Хаотичний розподіл Зменшення Зменшення Просвітлення Редукція Хаотичний розподіл Зменшення Зменшення Без змін Без змін

Ядро конденсований хроматин ядерце Генерализована конденсація Переважання вмісту гранулярного компонента Без змін Без змін

Вакуом популяційна щільність Значне збільшення Значне збільшення

Мітохондрії структура популяційна щільність Конденсована конфігурація Зменшення Без змін Зменшення

Диктіосоми популяційна щільність Зменшення Несуттєве зменшення

Плазмалема структура Са2+-зв’язуючі центри мембран Відсутність інвагінацій Присутність на всіх мембранних структурах Відсутність інвагінацій Утворення тільки в присутності екзогенного Са2+

Ендоплазматичний ретикулум топографія Без змін Утворення кластерів

Клітинна оболонка поперечний розмір Зменшення Зменшення

Мікротільця популяційна щільність Збільшення Збільшення

Ліпідні глобули популяційна щільність Збільшення Збільшення

Представлені у таблиці 5 дані свідчать про те, що в умовах космічного польоту в структурі статоцитів відбувається ширший спектр перебудов окремих органел, ніж при кліностатуванні. Проте ми можемо констатувати, що обертання рослин на го-

ризонтальному кліностаті дозволяє моделювати основні ефекти мікрогравітації на клітинному рівні.

Наші спостереження відносно появи Са2+-зв’язуючих центрів мембран в умовах космічного польоту свідчать про підвищення рівня Са2+ в гіалоплазмі. Припускається, що джерелом Са2+ були агарове середовище, клітинні оболонки та внутрішньоклітинні Саг+-депо. Вихід Са2* у гіалоплазму, можливо, відбувався внаслідок порушень у структурі мембран. Зважаючи на сучасні уявлення про Са2+-індуковані фазові переходи ліпідів від двошарової до інвертованої міцелярної конфігурації, або гексагональної Нн-фази [БесісЗоп, 1990], можна припустити вірогідність цього механізму втрати мембранного бар’єру проникності в такій ситуації. Перебудови в структурі мембран могли призвести до виходу Са2+ у гіалоплазму і підвищення його рівня, що спричинило активацію ряду протеолітичних ферментів [ЗЬіЬавакі, МсКІеоп, 1995], посилення інтенсивності перекисного окислення ліпідів [Жадько, 1994], зниження текучості мембранних ліпідів внаслідок зв’язування їхніх ліпідних груп [Полулях, 1994]. У сферу таких порушень потрапляли як мембрани органел, так і плазматична мембрана, що й було причиною ряду деструкційних перетворень.

Наші дані щодо підвищення рівня Са2+ в умовах космічного польоту отримали підтвердження в експериментах на хліностатах, де виявлено зростання інтенсивності та появу преципітату піроантимонатної реакції гіалоплазмі статоцитів, а також інгібування Са2+-АТФаз плазмалеми. Спираючись на отримані цитохімічні дані можна припустити, що в результаті дії горизонтального кліностатування клітини колумели переходять у стимульований стан, ддя якого притаманне підвищення рівня Са2+ в гіалоплазмі. Отже, постійне отримання клітиною сигналів про зміни орієнтації відносно вектору гравітації призводять до порушення Са2+-гомеостазу у статоцитах, можливо, внаслідок постійного переміщення амілопластів, що індукує вхід іонів Са2+, і/або змін у процесах відкачки цих іонів. Слід відмітити кореляцію одержаних нами даних з результатами біохімічних досліджень фракції плазмалеми коренів гороху, згідно з якими зниження активності Са2+-АТФази співпадало з дворазовим зменшенням вмісту білку в цій фракції в умовах кліностатування [Палла-дина идр., 1984].

