Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль глутаматных рецепторов и Na/K-насоса в регуляции окислительного стресса

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль глутаматных рецепторов и Na/K-насоса в регуляции окислительного стресса"

На правах рукописи

КАЗБЙ Василий Игоревич

РОЛЬ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ И Ка/К-НАСОСА В РЕГУЛЯЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва- 2007

003057730

Работа выполнена в ГУ НИИ неврологии РАМН (г. Москва)

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ доктор биологических наук профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор

доктор биологических наук профессор

БОЛДЫРЕВ Александр Александрович

ЛОПИНА Ольга Дмитриевна

СЫРОЕЖКИН Антон Владимирович

Овчинникова

часов на

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю. А.'

Защита диссертации состоится 2007 г. в

заседании диссертационного совета Д212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6,

Автореферат разослан » И^йу 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.203.13 доктор биологических наук, профессор

ЛУКАШЕВА Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Окислительный стресс, являющийся следствием дисбаланса про- и анти-оксидантных систем клетки и выражающийся в образовании активных форм кислорода (АФК), может являться причиной повреждения различных структур клетки и приводить к клеточной смерти. Показано также, что окислительный стресс лежит в основе ряда нейродегенеративных заболеваний.

Однако активные формы кислорода принимают участие и в нормальной жизнедеятельности клетки. Образование супероксид-аниона и гипохлорита используется клетками иммунной системы при защите от инфекций и опухолевых процессов. Свободные радикалы, которые образуются в цитозоле клетки в ответ на стимуляцию факторами роста, участвуют в регуляции процесса пролиферации. Образование простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов также требует участие супероксид аниона. Показано, что АФК наряду с другими факторами способны активировать такой транскрипционный фактор как NF-кВ, что приводит к экспрессии целого ряда различных белков.

Для исследования окислительного стресса применяются различные подходы, позволяющие выяснить молекулярные механизмы этого процесса как in vitro, так и in vivo. Для моделирования этого процесса можно использовать различные методы. В настоящей работе мы использовали линию животных с ускоренным процессом старения SAMP1 (Senescence Accelerated Mice Prone, Strain 1), выведенную путем близкородственных скрещиваний из линии AKR/J. Истинным контролем к данной линии является линия SAMR1 (Resistant), также выведенная из линии AKJR/J.

Для моделирования окислительного стресса в нейронах in vitro мы использовали N-метил-О-аспартат (NMDA) - соединение, активирующее одноименный класс ионотропных глутаматных рецепторов. Инкубируя выделенные из мозжечка нейроны крыс и мышей линии SAMP1 с различными концентрациями NMDA, мы наблюдали дозо- и время-зависимый прирост уровня АФК.

Недавно было показано, что центральный фермент ионного гомеостаза, Na/K-АТФаза, может принимать участие в процессах окислительного стресса, однако в литературе отсутствует систематическое исследование роли Ыа/К-АТФазы в этом процессе и ее функциональное взаимодействие с другими клеточными системами, принимающими участие в реализации окислительного стресса

Целью настоящей работы было установление взаимосвязи между глутаматными рецепторами, окислительным стрессом и Ыа/К-АТФазой.

Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи: 1) оценить продукцию АФК в клетках мозжечка двух исследуемых линий животных; 2) оценить влияние глутаматных рецепторов и Иа/К-АТФазы на развитие окислительного стресса; 3) оценить влияние АФК на физиологические и биохимических параметры животных; 4) охарактеризовать взаимодействие глутаматных рецепторов и Ма/К-АТФазы.

Научная новизна и практическая значимость работ ы. С помощью современных подходов были продемонстрированы различия в уровне АФК в мозге мышей линии БАМР1 и БАМШ. Показано защитное действие Ыа/К-АТФазы на нейроны в условиях окислительного стресса. Выявлено влияние ЫМБА и уабаина на этот процесс. Продемонстрировано влияние АФК на ряд физиологических параметров. Охарактеризована экспрессия различных изоформ Ыа/К-АТФазы и разных групп глутаматных рецепторов в мозге крыс в ранний постнатальный период. Продемонстрировано влияние ЫМБА на активность Ыа/К-АТФазы. Дальнейшее изучение взаимоотношений

выявить

возможность

NMDA рецепторов и Na/K-АТФэзы позволит коррекции различных патологических состояний.

Апробация работы. Материалы диссертации были международной конференции по церебральной ишемии (Марбург, Германия, 2002 год), международной конференции-школе по окислительному стрессу (Будапешт, Венгрия, 2003), на международной конференции исследованию мышей линии SAM (Саппоро, Япония, 2004), на конференции «Нейроспецифические метаболиты и этимологические основы деятельности центральной нервной системы», Пенза, 2006. Апробация раб на межлабораторном семинаре Института неврологии РАМН i

Публикации. По материалам диссертации опубликовг работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Ведения, Обзора литературы, Результатов и их обсуждения, Заключения, Выводов и

Списка литературы. Работа изложена на_стр. печатного текста, содержит

__ рисунков и_таблиц. Список литературы включает_наименований.

доложены на

эты состоялась 2006 г.

но 9 печатных

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В экспериментах использовали крыс и мышей линии 8АМР1 и контрольной к ней БАМИЛ. Мышей линии 8АМР1 и БАМЮ использовали в возрасте 14-16 месяцев, то есть в тот период жизни животных, когда наблюдаются отчетливые различия в их поведении, внешнем виде и ряде биохимических показателей. При работе с нейронами их выделяли из мозжечка молодых (8-15 дней) крыс и мышей линий БАМ.

Физиологические методы. Животных обеих исследуемых линий разбивали на две сходные группы (по 5-6 животных в каждой), формируемые на основании тестирования в норковой камере, что сводило к минимуму исходные различия у животных. Подопытной группе вводили МРТР в соответствии с разработанным протоколом, контрольные животные в это же время получали физиологический раствор в таком же объеме. Физиологическое состояние животных оценивали по различным параметрам, определяемым в тесте «Норковая камера».

Активность Иа/К-АТФазы измеряли после разрушений клеток 5-кратным замораживанием-оттаиванием оценивали по высвобождению неорганического фосфата после инкубации проб в присутствии 3 мМ М£АТФ в среде, содержащей 130 мМ НаС1 и 20 мМ КС1.

Определение активных форм кислорода проводили тремя разными способами: в присутствии 50 цМ люминола на хемилюминометре ЪКВ 1250 (Швеция), в присутствии того же количества люминола на счетчике фотонов МАЯК II (Дания).

Определение активности МАО В проводили в митохондриальной фракции мозга методом, разработанным для регистрации активности МАО типа В с бензиламином в качестве субстрата (Минеева, Стволинский, 1996).

Активность супероксиддисмупшзы определяли по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) при генерации супероксидного анион-радикала в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой при 560 нм. Реакционная смесь, инкубируемая при 25 °С, содержала 50 мМ К,Ыа-фосфатный буфер (рН 7,8); 0,1 мМ ЭДТА; 0,1 мМ ксантина; 25 10"3 мМ НСТ (Юнева, 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика окислительного стресса в мозге грызунов

Настоящий раздел исследования выполнен на клерках мозжечка быстростареющих мышах линии SAMP1. В качестве контроля использовались мыши линии SAMR1.

После добавления 50 цМ люминола к суспензии нейроне в, выделенных из мозжечка животных SAMP1 или SAMR1, измеряли стационарный уровень хемилюминесценции, отражающей продукцию свободных форм кислорода. При измерении хемилюминесценции суспензии нейронов SAMP1 и SAMR1 нами была обнаружена существенная разница в продукции активных форм кислорода (Рис. 1). Очевидно, что данное различие обусловлено нарушениями в метаболизме активных форм кислорода в мозге животных SAMP1 уже на таких ранних стадиях развития (6-10 дней). Тот факт, что на биохимическом уровне эти различия проступают на более ранних этапах развития, позволяет предполагать, что они являются однэй из причин будущих морфологических изменений.

Рис. 1. Уровень активных форм кислорода в нейронах и БАМР1 в

стационарном состоянии (слева) и после 10 мин активации клеток I цМ

ФМА (справа)

Добавление 1 цМ ФМА вызвало увеличение уровня активных форм кислорода как у ЗАМШ, так и у 8АМР1, причем более выражено оно у 8АМЫ1. После 10 мин инкубации с ФМА различие в уровне активных форм кислорода составило 31%, в то время как изначально оно составляло 113%. Такие различия в эффекте ФМА у 8АМР1 и БАМЮ позволяет заключить, что ФМА-зависимые протеинкиназы в нейронах 8АМР1 исходно активированы в большей степени, чем у ЗАМШ.

Хорошо известно, что экзайтотоксические эффекты глутамата могут в значительной степени быть опосредованными ММОА-рецепторами. Одной из основных причин гибели клетки при экзайтотоксическом стрессе является повышение внутриклеточной концентрации ионов Са2+, что приводит к активации протеинкиназы С, росту свободных форм кислорода и апоптозу. В нашем эксперименте инкубация с ЫМБА вызывала дозо- и время-зависимое повышение уровня активных форм кислорода нейронами как 8АМР1, так и БАМИЛ (Рис. 2).

О минут 10 минут 20 минут

Рис. 2. Продукция активных форм кислорода нейронами БАМК! (белые столбики) и БАМР1 (черные столбики) при их инкубации с 500 рМ ЫМИА

Для оценки влияние Ыа/К-АТФазы на генерацию АФК, мы инкубировали клетки с различными концентрациями уабаина, ингибитора Ма/К-АТФазы (Рис. 3). В случае 8АМР1 ингибирование Иа/К-АТФазы не приводило к существенному росту продукции АФК, в то время как в случае БАМЛ! характер зависимости был иным.

0 <

~г

Контроль 10Е-6 10Е-5 10Е-3

Рис 3. Влияние различных концентраций уабаина на генерацию АФК клетками мозжечка БАМЕ! (белые столбит) и БАМР1 (черные

столбики)

Максимальный эффект уабаина на АФК достигался в концентрации 10 5М, при прочих концентрациях эффект был менее выражен. Подобные различия в действии уабаина, вероятно, связаны с тем, что у животных линии БАМП продукция АФК изначально превосходит таковую у ЗАМШ (Рис. 1). Можно предположить, что в нейронах БАМР1 Ыа/К-АТФаза исходно может находиться в частично заингибированном состоянии. Ранее в нашей лаборатории было показано, что активные формы кислорсда приводят к ингибированию фермента посредством окисления его 8Н-групп (Курелла и др., 1996). В наших условиях это также вероятно, поскольку мы показали (см. ниже), что подобное ингибирование снимается добавлением восстанавливающих агентов.

