Роль гипохлорита в регуляции апоптоза и фагоцитоза миелоидных клеток in vitro

Ковалева, Анастасия Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль гипохлорита в регуляции апоптоза и фагоцитоза миелоидных клеток in vitro
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль гипохлорита в регуляции апоптоза и фагоцитоза миелоидных клеток in vitro"

На правах рукописи

КОВАЛЕВА АНАСТАСИЯ МИХАИЛОВНА

2 О ДВГ 2009

РОЛЬ ГИПОХЛОРИТА В РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА И ФАГОЦИТОЗА МИЕЛОИДНЫХ КЛЕТОК IN VITRO

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003475359

Работа выполнена в лаборатории морфологии Федерального государственного учреждения «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального медико-

биологического агентства

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Говорун Вадим Маркович,

Научный консультант:

кандидат биологических наук Борисенко Григорий Геннадьевич,

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Панасенко Олег Михайлович

профессор (ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России)

доктор биологических наук, Архипенко Юрий Владимирович

профессор (ГУНУ ФФМ МГУ им. Ломоносова)

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится «_»_2009г. в ___ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.057.01 ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России по адресу: 119435, Москва, Малая Пироговская 1А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России. Автореферат разослан «_»_2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Мурина М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Воспаление и сопутствующий ему окислительный стресс являются фундаментальными механизмами защиты организма от инфекций. Нарушение функционирования какой-либо из составляющих частей этого сложного и многоступенчатого процесса ведет к развитию серьезных заболеваний. Нейтрофилы являются основными участниками воспалительного процесса. Они секретируют миелопероксидазу (МПО), которая катализирует образование мощного окислителя - гипохлорита. В физиологических условиях гипохлорит окисляет белки и аминокислоты плазмы (Prütz W.A., 1999; Hawkins C.L., et al., 2003). Такое состояние принято называть хлорирующим стрессом. За последние пять лет опубликовано более 5 тысяч работ, посвященных изучению роли гипохлорита и его производных в патогенезе различных заболеваний, в том числе болезни Альцгеймера, атеросклероза, аутоиммунных заболеваний, хронических заболеваний дыхательной системы (Nathan С., 2002; Roman R.M., et al., 2008; Nicholls S.J. and Hazen S.L., 2005). В свете этого очевидно, что существует потребность в разработке новых лекарств и новых методов лечения заболеваний, в патогенезе которых участвует воспаление. В то же время без понимания механизмов функционирования биологических систем на клеточном и молекулярном уровне создание лекарств не возможно.

Данная работа посвящена изучению влияния хлорирующего стресса на апоптоз клеток И последующий их фагоцитоз. Бактерицидная роль гипохлорита (НОС1) хорошо известна. В то же время НОС1 представляет собой чрезвычайно реакционно-способную молекулу и может окислять клеточные липиды и белки (Сагг A.C., et al., 1998; Servaty R., et al., 1998; Rees, M.D., et al., 2003; Panasenko O.M., et al., 2003). В зависимости от окислительно-восстановительного состояния клетки последствия хлорирующего стресса для нее могут быть различными. К примеру, известно, что антиоксидантный статус клеток участвует в регуляции клеточной гибели, и на ранних этапах апоптоза наблюдается снижение антиоксидантов (Franco R. and Cidlowski J.A., 2006; Armstrong J.S„ and Jones D.R, 2002). Большая часть предшествующих работ была посвящена изучению влияния гипохлорита на живые клетки, у которых уровень антиоксидантов высок. В то же время более вероятно, что in vivo воздействию хлорирующего стресса подвергаются как раз погибающие клетки, у которых понижен уровень антиоксидантной защиты. Одной из основных задач данной работы было изучение влияния хлорирующего стресса на развитие в клетках апоптотической программы.

Другим, не менее важным аспектом воспаления, является фагоцитоз поврежденных и мертвых клеток. Известно, что развитие хронических заболеваний тесно связано с нарушением фагоцитоза клеток в очаге воспаления (Rosen and Casciola-Rosen, 1999). Если эффекты влияния гипохлорита на клетки достаточно интенсивно изучаются, то последствия

воздействия хлорирующего стресса на фагоцитоз клеток остаются неизученными. Даше» работа посвящена изучению последствий воздействия хлорирующего стресса на клетки мишени, находящиеся в различных физиологических состояниях с точки зрешо последующего их фагоцитоза макрофагами.

Окислительный стресс сопровождает различные патологические состояния (например, острые и хронические воспалительные процессы). Однако несмотря на обилие информации, касающейся образования НОС1 в тканях, влияние его на внутриклеточные процессы мало изучено.

Цель и задачи исследования

Целями работы было изучение роли гипохлорита в регуляции апоптоза лейкоцитов млекопитающих и последующего фагоцитоза поврежденных клеток макрофагами.

Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Разработать новый автоматизированный метод анализа фагоцитарной активности макрофагов на основе конфокальной флуоресцентной микроскопии.

2) Изучить влияние токсичного воздействия хлорирующего стресса (100-500 мкМ гипохлорита в полной среде в течение 16ч) на выживаемость и последующий фагоцитоз клеток макрофагами.

3) Изучить влияние субтоксичного хлорирующего стресса (100-1000 мкМ гипохлорита в бессывороточной среде в течение 1ч) на фагоцитоз клеток макрофагами.

4) Изучить влияние субтоксичного хлорирующего стресса на уровень глутатиона и белковых ЭН-групп в клетках.

5) Изучить влияние хлорирующего стресса на основные этапы апоптоза клеток.

6) Изучить влияние хлорирующего стресса на фагоцитоз апоптотических клеток.

7) С помощью липосом изучить роль фосфатидилсериновых рецепторов в фагоцитозе клеток, подвергшихся воздействию хлорирующего стресса

Основные положения, выносимые на защиту

Научная новизна работы

В рамках данной работы разработан новый метод анализа фагоцитарной активности макрофагов. Впервые изучено влияние различных биологических окислителей на фагоцитоз апоптотических клеток макрофагами. Впервые показан ингибирующий эффект хлорирующего стресса на фагоцитоз апоптотических клеток. Впервые продемонстрировано,

что под действием гипохлорита снижается уровень экстернализированного на поверхности клеток фосфатидилсерина. Впервые показано, что на фоне снижения содержания восстановленного глутатиона (основного внутриклеточного антиоксвданта) в апоптотических клетках под воздействием хлорирующего стресса происходит окисление SH-групп внутриклеточных белков. Получены косвенные данные, дающие основание полагать, что макрофаги обладают рецепторами для распознавания модифицированного гипохлоритом фосфатидилсерина на поверхности клеток-мишеней.

Теоретическое и практические значение работы

В ходе данной работы был разработан новый метод анализа фагоцитарной активности макрофагов. Данный метод основан на конфокальной флуоресцентной микроскопии, но также обладает всеми преимуществами, характерными для более производительных методов (как например, проточно-цитометрические методы). Оригинальные макрокоманды для программ Image J и EZ-C1 2.30 Software позволяют анализировать большие популяции клеток в сжатые сроки, благодаря чему обеспечивается статистическая надежность получаемых результатов. Этот подход может в дальнейшем использоваться в работе, связанной с выявлением новых факторов, влияющих на фагоцитоз, или новых фагоцитарных рецепторов.

В работе достигнут значительный прогресс в понимании роли хлорирующего стресса в апоптозе клеток млекопитающих, а также в последующем их фагоцитозе макрофагами. Впервые выявлены эффекты хлорирующего стресса на основные этапы апоптоза. Оказалось, что гипохлорит нарушает течение апоптотической программы в клетках, в результате чего, клетки переходят к стадии вторичного некроза, характеризующейся нарушением целостности плазматической мембраны апоптотической клетки. Такие клетки значительно хуже фагоцитируются макрофагами. Ключевую роль в этом остаточном фагоцитозе играет окисленный фосфатидилсерин цитоплазматической мембраны. В то же время, субтоксичное воздействие хлорирующего стресса на нативные клетки не оказывает влияния на фагоцитоз. Результаты работы открывают новые возможности для исследования механизмов фагоцитоза клеток в условиях окислительного стресса. Они согласуются с общими представлениями о провоспалительной роли миелопероксидазной системы в организме. Представляется перспективным дальнейшее изучение миелопероксидазной системы как возможной мишени фармакологических препаратов, направленных на лечение заболеваний, связанных с воспалением.

Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены и обсуждались на научных семинарах группы морфологии и семинарах отдела Молекулярной генетики человека

Института Физико-Химической Медицины Росздрава РФ, а также на ежегодных научных конференциях Института Физико-Химической Медицины Росздрава РФ.

Публикации

По теме диссертации опубликована 1 статья и сделано 2 стендовых сообщения на международных конференциях.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа написана по обычному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 108 страницах и иллюстрирована 25 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток

Работа выполнена на клеточных линиях Jurkat (трансформированные Т-лимфоциты человека), НЬ-60(трансформированные лейкоциты человека), J774 (трансформированные макрофаги мыши) и ТНР-^трансформированные моноциты человека). Клетки выращивались в культуральной среде DMEM или RPMI (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) в атмосфере насыщенных водяных паров и 5% COj.

Для дифференцировки моноцитов линии ТНР-1 в макрофаги в среду к клеткам добавляли 10 нМ индуктора форбол 12-миристат 13-ацетат (ТРА) (Molecular probes, США) на 48 часов.

Обработка клеток для подбора условий окрашивания и анализа фагоцитарной

активности

Апоптоз клеток линий Jurkat или HL-60 (5 х 103 клеток/мл среды) индуцировали добавлением в среду 0,5 мкМ акгиномицина D (Sigms, США) на 8 часов при 37 °С. Контрольные клетки инкубировали в ростовой среде RPMI 1640 без индуктора апоптоза.

Для изучения субтоксичного воздействия хлорирующего стресса, гипохлорят (Sigms, США) добавляли к клеткам в бессывороточной среде RPMI 1640 в диапазоне концентраций от 100 до 1000 мкМ на 1 час.

Для индукции токсичного действия хлорирующего стресса клетки инкубировали с гипохлоритом в полной ростовой среде в течение 16 часов в диапазоне концентраций от 100 до 1000 мкМ.