Проаналізовано ультраструктурні зміни під впливом модифікаторів Саг+-балан-су на окремі органеяи статоцитів коренів гороху. Встановлено, що основні закономірності такого впливу (хаотичне розміщення амілопластів, значна вакуолізація, потоншення клітинної оболонки) повністю корелюють з результатами аналізу структури статоцитів в умовах космічного польоту та кліностатування. Зведені дані цитохімічних досліджень впливу модифікаторів представлено у таблицях 6 та 7.

Інтенсивність цитохімічної реакції на вільний та слабкозв’язаний Са2+ в статоцитах коренів гороху при дії

модифікаторів Са2+-гомеостазу

Клітинні органели 1 комнартмснти Контроль ЕГТА ЬаСЬ Рутеній червоний А23187 Хлорпро- мазнн Д600 Нікарди- ПІН їла

Ядро

ядерце +++ 4 44 4 4-4-4 -и- 44 44 44

нуклеоплазма +++ 4 44 + 444 44 44 44 44

оболонка ± 4 4 4 44 4 4 4 4

Амілопласти

строма + 4 44 4 44 4-4-4 4 4 44

оболонка І ± 4 ± 44 44 4 ± ±

Мітохондрії

матрикс 4 + + 4 444 ± 4 4 4

кристи - - - - - - - - -

Ендоплазматичний 4 4 + 4 +4 4 4 4 4

ретикулум

Диктіосоми

цистерни 4 + ± 4* 444 4 4 4 4

везикули 4 4 ± 4 44 44 4 4 4

Вакуолі — 4 44 4* 4 ± 4 4 44

Плазмалема 4* 4 4 4 4-44 4 4 4 4

Клітинна оболонка 444 4 444 4-44 44 4 444 444 44

Гіалоплазма - 4 -и- _н_ 444 44 4 4 4

Примітка: Число (+) показує рівень інтенсивності реакції, (-) — її відсутність, (±) — реакція в окремих структурах.

Інтенсивність цитохімічної реакції на Са2+-активовані АТФази в статоцитах коренів гороху при дй модифікаторів

Са^-гомеостазу

Клітинні орган ели та їх компоненти Контроль ЕГТА ЬаСЬ Рутеній червоний А23187 Хлорпро- мазин Нікарди- пін Д600 ІЛС1

Хроматин +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Ядерце +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++

Мітохондрії - ± - - +++ ± - + -

Амілопласти - - - - - - + - -

Ендоплазматичний ретикулум - - ± - - - - - -

Диктіосоми - - - - - + - - -

Вакуолі - ± - - - - - - ' -

Плазмалема +++ +++ +++ +++ +4-+ +++ + +++ ++ +

Плазмодесми + + + + + + + +

Примітка: Число (+) показує рівень інтенсивності реакції, (-) — її відсутність, (±) — реакція в окремих структурах.

На основі представлених цитохімічних даних можна зробити висновок, що модифікатори, які викликали агравітропізм рослин, викликали підвищення у гіалоплазмі вмісту Са2+, тоді як активність Са1+-АТФаз плазмалеми не зазнавала суттєвих змін.

Встановлений нами зв’язок між індукованим агравітропізмом та перебудовами структурно-функціональної організації статоцитів дозволив виробити уявлення про шляхи сприйняття гравітаційного стимулу за участю Са2+-месенджерової системи.

Роздїл 8. Роль іонів кальцію в механізмі гравірецепцїї у рослин

Аналіз літературних та особистих даних дозволив поглибити існуючі уявлення про гравірецепцію у вищих рослин та запропонувати схему, що враховує внесок іонів Са2+ як найвірогіднішого вторинного месенджера, який передає інформацію про гравітаційний стимул із зони його сприйняття (колумели) у місце здійснення граві-реакції (зону розтягу) (рис. 1). Сусцептором, що сприймає гравітаційний стимул можуть бути актинові філаменти і/або інтегрини [Pickard, 1994; Sievers et al., 1991].