2. Влияние МРТР на биохимические и физиологическое характеристики

грызунов

Биохимическая характеристика

Для индукции окислительного стресса в мозге использовали нейротоксин МРТР, который, метаболизируя индуцирует образование свободных форм кислорода. Для влияния МРТР на состояние антиоксидантной системы моз активность таких ферментов как СОД (Рис. 4) и МАО В (Рис.

животных мы :ь в нейронах, карактеризации мы измеряли

{О-

га

Различие уровня активности СОД у мышей линий БАМР1 и БАМЮ было показано ранее в нашей лаборатории. В настоящей работе нами показано существенное снижение активности СОД в мозге БАМЮ, вызванное МРТР, в то время как в случае 8АМР1 наблюдалось небольшое повышение активности фермента.

35л I 30-

et 25 О

О 204

■Q Н О

о

X

ш

S

fc <

1510-

SAMR SAMR+MPTF SAMP ЗАМР+МРТР

Рис. 4. Влияние МРТР на активность СОД в митохондриях мозга мышей в разных условиях (достоверное снижение активности относительно контроля отмечено знаком «*»)

о я э-

\ 200' §

2 X

m

о <

s

л

Б

о

X

о

S

£

<

100-

SAMR SAMR+MPTP SAMP SAMP+MPTP

Рис. 5. Сравнение активности МАО-B в митохондриях мозга различных группах экспериментальных животных

В случае МАО-B МРТР достоверно не влиял нг. активность этого фермента.

С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии нами был измерен суммарный уровень биогенных аминов в стриггуме исследуемых животных (Табл. 1). Было обнаружено, что уровень дофамина был изначально существенно ниже у SAMP1 по сравнению с SAMR1. Этот факт хорошо сочетается с данными о повышенной активности МАО В, окисляющей дофамин. Вероятно, чем выше активность МАО В, тем меньше наблюдаемый уровень дофамина в тканях.

Уровень других биогенных аминов у животных достоверно не различался. Поскольку известно, что локомоторная активность зависит от норадренергической системы, закономерно, что норадреналина у интактных животных SAMP1 и SAMR1 не различается их локомоторная активность.

Введение МРТР приводило к снижению уровня дофг мина в стриатуме у SAMR1, в то время как у SAMP1 он оставался на том же (низком) уровне, как и до введения этого токсина. Мы предполагаем, что в с продукцией свободных радикалов в различных структурах головного мозга (в частности, в черной субстанции) мышей SAMP ь 10 месяцам уже осуществляются нейродегенеративные реакции, что негативно сказывается на уровне дофамина в стриатуме. Это предположение может объяснять низкий уровень этого медиатора.

Под действием МРТР обнаруживалось снижение уровня норадреналина, причем как у быстростареющих мышей, так и у животных контрольной группы. Учитывая, что это явление протекает на фон; снижения уровня дофамина, мы считаем его закономерным, поскольку известно, что норадреналин образуется из дофамина под действием дофамин-ß-гидроксилазы.

Соотношение норадреналин/дофамин в этой области мозга после воздействия МРТР понижалось как у SAMP1, так и у SAMR1, но у первых оно протекало более значительно.

концентрации ie различаются, как

ю

Таблица 1. Изменение уровня катехоламинов в стриатуме мышей 8АММ/8АМР1 под действием нейротоксина МРТР, нмоль/г ткани. * - Р<0,05 (отличия от животных этой же линии, получавших физиол. р-р), # -Р<0,05 (отличия от контрольной линии БАМИ!), ^критерий Стьюдента.

Группы животны X Дофамин Норадренали н Серотони н Норадренали н/ Дофамин

БАМЮ 0,27±0,20 2,5±0,44 2,76±0,1 9,25

БАМт + МРТР 0,052+0,0 7* 0,31±0,16* 2,48±0,5 5,96

БАМР1 0,021+0,0 1# 1,8±0,50# 2,71 ±0,2 85,71#

вАМР1 + МРТР 0,07+0,03 0,33±0,1* 2,8±2,8 4,71*

Полученные данные находятся в полном соответствии с тем, что в мозге 8АМР1 после введения МРТР наблюдается повышенное накопление продуктов окисления липидов и белков (Таблицы 2 и 3). При измерении Ре-индуцированной хемилюминесценции, генерируемой при

свободнорадикальном окислении липидов, мы обнаружили, что мембраны мозга 8АМР1 характеризуются более высоким уровнем предобразованных гидроперекисей и пониженной резистентностью к окислению (в соответствии с чем, лаг-период в развитии хемилюминесценции укорачивается) по сравнению с животными линии БАМЛ! (Таблица 2).

Таблица 2. Окисленность липидов в мембранных препаратах мозга вАМР1 и БАМШ после введения МРТР. "*" - р< 0.05. (Т-критерий Стьюдента)

Группа животных Предобр, перекиси, отн. ед. Устойчивост ь к окислению, сек Скорость окисления, отн. ед. С Окисляемый материал, отн. ед.

SAMR1 99,5+19,1 177±6 1,2410.13 2612118

SAMR1+MP TP 88,67±4,2 140±8 1,30+0,11 1849+18

SAMP1 115,0+10,6 130+9* 1,1010,14 2076+25

SAMP1+MP TP 127,0115,3* 115+2* 2,0310,30* 2162110*

Введение МРТР не приводит к изменению в уровне преобразованных гидроперекисей и скорости окисления у 8АММ, что, по-видимому, связано с активностью антиоксидантной системы, предотвращающей формирование окисленных продуктов, при этом резистентность к окислению падает, то есть имеет место истощение антиоксидантной системы под действием МРТР. В противоположность этому, у 5АМР1, получавших МРТР, увеличен уровень гидроперекисей (на 16%), и еще больше снижается устойчивость к окислению, а также в 2 раза возрастает скорость окисления липидного материала. Таким образом, ясно выражены снижение антиоксидантной защиты и повышенная продукция свободных радикалов, проявляющаяся в увеличении уровня гидроперекисей.

В соответствии с этими сдвигами находится и еще одю интересное наблюдение. Общее количество окисляемого липидного материала оказывается существенно пониженным для мембран мозга линии 8АМР1 по сравнению с линией БАМЮ. Это отчетливо указывает, что состояние окислительного стресса, наблюдаемое у подопытных мышен, индуцирует глубокое окисление мембранных липидов. По этой причине в мембранных препаратах, выделенных из мозга БАМР1 и БАМЮ, в гервом случае обнаруживается гораздо меньшее количество окисляемого материала. Более того, введение МРТР приводит к окислению липидов и сниж количество остаточного окисляемого материала, что механизмом действия МРТР в организме через формирование свободных радикалов, в то время как у БАМР1 он оставляет окисляемый материал на

ает у SAMR1 Согласуется с

том же низком, как и до введения МРТР, уровне. Создается впечатление, что фракция легко окисляемых липидов в мозге БАМР1 значительно окислена еще до введения МРТР.

Таким образом, еще одной причиной большей чувствительности линии 8АМР1 к МРТР может являться сниженная резистентность к окислению, которая обеспечивается истощением антиоксидантной системы.

Известно, что повышенная продукция свободных радикалов может приводить к повреждению различных клеточных структур, включая ДНК, липиды и белки. Для оценки влияния МРТР на состояние белка клетки, мы оценивали концентрацию гидроксильных групп белка.

Уровень окисленных белков, измеренных в митохондриальной фракции и в гомогенате мозга мышей 8АМР1 и ЗАМШ, в обеих группах до внесения МРТР был одинаков. Введение МРТР индуцировало накопление карбонильных групп в белках, и этот параметр возрастал гораздо существеннее у мышей с генетически ускоренным темпом старения (Таблица 3).

Таблица 3. Влияние МРТР на уровень карбонильных групп белка (представлены средние + СОШ, нмоль/мг белка; "*" - Р < 0,05)

Группы животных МРТР Контроль

Гомогенат мозга

8АМШ 0,62 ± 0,02 0,77 ± 0,05

БАМР! 0,58 ± 0,04 1,04 ±0,05*

Митохондриальная фракция мозга

БАМЮ 1,5 ±0,02 1,6 ±0,01

БАМР! 1,5 ±0,01 3,1 ±0,01*

Вызывает интерес то обстоятельство, что уровень карбонильных групп белка гораздо выше во фракции митохондрий, чем в целом гомогенате, позволяя предполагать, что митохондриальные белки повреждаются в первую очередь. Это также соответствует представлениям о характере вовлечения МРТР в генерацию свободных радикалов, в котором принимает активное участие митохондриальная МАО В (Корт и, й. а1. 1987). Вероятно, что, в связи с тем, что МРТР превращается в МРР-радикал непосредственно в митохондриях, именно они и повреждаются в первую очередь.

Физиологическа характеристика

Помимо биохимических изменений, мы наблюдали физиологических параметров. Введение МРТР вызывало снижение веса и ригидности, но только в группе SAMP1. Известно, что МРТР сильнее действует на старых животных. Наши данные г олностью это подтверждают. Необходимо отметить, что свой вклад чувствительность SAMP1 к МРТР вносит и дисбаланс проо антиоксидантной систем, проявляющийся в повышенной продукции свободных радикалов.

Вес животных. На Рис. 6 представлена разница в весе животных до и после введения МРТР в различных экспериментальных группах животных. Наибольшее снижение веса наблюдалось у мышей линии SAMP1, которым вводили МРТР.

Ригидность. На Рис. 7 представлены измерения ригидности в различных экспериментальных группах животных. Ригидност ь определяли как уменьшение расстояния от шеи до основания хвоста животных. Статистически достоверное изменение ригидности наблюдаюсь только у животных линии SAMP1, которым вводили МРТР.