Определение содержания апоптотических и некротических клеток в образцах проводили методом проточной цитомстрии с помощью AnnexinV-Alexa Fluor 488 apoptosis detection kit (Molecular Probes, США). AnnexinV взаимодействует с фосфатидилсерином на мембране апоптотических клеток, а пропидий йодид проникает в некротические клетки через разрывы в плазматической мембране и интеркалирует в ДНК. Анализ образцов проводили с помощью проточного цитометра Epix XL и программного обеспечения Flow Soft (Beckman Coulter, США). Флуоресценцию обоих красителей возбуждали при 488 им (FL1). Флуоресценцию Annexin V регистрировали 505-545 нм полосный фильтр FL2, а флуоресценцию пропидий йодида - в 660 - 700 нм полосном фильтре FL4. С помощью этого окрашивания можно выявить 4 субпопуляции клеток - живые (AnnexinV-/PI-), первично некротические (AnnexinV-/PI+), апоптотические (AnnexinV+/PI-) и вторично некротические (Annexin V+/PI+) - это апоптотические клетки, у которых нарушена целостность плазматической мембраны. В дальнейшем под мертвыми клетками мы понимали сумму апоптотических и некротических клеток. Для каждого эксперимента анализировали по 10 тыс. клеток в трех повторах; разбросы соответствуют стандартному отклонению.

Определение концентрации внутриклеточного глутатиона и белковых SH-групп проводили с помощью флуоресцентного красителя на SH-группы - ThioGlo (Molecular Probes, США). Этот краситель специфично ковалентно взаимодействует с доступными SH-группами пептидов и белков. Таким образом, флуоресценция красителя пропорциональна концентрации SH-групп. Калибровочную кривую для определения концентрации SH-групп строили с использованием стандартных растворов глутатиона (Fluka). Анализ образцов проводили с помощью спектрофлуориметра F-2500 Fluorescence Spectrophotometer DIGILAB (Hitachi, Япония) (Длина волны возбуждения - 380 нм, максим флуоресценции - 505 нм). В нативных условиях флуоресценция ThioGlo отражает концентрацию глутатиона в клетках. Полученные данные нормировали на тотальный клеточный белок. Общую концентрацию белка в клеточных лизатах определяли с помощью набора QuantiPro ВСА Assay Kit (Sigma, США) в соответствии с инструкцией производителя.

Концентрацию тотальных белковых SH-групп измеряли в клеточных лизатах в денатурирующих условиях в присутствии SDS (Sigma, США), также с помощью ThioGlo. В таких условиях SH-группы белков доступны для взаимодействия с красителем наравне с SH-группами глутатиона. Концентрацию белковых SH-групп определяли как разность между общей концентрацией SH-групп и концентрацией SH-групп глутатиона. Полученные данные нормировали на тотальный клеточный белок.

Для определения активности каспазы-3 использовали набор Caspase-3 Assay kit #2 (Molecular probes, США). Клетки лизировали методом замораживания-оттаивания в

лизирующем буфере трижды, после чего аликвоту клеточного лизата добавляли к рабочему раствору флуорогенного субстрата (Z-DEVD- R110), который специфично расщепляется каспазой-3 с образованием флуоресцирующего продукта (R110-моноамид). Анализ образцов проводили с помощью спектрофлуориметра F-2500 Fluorescence Spectrophotometer DIGILAB (Hitachi, Япония) (длина волны возбуждения 496 нм, эмиссии - 520 им). Флуоресценция продукта пропорциональна количеству каспазы-3 в образце. Полученные данные активности каспазы-3 нормировали на тотальный клеточный белок.

Для количественного анализа апоптоза клеток по морфологии ядер использовали проточную цитометрию и окрашивание SYTO 16 / PI (Molecular Probes, США). Предварительно было показано, что эта метка ярко окрашивает ядра живых клеток (с неконденсированным хроматином) и на порядок менее интенсивно окрашиваются мертвые (апоптотические или некротические клетки). Образцы анализировали с помощью проточного цитометра Epix XL и программного обеспечения Flow Soft (Beckman Coulter, США).

Получение липосом

Липосомы из PC (1-пальмитоил-2-олеоил-фосфатидилхолин - PC), PC/PS = 1/1 (1-пальмитоил-2-олеоил-8п-глицеро-3-[фосфо-Ь-серин]фосфатидилсерина - PS) (Avanti Polar Lipids) готовили по следующей методике: фосфолипиды (PC и PS) хранили в хлороформе и сушили под азотом. После ресуспендировали в PBS до конечной концентрации фосфолипидов 4 мМ, перемешивали и подвергали воздействию ультразвука в течение 5 мин при 30 °С с помощью Fisher sonic dismembrator model 300 (Fisher Scientific, США). Сразу после приготовления липосомы использовали в работе. Для окисления PC/PS липосом к ним добавляли гипохлорит на 1 час в конечной концентрации 1мМ.

Модель фагоцитоза in vitro

В качестве фагоцитов в экспериментах использовали клетки линий - J774 или ТНР-1. В качестве клеток-мишеней использовали клетки линий HL-60 и Jurkat. Клетки-мишени окрашивали 0,5 мкМ 4,4-дифлуоро-1,3,5,7-тетраметил-8-(4-малеймидилфенил)-4-бора-За-4а-диаза-в-индаценом (BODIPY-малеимид, ВМ (Molecular probes, США)) в течение 10 мин, отмывали PBS и добавляли к макрофагам в среде без сыворотки. После инкубации клеток-мишеней с макрофагами в течение часа, образцы отмывали от нефагоцитированных клеток-мишеней и окрашивали 0,5 мкМ CellTrace Far Red DDAO-SE (CTFR (Molecular probes, США)) в PBS в течение 10 мин, отмывали от красителя и фиксировали 4% параформальдегидом.

К Act D

Рис. 1. Фагоцитоз клеток-мишеней Jurkat макрофагами J774. Характерные флуоресцентные микрофотографии фагоцитоза, где нефагоцитирующие макрофаги -красные, а макрофаги, с фагоцитированными клетками-мишенями, - желтые (наложение красного и зеленого). Клетки-мишени Jurkat окрашивали BODIPY-maleimide и инкубировали с макрофагами J774, после этого образцы отмывали от нефагоцитированных клеток-мишеней, окрашивали CTFR и фиксировали 4% параформальдегидом. К - фагоцитоз нативных клеток Jurkat, Act D - фагоцитоз клеток Jurkat, обработанных актиномицином D. А ,В - масштабная линейка 100 мкм, С - масштабная линейка 40 мкм.

Полученные образцы анализировали с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа Nikon ECLIPSE Е-800 (Nikon Corporation, Япония), снабженного аргоновым и гелий-неоновым лазерами. Данные накапливали и сохраняли как восьмибитные изображения с помощью программного обеспечения EZ-C1 2.30 Software (Nikon Corporation).

На представленных микрофотографиях видно, что макрофаги почти на порядок 1 лучше фагоцитируют апоптотические клетки-мишени по сравнению с контрольными (необработанными) клетками. Количественную обработку данных осуществляли с помощью

программ ImageJ 1.34 (Wayne Rasband, National Institute of Health, USA) и Excel (Microsoft Corporation) с использованием оригинальных макрокоманд. Фагоцитарный индекс определяли как отношение общей площади желтых частиц (фагоцитированные клетки-мишени) на микрофотографиях к общей площади красных частиц (макрофаги). В среднем i анализировали 104 макрофагов в каждом образце.

I Отличия между выборками определяли с помощью критерия Стьюдента. Отличия

считались достоверными при значениях р < 0,05. Результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Поиск биологических окислителей, влияющих на фагоцитоз апоптотических

клеток

С помощью актиномицина D в клетках HL-60 индуцировали апоптоз, после чего к ним добавляли окислители (500 мкМ Н2О2 (Sigma, США) на 1час; донор NO -

PAPANONOate (Sigma, США), добавляли в полной среде RPMI по 10 мкМ каждые 10 минут в течение часа; GSNO добавляли 60 мкМ (Sigma, США) каждые 30 минут в течение часа). После инкубации клетки окрашивали и анализировали, как описано выше.

Конкурентное ингибирование фагоцитоза с помощью липосом

В экспериментах по конкурентному ингибированию фагоцитоза, клетки-мишени HL-60 добавляли к макрофагам ТНР-1 в присутствии липосом на 1 ч. В работе использовали липосомы, обогащенные фосфатидилхолином, фосфатидилсерином или окисленным фосфатидилсерином. Концентрация липосом в инкубационной среде для клеток составляла 1 мМ. После этого макрофаги отмывали от нефагоцитированных клеток-мишеней и липосом, окрашивали и анализировали, как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ

I. Разработка нового метода анализа фагоцптарной активности макрофагов

На сегодняшний день существуют два наиболее распространенных подхода к анализу фагоцитоза клеток. Первый из них - микроскопический, позволяющий визуально анализировать события фагоцитоза. Благодаря этому снижается количество артефактов, связанных с окраской или отмывкой образцов. Основным недостатком микроскопического метода является его высокая трудоемкость. По этой причине количество анализируемых событий ограничивается 200 клетками в образце. При таком объеме выборки осложняется статистический анализ получаемых данных. Напротив, проточно-цитометрические методы лишены этого недостатка и позволяют быстро анализировать большие выборки клеток. Однако, как правило, использование проточно-цитометрических методов требует дополнительного микроскопического контроля качества образцов. Нашей задачей было совместить преимущества этих подходов в одном методе.

В первую очередь мы подобрали условия для окрашивания клеток-мишеней и макрофагов. Потенциальный краситель для клеток-мишеней должен удовлетворять трем основным требованиям: окрашивать как нативные, так и поврежденные и мертвые клетки, не оказывать цитотоксического эффекта на клетки и не выходить из клеток за время проведения исследования. Для работы мы выбрали два широко используемых красителя (ВМ и CMFDA) для прижизненного наблюдения за клетками. Апоптоз клеток индуцировали с помощью актиномицина D. Мы изучали влияние различных окислителей на клетки, и стабильность окрашивания клеток при окислительном стрессе имела первостепенное значение. В наших экспериментальных условиях инкубации было показано более чем трехкратное снижение сигнала флуоресценции от клеток, обработанных гипохлоритом при окрашивании CMFDA, в то время как флуоресценция ВМ таких клеток даже слегка

превышала флуоресценцию нативных. Так как СМ КО А окрашивал клетки неодинаково, то в дальнейшем мы использовали ВМ. Цитотоксического эффекта ВМ на нативные клетки, а также на клетки, после воздействия окислительного стресса (обработанные НОС1) в | подобранных экспериментальных условиях, не было выявлено, поэтому краситель ВМ был | выбран для дальнейшего окрашивания клеток-мишеней.