Ми вважаємо, що в статоцитах рослин в умовах гравістимуляції внаслідок переміщення амілопластів виникає механічне подразнення цигоскелету, сигнал від якого може передаватися на плазмалему через лінкерні білки, які зв’язують її з елементами цитоскелету, або на молекули інтегрину шляхом їхньої взаємодії з фібронек-тшгом/вітронектином. Виходячи з аналогії з клітинами тварин, можна припустити, що у плазмалемі статоцитів знаходяться механочутливі Са2+-канали, наявність яких у клітинах рослин уже доведено [Ding, Pickard, 1993]. Ці канали можуть відкриватися внаслідок прямого фокусування на них механічної енергії від цитоскелету і/або від екстрацелюлярних елементів. У результаті активації механочутливих Са2+-каналів підвищується рівень Са2+ у кортикальному шарі цитоплазми, що, в свою чергу, призводить до активації Са2+-залежних аніонних каналів [Hedrich et al., 1990], в результаті чого відбувається деполяризація плазмалеми і активація потенціал-чутливих Са2+-каналів, через які Са2+ потрапляє у клітину.

Результати проведених нами досліджень впливу блока торів Са2+-каналів, хела-тору Са2+ (ЕГТА) та Са2+-іонофора А23187 на гравітропізм та клітини колумели коренів рослин гороху показали, що індукований вказаними речовинами агравітропізм коренів супроводжується втратою полярності статоцитів, незалежно від того, інгібується або стимулюється вхід екстрацелюлярного Са2+ у статоцити. Спричинені вказаними модифікаторами зміни Са2+-балансу, що стосуються транспорту Са2+ з апопласту, є доказом участі екстрацелюлярного Са2+ у передачі гравітаційного стимулу.

Рис.І. Схема гравірецепції за участю іонів Са2+,

Беручи до уваги важливу роль фосфоінозитидного (ФІ) циклу в передачі Са2+-сигналів, вважаємо, що підвищення рівня Са2+ в лримембранному шарі плазмалеми викличе утворення інозитолтрифосфату (ІФз), який стимулює вихід кальцію із внутрішньоклітинних Са2+-депо. У зв’язку з цим уявляється вірогідним розповсюдження Са2+'Хвиль, що індукуються вивільненням Са2+ із Са2+-депо. У гравістимульо-ваних коренях такі хвилі можуть викликати вивільнення ауксину із стимульованих клітин, створюючи градієнт фітогормону, необхідного для ростової реакції, яка призводить до згину. Наші експерименти з використанням LiCI та рутенія червоного, речовин, які блокують різні етапи ФІ-циклу, виявили кореляцію між змінами у Са2+-балансі та інгібуванням гравітропізму, що також супроводжувалося кардинальним порушенням полярності статоцитів. Отримані дані вказують на участь ІФз-активованої системи транспорту іонів Са2+ в гравітропічній реакції.

Очевидно, підвищення рівня Са2+ внаслідок активації Са2+-каналів плазмалеми та Са2+-депо, що відбувається в гіалоплазмі, а також у ядрі може, в свою чергу, індукувати експресію генів Са2+-зв’язуючих білків (кальмодуліну, протеінкінази С, анексинів та ін.), що виявлено, наприклад, в умовах механічного стресу [Braam, Davis, 1990]. Це положення знаходить підтримку у результатах наших експериментів щодо агравітропічної дії інгібітора кальмодуліну (хлорпромазину).

Цю гіпотезу також підтверджують отримані нами дані, що стосуються змін Са2+-балансу у клітинах колумели в умовах космічного польоту та кліностатуван-ня, оскільки перевантаження, що діє на рослини під час підйому космічного корабля, або постійний рух амілопластів на кліностаті, можуть викликати відкриття Са2+-каналів, включаючи і ІФз-активовані Са2+-канали на мембранах органел, та масований вхід Са2+ в гіалоплазму. Очевидно, що у відповідь на підвищення концентрації Са2+ клітина відповідає посиленням Са2+- зв’язуючої активності мембран, щоб захистити клітину від надлишку іона-регулятора.