и изменения достоверное

в большую ксидантной и

SAMR1 контроль SAMR1+MPTP SAMPI+контроль SAMPI+MPTP

Рис. 6. Влияние МРТР на вес экспериментальных животных

7-1

л &

о

л

ш

1до введения

I после введения

1_

БАММ контроль 5АМ1?1 + МРТР БАМР! контроль Т5АМР1 + МРТР

Рис. 7 Влияние МРТР на ригидность экспериментальных животных. Ригидность определяли как уменьшение расстояния от шеи до основания

хвоста

Горизонтальная локомоторная активность. На Рис. 8 представлен график локомоторной активности различных экспериментальных групп животных. Локомоторная активность определялась в тесте «норковая камера» как число квадратов, которые животное пересекало за время теста.

л.

X

■ до введения I после введения

X

1

I

ЭАМт контроль вАМЯ1 + МРТР 8АМР1 контроль 8АМР1 + МРТР

Рис. 8. Влияние МРТР на локомоторную активность экспериментальных животных

вАМГН контроль вАММ + МРТР вАМР1 контроль вАМР1 н МРТР

Рис. 9 Влияние МРТР на вертикальную активность экспериментальных

животных

тую

Изначально группы БАМП и ЗАМШ не различались по Локомоторной активности. Введение МРТР достоверно снижало локомотор БАМЮ в среднем на 39%, тогда как в случае БАМР1 - на 68 локомоторной активности указывает на возникновение индуцир; повреждений в области черной субстанции и в ответственной зе дофаминергической системе, что характерно для парки синдрома и описывалось многими исследователями. Необхсда что, судя по полученным данным, дофаминергическая система у БАМР1 в большей степени, чем у БАМЮ. Это может быть повышенной продукцией свободных радикалов, так и со активностью антиоксидантной системы, поскольку из дофаминергическая система очень чувствительна к окислительн

Вертикальная локомоторная активность, локомоторная активность определялась в тесте «норковая камеЬ; стоек животного за время тестирования. При исследовании активности животных не было найдено достоверных отх группами до введения МРТР. Введение нейротоксина вертикальную активность у БАМИЛ на 54%, а у БАМР1 - на образом, и в этом случае мы видим большее влияние нейи БАМРЬ

Исследовательская активность. Данный физиологический параметр определялся как число заглядываний животным в норки в тесте «норковая камера». При анализе исследовательской активности, мы обнаружили

активность Уо. Снижение уемых МРТР эти функции нсонического мо отметить, ювреждалась связано как с сниженной зестно, что ому стрессу. Зертикальная а» как число вертикальной ичий между снижало 68%. Таким отоксина на

различия между двумя группами: животные БАМР1 проявляли исследовательскую активность на 54% меньше, чем ЗАМШ. Вероятно, в основе этих различий лежит истощенное состояние антиоксидантной системы, приводящее к поражению различных клеточных структур. Достоверного влияния МРТР обнаружено не было, что хорошо коррелирует с данными литературы.

£ &

о

20-

* х

& г

к л

а! 1°н

с со 3 п

и

э*

5 о

и

3 до введения I после введения

X

Лл

ш ■

ЭАМР1 контроль БАММ + МРТР 8АМР1 контроль ЗАМР1 + МРТР

Рис 10. Влияние МРТР на исследовательскую активность экспериментальных животных

Груминг. При анализе груминга выявилось, что реакция на МРТР у БАМР1 и БАМШ оказалась разнонаправленной: введение нейротоксина снижало этот параметр у БАМЮ на 77% и повышало у ЗАМР1 на 181%. Известно, что груминг коррелирует с уровнем тревожности у животных [Ка1иеГГ АУ й а1., 2005]. Таким образом, очевидно, что МРТР достоверно повышает тревожность у 8АМР1, в то время как у БАМЮ она снижается. В итоге получается, что если судить по трем параметрам теста из четырех, животные линии 8АМР1 более чувствительны к МРТР, что, по-видимому, объясняется слабостью их антиоксидантной системы и повышенной продукцией свободных радикалов.

Снижение двигательной функции и увеличение ригидности считаются в литературе необходимыми физиологическими свидетельствами развития МРТР-индуцированного паркинсонизма [СпапаНг^Иат КК, 2000]. Наши данные подтверждают этот вывод и позволяют считать, что эффект МРТР на БАМ приводит к тем же самым результатам.

Кроме того, действие МРТР на линию 8АМР1 приводит к более выраженным эффектам, чем в случае ЗАМШ, что связано с дисбалансом прооксидантной и антиоксидантной систем, приводящим к различным

[ИЮ

метаболическим нарушениям и преждевременному старей окислительный стресс делает эту группу более восприимчи поскольку в основе действия этого нейротокс свободнорадикальные механизмы.

Вероятно, ¡¿ой к МРТР, ша лежат

6'

5-

и 4-х

о.

и 2Н 1 О'

до введения после введения

Ул

БАМШ контроль ЗАМШ + МРТР 8АМР1 контроль вАМР1 + I

Рис. 11. Влияние МРТР на груминговую активность экспериментальных

животных

Таким образом, использование быстростареющих мыше: МРТР позволило нам продемонстрировать более выражен^ физиологических признаков дегенерации дофаминергически: черной субстанции, по сравнению с контрольными животни факт, по-видимому, объясняется различным состояние антиоксидантных систем, что делает животных Б. чувствительными к окислительному стрессу в мозге, нейротоксином МРТР.

л в опытах с ое развитие [х структур 1ми. Данный м про- и Р1 более аызываемому

ам:

3. Экспрессия глутаматных рецепторов и Ка-траспортера в

МРТР

возбудимых

тканях грызунов

Мы оценивали уровень мРНК различных ионотропных и метаботропных рецепторов в мозжечке 5, 9, и 11-дневных крыс методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (Рис. 12). Различий в экспрессируемых рецепторах между грызунами данных возрастов

обнаружено не было. Список ¡репрессируемых рецепторов представлен в Таблице 4.

Таблица 4. Присутствие мРНК, кодирующей различные типы глутамятных рецепторов.

Группа рецепторов Присутствие

NMDA 1 +

NMDA 2 +

NMDA3 +

АМРА +

Kainate +

mGIuI +

diGIU II +

inGlu III +

Рис. 12. Пример экспрессии иопотропных рецепторов в мозжечке 11-

дневных крыс

Оценку уровня мРНК, кодирующей различные изоформы Na/K-АТФазы, мы проводили тем же методом. Уровень мРНК анализировали в мозжечках 5, 9 и 11-дневных крыс. Различий в характере экспрессии различных изоформ фермента у животных различного возраста обнаружено не было. Была показана экспрессия всех трех изоформ Na/K-АТФазы, причем с заметным преобладанием аЗ, ответственной за сигнальную функцию Na/K-АТФазы.

Рис. 13. Экспрессия изоформ ,\'а/К-А ТФазы в нейронах крыс различного

возраста

Кроме этого мы изучали характер экспрессии изоформ N а/К-А ТФазы в левом желудочке крысы в зависимости от активации р-адренергической системы. С помощью осмотического насоса крысам вводился изопреналин, активатор р-адрснорецепторов. При определении веса различных отделов сердца в контрольной и экспериментальной группах животных, нами была обнаружена гипертрофия левого желудочка сердца. Проанализировав экспрессию Ыа/К-АТФазы в этом желудочке, мы обнаружили снижение экспрессии а2 изоформы фермента, в то время как уровень экспрессии а! не изменялся (Рис. 14).

Экспрессия изоформы аЗ также была обнаружена, однако ее уровень был очень низок. Вероятно, что эта изоформа представлена лишь в проводящей системе сердца (волокна Пуркинье), составляющей очень малую по объему часть органа. По-видимому, именно с этим обстоятельством связан исключительно низкий уровень аЗ изоформы фермента.

Для того чтобы получить больше информация об изменении основных ферментов ионного гомео стаза под влиянием бета-адренорецепторов, мы анализировали экспрессию Ыа/Са-обменника (Рис. 15). Мы обнаружили, что под влиянием изопрсналина происходит снижение экспрессии МЙСа-обменника.

12.5-1

X 30-

10-

<

О 20-

0-

■

Контроль Изопреналин

Альфа 1 Альфа 2

изоформы Ыа/К-АТФазы

Рис. 14 (слева). Влияние изопреналина на экспрессию изоформ Na/K-АТФазы в сердце крыс (белые столбики - контроль, черные -экспериментальная группа животных) Рис. 15 (справа). Влияние изопреналина на экспрессию N.а/Са-обменника в сердце крыс (белые столбики — контроль, черные - экспериментальная

группа животных)

Таким образом, нам удалось показать, что в сердечной ткани экспрессия таких важнейших ферментов ионного гомеостаза, как Иа/К-АТФаза и Ыа/Са-обменник, находится под контролем Р-адренергической системы.

4. Влияние рецепторов на активность №/К-АТФазы

Мы исследовали влияние различных концентраций ИМБА на активность Ыа/К-АТФазы нейронов мозжечка крысы. Нами было обнаружено, что активность Ыа/К-АТФазы падает с увеличением концентрации >ШОА, причем при добавлении в реакционную смесь 1 мМ цистеина активность Ыа/К-АТФазы восстанавливается (Рис. 16).

110-1 1009080706050' 40' 3020100

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.S 0.6 0.7 0.8 0.9 1 mM NMDA

Рис 16. Влияние NMDA на активность Na/K-АТФазы в нейронах мозжечка крысы

Вероятно, ЫМЭА влияет на активность Иа/К-АТ образование активных форм кислорода (Рис. 17), которы окислять цистеины, входящие в состав цитоплазматической АТФазы. Эффект NMDA на образование активных форм кис. сниматься 10 цМ дизоцилпина (МК-801), являющегося ЫМБА-регулируемых каналов.

130-1 ¡с 120© 110-< 100'

о; s з

X &

о

2L

о >>

с; в

—р-0.3

—г-

0.5

mM NMDA

МК-801

Рис 17. Влияние NMDA на образование активных форм кислорода в нейронах мозжечка крыс

Фазы через .ie способны части Na/K-Лорода может антагонистом

Сопоставление концентрационной зависимости обоих процессов показывает, что ингибирование Иа/К-АТФазы ЫМБА достигает наибольшей величины уже при концентрации этого лиганда, составляющей 0,5 мМ, в то время как рост уровня активных форм кислорода продолжается при дальнейшем увеличении концентрации №уША (Рис. 16, 17). По-видимому, это означает, что Ыа/К-АТФаза, остающаяся в суспензии нейронов после их активации 0,5 мМ ЫМБА, не чувствительна к АФК.