Известно, что в физиологических условиях удаление поврежденных и апоптотических клеток в тканях осуществляют макрофаги, в то время как нативные клетки не подвергаются фагоцитозу. В качестве положительно контроля на фагоцитоз при разработке метода мы использовали клетки-мишени линии .(игкаГ, в которых индуцировали ' апоптоз с помощью актиномицина Р. В качестве модели окислительного стресса была выбрана обработка клеток гипохлоритом (200 мкМ НОС1, 16 ч) в полной среде КРМ(. В таких условиях инкубации гипохлорит индуцирует гибель клеток-мишеней. При этом мы наблюдали значительное увеличение фагоцитарной активности (Рис. 2В) в образцах, где присутствовали мертвые клетки-мишени (Рис. 2А). Кроме того, метод позволял анализировать фагоцитоз клеток-мишеней, подвергшихся предварительно действию I сильного окислителя (Рис. 2).

Рис. 2. Количественный анализ выживаемости и фагоцитоза клеток <1игка( при апоптозе и окислительном стрессе. А - Анализ выживаемости клеток 1игка1, окрашенных Ашшхш У Р1 методом проточной цитометрии. В - Анализ фагоцитоза клеток Лика! макрофагами 1774 с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. К - нативные клетки; НОС1 - клетки, инкубированные в присутствии 200 рМ гипохлорита в полной ростовой среде в течение 16 ч.; АсП) - клетки, инкубированные в присутствии актиномицина Э

В данной работе мы предложили улучшенный флуоресцентно-микроскопический метод, который сочетает в себе ряд таких достоинств, как возможность визуального контроля качества препаратов, высокая продуктивность получения и анализа данных. Благодаря перечисленным достоинствам данный метод может стать привлекательным инструментом для скрининговых работ по поиску новых лигандов, которые распознаются макрофагами, новых рецепторов, которые опосредуют фагоцитоз, и новых сигналов,

5? Ю0

1 80

| 60

5 40 со

Б. 20

2 0-

20, : 15: 1050-

НОС1- Ай О

НОи АсЕ й

которые модулируют активность макрофагов. Он позволяет достоверно оценить фагоцитоз некротических, апоптотических и поврежденных под действием окислительного стресса клеток, таим образом, расширяя возможности изучения механизмов фагоцитоза и их роли в патогенезе различных заболеваний.

С помощью разработанного метода анализа фагоцитарной активности мы изучили влияние одного из основных окислителей, присутствующих в очаге воспаления -гипохлорита, на фагоцитоз живых и апоптотических клеток.

II. Изучение влияния субтоксичного хлорирующего стресса на фагоцитоз

Для изучения субтоксичного эффекта хлорирующего стресса на фагоцитоз, клетки-мишени линий HL-60 инкубировали в присутствии 100 - 1000 мкМ гипохлорита в течение 1 часа, после чего инкубировали их с макрофагами ТНР-1. Гипохлорит не оказывал влияния на выживаемость клеток во всем диапазоне используемых концентраций (от 100 до 1000 мкМ).

А 40 В 25

Количество мертвех клеток, % м со о о о о Фагоцитарный индекс, % го СЛ О OI о гч г-н ra El п I

0 0,1 0,2 0,5 1 ActD — HOCI, мМ-' 0 0,1 0,2 0,5 — HOCI, мМ — 1 ActD

Рис. 3. Влияние субтоксичных концентрацй гипохлорита на выживаемость клеток и их фагоцитоз. А - Анализ выживаемости клеток Jurkat после обработки различными концентрациями гипохлорита в бессывороточной среде в течение 1ч. В -Анализ фагоцитоза клеток Jurkat макрофагами ТНР-1. После обработки различными конценрациями гипохлорита в бессывороточной среде в течение 1 ч клетки Jurkat окрашивали ВМ и добавляли к макрофагам ТНР-1. После этого образцы отмывали от нефагоцитированных клеток-мишеней, окрашивали CTFR и фиксировали 4% параформальдегидом. Act D - клетки, обработанные актиномицином D.

При этом увеличения фагоцитарной активности макрофагов по отношению к клеткам-мишеням, подвергшимся субтоксичному воздействию хлорирующего стресса, также не наблюдалось. (Рис. ЗВ).

Таким образом, можно заключить, что в отсутствии цитотоксического эффекта гипохлорит не индуцирует фагоцитоз клеток-мишеней макрофагами.

III. Изучение токсичного воздействия хлорирующего стресса на фагоцитоз

Для индукции апоптоза гипохлорит добавляли к клеткам в полную среду инкубации ¡на 16 часов в концентрации 200 - 500 мкМ. Количественное соотношение живых и апоптотических клеток определяли по окрашиванию AnnexinV/PI. При добавлении гипохлорита в среду инкубации клеток-мишеней, наблюдалось дозозависимое увеличение смертности клеток с 5% в контроле до 80% при 500 мкМ НОС1. Одновременно с ростом I смертности клеток (Рис. 4А) происходило увеличение фагоцитоза клеток макрофагами при 100 и 200 мкМ гипохлорита. Однако при добавлении к клеткам-мишеням 500 мкМ гипохлорита, фагоцитоз снижался по сравнению с дозой 200 мкМ. (Рис. 4В). Этот эффект может объясняться тем, что при 500 мкМ гипохлорита значительно возрастает количество некротических клеток в образцах, а некротические клетки фагоцитируются посредством других механизмов, чем апоптотические.

Количество Î* мертвых клеток, % ГО О) ОЭ о О О О О О О m П É ra >агоцитарный индекс, % ->■ M СО о о о о г——1 1 п

К 100 200 500 Act D К 100 200 500 Act D Ч-IOCI , mkMj -HOCI, мкМ J

Рис. 4. Влияние токсичных концентраций гипохлорита на фагоцитоз. А -

Анализ выживаемости клеток Jurkat после обработки различными концентрациями [ гипохлорита в полной среде в течение 16 ч. В - Анализ фагоцитоза клеток Jurkat, обработанных различными концентрациями гипохлорита в полной среде в течение 16 ч. К -нативные клетки, Act D - клетки, обработанные актиномицином D.

При апоптозе происходит экстернапизация фосфатидилсерина из внутреннего слоя цитоплазматической мембраны во внешний. Экстернализированный фосфатидилсерин является важным фагоцитарным сигналом. Мы исследовали роль фосфатидилсерина в фагоцитозе клеток, погибших под действием хлорирующего стресса, с помощью липосом, содержащих фосфатидилсерин. Липосомы конкурируют с клетками-мишенями за связывание с макрофагами, таким образом, метод дает возможность оценить роль этого фосфолипида в фагоцитозе.

Рис. 5. Влияние

фосфатидилсерина на фагоцитоз клеток под действием токсичных концентраций гипохлорита (200 мкМ, 16ч.) Клетки .Гигка! инкубировали с макрофагами в присутствии липосом, обогащенных фосфатидилсерином. Для каждого эксперимента проанализировали по 10 тыс. клеток в трех повторах; разбросы соответствуют стандартному отклонению.

При добавлении липосом в среду инкубации макрофагов с клетками-мишенями наблюдалось двукратное снижение фагоцитоза клеток-мишеней. То есть, фагоцитоз клеток, погибших под воздействием хлорирующего стресса, осуществляется по классическому фосфатидилсерин-зависимому механизму.

IV. Изучение влияния хлорирующего стресса на фагоцитоз апоптотических клеток

Нам удалось показать, что под действием хлорирующего стресса в клетках активируется программа апоптоза, после чего погибающие клетки могут фагоцитироваться макрофагами. Известно, что физиологических условиях, воздействию хлорирующего стресса могут подвергаться и погибающие клетки, а их функциональное состояние значительно отличается от такового у живых клеток. Дальнейшая работа посвящена изучению влияния хлорирующего стресса на клетки, в которых уже произошла индукция апоптоза.

Для индукции апоптоза клетки-мишени линий Н 1,-60 или ,1игка1 инкубировали в присутствии 0,5 мкМ актиномицина И в течение 16 часов, после чего помещали в условия хлорирующего стресса, который моделировали путем добавления гипохлорита в бессывороточную среду инкубации клеток на 1 час. В результате воздействия хлорирующего стресса наблюдалось незначительное (не более 5%) увеличение смертности клеток, при этом в 5 раз снижался фагоцитоз апоптотических клеток, по сравнению с апоптотическими клетками, которые не подвергались воздействию гипохлорита. Ингибиторное действие гипохлорита на фагоцитоз апоптотических клеток наблюдалось в моделях фагоцитоза с использованием линий .1игка1 (Рис. 6А) и НЬ-60 (Рис. 6В).

ф 2

x 5 -0

о m

Ф 2

Jurkat

30-

10-

Д,

К HOCI Act D Act D/ HOCI

>£"30

a; 5

О Ш

HL-60

HOCI Act D

Act D/ HOCI

10 -

э о

Jurkat/THP-1

¿L

HOCI Act D

Act D/ HOCI

5 30

2 20

HL-60/THP-1

J±L

HOCI Act D

Act D/ HOCI

Рис. 6. Влияние гипохлорита на выживаемость и фагоцитоз апоптотических клеток. А, В - Анализ выживаемости клеток Jurkat и HL-60 после обработки гипохлоритом в бессывороточной среде. С, D - Фагоцитоз апоптотических клеток Jurkat и HL-60, обработанных гипохлоритом. К - фагоцитоз нативных клеток; HOCI - фагоцитоз клеток, обработанных 500 мкМ гипохлорита в бессывороточной среде в течение I ч; Act D -фагоцитоз клеток HL-60, обработанных акгиномицином D; Act D/HOCI - фагоцитоз клеток HL-60, в которых индуцировали апоптоз с помощью акгиномицина D, после чего обрабатывали 500 мкМ гипохлорита в бессывороточной среде в течение 1 ч.