Таким чином, отримані нами дані щодо структури та змін Са2+-балансу в клітинах колумели коренів рослин в умовах дії факторів хімічної та фізичної природи, що пригнічують гравітропізм, являють собою незаперечні докази того, що гравіре-цепторний механізм вищих рослин, який локалізовано у гравісенсорних клітинах, включає систему передачі Са2+-сигналу.

Підсумкова частина

Гравітаційна сила на Землі є одним з фундаментальних факторів оточуючого середовища. Її наявність та незмінність протягом усього періоду існування живого на Землі призвели до того, що майже усі живі організми виробили в процесі еволюції

спеціальні механізми, які дозволили їм адаптуватися до дії даного фактора. Розвиток спочатку примітивних, а згодом все розвинутіших механізмів гравірецепції у живих організмів відбувався в ході їх еволюції [Barlow, 1995]. Протягом багатьох років увагу біологів привертав гравітропізм та процеси, які лежать в основі сприйняття рослиною сили тяжіння. Інгібіторний підхід, який використовувався нами, щоб пригнічувати гравітропізм за допомогою модифікаторів Са2+-гомеостазу, в умовах космічного польоту або кліностатування, дозволив виявити кореляції між ультраструктурними перебудовами та змінами Са2+-балансу в статоцитах. На основі власних даних та інформації з літературних джерел ми аргументували положення про те, що серед основних факторів, які визначають формування гравітропіч-ної реакції (градієнти Са2+, біопотенціали та акусин), провідна роль в гравірецепції належить Са2+ тому, що саме іони Са2+ передають інформацію про зміну просторового розташування органу рослини від гравірецепторних клітин у місце формування іраві-тропічного згину. Усі компоненти системи підтримки Са2+-гомеостазу беруть участь у передачі Са2+-сигналу під впливом гравітаційного стимулу.

Дослідження структурно-функціональної організації клітини, процесів росту та розвитку рослин в умовах мікрогравітації та зміненої сили тяжіння сприяють встановленню біологічної ролі гравітації у формуванні і розвитку живих організмів на Землі та вирішенню завдань забезпечення нормальної життєдіяльності організмів в умовах космічного польоту. Отримані нами дані космічного експерименту, що свідчили про суттєві зміни в Са2+-гомеостазі гравічутливих клітин коренів вищих рослин, стали основою нового напрямку - дослідження ролі Са2+ в біологічних ефектах мікрогравітації.

Ми вважаємо, що встановлені нами закономірності порушень Са2+-балансу в умовах зміненої гравітації мають більш загальний характер і можуть використовуватися як критерій при вивченні інших альтеруючих факторів.

Серед прикладних напрямків майбутніх досліджень, які випливають із результатів, викладених у цій роботі, нам видається перспективним вивчення реакції на мікрогра-вітацію тих видів рослин, які мають протилежну чутливість до присутності Са2+ у поживному середовищі (кальцефіли та кальцефоби), що може стати важливим критерієм для відбору видів рослин, які вирощуватимуться у космічних оранжереях.

ВИСНОВКИ

1. У механізмі гравірецепції у вищих рослин, що є притаманним спеціалізованим гравічутливим клітинам - статоцитам, бере участь Са2+-сигнальна система, яка активується під дією гравітаційного стимулу.

2. Агравітропізм коренів вищих рослин, що викликається фізичними факторами (мікрогравітація, кліностатування) або хімічними факторами (модифікатори Са2+-гомеостазу), на клітинному рівні корелює з втратою структурної полярності статоцитів, яка притаманна гравічутливим клітинам у нормі.

3. Структурні та функціональні зміни у статоцитах, індуковані дією фізичних факторів (мікрогравітація і кліностатування), мали в значній мірі однотипний характер, проте ширший спектр перебудови ультраструктури відмічено в умовах космічного польоту, ніж при кліностатуванні.