Известно, что в тканях мозга присутствуют несколько изоформ Ма/К-АТФазы, различающихся по содержанию и локализации сульфгидрильных групп в молекуле. Одна из них (а1) относительно резистента к уабаину и более устойчива к свободнорадикальному окислению; другие изоформы (а2+аЗ), чувствительные к уабаину, содержат более доступные для модификации БН-группы и окисляются активными формами кислорода в первую очередь. Хотя в онтогенезе мозга (а2+аЗ) изоформы появляются позже, чем а1, в мозге 8-12-дневных крыс уже присутствуют все 3 изоформы фермента (Рис. 13). Принимая во внимание тот факт, что в мозжечке крыс этого возраста Иа/К-АТФазы представлена в основном (а2+аЗ) изоформами (Рис. 13), можно предположить, что окисляемая в условиях активации ИМИА-рецепторов доля Ыа/К-АТФазы представлена также в основном а2 и аЗ изоформами, так как ее активность подавляется при генерации активных форм кислорода и восстанавливается при внесении 1 мМ цистеина. То обстоятельство, что нейрональная Иа/К-АТФаза доступна для активных форм кислорода, генерируемых в ответ на активацию нейронов ЫЗУГОА, указывает на возможное физиологическое значение регуляции №-насоса свободными радикалами.

Выводы

1. В нейронах мышей линии БАМП обнаружено образование активных форм кислорода, сопровождающееся активности супероксиддисмутазы и повышенной моноаминооксидазы В.

2. Ыа/К-АТФаза контролирует генерацию активных форм нейрональных клетках, и окислительный стресс нарушает этот

3. Окислительный стресс, индуцируемый МРТР окислительную модификацию липидов и белков головного мо нарушениям физиологического поведения животных.

4. Матричная РНК, кодирующая различные изоформы N. глутаматных рецепторов в мозге грызунов появляется на этапах постнатального развития.

5. Экспрессия Ыа/К-АТФазы, по-видимому, находится г адренергической системы, причем наиболее чувствительна к а2-изоформа фермента.

6. Обнаружено взаимодействие между глутаматными КМБА-класса и Na/K-ATФaзoй, выражающееся во взаимном функциональным состоянием.

7. Активация ЫОМА-рецепторов приводит к увеличению уровня активных форм кислорода в нейрон; Положительный вклад в увеличении продукции активных вносит также NMDA-зaвиcимoe ингибирование Ыа/К-АТФазы.

повышенное подавлением активацией

кислорода в контроль.

вызывает зга, приводя к

а/К-АТФазы и :амых ранних

до 31

од контролем ому контролю

рецепторами сонтроле за их

:ал]

о-зависимому ьной клетке.

форм кислорода

Список публикаций по теме диссертации

1. Бастрикова Н.А., Сорокина Е.В., Казей В.И., Федорова Т.Н., Стволинский- C.JL, Болдырев А. А. Модель паркинсонизма, вызываемого введением нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МРТР) быстростареющим мышам линии SAMP1. // Нейрохимия, 2002,19,247-253.

2. Sorokma E.V., Bastrikova N.A., Kazey V.I., Stvolinsky S.L., Fedorova T.N., Boldyrev A.A. MPTP effects in vivo on some biochemical parameters in SAM brain. // Annual reports on SAM studies, 2002,18, 115-116.

3. Kazey V.I., Fedorova T.N. Influence of MPTP on lipid oxidation in the brain of senescence accelerated mice. // Abstracts of the 9th International Symposium of Cerebral Ischemia, Marburg, Germany (2002), p. 24.

4. Kazey V., Petrushanko I., Bulygina E. Na/K-ATPase participates in regulation of ROS level in neuronal cells. // Proc. Physiol. Soc. Spring Workshop, Budapest (Hungary), (2003) p. 39.

5. Bastrikova N., Sorokina E., Kazey V., Fedorova Т., Boldyrev A., MPTP-induced changes in senescence accelerated mice. // Zbornik (Collection dedicated to Prof. Dusan Vuchelich), D. Suznjevic, et al. (Eds.) Holding Inst. Gen. Phys. Chem. Beograd, 2003, pp. 159-170.

6. Kazey V., Tuneva E., Boldyrev A.A., Production of reactive oxygen species by cerebellum granule cells isolated from senescence accelerated mice. // International Congress Series 1260 (2004) 245-249.

7. Boldyrev A., Kazey V., Leinsoo Т., Mashkina A., Tyulina O., Johnson P., Tuneva J., Chittur Sh., Carpenter D. Rodent lymphocytes express functionally active glutamate receptors. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 324. P. 133-139.

8. Казей В.И., Шайнер-Бобис Г. Влияние изопреналина на экспрессию Ыа-транспортирующих белков в кардиомиоцитах крысы. // Биологические мембраны, 2006, том 23, N 3, стр 212-216

9. Болдырев А.А., Булыгина Е.Р., Казей В.И., Куликов А.В., Maxpo А.В., Соколова Н.А., Степанова М.С. Молекулярные механизмы экзайтотоксичности глутамата. // в материалах конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности центральной нервной системы» Пенза,(2006). С. 38-40.

Краткая аннотация диссертационной работы В.И. Казея ««Роль глутаматных рецепторов и ^'а/К-насоса в регуляции окисг ительного

стресса »

OQ

ка:

Диссертационная работа Казея В.И. посвящена фуь взаимосвязи глутаматных рецепторов и Ыа/К-АТФазы, активными формами кислорода (АФК). Работа выполнялась гранулярных клетках мозжечка мозга быстростареющих м SAMP1 и контрольной линии SAMR1, так и in vivo на этих я Основными результатами работы являются данные, свидетель' экспрессии глутаматных рецепторов и Na/K-АТФазы постнатальном развитии грызунов, контроле экспрессии Na/K-стороны бета-адренергической системы, активном участии Na/ контроле образования АФК, и функциональном взаимодей АТФазы и глутаматных рецепторов в процессах реализации ок стресса. Также диссертантом показаны различия в уровне про между животными SAMP1 and SAMR1.

кциональнои ¡условленной к in vitro на лшей линии :е животных, твующие об в раннем АТФазы со К-АТФазы в ствии Na/K-(слительного цукции АФК

Summary of Ph.D. thesis by V.Kazey entitled "Role of glutamate receptors and Na/K-ATPase in regulation of oxidative st/ess"

Doctorate thesis is dedicated to the functional relation glutamate receptors and Na/K-ATPase. In vitro experiments were cai cerebellum cells derived from the senescence accelerated mice strain SAMR1, the same animals were used for m vivo experiments. The the work include data showing expression of glutamate recepto ATPase in early postnatal development of rodents, evidence that b system controls expression of Na/K-ATPase in cardiomiocytes, dem Na/K-ATPase controls generation of reactive oxygen species, relationship between Na/K-ATPase and glutamate receptors. The dal the thesis also shows significant difference in the level of generati oxygen species between SAMP1 and SAMR1 mice.

ship between u Tied out using s SAMP1 and am results of s and Na/K-sta-adrenergic )n strati on that functional a presented in )n of reactive

n¡

Принято кисполнению 02/03/2007 Исполнено 05/03/2007

Заказ № 153 Тираж: 120 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495)975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Казей, Василий Игоревич

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

РАЗДЕЛ I. РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В АДАПТАЦИИ К ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ.

1.1. СИГНАЛЬНАЯ ФУНКЦИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В

ВОЗБУДИМЫХ ТКАНЯХ.

I.II. ГЛУТАМАТНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И РЕГУЛЯЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В МОЗГЕ.

I.III. МИШЕНИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В ЖИВОЙ КЛЕТКЕ.

РАЗДЕЛ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

II. I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

11.1.1. Животные.

11.1.2. Протокол введения исследуемых соединений.

11.1.3. Физиологические методы исследования.

11.1.4. Выделение нейронов из мозжечка мышей и крыс.

11.1.5. Определение концентрации белка.

11.1.6. Определение ферментативных активностей.

11.1.7. Определение концентрации биогенных аминов.

11.1.8. Определение окисленности белков.

11.1.9. Хемилюминесцентный анализ АФК.

11.1.10. Измерение уровня Fen-индуцированной хемилюминесценции.

ILL11. Определение уровня мРНК к Na/K-A ТФазе и глутаматным рецепторам.

II.1.12. Статистическая обработка результатов.

II.II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

II.II. 1. Продукция свободных радикалов нейронами грызунов.

11.11.2. Влияние МРТР на биохимические характеристики мозга грызунов.

11.11.3. Влияние МРТР на физиологические параметры животных.

11.11.4. Экспрессия глутаматных рецепторов и Na-mpacnopmepa в возбудимых тканях грызунов.

11.11.5. Взаимное влияние Na/K-АТФазы и глутаматных рецепторов.

РАЗДЕЛ III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

РАЗДЕЛ IV. ВЫВОДЫ.

РАЗДЕЛУ. БЛАГОДАРНОСТИ.

РАЗДЕЛ VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

Сокращения, принятые в тексте диссертации для обозначения радикальных продуктов и химических групп, соответствуют рекомендации Комиссии по биохимической номенклатуре IUPAC.

Другие сокращения, используемые в диссертации:

ACPD - 1-аминоциклопентан-1,3-дикарбоновая кислота

АМРА - а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изооксазолпропионовая кислота

DHPG - 3,4-дигидроксифенилгликоль

DNP - динитрофенилгидразин dNTP - смесь дезоксинуклеотидов АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ.

GAPDH - глицеральдегид-3 фосфат дегидрогеназа

GPCR - G-protein coupled receptors, рецепторы сопряженные с Gбелками mGluI (II,III) - глутаматные рецепторы 1,11,III групп соответственно M-MLV-RT - обратная транскриптаза вируса саркомы Молони грызунов.

МРТР - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин NMDA - N-метил-О-аспартат OD - оптическая плотность

SAM(P/R) - Senescence Accelerated Mice (Prone/Resistant), линия мышей с ускоренным старением (склонные/устойчивые)

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

АФК - активные формы кислорода

ДОБА - диоксибензиламин кДНК - кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота МАО А, В - моноаминооксидаза А, В соответственно МДА - малоновый диальдегид мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота мтДНК - митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота

НСТ - нитросиний тетразолий

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СОД - супероксиддисмутаза

СОШ - стандартная ошибка среднего

ТАЕ - трис-ацетат-ЭДТА буфер

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ФМА - форбол 12-миристат 13-ацетат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль глутаматных рецепторов и Na/K-насоса в регуляции окислительного стресса"

Окислительный стресс, являющийся следствием дисбаланса про-и антиоксидантных систем клетки и отражающийся в избыточном образовании в клетке активных форм кислорода (АФК), может являться причиной повреждения различных структур: ДНК, белков и липидов, и может приводить к клеточной смерти. Окислительный стресс сопровождает многие нейродегенеративные заболевания, по этой причине АФК принято считать вестниками клеточной смерти.