Мы предположили, что столь ярко выраженный эффект на фагоцитоз является 1 следствием значительных изменений в течении апоптоза, и оценили изменения основных апоптотических маркеров в этих клетках.

V. Изучение влияния хлорирующего стресса на апоптоз клеток in vitro Под действием хлорирующего стресса нарушается целостность плазматической мембраны апоптотических клеток I Основным отличием апоптотических клеток от вторично-некротических является

целостность плазматической мембраны первых. Благодаря тому, что мембраны апоптотических клеток сохраняют целостность до момента фагоцитоза, индукции

иммунного ответа на апоптотические клетки не происходит. Напротив, если под действием какого-либо стимула целостность мембраны нарушается, это может быть важным, с точки зрения последствий, событием.

¡2 ¡? Б|

Ф 5

s X

5 -о

о m

0) £

s :

§! I

К Act D Act D/HOCI □ AnnexinV+/PI- □ AnnexinV+/PI+

К Act D Act D/HOCI □ SYTO-/PI- □ SYTO-/PI+

Act D

некроз j^.« MIL

апоптоз • .V

Act D/HOCI

некроз Ж1

апоптоз

-SYT016-

Рис. 7. Вторичный некроз апоптотнческих клеток, вызванный действием гипохлорита. А - Измерение соотношения субпопуляций апоптотнческих и вторично некротических клеток в образцах по экстернапизации фосфатидилсерина на цитоплазматической мембране (А) и по конденсации хроматина (В). Апоптотические клетки, окрашенные AnnexinV+/PI- (белые столбики), вторично некротические клетки, окрашенные AmiexinV+/PI+ (серые столбики). В - Апоптотические клетки, окрашенные SYTO-/PI-(белые столбики), вторично некротические клетки, окрашенные SYTO-/PI+ (серые столбики) С - Дифференциальное окрашивание ядер живых и апоптотнческих клеток красителем SYTO 16. Ядра живых клеток окрашивались ярко (вверху), а конденсированные ядра апоптотнческих клеток окрашивались слабо (внизу). D - Увеличение количества вторично некротических клеток под действием гипохлорита. К - нативные клетки, Act D - клетки, обработанные актиномицином D. К - нативные клетки; НОС1 - клетки, обработанные 500 мкМ гипохлорита в бессывороточной среде в течение 1ч. Act D - клетки, обработанные актиномицином D, Act D / НОС1 - апоптотические клетки, обработанные гипохлоритом.

При добавлении гипохлорита, происходило увеличение проницаемости мембран апоптотнческих клеток. Этот эффект был показан двумя независимыми методами -

окрашиванием клеток АппехтУ/Р1 (Рис. 7А) и окрашиванием БУТО 16/Р1 (Рис 7В). Аппехт V взаимодействует с фосфатидилсерином на мембране апоптотических клеток. Мы наблюдали увеличение доли клеток, положительных по окрашиванию пропвдий йодидом среди Аппехт V положительных клеток. Этот результат говорит о том, что мембраны апоптотических клеток теряют целостность, происходит переход их в стадию вторичного некроза.

Аналогичные данные были получены с использованием принципиально иного маркера на апоптотические клетки - 8УТ016 (Рис. 7В). Краситель Б У ТО 16 на порядок более интенсивно окрашивает ядра живых клеток, чем конденсированные ядра мертвых клеток (Рис. 7С). Под действием гипохлорита наблюдалось увеличение популяции вторично некротических (8ТГ016-/Р1+) клеток за счет уменьшения популяции апоптотических (8УТ016-/Р1-) клеток (Рис. 7В, О). Таким образом, двумя независимыми методами было показано, что под действием производных гипохлорита нарушается целостность плазматической мембраны апоптотических клеток.

Изменение количества фосфатидилсерина на поверхности апоптотических

теток под действием хлорирующего стресса

Для анализа апоптоза и некроза клеток, как правило, используют стандартные маркеры. Классический апоптоз характеризуется активацией эффекгорных каспаз, нарушением асимметрии цитоплазматической мембраны и экстернализацией фосфатидилсерина во внешний слой липидного бислоя, конденсацией хроматина. Нарушение целостности плазматической мембраны апоптотических клеток означает их переход в стадию вторичного некроза. В клетках линий НЬ-60 и 1игка1 индуцировали апоптоз акгиномицином О, а затем подвергали воздействию хлорирующего стресса в бессывороточной среде и анализировали маркеры апоптоза. Экстернализацию фосфатидилсерина анализировали с помощью проточной цитометрии, окрашивая клетки АппехтV. На рисунке 8 видно, что после обработки апоптотических клеток гипохлоритом, интенсивность флуоресценции Аппехт V популяции апоптотических клеток снижается. Это свидетельствует о снижении содержания фосфатидилсерина на мембране апоптотических клеток.

Возможно, под действием хлораминов среды происходит окислительное ингибирование ферментов, ответственных за транспорт фосфатидилсерина из внешнего слоя липидного бислоя во внутренний, или окисление фосфатидилсерина на поверхности мембраны клетки.

нативные клетки

Act D

с -I

m о

го

оУ о х ч

О О

X +

0.0% 0.4%

ги

тШ 2.6%

0.0% 0.3%

■4 98.8% - " 1.2%

0.0% 3.1% . . .4

32,14.

0.1% 8.9%

# 73.8% 17.2%

£ CD

=Г О |>"

о С

и !<

2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 -I 0

HL-60

К Act D

т ActD/ HOCL

Jurkat

Annexin V -

i® =г о

l>" о с

CD 5 о x

С c

6.0 4.0

2.0

К ActD

X 1

ActD/

HOCL

□ Annexin V- □ Annexin V+

Рис. $. Гипохлорит вызывает снижение количества фосфатидилсерииа на поверхности апоптотических клеток. А - Снижение интенсивности флуоресценции Annexin V в популяции апоптотических HL-60 клеток. В и С - Содержание фосфатидилсерииа на апоптотических клетках HL-60 и Jurkat до и после обработки гипохлоритом.. К - нативные клетки; Act D - клетки, обработанные акпшомицином D; Act D/HOCI - апоптотические клетки, обработанные гипохлоритом.

Таким образом, в мембране апоптотических клеток происходят значительные изменения, а это может в значительной степени отражаться на способности макрофагов распознавать клетки, подвергшиеся воздействию хлорирующего стресса.

Ингибировиние каспазы-3 в апоптотических клетках под действием хлорирующего стресса

Мы рассмотрели процессы, происходящие на уровне мембраны апоптотических клеток, но известно, что изменениям на мембране предшествует ряд процессов, происходящих в цитоплазме клеток при активации программы апоптоза.

Ключевым этапом в развитии апоптоза является активация терминальных каспаз. Эти ферменты обеспечивают своевременную разборку всех внутриклеточных компонентов и готовят клетку к формированию апоптотических телец. Активность каспаз регулируется сигналами как изнутри, так и снаружи клетки. Есть данные о том, что окислители могут влиять на протекание апоптотической программы в клетке, в том числе, инактивируя каспазы, и, таким образом, даже работать в качестве переключателей между различными

типами клеточной смерти. В тех случаях, когда апоптоз запущен и прерван на каком-либо промежуточном этапе, гибель клетки осуществляется по альтернативным механизмам.

4 ю

HL-60 |

П П п

К HOCL Act D Act D/ HOCL

Рис. 9. Ингибирование каспазы-3 в апоптотических клетках под действием гипохлорита. Активность каспазы-3, определяемую по флуоресценции её субстрата Z-DEVD-R110, измеряли в нМ субстрата/мг белка в час. К - нативные клетки; HOCI - клетки, обработанные 500 мкМ гипохлорита в бессывороточной среде в течение 1 ч; Act D - клетки, обработанные актиномицином D; Act D / НОС1 - апоптотические клетки, обработанные гипохлоритом (500 мкМ, 1ч.). Эксперимент выполнен в трех повторах, разбросы соответствуют стандартному отклонению

Мы измеряли активность каспазы-3 в апоптотических клетках Jurkat и HL-60 после воздействия на них хлораминов и наблюдали достоверное ингибирование каспазной активности в этих клетках (Рис. 9А и В).

Таким образом, продукты хлорирующего стресса могут играть роль переключателя между различными типами клеточной смерти, например, инактивируя ключевые ферменты апоптоза и, тем самым, стимулируя неапоптотические механизмы гибели клеток.

Изменение количества внутриклеточного глутатиона и белковых ЯН-групп под действием хлорирующего стресса

Антиоксидантный статус клеток чрезвычайно важен для нормального функционирования клеток. Есть данные, свидетельствующие о том, что уже на ранних этапах апоптоза клетки теряют глутатион. Возможно, различия эффектов хлорирующего стресса на нативных и апоптотических клетках связаны с различиями в уровне их антиоксидантной защиты.

Для изучения изменения уровня внутриклеточных 5Н-групп мы использовали флуоресцентную метку ТЫо01о. Краситель взаимодействует с БН-группами в клеточных лизатах, образуя в результате реакции флуоресцирующий комплекс. Таким образом, флуоресценция в лизатах пропорциональна концентрации 5Н-групп в них. В работе

использовались клетки линии Н 1.-60. Апоптоз клеток индуцировали с помощью актиномицина О. Нативные и апоптотические клетки подвергались субтоксичному воздействию НОС1 (100 - 1000 мкМ, 1ч). Анализ образцов показал, что, по сравнению с нативкыми клетками, в апоптотических клетках содержание восстановленного глутатиона снижается в 7 раз (Рис. ЮА). Этот результат вполне согласуется с данными других авторов, которые также наблюдал снижение уровня глутатиона в клетках при апоптозе.

0,08

Нативные клетки

о ю

и о

о §

<л сэ

0,06 0,04 0,02 0

0,012 -0,008 0,004 -0 -

АсШ

100 200 500 1000 НОС1, мкМ

О 100 200 500 1000 НОС1, мкМ

Рис. 10. Снижение содержания внутриклеточного глутатиона под действием гипохлорита. Нативные (А) или апоптотические (В) клетки линии НЬ-60 инкубировали в присутствии различных конценраций гипохлорита (100 - 1000 мкМ в бессывороточной среде 1ч.). Концентрацию глутатиона в клеточных лизатах определяли по флуоресценции ТЫо01о и нормировали на тотальный клеточный белок. Эксперимент выполнен в десяти повторах; разбросы соответствуют стандартному отклонению.