4. Дія факторів космічного польоту на гравічутливі клітини коренів гороху призводила до суттєвих змін в ультраструктурі органел (амілопласти, ядро, вакуолі, мітоховдрії, клітинна оболонка) та їх чисельності (амілопласти, вакуолі, міто-хондрії, диктіосоми, мікротільця, ліпідні глобули). Зміщення Са2+-балансу в бік підвищення вмісту кальцію на клітинному рівні проявлялося в утворенні Са2+-зв’язуючих центрів мембран, цитохімічний аналіз яких показав, що до їх складу входили іони Са2+, Са2+~зв’язуючі білки та фосфоліпіди. У деяких випадках за модифікованих умов вирощування надмірне насичення клітин іонами Саг+ призводило до появи ознак деструкції клітин внаслідок руйнування мембранної системи, найвразливіщим компонентом яхої була плазматична мембрана.

5. В умовах моделювання деяких основних ефектів мікрогравітації при обертанні рослин на горизонтальних кліностагах встановлено, що в статоцитах коренів вищих рослин, крім певних змін у топографії, ультраструктурі та кількості органел, також порушувався Са2+-баланс, про що свідчило підвищення інтенсивності піроантимонатної реакції та зміни в локалізації Са2+-АТФазної активності.

6. Ультраструктурні та цигохімічні дослідження статоцитів коренів рослин гороху, які обробляли модифікаторами Са2+-балансу, в результаті чого рослини втрачали здатність згинатися під дією сили тяжіння, виявили ряд загальних рис:

• перерозподіл амілопластів по усьому об’єму клітин;

• вакуолізація клітин колумели;

• зміни інтенсивності та локалізації піроантимонатної реакції, яка ідентифікує вільний та слабко зв’язаний кальцій;

• несуттєві зміни (або їх відсутність) у локалізації Са2+-активованих АТФаз. Поруч з тим сукупність виявлених змін та ступінь їх розвитку мають особливості, що є характерними для дії кожного окремого модифікатора.

7. Спираючись на результати експериментів з використанням блокаторів Са2+-каналів у поживному середовищі для рослин, які оберталися на горизонтальних кліностатах, що показали можливість стабілізації Са2+-гомеостазу, розроблено

методичний підхід, який дозволяє коригувати Са2+-баланс у клітинах рослин, що

вирощуються в умовах космічного польоту.

ОСНОВНІ ПУБЛІКАЦІЇ, НАДРУКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кордюм Е.Л., Сьггник К.М., Белявская Н.А., Жадько С.И., Климчук Д.А., Полулях Ю.А. Современные проблемы космической клеточной биологии / Проблемы космической биологии, Т.73. М.: Наука, 1994.-293 с. (С. 82-144).

2. Belyavskaya N.A. Calcium and graviperception in plants: inhibitor analysis // Int. Rev. Cytol.- 1996.-V. 168.-P. 123-185.

3. Білявська H.O. Деякі особливості ультраструктури статоцитів кореневого чохлика проростків гороху // Укр. бот. журн.- 1982.-Т. 39, № 6.-С. 77-80.

4. Sytnik К.М., Kordyum E.L., Nedukha Е.М., Belyavskaya N.A., Tarasenko V.A. Biological effects of weightlessness and clinostatic conditions registered in cells of higher plant root meristera and cap II Adv. Space Res.- 1983.-V. З, № 9.-P. 251-255.

5. Палладіна T.O., Кордюм Є.Л., Білявська H.O. Активність та локалізація транспортних АТФаз в клітинах коренів проростків гороху в умовах гіпогравітації //Укр. бот. журн.-1984.-№ 5.-С. 54-57.

6. Kordyum E.L., Belyavskaya N.A. Nedukha E.M., Palladina T.A., Tarasenko V.A. The role of calcium ions in cytological effects of hypogravity II Adv. Space Res.- 1984.-V.

4, N9 12.-P. 23-26.

7. Сытник K.M., Кордюм Е.Л., Белявская H.A. Тарасенко B.A. Роль ионов кальция в механизме гравиорецепции корней гороха и в эффектах клиностатирования // Докл. АН УССР.-1986.-№ 4.-С. 79-82.