Однако в последнее время стало понятно, что активные формы кислорода принимают участие и в нормальной жизнедеятельности клетки в качестве сигнальных молекул. Так, реакции образования супероксид-аниона и гипохлорита клетками иммунной системы используется организмом при защите от инфекций и опухолевых процессов. Свободные радикалы, возникающие в цитозоле клетки в ответ на ее стимуляцию факторами роста, участвуют в регуляции процесса пролиферации. Образование простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов требует участие супероксид аниона, взаимодействующего с другим компонентом этой системы, арахидоновой кислотой - соединением, высвобождающимся из мембранных фосфолипидов в ходе индуцируемого АФК перекисного окисления липидов (ПОЛ). Недавно показано, что АФК, наряду с другими факторами, способны активировать такой транскрипционный фактор, как NF-кВ, что приводит к экспрессии различных белков.

Для исследования окислительного стресса применяются различные экспериментальные подходы, позволяющие выяснить молекулярные механизмы этого процесса как in vitro, так и in vivo. В настоящей работе мы использовали линию животных с ускоренным процессом старения SAMP1 (Senescence Accelerated Mice Prone, Strain 1), выведенную путем близкородственных скрещиваний из линии AKR/J. Характерной особенностью этой линии является то, что животные нормально развиваются до 4-х месячного возраста, после чего наступает фаза ускоренного накопления старческих признаков, обусловленных повышенной продукцией АФК. Истинным контролем к данной линии является линия SAMR1 (Resistant), также выведенная из линии AKR/J (Takeda, 1994).

Для моделирования окислительного стресса in vitro мы использовали N-метил-О-аспартат, NMDA, - соединение, активирующее одноименную группу ионотропных глутаматных рецепторов. Инкубируя выделенные из мозжечка нейроны мышей линии SAMP1 и крыс с различными концентрациями NMDA, мы наблюдали доз о- и время-зависимое увеличение продукции АФК.

Достаточно давно известно, что центральный фермент ионного гомеостаза, Ыа/К-АТФаза, также может принимать участие в процессах окислительного стресса, однако в литературе отсутствует систематическое исследование роли Ыа/К-АТФазы в этом процессе и ее функциональной связи с другими клеточными системами, принимающими участие в реализации окислительного стресса.

Целью настоящей работы явилось установление связи между глутаматными рецепторами, окислительным стрессом и Na/K-АТФазой.

Следующие задачи были сформулированы для достижения этой цели: 1) оценить продукцию АФК в клетках мозжечка двух исследуемых линий животных; 2) оценить влияние глутаматных рецепторов и Ыа/К-АТФазы на развитие окислительного стресса; 3) оценить влияние АФК на физиологические и биохимических параметры животных; 4) охарактеризовать взаимодействие между глутаматными рецепторами и Ыа/К-АТФазой.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Казей, Василий Игоревич

РАЗДЕЛ IV. ВЫВОДЫ

1. В нейронах мышей линии SAMP1 обнаружен повышенный уровень активных форм кислорода, коррелирующий с пониженной активностью супероксиддисмутазы и повышенной активностью моноаминооксидазы В.

2. Na/K-АТФаза контролирует генерацию активных форм кислорода в нейрональных клетках, и окислительный стресс нарушает этот контроль.

3. Окислительный стресс, индуцируемый МРТР, вызывает окислительную модификацию липидов и белков головного мозга, приводя к нарушениям физиологического поведения животных.

4. Экспрессия Na/K-АТФазы и глутаматных рецепторов в мозге грызунов проявляется на самых ранних этапах постнатального развития, обеспечивая взаимодействие этих белков в процессе контроля за окислительным стрессом.

5. Экспрессия Na/K-АТФазы в кардиомиоцитах крысы находится под контролем АФК, причем наиболее чувствительна к этому контролю альфа 2 изоформа фермента.

6. Обнаружено взаимодействие между глутаматными рецепторами NMDA-класса и Ыа/К-АТФазой, выражающееся во взаимном контроле их функционального состояния.

7. Активация NDMA-рецепторов приводит к дозозависимому увеличению уровня АФК в нейрональной клетке. Положительный вклад в увеличении продукции АФК вносит также NMDA-зависимое ингибирование Na/K-АТФазы.

РАЗДЕЛУ. БЛАГОДАРНОСТИ

Я бы хотел выразить благодарность моему научному руководителю профессору Александру Александровичу Болдыреву за внимание, помощь, предоставленную возможность работать и терпение. Без его участия настоящая работа не могла бы быть выполнена.

Я также благодарен сотрудникам лаборатории нейрохимии Института неврологии РАМН: Татьяне Николаевне Федоровой и Сергею Львовичу Стволинскому, а также сотрудникам кафедры биохимии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова: Елене Романовне Булыгиной, Ольге Владимировне Тюлиной и Томасу Аадоевичу Лейнсоо за ценные советы при обсуждении результатов и полезную дискуссию при подготовке этой диссертационной работы. Моя особая благодарность - коллегам из Гиссенского Университета - профессору В. Шонеру и профессору Г. Шайнер-Бобису за гостеприимство и руководство в овладении методами молекулярной биологии.

Огромное спасибо всем сотрудникам кафедр физиологии человека и животных и биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова за помощь в выборе жизненного пути и полученную радость от работы.

РАЗДЕЛ III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе мы проводили исследование основных механизмов развития и регуляции окислительного стресса в возбудимых тканях. В качестве основного объекта исследования мы использовали мышей линии SAMP1, характеризующихся ускоренным старением по сравнению с контрольной линией SAMR1. Ускоренное старение мышей линии SAMP1, проявляющееся в возрасте 4-6 месяцев, характеризуется потерей двигательной активности, алопецией, лордокифозом, системным амилоидозом и прочими возрастными нарушениями. Ускоренное старение мышей этой линии может быть обусловлено дисбалансом работы про- и антиоксидантных систем клетки, проявляющимся в повышенном уровне продукции АФК. Это обстоятельство делает эту линию мышей удобной при изучении механизмов окислительного стресса. В опытах in vitro мы использовали нейрональные клетки мышей линии SAMP1 и контрольной к ней линии SAMR1. Нейрональные клетки были выбраны как наиболее чувствительные к действию АФК структуры, в которых можно значительно раньше наблюдать изменения метаболических процессов по сравнению с другими тканями. Хемилюминесцентным методом у мышей обеих линий (SAMP1 и SAMR1) нами был измерен стационарный и индуцированный ФМА и NMDA уровень АФК и показано, что нейрональные клетки, выделенные из мозжечка 12-дневных мышей SAMP1, характеризуются достоверно более высоким уровнем АФК, чем нейроны, выделенные из мозжечка контрольных животных. Таким образом, мы показали, что повышение продукции АФК в нейрональных клетках SAMP1 наблюдается на более ранней стадии онтогенеза, чем те, при которых у этих животных можно найти

86 отклонения в поведении или обучаемости - накопление старческих признаков у мышей этой линии наблюдается только с 4-месячного возраста, и в возрасте 12 дней животные исследуемых групп по морфологическим признакам неразличимы между собой. Другими словами, увеличение стационарного и индуцируемого уровня АФК в тканях предшествует появлению видимых дефектов организма и может рассматриваться как одна из причин, вызывающих эти дефекты.

При инкубации нейрональных клеток с различными концентрациями специфического ингибитора Na/K-АТФазы уабаина мы наблюдали, что в нейрональных клетках SAMP1, для которых характерен изначально повышенный уровень АФК, внесение уабаина не приводило к существенному росту АФК, в то время как в случае с нейронами SAMR1 наблюдалось повышение продукции АФК в интервалах концентрации уабаина до 10 мкМ включительно, а при большей концентрации уабаина (1 мМ) обнаруживалось некоторое снижение уровня АФК. Этот факт свидетельствует об участии Na/K-АТФазы в процессах регуляции уровня АФК в нейрональных клетках.

Мы также анализировали влияние NMDA-рецепторов на уровень АФК в нейрональных клетках мышей линии SAMP1. Обнаружилось, что инкубация клеток с агонистом NMDA-рецепторов N-метил-О-аспартатом приводит к увеличению уровня АФК в нейрональных клетках как SAMR1, так и SAMP1, причем у последних этот эффект был более выражен, вероятно, из-за сниженного уровня антиоксидантной защиты.

Для того чтобы убедиться, что в нейрональных клетках 5-дневных животных экспрессируются и глутаматные рецепторы и Na/K-АТФаза, мы проанализировали уровень матричной РНК кодирующей соответствующие белки. Анализ показал, что в нейрональных клетках мозжечка присутствует матричная РНК, кодирующая большинство ионотропных, и метаботропных глутаматных рецепторов (за исключением каинатных рецепторов II класса). В нейрональных клетках присутствует также матричная РНК к альфа-1, альфа-2, и альфа-3 субъединицам Na/K-АТФазы, причем количество матричной РНК, кодирующей альфа-3 (сигнальную) субъединицу, обнаруживается в количестве большем, чем мРНК к альфа-1 и альфа-2 субъединицам Na/K-АТФазы. Существенных различий в характере экспрессии Na/K-АТФазы в мозжечке между 5-, 9- и 11-дневными животными мы не выявили.

Классические исследования о вовлечении Na/K-АТФазы в сигнальные пути проводились на кардиомиоцитах крысы (Kometiani et al, 1998, Xie et al, 1999). Этот же объект мы использовали для того, чтобы продемонстрировать влияние окислительного стресса на уровень экспрессии Na/K-АТФазы. Для индукции окислительного стресса мы использовали изопреналин, являющийся агонистом бета-адренорецепторов, поскольку известно, что системное введение изопреналина вызывает рост АФК в кардиомиоцитах (Zhang et al, 2005). Выяснилось, что в ответ на системное введение изопреналина в кардиомиоцитах крысы наблюдается снижение количества матричной РНК, кодирующей альфа-2 субъединицу Na/K-АТФазы, при этом уровень мРНК к альфа-1 субъединице остается неизменным. Матричная РНК, кодирующая альфа-3 субъединицу Na/K-АТФазы, также была обнаружена в сердечной ткани, однако ее количество было очень небольшим. Вероятно, сигнальная функция этой субъединицы проявляется преимущественно в проводящей системе сердца (волокна Пуркинье).