При обработке гипохлоритом нативных клеток статистически значимое снижение концентрации глутатиона мы наблюдали, начиная с 500 мкМ НОС1, в то время как обработки 100-200 мкМ НОС1 не влияли на концентрацию глутатиона в нативных клетках. В то же время даже самая низкая концентрация гипохлорита уже вызвала 30% снижение восстановленного глутатиона в апоптотических клетках (Рис. 10В). А при увеличении количества НОС1 в среде наблюдалось еще более выраженное (до 70%) снижение концентрации внутриклеточного глутатиона.

Мы предположили, что апоптотические клетки, в которых изначально снижен уровень антиоксидантов, могут быть более восприимчивы к действию НОС1, чем нативные клетки. Основной мишенью для окислителей являются БН-группы аминокислот в белках. Окислительно-восстановительный статус 8Н-групп внутриклеточных белков может косвенно отражать степень повреждения клеток в результате окислительного стресса. Для измерения концентрации внутриклеточных 8Н-групп мы также использовали ТЫо01о, только на этот раз добавляли его к клеточным лизатам в денатурирующих условиях. Достоверных изменений концентрации белковых ЭИ-групп при апоптозе по сравнению с контролем мы не наблюдали (Рис. 11).

о с а> ю

со

0,4

0,3 -

0,2-

0,1

100 200 500

НОС1, мкМ

□ Нативные клетки ■ Ас1 О

1000

Рис. 11. Снижение концентрации 8Н-групп белков под действием гипохлорита.

Нативные или апоптотические (обработанные актиномицином Р) клетки линии НЬ-60 инкубировали в присутствии гипохлорита (100 - 1000 мкМ, в бессывороточной среде 1ч.). Концентрацию внутриклеточных 8Н-групп определяли по флуоресценции ТЫоС1о в денатурирующих условиях. Эксперимент выполнен в шести повторах; разбросы соответствуют стандартному отклонению.

В нативных клетках гипохлорит вызывал достоверное снижение уровня белковых 1 8Н-групп лишь при концентрации 1000 мкМ. В апоптотических клетках снижение концентрации вН -групп белков наблюдалось уже при обработке 100 мкМ НОС1 (Рис. 11). Увеличение концентрации гипохлорита вело к дальнейшему снижению уровня внутриклеточных сульфгидрильных групп белков. Максимальный эффект гипохлорита наблюдался при 1000 мкМ гипохлорита (снижение на 74% по сравнению с апоптотическими

клетками, к которым гипохлорит не добавляли).

Полученные нами данные говорят о том, что антиоксидантный статус апоптотических клеток в значительной степени отличается от такового у нативных клеток. При апоптозе наблюдалось семикратное снижение концентрации восстановленного глутатиона в клетках. Одновременно с этим происходило окисление БН-групп

внутриклеточных белков уже при минимальной концентрации гипохлорита (100 мкМ). С ростом концентрации гипохлорита в среде наблюдалось дальнейшее снижение количества SH-групп белков (то есть, их окисление). Напротив, в нативных клетках, где уровень глутатиона снижался лишь при максимальной из используемых концентраций гипохлорита, антиоксиданты защищали SH-группы белков от окисления.

Мы показали, что под действием хлорирующего стресса прерывается нормальное течение апоптотической программы, в результате чего клетки переходят в стадию вторичного некроза. Можно предположить, что in vivo, окислители играют одну из ключевых ролей в определении иммунологических последствий воспаления. Литературные данные говорят в пользу того, что нарушение целостности клеточных мембран и попадание содержимого клеток во внешнее пространство приводит к активации провоспалительного макрофагального ответа и не способствует завершению воспаления и заживлению раны. Возможно, описанные нами процессы влияют на развитие воспаления в условиях ш vivo.

VI. Липосомы, обогащенные фосфатмдилсерином и окисленным фосфатидилсерппом, ипгибируют фагоцитоз апоптотических клеток

Апоптотические клетки несут на своей поверхности набор лигандов, которые распознаются макрофагами, благодаря чему и осуществляется фагоцитоз апоптотических клеток. Наиболее хорошо изученный сигнал «съешь меня» на поверхности апоптотических клеток - фосфатидилсерин. Он появляется на поверхности апоптотических клеток в результате инактивации транспортера АРТ, который обеспечивает поддержание асимметрии мембраны в живых клетках. На поверхности макрофагов есть специфичные рецепторы к фосфатидилсерину. Они играют ключевую роль в распознавании апоптотических клеток макрофагами. Для изучения роли фосфатидилсериновых рецепторов в фагоцитозе апоптотических клеток, поврежденных гипохлоритом, мы использовали липосомы, обогащенные этим фосфолипидом. В качестве контроля мы взяли фосфатидилхолин, который в норме присутствует на поверхности нативных клеток и не является фагоцитарным сигналом. Липосомы добавляли в среду инкубации макрофагов с клетками-мишенями. Как и ожидалось, добавление фосфатидилхолиновых липосом никак не сказалось на фагоцитозе (Рис. 12). Фосфатидилсериновые липосомы ингибировали фагоцитоз апоптотических клеток вдвое, что вполне согласуется с данными литературы. На фагоцитоз апоптотических клеток, поврежденных гипохлоритом, PS-липосомы также оказывали двукратное ингибирующее действие, что дает основания полагать, что фосфатидилсериновые рецепторы на макрофагах опосредуют распознавание и фагоцитоз таких мишеней.

В последние годы увеличивается количество данных, подтверждающих участие окисленных фосфолипидов в фагоцитозе апоптотических клеток. Так как мы наблюдали снижение содержания фосфатидилсерина на мембране апоптотических клеток в

экспериментах по окрашиванию АппехтУ, мы предположили, что под действием хлорирующего стресса может происходить окисление фосфатидилсерина на мембране клеток. Это может быть причиной снижения фагоцитоза апоптотических клеток, обработанных гипохлоритом.

Aci D

F 10 -s

rf 2

без

PC PS PSox

<l) Ч

s 10 -

Act D / HOC!

К без PC PS PSox

Рис. 12. Роль окисленного и восстановленного фосфатидилсерина в фагоцитозе апоптотических клеток под действием гипохлорита. Клетки HL-60 инкубировали с макрофагами ТНР-1 в присутствии липосом, обогащенных фосфатидипхолином (PC), фосфатидилсерином (PS) или окисленным фосфатидилсерином (PSox). К - нативные клетки; Act D - клетки, обработанные актиномицином D; Act D / НОС1 - апоптотические, обработанные гипохлоритом (500 мкМ в бессывороточной среде 1 ч.). Эксперимент выполнен в трех повторах; разбросы соответствуют стандартному отклонению

Для изучения роли фосфатидилсерина, окисленного гипохлоритом, в фагоцитозе апоптотических клеток мы добавляли липосомы, содержащие окисленный гипохлоритом фосфатидилсерин (Psox), в среду инкубации клеток-мишеней с макрофагами. Следует заметить, что используемый нами фосфатидилсерин взаимодействует с гипохлоритом преимущественно по аминогруппе. Таким образом, мы полагаем, что с помощью обработанных гипохлоритом липосом, мы получили представление об участии хлорированного по аминогруппе фосфатидилсерина, в фагоцитозе. Эти липосомы оказывали двукратный ингибирующий эффект на фагоцитоз апоптотичеких клеток как и липосомы, содержащие неокисленный PS. Фагоцитоз апоптотичеких клеток, поврежденных гипохлоритом, PSox-содержащие липосомы ингибировали более чем на 60%. Этот результат свидетельствует о том, что на макрофагах присутствуют рецепторы, распознающие окисленный гипохлоритом фосфатидилсерин на поверхности клеток-мишеней.

\ Рвао имтакхноо вмутромивм

млои СПОв

и ■ • ■• ' '

, конденсации _

11 хроматина ^ЯЙЯЩ^Ш касплза-3

\ ' ' ^ АПОПТОТИЧЕСКАЯ у

КЛЕТКА

прок.зспззз

Экс тсришимци)

РБ

конденсации хроматина

конденсация хроматина

/ I \\

АПОПТОТИЧЕСКАЯ У ^ КЛЕТКА ^У

АПОПТОТИЧЕСКАЯ КЛЕТКА >

фагоцитоз, завершение воспаления

нарушение фагоцитоза, развитие воспаления

Рис. 13. Гипотетическая схема участия продуктов хлорирующего стресса в воспалении. 1

Результаты, полученные в ходе работы, можно обобщить следующей схемой (Рис.

13). Существует, по крайней мере, два сценария развития событий после воздействия хлорирующего стресса на клетки. С одной стороны, в очаге воспаления гипохлорит может воздействовать на живые клетки, вызывая их апопгоз и последующий фагоцитоз, что способствует завершению воспаления. С другой - он может воздействовать на апоптотические клетки и препятствовать нормальному завершению апоптоза, ингибируя каспазы и снижая количество фосфатидилсерина на мембране, разрушая 1 цитоплазматическую мембрану. Это препятствует фагоцитозу апоптотических клеток и может приводить к развитию хронического воспаления.

выводы

1. Разработан новый автоматизированный метод анализа фагоцитарной активности макрофагов на основе конфокальной флуоресцентной микроскопии, позволяющий анализировать большие популяции клеток. Кроме того, метод позволяет анализировать фагоцитоз клеток в условиях моделирования окислительного стресса.

2. Токсичное воздействие хлорирующего стресса вызывает апоптоз клеток и последующий их фагоцитоз. Липосомы, обогащенные фосфатидилсерином, оказывают ингибирующее действие на фагоцитоз таких клеток, что указывает на фосфатидилсерин-зависимый механизм фагоцитоза клеток, погибших в результате воздействия хлорирующего стресса.

3. Субтоксичное воздействие хлорирующего стресса на нативные клетки не вызывает их фагоцитоза макрофагами.