8. Белявская Н.А. Ультраструктура и локализация ионизированного кальция в статоцитах корней гороха под влиянием модификаторов кальциевого гомеостаза // Докл. АН УССР.-1988.-№ 7.-С. 65-68.

9. Белявская Н.А., Кордюм Е.Л., Подлуцкий А.Г. Особенности локализации Са2+-АТФаз в клетках корней гороха при клиностатировании. IIЦитология. - 1988.-Т. 30, № 1.-С. 84-87.

10. Belyavskaya N.A. The function of calcium in plant graviperception // Adv. Space Res.- 1992,- V. 12, № l.-P. 83-91.

11. Belyavskaya N.A. (1994) Promoting calcium binding to pea root cell membranes by calcium chloride and clinostating // Докл. АН УССР.-1994.-№ 2.-C. 172-174.

12. Белявская H.A. Влияние ионов лития на ультраструктуру и локализацию ионизированного кальция в статоцитах корней гороха П Докл. АН УССР.-1994.-№

11.-С. 153-156.

13. Belyavskaya N.A. Free and membrane-bound calcium in microgravity and micro-ravity effects at the membrane levelII Adv. Space Res.- 1996,-V. 17, № l.-P. 169-177.

14. Белявская H.A. Влияние клиностатирования и блокаторов кальциевых каналов на кальциевый гомеостаз гравирецепторных клеток корней гороха //Цитология -1997.-Т. 39, № 7.-С. 612-616.

15. Белявская Н.А. Влияние клиностатирования и блокаторов кальциевых каналов на кальциевый гомеостаз гравирецепторных клеток корней гороха И Цитология и генетика,-1998.-№ 2.-С. 3-8.

16. Belyavskaya N.A., Tsarik N.P. Calcium balance in pea root statocytes under both clinorotation and Ca2+ channel blockers influence II Adv. Space Res.- 1998.- V. 21, № 8/9.-P. 1225-1228.

17. Белявская H.A., Величко C.H. Механизм адаптации растительной клетки к условиям микрогравитации через изменение кальциевого баланса // Цитология. -1991.-№5.-С. 88-89.

18. Белявская H.A. Влияние клиностатирования на ультраструктуру амилоплас-тов корней гороха II Мат-лы 11 -го Всес. совещ. по круговороту веществ в замкнутых экологических системах. Киев, 1983.-С. 21-24.

19. Сытник K.M., Кордюм Е.Л., Гречко Г.М., Сидоренко П.Г.,Белявская H.A. Перспективы создания биологических систем жизнеобеспечения на основе изучения биологии растительной клетки И Космическая антропоэкология: техника и методы исследований, Л.: Наука, 1984.-С. 379-381.

20. Кордюм Е.Л., Недуха Е.М., Белявская H.A. Современное развитие идей К.Э. Циолковского в вопросе роста растений в условиях невесомости // Труды 16-17-ых Чтений, посвященных разработке научного наследия и развитию идей К.Э.Циолковского. М.: Наука, 1985.-С. 131-134.

21. Белявская H.A. Роль ионов кальция в механизме гравирецепции у высших растений // Труды Междунар. конф. по анатомии и морфологии растений, Санкт-Петербург: Диада, 1997.-С. 160-161.

22. Sytnik K.M., Kordyum E.L., Belyavskaya N.A. Zaslavsky V.A., Nedukha E.M., Tarasenko V.A., Fomicheva V.M., Palladina T.A. Cytological aspects of higher plant ontogenesis under microgravity // Preprint IAF-83-190, Budapest, 1983.-5 p.

23. Sytnik K.M., Kordyum E.L., Belyavskaya N.A. (1987) Ultrastructure of pea meristem and root cap cells under space flight condition // Preprint IAF/1AA-87-558, London, 1987.-5 p.