Таким образом, нами показано, что в нейрональных клетках мозжечка грызунов исследованного нами возраста экспрессируются и глутаматные рецепторы, и Na/K-АТФаза, и эти белки принимают непосредственное участие в развитии и регуляции окислительного стресса, причем ионотропные глутаматные рецепторы влияют на активность Na/K-АТФазы посредством АФК. Показано также, что помимо прямого влияния на активность Na/K-АТФазы, АФК также контролируют экспрессию альфа-2 субъединицы этого белка в кардиомиоцитах крысы.

В качестве фактора усиления окислительного стресса у исследованных животных мы использовали нейротоксин МРТР, индуцирующий окислительный стресс в мозге грызунов (Sriram et al, 1997) и вызывающий симптомы паркинсонизма у приматов и грызунов (Burns et al., 1983). Систематическое введение животным этого нейротоксина приводило к изменению их физиологических и биохимических параметров. Так, после введения МРТР у животных линии SAMP1 выявлялся кратковременный тремор, значительно снижалась масса тела и увеличивалась мышечная ригидность (по сравнению с SAMR1). Двигательная активность снижалась у животных обеих групп, но более выраженным это снижение было у SAMP1. Исходя из более явного изменения их физиологических параметров, можно предположить, что животные линии SAMP1 в большей степени подвержены действию МРТР, и эти изменения указывают на возникновение индуцируемых МРТР повреждений в области черной субстанции мозга (Sedelis et al, 2000).

Концентрация дофамина в стриатуме, измеренная нами методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, была настолько низка у SAMP1, что введение МРТР существенно не влияло на нее, в то время как в группе SAMR1 мы наблюдали существенное снижение уровня дофамина (практически на порядок) - до той же величины, что и у SAMP1. Концентрация норадреналина в тканях мозга зависит от содержания дофамина, в связи с этим закономерно выглядит как исходно сниженная концентрация норадреналина у SAMP1, так и ее снижение у животных обеих экспериментальных групп после введения МРТР.

Активность МАО В, изначально повышенная у мышей линии SAMP1, еще более возрастала при введении МРТР, что, очевидно, сказывалось как на уровне дофамина, так и на степени превращения МРТР в МРР+-радикал в исследуемых разделах мозга.

В мозге животных, получавших МРТР, наблюдалось увеличение уровня липидных гидроперекисей, ускорение окисления липидов и снижение их резистентности к окислению, что, по-видимому, связано с истощением антиоксидантной системы, которая должна предотвращать накопление окисленных продуктов. Эти изменения были демонстративно представлены в группе животных SAMP1, в то время как у SAMR1 количество липидных гидроперекисей в мозге не изменялось, а резистентность к окислению снижалась незначительно.

Вызванное МРТР снижение активности антиоксидантной системы удалось выявить и при измерении активности СОД. После введения МРТР активность СОД снижалась в обеих группах животных, что свидетельствует об истощении антиоксидантной системы, причем в случае SAMP1 эта система исходно характеризовалась меньшей эффективностью.

Дополнительным доказательством недостаточности антиоксидантной системы в мозге SAMP1 могут служить данные по количеству карбонильных групп белка в тканях мозга. Введение МРТР достоверно повышало концентрацию карбонильных групп и в гомогенате, и в митохондриях мозга SAMP1, но не SAMR1. Необходимо отметить, что концентрация карбонильных групп в митохондриальной фракции мозга была выше, чем в целом гомогенате, что, вероятно, связано с направленным действием МРТР в первую очередь на митохондрии - ведь именно митохондриальная МАО В осуществляет превращение МРТР в МРР+-радикал.

В результате проделанной работы нам удалось показать, что окислительный стресс, вызываемый МРТР, оказывает существенное влияние как на биохимические, так и на физиологические параметры грызунов, причем мыши линии SAMP более подвержены действию этого индуктора окислительного стресса. Повышенная продукция АФК при окислительном стрессе может контролироваться как Na/K-АТФазой, так и глутаматными рецепторами, в частности NMDA-рецепторами. Кроме того, активность Na/K-АТФазы находится под опосредованным АФК контролем NMDA рецепторов. В кардиомиоцитах АФК также контролируют уровень мРНК кодирующей альфа-2 изоформу Na/K-АТФазы.

Настоящая работа дополняет известную картину развития окислительного стресса в возбудимых тканях, позволяя получить более полную картину механизмов, участвующих в повреждении возбудимых клеток при нарушениях снабжения кислородом этих клеток. Понимание молекулярных реакций, реализующихся в ходе окислительного стресса, является основой для выработки адекватных подходов для защиты мозга и сердца от окислительного стресса и его последствий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Казей, Василий Игоревич, Москва

1. Болдырев А. А. Карнозин: биологическое значение и возможности применения в медицине. М.: Изд-во МГУ. - 1998. - 320 с.

2. Болдырев А. А. Карнозин и защита тканей от окислительного стресса. М.: Диалог-МГУ. - 1999. - 362с.

3. Болдырев А.А. Дискриминация между апоптозом и некрозом нейронов под влиянием окислительного стресса.// Биохимия. -2000.-Т.65.-стр. 981-990.

4. Болдырев А. А. Окислительный стресс и мозг. // Соросовский Образовательный Журнал. 2001. - Т. 7. - № 4. - с. 21-28.

5. Болдырев А. А., Курелла Е.Г., Павлова Т.Н., Стволинский C.JI., Федосова Н.У.// Биологические мембраны. М. - 1992. - с. 92-93.

6. Болдырев А.А., М.О.Юнева, Е.В. Сорокина, Г.Г. Крамаренко, Т.Н.Федорова, Г.Г. Коновалова, и В.З. Ланкин. Антиоксидантные системы в тканях мышей с ускоренным темпом старения (SAM, Senescence Accelerated Mice).// Биохимия. 2001. - Т. 66. - стр. 1157-1163.

7. Булыгина Е.Р., Ляпина Л.Ю., Болдырев А.А. Активация глутаматных рецепторов ингибирует Na/K-АТРэзу гранулярных клеток мозжечка.// Биохимия. 2002. - Т.67. - стр. 1209-1214.

8. Бурчинский С. Г., Кузнецова С. М. Моноаминооксидаза мозга и ее ингибиторы в геронтологии. // Вопросы мед. Химии. -1988.-Т. 34.-Вып.4. -с. 2-9.

9. Владимиров Ю. А., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция клеток животных.// Итоги науки и техники. Серия Биофизика. 1989. - т. 24.-с. 172.

10. Владимиров Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты. // Вестник РАМН. 1998.- Т. 7. - с. 43-51.

11. Дурнев А., Середенин С. Мутагенез, скрининг и фармакологическая профилактика.// Медицина: М. -1999.

12. Зенков Н. К., Ланкин В. 3., Меныцикова Е. Б. Окислительный стресс.// МАИК.- 2001. -343 с.

13. Крыжановский Г. Н., Карабань И. Н., Магаева С. В., Карабань Н. В. Компенсаторные и восстановительные процессы при паркинсонизме.//Киев.- 1995. -139с.

14. Кудрин В. С., Мирошниченко И. И., Раевский, К. С. Различия в механизмах ауторецепторной регуляции биосинтеза и высвобождения дофамина в подкорковых структурах мозга крыс.// Нейрохимия. 1988. - Т. 7. -№1. - с. 3-9.

15. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Лемешко В.В., Шерматов К., Калиман П.А., Вихерт A.M. Возрастные изменения активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в цитозоле и митохондриях печени крыс.// Бюлл. Экспер. Биол. Мед. -1981. -Т. 92.-е. 310-311.

16. Ланкин В. 3., Тихазе А. К., Беленков Ю. Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях. // НИИ кардиологии им. Л.А. Мясникова, пособие для врачей. М., РКНПК МЗ РФ, 2001, 78, стр. 14-39.

17. Лопина О.Д. Взаимодействие каталитической субъединицы Na,K-ATPa3bi с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами.// Биохимия. 2001. - T.66.N0 10. - стр. 1122-1131.

18. Минеева М.Ф., Стволинский С.Л. Влияние гистидинсодержащих дипептидов на тирозингидроксилазу мозга.// Бюл. эксп. биол. мед. 1996.-Т. 121.-№4. -с. 420-422.

19. Мирошниченко И. И., Кудрин В. С., Раевский К. С. Влияние карбидина, сульпирида и галоперидола на содержание моноаминов и их метаболитов в структурах головного мозга крыс.// Фармаколог, и Токсикол. 1988. - Т 2. - с. 26-29.

20. Сорокина Е.В., Бастрикова Н.А., Стволинский С.Л., Федорова Т.Н. Эффекты карнозина и селегилина при паркинсонизме, вызванном введением МРТР мышам линии SAM.// Нейрохимия. -2003. Т. 20. - стр. 133-138.

21. Федорова Т. Н., Болдырев А. А. и Ганнушкина И. В. Перекисное окисление липидов при экспериментальной ишемии мозга.// Биохимия. 1999. - Т. 64. - стр. 94-98.

22. Agarwal S., and Sohal R. S. Differential oxidative damage to mitochondrial proteins during aging.// Mech. Ageing Dev. 1995. - v. 85. - pp. 55-63.

23. Aiba, А., Капо, M., Chen, C., Stanton, M. E., Fox, G. D., Herrup, K., Zwingman, T. A. and Tonegawa, S. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluRl mutant mice.// Cell. 1994, v. 79.-pp. 377-388

24. Akimova OA, Bagrov AY, Lopina OD, Kamernitsky AV, Tremblay J, Hamet P, Orlov SN. Cardiotonic steroids differentially affectintracellular Na+ and Na+.i/[K+]i-independent signaling in C7-MDCK cells.// J Biol Chem. 2005. - v.280. - pp. 832-839.

25. Alper G., Girgin F.K., Ozgonul M., Mentes G., Ersoz В. MAO inhibitors and oxidant stress in aging brain tissue.// Eur. Neuropsychopharmacol. 1999. - v. 9. - pp. 247-252.