4. Основной внутриклеточный антиоксидант - глутатион защищает нативные клетки от повреждения в результате воздействия хлорирующего стресса. В нативиых клетках окисления белковых вН-групп под действием гипохлорита не наблюдалось. При апоптозе происходит снижение концентрации восстановленного глутатиона в клетках, в результате чего БП-группы внутриклеточных белков окисляются в условиях субтоксичного воздействия хлорирующего стресса.

5. Под действием хлорирующего стресса нарушается течение апоптоза в клетках (происходит ингибирование каспазы-3, снижается количество фосфатидилсерина на поверхности клеток, нарушается целостность цитоплазматической мембраны).

6. Под действием хлорирующего стресса происходит ингибирование фагоцитоза апоптотических клеток.

7. Несмотря на то, что под действием гипохлорита снижается количество экстернализированного на апоптотических клетках фосфатидилсерина, липосомы, обогащенные фосфатидилсерином, а также фосфатидилсерином, окисленным гипохлоритом, ингибируют фагоцитоз апоптотических клеток, подвергшихся хлорирующему стрессу.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах:

1. Ковалёва A.M., Борисенко Г.Г., Лукина Г.И., Базикян Э.А. Предварительная оценка морфологических изменений слизистой оболочки полости рта при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. 2009 Клиническая медицина 6: 36-38.

2. Тезисы докладов на конференциях

1. O.G. Borisenko, A.M. Kovaleva. Subtoxic concentrations of hypochlorous acid induce phagocytosis of lymphocytes in vitro. Annual Meeting of the Society for free Radical Biology and Medicine. Denver, CO, November, 2006. p 375.

2. A.M. Kovaleva, G.G. Borisenko. HOC1 impairs apoptosis and phagocytosis of apoptotic cells in vitro. Apoptosis World 2008: From mechanisms to applications. Luxembourg, January, 2008, p. 478.

Заказ №37/07/09 Подписано в печать 16.07.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

,4- <>, ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 www.cfr.ru ; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковалева, Анастасия Михайловна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Роль миелопероксидазной системы в воспалении.

2.1.1. Миелопероксидазная система.

2.1.2. Взаимодействие НОС1 с биомолекулами.

2.2. Типы клеточной смерти.

2.2.1. Апоптоз клеток в условиях хлорирующего стресса.

2.2.1.1. Гибель клеток под действием хлораминов.

2.2.2. Роль глутатиона в апоптозе.

2.3. Роль фагоцитоза в воспалении.

2.3.1. Фагоцитоз апоптотических клеток.

2.3.2. Сигналы для фагоцитоза.

2.3.2.1. Разнообразие рецепторов для распознавания апоптотических клеток

2.3.2.2. Роль фосфатидилсерина в фагоцитозе апоптотических клеток.

2.3.2.3. Окисленные эпитопы, распознаваемые макрофагами.

2.3.2.4. Фагоцитарный синапс.

2.3.3. Иммунологические последствия фагоцитоза апоптотических и некротических клеток.

2.3.4. Фагоцитоз клеток в условиях хлорирующего стресса.

3. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Реагенты и оборудование.

4.2. Культивирование клеток.

4.3. Определение содержания апоптотических и некротических клеток в образце с помощью окрашивания AnnexinV/PI.

4.4. Определение концентрации глутатиона.

4.5. Определение общей концентрации белковых SH - групп.

4.6. Определение общей концентрации белка в клетках.

4.7. Определение активности каспазы-3.

4.8. Определение апоптотических клеток по морфологии ядер.

4.9. Клеточные модели, использованные в работе.

4.9.1 Подбор условий окрашивания клеток-мишеней.

4.9.2. Модель токсичного воздействия хлорирующего стресса на клетки в PBS (индукция некроза клеток под действием хлорирующего стресса).

4.9.3. Субтоксичное воздействие хлорирующего стресса на клетки в среде.

4.9.4. Токсичное воздействие хлорирующего стресса на клетки в среде (индукция апоптоза клеток под действием хлорирующего стресса).

4.9.5. Инкубация апоптотических HL-60 клеток с окислителями.

4.10. Анализ фагоцитарной активности макрофагов.

4.11. Приготовление липосом.

4.12. Ингибирование фагоцитоза с помощью липосом.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ.

5.1 Разработка метода оценки фагоцитарной активности макрофагов.

5.1.1. Подбор условий для окрашивания клеток-мишеней.

5.1.2. Подбор условий окрашивания макрофагов.

5.1.3. Количественный анализ фагоцитарной активности макрофагов.

5.1.4. Анализ полного и неполного фагоцитоза.

5.2. Субтоксичное воздействие хлорирующего стресса на выживаемость и фагоцитоз нативных лимфоцитов in vitro.

5.3. Влияние токсичного воздействия хлорирующего стресса на фагоцитоз нативных клеток. Роль фосфатидилсерина.

5.4. Изучение влияния хлорирующего стресса на апоптоз и фагоцитоз апоптотических клеток.

5.4.1. Влияние хлорирующего стресса на фагоцитоз апоптотических клеток.

5.4.2. Хлорирующий стресс индуцируют образование разрывов в плазматической мембране апоптотических клеток.

5.4.3. Влияние хлорирующего стресса на экстернализацию фосфатидилсерина на поверхности апоптотинеских клеток.

5.4.4. Ингибирование каспазы-3 в апоптотинеских клетках.

5.4.5. Влияние хлорирующего стресса на уровень глутатиона и белковых SH-групп в нативных и апоптотинеских клетках.

5.4.6. Фосфатидилсерин и окисленный гипохлоритом фосфатидилсерин ингибируют фагоцитоз апоптотинеских клеток.

5.5. Влияние кислородного и нитрозитивного стрессов на фагоцитоз нативных и апоптотинеских клеток.

6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6.1. Разработка метода анализа фагоцитарной активности макрофагов.

6.2. Влияние гипохлорита на фагоцитоз нативных клеток.

6.3. Роль гипохлорита в фагоцитозе апоптотинеских клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль гипохлорита в регуляции апоптоза и фагоцитоза миелоидных клеток in vitro"

Развитие воспалительного процесса всегда сопровождается окислительным стрессом и гибелью клеток иммунной системы. Основным ферментом, участвующим в воспалительном процессе, является миелопероксидаза. Она секретируется активированными нейтрофилами и посредством продукции гипохлорита осуществляет бактерицидную функцию. В физиологических условиях гипохлорит мгновенно взаимодействует с белками и аминокислотами среды с образованием более стабильных и менее токсичных продуктов — хлораминов. Хлорамины опосредуют эффекты гипохлорита на клетки и могут влиять на различные физиологические процессы, окисляя важнейшие внутриклеточные белки.

Фагоцитоз поврежденных и мертвых клеток является заключительным этапом воспаления и определяет иммунологические последствия этого процесса. Он опосредуется макрофагальными рецепторами, которые распознают специфические эпитопы на поверхности клеток-мишеней, в результате чего индуцируется процесс фагоцитоза. Существуют данные, свидетельствующие об участии окисленных эпитопов на поверхности ЛНП в фагоцитозе их макрофагами.

Мы предположили, что гипохлорит (основной продукт миелопероксидазной системы) может модулировать процессы гибели клеток и последующий фагоцитоз этих клеток макрофагами.

В ходе работы нам удалось показать, что под действием гипохлорита происходит нарушение течения апоптотической программы в клетках: наблюдается ингибирование каспазы-3, снижение уровня экстернаггизированного фосфатидилсерина, клетки переходят в стадию вторичного некроза. Возможным объяснением тому может служить снижение концентрации белковых SH-групп в апоптотических клетках по сравнению с нативными клетками (что является признаком повреждения белков). Следствием нарушения апоптоза в клетках является нарушение фагоцитоза апоптотических клеток, подвергшихся воздействию гипохлорита. В то же время субтоксичное воздействие гипохлорита на нативные клетки не влияет на фагоцитарную активность макрофагов по отношению к этим клеткам. В условиях, когда проявляется токсичный эффект гипохлорита, наблюдается увеличение смертности клеток путем апоптоза и увеличение фагоцитоза таких клеток.

Полученные нами результаты расширяют знания о роли миелопероксидазной системы в регуляции апоптоза клеток и последующего фагоцитоза погибших клеток макрофагами.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ковалева, Анастасия Михайловна

8. ВЫВОДЫ

3. Субтоксичное воздействие хлорирующего стресса на нативные клетки не вызывает их фагоцитоза макрофагами.

4. Основной внутриклеточный антиоксидант - глутатион защищает нативные клетки от повреждения в результате воздействия хлорирующего стресса. В нативных клетках окисления белковых SH-групп под действием гипохлорита не наблюдается. При апоптозе происходит снижение концентрации восстановленного глутатиона в клетках, в результате чего SH-группы внутриклеточных белков окисляются в условиях субтоксичного воздействия хлорирующего стресса.

6. Под действием хлорирующего стресса происходит ингибирование фагоцитоза апоптотических клеток.

7. Несмотря на то, что под действием гипохлорита снижается количество экстернализированного на апоптотических клетках фосфатидилсерина, липосомы, обогащенные фосфатидилсерином, а также окисленным фосфатидилсерином, ингибируют фагоцитоз апоптотических клеток, подвергшихся хлорирующему стрессу.

7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщить результаты, полученные в ходе данной работы можено следующей схемой (Рис 25.). Очевидно, что в процессе воспаления и гибели клеток, миелопероксидазная система играет двоякую роль. Индуцируя гибель клеток по апоптотическому механизму, она способствует разрешению воспалительного процесса и заживлению раны. В то же время, если по каким-то причинам происходит пролонгированное рекрутирование нейтрофилов в очаг воспаления, то под действием хлорирующего стресса может нарушаться процесс апоптоза клеток и последующего их фагоцитоза. Это, в свою очередь, может препятствовать заживлению раны и способствовать развитию хронического воспаления.

НОС1 фагоцитоз, завершение воспаления

V АПОПТОТИЧЕСКАЯ КЛЕТКА Ф нарушение фагоцитоза, развитие воспаления

Рис. 25. Гипотетическая схема участия продуктов хлорирующего стресса в воспалении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалева, Анастасия Михайловна, Москва

1. Anderson Н.А., Hiltbold Е.М., Roche P.A. 2000. Concentration of MHC class II molecules in lipid rafts facilitates antigen presentation. Nat Immunol. 1(2): 156-62.