24. Кордюм E.JI., Недуха E.M., Попова А.Ф., Сидоренко П.Г., Белявская H.A., Климчук Д.А., Тарасенко В.А. Особенности ультраструктуры клеток растений при

клиностатировании // Мат-лы 2-ой Респ. Науч.-техн. конф. “Электронная микроскопия и вопросы прогнозирования”, Кишинев, 1981.-С. 56.

25. Белявская Н.А. Ультраструктурные перестройки в клетках корней проростков гороха при клиностатировании // Тез. докл. 7-го съезда УБО. Киев, 1982.-С. 77.

26. Sytnik К.М., Kordyum E.L., Belyavskaya N. A., Tarasenko V.A. Biological effects of weightlessness and clinostatic conditions registered in cells of higher plant root meristem and cap // Abstr. 24th Plenary Meeting of COSPAR, Ottawa, 1982.-P. 493.

27. Sytnik K.M., Kordyum E.L., Belyavskaya N.A., Zaslavsky V.A., Nedukha E.M., Tarasenko V.A., Fomicheva V.M., Palladina T.A. Cytological aspects of higher plant ontogenesis under microgravity//Abstr. 34th Congress IAF, Budapest, 1983.-P. 211.

28. Белявская Н.А. Нарушения ультраструктуры статоцитов корней гороха в условиях клиностагирования //Цитология и генетика.-1983.-№ З.-С. 70-71.

29. Белявская Н.А. Исследование электронно-плотных структур, возникающих в статоцитах корней гороха при гипогравитации // Тез. докл. Всес. симп. “Ультраструктура растительной клетки”, Кишинев,1983.-С. 38-39.

30. Сытник К.М., Кордюм Е.Л., Белявская Н.А., Подлуцкий А.Г. Роль ионов кальция в механизме гравиорецепции корней гороха и в эффектах клиностатирования // Мат-лы 3-ой Респ. Науч.-техн. конф. по электронной микроскопии, Кишинев, 1986.-С. 59.

31. Kordyum E.L., Belyavskaya N.A., Nedukha Е.М., Palladina T.A., Tarasenko V.A. The role of calcium ions in cytological effects of hypogravity // Abstr. 25th Plenary Meeting of COSPAR, Graz, 1984.-P. 299.

32. Kordyum E.L., Sytnik K.M., Belyavskaya N.A., Nedukha E.M., Musatenko L.I., Tarasenko V.A. Possible mechanism of cell adaptation to hypogravitation II Abstr. 35th Congress IAF, Lausanne, 1984.-P. 192.

33. Кордюм Е.Л., Белявская Н.А. Структурные аспекты дифференцировки тканей гороха в условиях гипогравитацш IIТез. докл. 1-ой Всес. Конф. по анатомии растений, Л.: Наука, 1984.-С. 77-78.

34. Sytnik К.М., Kordyum E.L., Belyavskaya N.A., Podlutsky A.G. A role of calcium in the mechanism of graviperception of pea roots and in effects of clinostat rotation II Abstr. 26th Plenary Meeting of COSPAR, Toulouse, 1986.-P. 314.

35. Belyavskaya N.A. The effects of modificators of calcium homeostasis on ultrastructure and distribution of ionized calcium in statocytes of pea rootII Abstr. 27* Plenary Meeting of COSPAR, Espoo, 1988.-P. 361.

36. Belyavskaya N.A., Velichko S.N. The adaptation mechanism of plant cell to microgravity condition through changes in calcium balance//Abstr. 28th Plenary Meeting of COSPAR, Hague, 1990.-P. 55.

37. Belyavskaya N.A. The function of calcium in plant graviperception // Abstr. 29th Plenary Meeting of COSPAR, Washington, 1992.-P. 572.

38. Belyavskaya N.A. Free and membrane-bound calcium in microgravity and microgravity effects at the membrane level II Abstr. 30* Plenary Meeting of COSPAR, Hamburg, 1994.-P. 316.

39. Belyavskaya N.A. Calcium and graviperception in higher plants: possible models II Abstr. 31st Plenary Meeting of COSPAR, Birmingham, 1996.-P. 316.