26. Ames B.N., Shigenaga M.K., and Hagen Т. M. Oxidants, antioxidants, and degenerative diseases of aging.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - v. 90. - pp. 7915-7922.

27. Arrigo A.P., and Kretz-Remmy C. Regulation of mammalian gene expression by free radicals.// In: Molecular Biology of Free Radicals in Human Disease. Aruoma 0. and Halliwell B. (Eds.). - Oica International, Saint Lucia, London. - 1998. - pp. 183-223.

28. Aruoma О. I. Free radicals, oxidants and antioxidants: trend towards the year 2000 and beyond.// In: Molecular Biology of Free Radicals in Human Disease. Aruoma O. and Halliwell B. (Eds.). - Oica International, Saint Lucia, London. - 1998. - pp. 1-28.

29. Barja G., and Herrero A. Oxidative damage to mitochondrial DNA is inversely related to maximum life span in the heart and brai of mammals.//FASEB J. 2000. - v. 14. - pp. 312-318.

30. Basaga H. S. Biochemical aspects of free radicals.// Biochem. Cell Biol. 1990. - v. 68. - pp. 989-998.

31. Bell RM, Burns DJ. Lipid activation of protein kinase С.// J Biol Chem. 1991.-v.266.-pp. 4661-4664.

32. Bennett JA, Dingledine R. Topology profile for a glutamate receptor: three transmembrane domains and a channel-lining reentrant membrane loop.// Neuron. 1995. - v. 14(2) - pp. 373-384.

33. Blanco G. Na,K-ATPase subunit heterogeneity as a mechanism for tissue-specific ion regulation.// Semin Nephrol. 2005. - v. 25. - pp. 292-303.

34. Boldyrev A, Bulygina E, Makhro A. Glutamate receptors modulate oxidative stress in neuronal cells. A mini-review.// Neurotox Res. -2004.-v. 6.-pp.581-587.

35. Boldyrev A, Kurella E. Mechanism of oxidative damage of dog kidney Na/K-ATPase.// Biochem Biophys Res Commun. 1996. - v. 15. - pp. 483-487.

36. Boldyrev A., Song R., Lawrence D., and Carpenter D. Carnosine protects against excitotoxic cell death independently of effects on reactive oxygen species.// Neurosci. 1999. - v. 94. - pp. 571-577.

37. Boveris A. Determination of the production of superoxide radicals and hydrogen peroxide in mitochondria.// Methods Enzymol. 1984. -v. 105. - pp. 429-435.

38. Brines ML, Robbins RJ. Cell-type specific expression of Na+, K(+)-ATPase catalytic subunits in cultured neurons and glia: evidence for polarized distribution in neurons.// Brain Res. 1993. - v. 17. - pp. 111.

39. Britton DR, Britton KT. A sensitive open field measure of anxiolytic drug activity.// Pharmacol Biochem Behav. 1981. - v. 15. - pp. 577582.

40. Bulygina E., Gallant S., Kramarenko G., Stvolinsky S., Yuneva M., and Boldyrev A. Characterization of the Age Changes in Brain and Liver Enzymes of Senescence-Accelerated Mice (SAM).// J. Anti-Aging Med. 1999. - v. 2. - pp. 43-48.

41. Buss H., Chan Т., Sluis K., Domigan M., and Winterbourn C. Protein Carbonyl measurement by a sensitive ELISA method.// Free Rad. Biol. Med. 1997. - v .23. - pp. 361-366.

42. Cadenas E., and Davies K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.// Free Rad. Biol. Med. 2000. - v. 29. -pp. 222-230.

43. Cadet J. Free radicals and neurodegeneration.// Trends Neurosci. -1994.-v. 17.-pp. 192-193.

44. Choi D. Antagonizing excitotoxicity: A therapeutic strategy for stroke?// Mount Sinai J Med. 1998. - v.65. - pp. 133-138.

45. Choi WS, Yoon SY, Oh TH, Choi EJ, O'Malley KL, Oh YJ. Two distinct mechanisms are involved in 6-hydroxydopamine- and MPP+-induced dopaminergic neuronal cell death: role of caspases, ROS, and JNK.// J Neurosci Res. 1999. v.57. - pp. 86-94.

46. Chu Y, Kordower JH. Age-associated increases of alpha-synuclein in monkeys and humans are associated with nigrostriatal dopamine depletion: Is this the target for Parkinson's disease?// Neurobiol Dis. -2007.-v.25. pp. 134-149

47. Chun HS, Gibson GE, DeGiorgio LA, Zhang H, Kidd VJ, Son JH. Dopaminergic cell death induced by MPP(+), oxidant and specific neurotoxicants shares the common molecular mechanism.// J Neurochem. -2001. v.76. pp. 1010-1021.

48. Colotla VA, Flores E, Oscos A, Meneses A, Tapia R. Effects of MPTP on locomotor activity in mice.// Neurotoxicol Teratol. 1990. -v.12.-pp. 405-407.

49. Conn, P. J. and Pin, J. P. Pharmacology and functions of metabotropic glutamate receptors.// Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. -1997.-v.37.-pp. 205-237.

50. Costantino, C., Macchiarulo, A. and Pellicciari, R. Homology model of the closed, functionally active, form of the amino terminal domain of mGluRl.// Bioorg. Med. Chem. 2001. - v.9. - pp. 847-852.

51. Cross C., Halliwell В., Borish E., Pryor W., Ames В., Saul R., McCord J., and Harman D. Oxygen radicals and human disease.// Ann. Intern. Med. 1987. - v. 107. - pp. 526-545.

52. Desai VG, Feuers RJ, Hart RW, Ali SF. MPP(+)-induced neurotoxicity in mouse is age-dependent: evidenced by the selectiveinhibition of complexes of electron transport.// Brain Res. 1996. -v.9. - pp. 1-8.

53. Dobrota D, Matejovicova M, Kurella EG, Boldyrev AA. Na/K-ATPase under oxidative stress: molecular mechanisms of injury.// Cell Mol Neurobiol. 1999. - v. 19. - pp. 141-149.

54. Ebadi M, Srinivasan SK, Baxi MD. Oxidative stress and antioxidant therapy in Parkinson's disease.// Prog Neurobiol. 1996. - v. 48. -pp. 1-19.

55. Emerling BM, Platanias LC, Black E, Nebreda AR, Davis RJ, Chandel NS. Mitochondrial reactive oxygen species activation of p38 mitogen-activated protein kinase is required for hypoxia signaling.// Mol Cell Biol. 2005. - v.25. - pp. 4853-4862.

56. Evans P. Free radicals in brain metabolism and pathology.// Brit. Med. Bull. 1993. - v. 49. - pp. 577-587.

57. Feldman AM, Tsutsui H, Shimokawa H, Takeshita A. Overexpression of tumor necrosis factor-alpha increases production of hydroxyl radical in murine myocardium.// Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2003. - v. 284. - pp. 449-555.

58. File SE, Wardill AG. The reliability of the hole-board apparatus.// Psychopharmacologia. 1975. - v. 14. - pp. 47-51.

59. Finkel Т., and Holbrook N. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing.// Nature. 2000. - v. 408. - pp. 239-247.

60. Francesconi, A. and Duvoisin, R. M. Role of the second and third intracellular loops of metabotropic glutamate receptors in mediating dual signal transduction activation.// J. Biol. Chem. 1998. - v. 273. -pp. 5615-5624.

61. Fridovich I. The reaction of xantine oxidase with molecular oxygen.// J. Biol. Chem. 1974. - v. 249. - pp. 4350-4353.

62. Gereau, R. W. and Heinemann, S. F. (1998) Role of protein kinase С phosphorylation in rapid desensitization of metabotropic glutamate receptor 5.//Neuron. 1998,-v.20.-pp. 143-151.

63. Green M. J., and Hill H.A.O. Chemistry of dioxygen.// Methods in Enzymology. 1984. - v. 105. - pp. 3-22.

64. Greene JG and Greenamyre JT. Bioenergetics and gluamate excitotoxicity.// Prog Neurobiol. 1996. - v. 48. - pp. 613-634.

65. Griendling KK, FitzGerald GA. Oxidative stress and cardiovascular injury: Part I: basic mechanisms and in vivo monitoring of ROS.// Circulation. 2003. - v.21. - pp. 1912-1916.

66. Grune Т., Reinheckel Т., and Davies K. J. Degradation of oxidized proteins in mammalian cells. // The FASEB J. 1997. - v. 11. - pp. 526-534.

67. Halliwell В., and Gutteridge J. M. C. Free Radicals in Biology and Medicine. // Oxford University Press. 1999. - pp. 936.

68. Halliwell В., and Gutteridge J. M. C. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease.// Biochem. J. 1984. - v. 219. -pp. 1-14.

69. Hampton MB, Kettle AJ, Winterbourn CC. Involvement of superoxide and myeloperoxidase in oxygen-dependent killing of Staphylococcus aureus by neutrophils.// Infect Immun. 1996. - v. 64. -pp. 3512-3517.

70. Hermans E. and Challiss J. Structural, signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors : prototypic family С G-protein-coupled receptors.// Biochem J. 2001. - v. 359. -pp. 465-484.

71. Hollmann M, Heinemann S. Cloned glutamate receptors.// Annu Rev. Neurosci. 1994.-v. 17.-pp. 31-108

72. Hollmann M, Maron C, Heinemann S. N-glycosylation site tagging suggests a three transmembrane domain topology for the glutamate receptor GluRl.// Neuron. 1994. - v.13 - pp. 1331-1343.

73. Hosokawa M. A higher oxidative status accelerates senescence and aggravates age-dependent disorders in SAMP strains of mice.// Mech Ageing Dev. 2002. - v.123. - pp. 1553-1561.

74. Huang WH, Wang Y, Askari A, Zolotarjova N, Ganjeizadeh M. Different sensitivities of the Na+/K(+)-ATPase isoforms to oxidants.// Biochim Biophys Acta. 1994. - v.23. - pp. 108-114.

75. Huang WH, Wang Y, Askari A. (Na+ + K+)-ATPase: inactivation and degradation induced by oxygen radicals.// Int J Biochem. 1992. - v.24. - pp. 621-626.

76. Jansen M, Dannhardt G. Antagonists and agonists at the glycine site of the NMDA receptor for therapeutic interventions.// Eur J Med Chem. 2003. - v.38. - pp. 661-670.