2. Armstrong J.S. and. Jones D.P. 2002. Glutathione depletion enforces the mitochondrial permeability transition and causes cell death in Bcl-2 overexpressing HL60 cells. FASEB Journal. 16: 1263-5.

3. Aruoma O.I., Halliwell В., Hoey B.M., Butler J. 1988. The antioxidant action of taurine, hypotaurine and their metabolic precursors. Biochem J. 256(1): 251-5.

4. Arur S., Uche U.E., Rezaul K., Fong M., Scranton V., Cowan A.E., Mohler W., Han D.K. 2003. Annexin I is an endogenous ligand that mediates apoptotic cell engulfment. Dev Cell. 4(4): 587-98.

5. Babior B.M. 2000 Phagocytes and oxidative stress. Am J Med. 109(1): 33-44. Review.

6. Balasubramanian K., Chandra J., Schroit A.J. 1997. Immune clearance of phosphatidylserine-expressing cells by phagocytes. The role of beta2-glycoprotein I in macrophage recognition. J Biol Chem. 272(49): 31113-7.

7. Balasubramanian K., Schroit A.J. 1998. Characterization of phosphatidylserine-dependent beta2-glycoprotein I macrophage interactions. Implications for apoptotic cell clearance by phagocytes. J. Biol. Chem. 273: 29272-7.

8. Beaver J.P., Waring P. 1995. A decrease in intracellular glutathione concentration precedes the onset of apoptosis in murine thymocytes. Eur J Cell Biol. 68(1): 47-54.

9. Beckman J.S, Koppenol W.H. 1996. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad, and ugly. Am J Physiol. 271: C1424-C1437.

10. Beppu M., Ando K., Saeki M., Yokoyama N., Kikugawa K. 2000. Binding of Oxidized Jurkat Cells to THP-1 Macrophages and Antiband 3 IgG through Sialylated Poly-Nacetyllactosaminyl Sugar Chains. Archives of Biochemistry and Biophysics. 384: 368-374.

11. Berndt C., Mopps В., Angermuller S., Gierschik P., Krammer P.H. 1998. CXCR4 and CD4 mediate a rapid CD95-independent cell death in CD4+ T cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 95:12556-12561.

12. Bevers E.M., Comfurius E.M., Dekkers D.W.C., Zwaal R.A. 1999. Lipid translocation across the plasma membrane of mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta. 1439: 317-330.

13. Bharat S., Cochran B.C., Hsu M., Liu J., Ames B.N., Andersen J.K. 2002. Pre-treatment with R-lipoic acid alleviates the effects of GSH depletion in PC 12 cells: implications for Parkinson's disease therapy. Neurotoxicology. 23(4-5): 479-486.

14. Borisenko G.G., Iverson S.L., Ahlberg S., Kagan V.E., Fadeel B. 2004. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) binds to oxidized phosphatidylserine: implications for macrophage clearance of apoptotic cells. Cell Death Differ. 11(8): 943-5.

15. Bomer C., Monney L. 1999. Apoptosis without caspases: an inefficient molecular guillotine. Cell Death Differ. 6: 497-507.

16. BracherM., Gould H.J., Sutton B.J., Dombrowicz D., Karagiannis S.N., 2007. Three-colour flow cytometric method to measure antibody-dependent tumour cell killing by cytotoxicity and phagocytosis. J. Immunol. Methods. 323(2): 160.

17. Brown S., Heinisch I., Ross E., Shaw K., Buckley C.D., Savill J. 2002. Apoptosis disables CD31-mediated cell detachment from phagocytes promoting binding and engulfment. Nature. 418(6894): 200-3.

18. Carr A.C., Hawkins C.L., Thomas S.R., Stocker R., Frei B. 2001. Relative reactivities ofiV-chloramines and hypochlorous acid with human plasma constituents Free Radical Biology and Medicine. 30: 526-536.

19. Carr A.C., van den Berg J.J., Winterbourn C.C. 1998. Differential reactivities of hypochlorous and hypobromous acids with purified Escherichia coli phospholipid: formation ofhaloamines and halohydrins. Biochim Biophys Acta. 1392(2-3): 254-64.

20. Carr A.C., Winterbourn C.C. 1997. Oxidation of neutrophil glutathione and protein thiols by myeloperoxidase-derived hypochlorous acid. Biochem J. 327(1): 275-81.

21. Chan P.H. 2001. Reactive oxygen radicals in signaling and damage in the ischemic brain. J Cereb. Blood Flow. Metab. 21: 2-14.

22. Chang M.K., Binder C.J., Torzewski M., Witztum J.L. 2002. C-reactive protein binds to both oxidized LDL and apoptotic cells through recognition of a common ligand: Phosphorylcholine of oxidized phospholipids. Proc Natl Acad Sci USA. 99(20): 13043-8.

23. Chautan M., Chazal G., Cecconi F., Gruss P., Golstein P. 1999. Interdigital cell death can occur through a necrotic and caspase-independent pathway. Curr. Biol. 9: 967-970.

24. Chua B.T., Guo K., Li P. 2000. Direct cleavage by the calcium-activated protease calpain can lead to inactivation of caspases. J. Biol. Chem. 275: 5131-5135.

25. Coppola S., Ghibelli L. 2000. GSH extrusion and and the mitochondrial pathway of apoptotic signalling. Biochem Soc Trans. 28(2): 56-61. Review.

26. Devera G., Stewarta L.J., Pittb A.R.,. Spickett C.M. 2003. Phospholipid chlorohydrins cause ATP depletion and toxicity in human myeloid cells. FEBS Letters. 540: 245-250.

27. Ding J., Wu Z„ Crider B.P., Ma Y., Li X., Slaughter C„ Gong L., Xie X.S. 2000. Identification and functional expression of four isoforms of ATPase II, the putative aminophospholipid translocase. J. Biol. Chem. 275: 23378-23386.

28. Eguchi Y., Shimizu S., Tsujimoto Y. 1997. Intracellular ATP levels determine cell death fate by apoptosis or necrosis. Cancer Res. 57(10): 1835-40.

29. Eiserich J.P., Baldus S., Brennan M-L, Ma W., Zhang C., Tousson A., Castro L, Lusis A.J., Nauseef W.M., White C.R., Freeman B.A. 2002. Myeloperoxidase, a Leukocyte-Derived Vascular No Oxidase. Science. 296: 2391-2394.

30. Elliott K., Ge K., Du W., Prendergast G.C. 2000. The c-Mycinteracting adaptor protein Binl activates a caspaseindependent cell death program. Oncogene. 19: 4669-4684.

31. Emerson D.K., McCormick M.L., Schmidt J.A., Knudson C.M. 2005. Taurine monochloramine activates a cell death pathway involving Bax and Caspase-9. J Biol Chem. 280: 3233-3241.

32. Eming S.A., Krieg Т., Davidson J.M., 2007. Inflammation in Wound Repair: Molecular and Cellular Mechanisms Journal of Investigative Dermatology. 127: 514-525.

33. Englert R.P., Shacter E. 2002. Distinct modes of cell death induced by different reactive oxygen species: amino acyl chloramines mediate hypochlorous acid-induced apoptosis. J Biol Chem. 277: 20518-20526.

34. Erdosova В., Hlavkova L., Prochazkova J., Lichnovsky V. 2002. Part of CD68+ macrophages in the clearence of apoptotic bodies in human metanephros. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 146(2): 41-5.

35. Erwig L.P., Henson P.M. 2007. Immunological consequences of apoptotic cell phagocytosis. Am J Pathol. 171(1): 2-8. Review.

36. Fadok V.A., Bratton D.L., Rose D.M., Pearson A., Ezekewitz R.A., Henson P.M. 2000. A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells. Nature. 405(6782): 8590.

37. Fadok V.A., Voelker D.R., Campbell P.A., Cohen J.J., Bratton D.L., Henson P.M. 1992. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol. 148(7): 2207-16.

38. Favero T.G, Colter D., Hooper P.F., Abramson J.J. 1998. Hypochlorous acid inhibits Ca(2+)-ATPase from skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. J Appl Physiol. 84(2): 425-30.

39. Favero T.G., Webb J., Papiez M., Fisher E., Trippichio R.J., Broide M., Abramson J.J. 2003. Hypochlorous acid modifies calcium release channel function from skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. J Appl Physiol. 94(4): 1387-94.

40. Foghsgaard L., Wissing D., Mauch D., Lademann U., Bastholm L., Boes M., Elling F., Leist M., Jaattela M. 2001. Cathepsin В acts as a dominant execution protease in tumor cell apoptosis induced by tumor necrosis factor. J. Cell Biol. 153: 999-1009.

41. Foote C.S., Goyne Т.Е., Lehrer R.I. 1983. Assessment of chlorination by human neutrophils. Nature. 301(5902): 715-6.

42. Forman H.J., Zhang H., Rinna A. 2009. Glutathione: Overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30: 1-12.

43. Forte M., Bernardi P. 2006. The permeability transition and BCL-2 family proteins in apoptosis: co-conspirators or independent agents? Cell Death and Differentiation. 13: 12871290.

44. Franco R., Panayiotidis M.I., Cidlowski J.A. 2007. Glutathione depletion is necessary for apoptosis in lymphoid cells independent of reactive oxygen species formation. J Biol Chem. 282(42): 30452-65.

45. Fukui К., Kaneda M., Takahashi E., Washio M., Doi K. 1994. Protective effects of sulfhydryl compounds on HOCl-induced intracellular Ca2+ increase in single rat ventricular myocytes. J Mol Cell Cardiol. 26(4): 455-61.

46. Galluzzi L., Joza N., Tasdemir E., Maiuri M.C., Hengartner M., Abrams J.M., Tavernarakis N., Penninger J., Madeo F., Kroemer G. 2000. No death without life: vital functions of apoptotic effectors. Cell Death and Differentiation. 15: 1113-1123.

47. Geske F.J., Monks J., Lehman L., Fadok V.A. 2002.The role of the macrophage in apoptosis: hunter, gatherer, and regulator. Int J Hematol. 76(1): 16-26.