40. Belyavskaya N.A., Tsarik N.P. (1996) Calcium balance in pea root statocytes under both clinorotation and Ca2+ channel blockers influence // Abstr. 31st Plenary Meeting of COSPAR, Birmingham, 1996.-P. 316.

41. Belyavskaya N.A. (1998) Effects of gadolinium ions on statocyte ultrastructure in pea roots II Abstr. 32nd Plenary Meeting of COSPAR, Nagoya, 1998.-P. 388.

42. Белявская H.A. Кальциевый гомеостаз статоцитов корней гороха под влиянием клиностатирования и блокаторов кальциевых каналов // Тез. докл. XI Конф. по космич. биологии и авиакосм, медицине, Москва, 1998.-С. 99-100.

Білявська Н.О. Роль іонів кальцію в механізмі гравірецепції у рослин та в ефектах мікрогравітації на клітинному рівні. - Рукопис. Дисертація на здобуття вченого ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - клітинна біологія. Інститут клітинної біології і генетики НАН України, Київ, 1998.

Дисертацію присвячено ролі кальцію у сприйнятті сили тяжіння рослинами. У роботі розвивається новий напрямок у клітинній гравітаційній біології, який базується на концепції Са2+-сигналів як вторинного месенджера в передачі гравітаційного стимулу. Встановлено, що агравітропізм, індукований умовами мікрогравітації, клі-ностатування або дією модифікаторів Са2+-балансу, на клітинному рівні супроводжується втратою полярної організації, вакуолізацією та порушенням Са2+-гомеостазу у статоцитах. В умовах космічного польоту виявлено перенасиченість клітин колумели кальцієм. Запропоновано метод корекції за допомогою блокаторів Са2+-каналів Са2+-статусу у вищих рослинах, що розвиваються в умовах космічного польоту.

Ключові слова', агравітропізм, гравірецепція, Саг+-баланс, кліностатування, мікро-гравітація, рослини.

Белявская Н.А. Роль ионов кальция в механизме гравирецепции у растений и в эффектах микрогравитации на клеточном уровне. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.22 - клеточная биология. Институт клеточной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1998.

Диссертация посвящена выяснению роли кальция в восприятии силы тяжести растениями. В работе развивается новое направление в клеточной гравитационной биологии, основанное на концепции Саг+-сигналов как вторичного мессенджера в передаче гравитационного стимула. Установлено, что агравигрогшзм растений, индуцированный условиями микрогравитации, клиностатирования или воздействия модификаторов Са2+-баланса, на клеточном уровне сопровождается утратой полярной организации, вакуолизацией и нарушением Са2+-гомеостаза статоцитов. В условиях космического полета обнаружено чрезмерное насыщение клеток колумеллы кальцием. Предложен метод коррекции с помощью блокаторов Са2+-каналов Са2+-статуса у высших растений, развивающихся в условиях космического полета. Ключевые слова: агравитропизм, гравирецепция, Са2+-баланс, клиностатирование, микрогравитация, растения.

Belyavskaya N.A. The role of calcium ions in graviperceptive mechanism in plants and in microgravity effects at the cellular level. - Manuscript. Thesis on a scientific title of the Doctor of Biological Science, specialization 03.00.22 - Cell Biology. Institute of Cell Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.

Dissertation is devoted to the elucidating the role of Ca2+ in a gravity perception by plants. In the study, a new direction in a cellular gravitational biology based on the conception of Ca2+ signalling as a secondary messenger in transduction of gravitational stimulus is developed. It is established that a plant agravitropism induced by microgravity, clinorotation or Ca2+ balance modificators’ treatments is accompanied by a loss of polarity, vacuolization and Ca2+ homeostasis disturbances in statocytes at the cellular level. In space flight condition, an oversaturation with calcium of columella cells was found. The method for correction of Ca2+ stat by means of Ca2+ channel blockers in plants developed under space flight condition is proposed.

Key words: agravitropism, Ca2+ balance, clinorotation, graviperception, microgravity, plants.