77. Jenner P., and Olanow C. W. Oxidative stress and the pathogenesis of Parkinson's disease. // Neurology. 1996,- v. 47.- pp. 161-170.

78. Juhaszova M, Blaustein MP. Na+ pump low and high ouabain affinity alpha subunit isoforms are differently distributed in cells.// Proc Natl Acad Sci. 1997. - v.94. -pp. 1800-1805.

79. Kaplan P, Matejovicova M, Herijgers P, Flameng W. Effect of free radical scavengers on myocardial function and Na+, K+-ATPase activity in stunned rabbit myocardium.// Scand Cardiovasc J. 2005. - v.39. - pp. 213-219.

80. Kettle AJ, Gedye CA, Winterbourn CC. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide.// Biochem J. -1997.-v.15.-pp. 503-508.

81. Kifle Y, Monnier J, Chesrown SE, Raizada MK, Nick HS. Regulation of the manganese superoxide dismutase and inducible nitric oxide synthase gene in rat neuronal and glial cells.// J. Neurochem. 1996. - v.66. - pp. 2128-2135.

82. Knight JA. Review: Free radicals, antioxidants, and the immune system.// Ann Clin Lab Sci. 2000. - v.30. - pp. 145-158.

83. Kometiani P, Liu L, Askari A. Digitalis-induced signaling by Na/K-ATPase in human breast cancer cells.// Mol Pharmacol. 2005. -v.67.-pp. 929-936.

84. Kopin I. J. MPTP: an industrial chemical and contaminant of illcit narcotics stimulates a new era in research on Parkinson, s disease.// Environ Heath Perspect. 1987. - v. 75. - pp. 45-51.

85. Lenaz G., Bovina C., Formiggini G., and Castelli G. P. Mitochondria, oxidative stress and antioxidant defences.// Acta Biochim Pol. 1999. - v. 46. - pp. 1-21.

86. Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., and Randal R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent.// J. Biol. Chem. 1951. -v. 93.-pp. 265-275.

87. Mackes JL, Willner J. NMDA antagonist MK-801 impairs acquisition of place strategies, but not their use.// Behav Brain Res. -2006.-v. 175.-pp. 112-118.

88. Makanjuola R. O., Hill G., Dow R. C., Campbell G., and Ashcroft G. W. The effects of psychotropic drugs on exploratory and stereotyped behavior of rats studied on a hole-board.// Psychopharmacology. -1977.-v. 55.-№1.-pp. 67.

89. Misra H., and Fridovich I. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase.//J. Biol. Chem. 1972. - v. 247. - pp. 3170-3175.

90. Mohammadi K., P. Kometiani, Z. Xie, and A. Askari, Role of Protein Kinase С in the Signal Pathways That Link Na/K-ATPase to ERK1/2.// J. Biol. Chem. 2001. - v.276. No. 45. - pp. 42050-42056.

91. Moody TW, Merali Z, Crawley JN. The effects of anxiolytics and other agents on rat grooming behavior.// Ann N Y Acad Sci. 1988. -v.525. - pp. 281-290.

92. Morrow J. and Roberts L.J. Mass spectrometric quantification of F2-isoprostanes in biological fluids and tissues as measure of oxidative stress.// Methods of Enzymology. 1999. - v. 300. - pp. 3-13.

93. Nemoto S., Takeda K., Yu Z. X., Ferrans V. J., and Finkel T. Role of mitochondrial oxidants as regulators of cellular metabolism.// Mol. Cell. Biol.- 2000.-v. 20. pp. 731 1-7318.

94. Newcomb T. G. and Loeb L. A. Mechanisms of mutagenicity of oxidatively-modified bases. In: Molecular Biology of Free Radicals in Human Disease. Aruoma O. and Halliwell B. (Eds.). - Oica International, Saint Lucia, London. - 1998. - pp. 139-166.

95. Peng L, Martin-Vasallo P, Sweadner KJ. Isoforms of Na/K-ATPase alpha and beta subunits in the rat cerebellum and in granule cell cultures.// J Neurosci. 1997. - v. 17. - pp. 3488-3502.

96. Poewe W. H., and Wenning G. K. The natural history of Parkinson's disease.// Ann. Neurol. 1998. - v. 44. - pp. S1-S9.

97. Pryor W. A. Oxy-radicals and related species: Their formation, lifetime and reaction.// Annu. Rev. Physiol. 1986. - v. 48. - pp. 657667.

98. Raha S., and Robinson В. H. Mitochondria, oxygen free radicals, disease and aging.// Trends Biochem. Sci. 2000. - v. 25. - pp. 502508.

99. Rathbun WB, Betlach MV. Estimation of enzymically produced orthophosphate in the presence of cysteine and adenosine triphosphate.// Anal Biochem. 1969. - v.28. - pp. 436-445.

100. Rathore N, John S, Kale M, Bhatnagar D. Lipid peroxidation and antioxidant enzymes in isoproterenol induced oxidative stress in rat tissues.// Pharmacol Res. 1998. - v.38. - pp. 297-303.

101. Ray, K. and Hauschild, В. C. Cys-140 is critical for metabotropic glutamate receptor-1 dimerization.// J. Biol. Chem. 2000. - v.275 -pp. 34245-34251.

102. Richter C. Biophysical consequence of lipid peroxidation in membranes.//Chem. Phys. Lipids. 1987. - v. 44. - pp. 175-189.

103. Sabri A, Hughie HH, Lucchesi PA. Regulation of hypertrophic and apoptotic signaling pathways by reactive oxygen species in cardiac myocytes.// Antioxid Redox Signal. 2003. - v.5. - pp. 731-740.

104. Schoner W, Bauer N, Muller-Ehmsen J, Kramer U, Hambarchian N, Schwinger R, Moeller H, Kost H, Weitkamp C, Schweitzer T, Kirch U, Neu H, Grunbaum EG. Ouabain as a mammalian hormone.// Ann N Y Acad Sci. 2003. - v.986. - pp. 678-684.

105. Sedelis M., Hofele K., Auburger G. W, Morgan S., Huston J. P., and Schwarting R. К. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences.//Behav Genet.- 2000. v. 30. №3. - pp. 171-182.

106. Semsei I., Rao G., and Richardson A. Expression of superoxide dismutase and catalase in rat brain as a function of age.// Mech. Ageing Dev. 1991. - v. 58. - pp. 13-19.

107. Shigenaga M. K., Hagen Т. M., and Ames B. N. Oxidative damage and mitochondrial decay in aging.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994.-v. 91.-pp. 10771-10778.

108. Shih J. C., and Thompson R. F. Monoamine oxidase in neuropsychiatry and behavior.// American Journal of Human Genetics. 1999.-v. 65.-pp. 593-598

109. Shih J. C., Chen K., and Ridd M. J. Monoamine oxidase: from genes to behavior.// Annu. Rev. Neurisci. 1999.- v. 22.- pp. 197-217.

110. Sies H. Oxidative Stress II. Oxidants and antioxidants.// Academic Press, London. 1991.

111. V., and Hahn V. A behavioural study of the effect of pentadecapeptide BPC 157 in Parkinson's disease models in mice and gastric lesions induced by l-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydrophyridine.// J. Physiol. Paris. 1999. - v. 93. - pp. 505-512.

112. Sladeczek, F., Pin, J. P., Recasens, M., Bockaert, J. and Weiss, S. Glutamate stimulates inositol phosphate formation in striatal neurones.// Nature. 1985. - v.317. - pp. 717-719.

113. Slater T. F. Recent advances in biochemical pathology: toxic liver injury.// Pion Press. 1976. - pp. 1-283.

114. Sriram K, Pai KS, Boyd MR, Ravindranath V. Evidence for generation of oxidative stress in brain by MPTP: in vitro and in vivo studies in mice.// Brain Res. 1997. - v.749. - pp. 44-52.

115. Suzuki Y, Takagi Y, Nakamura R, Hashimoto K, Umemura K. Ability of NMDA and non-NMDA receptor antagonists to inhibit cerebral ischemic damage in aged rats.// Brain Res. 2003. - v.21. -pp. 116-120.

116. Takeda T, Hosokawa M, Higuchi K. Senescence-accelerated mouse (SAM): a novel murine model of senescence.// Exp Gerontol. 1997. -v.32.-pp. 105-109.

117. Takeda Т., Hosokawa M., and Higuchi K. Senescence Accelerated Mice. A novel murine model of aging.// In: The SAM Model of Senescence (T. Takeda Ed.). Excerpta Medica, Amsterdam. - 1994. -pp. 15-23.

118. Thannickal VJ, Fanburg BL. Reactive oxygen species in cell signaling.// Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2000. - v.279. -pp. 1005-1028.

119. Tu, J. C., Xiao, В., Yuan, J. P., Lanahan, A. A., Leoffert, K., Li, M., Linden, D. J. And Worley, P. F. Homer binds a novel proline-rich motif and links group 1 metabotropic glutamate receptors with IP3 receptors.// Neuron. 1998. - v.21. -pp. 717-726.

120. Turpaev KT. Reactive oxygen species and regulation of gene expression. //Biochemistry (Mosc). 2002. -v.67 No.3. - pp. 281-292.

121. Vladimirov Y. A. Studies of antioxidants with chemiluminescence.// In: Proceedings of the International Symposium on Natural Antioxidants. Molecular Mechanisms and Health Effects. Packer L., Traber M.G., and Xin W. (Eds.). - 1996. - pp. 125-144.

122. Wu HM, Chi KH, Lin WW. Proteasome inhibitors stimulate activator protein-1 pathway via reactive oxygen species production.// FEBS Lett. 2002. -v.526. - pp. 101-105.

123. Xie Z, Kometiani P, Liu J, Li J, Shapiro JI, Askari A. Intracellular reactive oxygen species mediate the linkage of Na+/K+-ATPase to hypertrophy and its marker genes in cardiac myocytes.// J. Biol. Chem. 1999. - v.274. - pp. 19323-19328.

124. Zhang GX, Kimura S, Nishiyama A, Shokoji T, Rahman M, Yao L, Nagai Y, Fujisawa Y, Miyatake A, Abe Y. Cardiac oxidative stress in acute and chronic isoproterenol-infused rats.// Cardiovasc Res. -2005.-v.65.-pp. 230-238.