48. Ghibelli L., Fanelli C., Rotilio G., Lafavia E., Coppola S., Colussi C., Civitareale P., Ciriolo M.R. 1998 . Rescue of cells from apoptosis by inhibition of active GSH extrusion. FASEB J. 12(6): 479-86.

49. Ghibelli L., Coppola S., Rotilio G., Lafavia E., Maresca V., Ciriolo M.R. 1995. Non-oxidative loss of glutathione in apoptosis via GSH extrusion. Biochem Biophys Res Commun. 216(1): 313-20.

50. Grimsley C., Ravichandran K.S. 2003. Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals. Trends Cell Biol. 13(12): 648-56.

51. Grisham M.B., Jefferson M.M., Melton D.F., Thomas E.L. 1984. Chlorination of endogenous amines by isolated neutrophils. Ammonia-dependent bactericidal, cytotoxic, and cytolytic activities of the chloramines. J Biol Chem. 259(16): 10404-13.

52. Guicciardi M.E., Leist M., Gores G.J. 2004. Lysosomes in cell death. Oncogene. 23: 2881— 2890.

53. Hall A.G. 1998. Medicaid's impact on access to and utilization of health care services among racial and ethnic minority children. J Urban Health. 75(4): 677-92. Review.

54. Halliwell В., Wasil M., Grootveld M. 1987. Biologically significant scavenging of the myeloperoxidase-derived oxidant hypochlorous acid by ascorbic acid. Implications for antioxidant protection in the inflamed rheumatoid joint. FEBS Lett. 213(1): 15-7.

55. Hanayama R., Tanaka M., Miwa K., Shinohara A., Iwamatsu A., Nagata S. 2002. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417(6885): 182-7.

56. Hanayama R., Tanaka M., Miyasaka K., Aozasa K., Koike M., Uchiyama Y., Nagata S. 2004. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304(5674): 1147-50.

57. Hart S.P., Dransfield I., Rossi A.G. 2008. Phagocytosis of apoptotic cells. Methods. 44 (3): 280-285.

58. Hawkins C.L., Davies M.J. 2005. Inactivation of protease inhibitors and lysozyme by hypochlorous acid: role of side-chain oxidation and protein unfolding in loss of biological function. Chem Res Toxicol. 18(10): 1600-10.

59. Hawkins C.L., Davies M.J. 1998. Hypochlorite-induced damage to proteins: formation of nitrogen-centred radicals from lysine residues and their role in protein fragmentation. Biochem. J. 332: 617-625.

60. Hawkins C.L., Pattison D.I., Davies M.J. 2003. Hypochlorite-induced oxidation of amino acids, peptides and proteins. Amino Acids. 25(3-4): 259-74. Review.

61. Hawkins C.L., Davies M.J. 1998. Reaction of HOC1 with amino acids and peptides: EPR evidence for rapid rearrangement and fragmentation reactions of nitrogen-centered radicals. J. Chem. Soc. 2: 1937-1945.

62. Hazen S.L., Heinecke J. W. 1997. 3-chlorotyrosine, a specific marker of myeloperoxidase-catalysed oxidation, is markedly elevated in low-density lipoprotein isolated from human atherosclerotic intima. J. Clin. InVest. 99: 2075-2081.

63. He Y.Y., Huang J.L., Gentry J.B., Chignell C.F. 2003. Epidermal growth factor receptor down-regulation induced by UVA in human keratinocytes does not require the receptor kinase activity. J Biol Chem. 278(43): 42457-65.

64. Henson P.M., Bratton D.L., Fadok V.A. 2001. The phosphatidylserine receptor: a crucial molecular switch? Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2: 627.

65. Henson P.M., Hume D.A. 2006. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends in Immunology. 27(5): 244-250.

66. Hirt U.A., Gantner F., Leist M. 2000. Phagocytosis of Nonapoptotic Cells Dying by Caspase-Independent Mechanisms. The Journal of Immunology. 164: 6520-6529.

67. Hodge S., Hodge G., Flower R., Reynolds PN., Scicchitano R., Holmes M. 2002. Up-regulation of production of TGF-P and IL-4 and down-regulation of IL-6 by apoptotic human bronchial epithelial cells. Immunology and Cell Biology. 80: 537-543.

68. Holzbecher J., Ryan D.E. 1980. The rapid determination of total bromine and iodine in biological fluids by neutron activation. Clin Biochem. 13(6): 277-8.

69. Honda Т., Coppola S., Ghibelli L„ Cho S., Kagawa Sh., Spurgers K.B., Brisbay S.M., McDonnell T.J. 2004. GSH depletion enhances adenoviral bax-induced apoptosis in lung cancer cells, Cancer Gene Therapy. 11 (4): 249-255.

70. Hussien M., Delecata R.J., Carey P.D. 2002. Neutrophil hypochlorous acid production is impaired in multiple organ failure patients with candidaemia; reversal with antifungal agents. Inflamm Res. 51(4): 213-7.

71. Huynh M.L., Fadok V.A., Henson P.M. 2002. Phosphatidylserine-dependent ingestion of apoptotic cells promotes TGF-betal secretion and the resolution of inflammation. J Clin Invest. 109(1): 41.

72. Ishimoto Y., Ohashi K., Mizuno K., Nakano T. 2000. Promotion of the uptake of PS liposomes and apoptotic cells by a product of growth arrest-specific gene, gas6. J Biochem. 127(3): 411-7.

73. Kagan V.E., Kuzmenko A.I., Tyurina Y.Y., Shvedova A.A., Matsura Т., Yalowich J.C. 2001. Pro-oxidant and antioxidant mechanisms of etoposide in HL-60 cells: role of myeloperoxidase. Cancer Res. 61(21): 7777-84.

74. Kato Y., Nagao A., Terao J., Osawa T. 2003. Inhibition of myeloperoxidase-catalyzed tyrosylation by phenolic antioxidants in vitro. Biosci Biotechnol Biochem. 67(5): 1136-9.

75. Kenis H., van Genderen H., Deckers N.M., Lux P.A.G., Hofstra L., Narula J., Reutelingsperger C.P.M., 2006. Annexin A5 inhibits engulfment through internalization of PS-expressing cell membrane patches. Experimental Cell Research. 312 (6): 719-726.

76. Khwaja A., Tatton L. 1999. Resistance to the cytotoxic effects of tumor necrosis factor-a can be overcome by inhibition of a FADD/caspase-dependent signaling pathway. J. Biol. Chem. 274: 36817-36823.

77. King C.C., Jefferson M.M., Thomas E.L. 1997. Secretion and inactivation of myeloperoxidase by isolated neutrophils. J Leukoc Biol. 61(3): 293-302.i

78. Krysko D.V., Berghe T.V., D'Herde K., Vandenabeele P. 2008. Apoptosis and necrosis: Detection, discrimination and phagocytosis. Methods. 44(3): 205-221.

79. Krysko D.V., D'Herde K., Vandenabeele P. 2006. Clearance of apoptotic and necrotic cells and its immunological consequences. Apoptosis. 11(10): 1709-26. Review.

80. Lampert M.B., Weiss S.J. 1983. The chlorinating potential of the human monocyte. Blood. 62(3): 645-51.

81. Lankiewicz S., Marc Luetjens C., True Bui N., Krohn A.J., Poppe M., Cole G.M., Saido T.C., Prehn J.H. 2000. Activation of calpain I converts excitotoxic neuron death into a caspase-independent cell death. J. Biol. Chem. 275: 17064-17071.

82. Lavoie J.N., Nguyen M., Marcellus R.C., Branton P.E., Shore G.C. 1998. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140: 637-645.

83. Learn D.B, Fried V.A, Thomas E.L. 1990. Taurine and hypotaurine content of human leukocytes. J Leukoc Biol. 48(2): 174-82.

84. Lee Y.J., Shacter E. 1999. Oxidative stress inhibits apoptosis in human lymphoma cells.J Biol Chem. 274(28): 19792-8.

85. Lee Y.J., Shacter E. 2000. Hydrogen peroxide inhibits activation, not activity, of cellular caspase-3 in vivo. Free Radic Biol Med. 29(7): 684-92.

86. Leist M., Single В., Castoldi A.F., Kuhnle S., Nicotera P. 1997. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J. Exp. Med. 185: 1481-1486.

87. Leist M., Single В., Naumann H. Fava E., Simon В., Ktihnle S., Nicotera P. 1999. Inhibition of mitochondrial ATP generation by nitric oxide switches apoptosis to necrosis. Exp. Cell Res. 249: 396^103.

88. Lelli J.L. Jr., Becks L.L., Dabrowska M.I. Hinshaw D.B. 1998. ATP converts necrosis to apoptosis in oxidant-injured endothelial cells. Free Radic Biol Med. 25(6): 694-702.

89. Li M.O., Sarkisian M.R., Mehal W.Z., Rakic P., Flavell R.A. 2003. Phosphatidylserine Receptor Is Required for Clearance of Apoptotic Cells. Science. 302: 1560.

90. Luciani M.F., Chimini G. 1996. The ATP binding cassette transporter ABC1, is required for the engulfment of corpses generated by apoptotic cell death. EMBO J. 5(2): 226-35.

91. Luschen S., Ussat S., Scherer G., Kabelitz D., Adam-Klages S. 2000. Sensitization to death receptor cytotoxicity by inhibition of FADD/caspase signaling: requirement of cell cycle progression. J. Biol. Chem. 275: 24670-24678.

92. Madejczyk M.S., Ballatori N. 2004 . Activation of plasma membrane reduced glutathione transport in death receptor apoptosis of HepG2 cells. Toxicol Appl Pharmacol. 195(1): 1222.

93. Maianski N.A., Geissler J., Srinivasula S.M., Alnemri E.S., Roos D., Kuijpers T.W. 2004. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11: 143-153.

94. Malle E., Furtmiiller P.G. Sattler W., Obinger C. 2007 Myeloperoxidase: a target for new drug development? British Journal of Pharmacology. 152 (6): 838-854.

95. Malle, E., Buch, Т., and Grone, H.-J. 2003. Myeloperoxidase in kidney disease. Kidney Int. 64: 1956-1967.

96. Mathiasen I ,S., Lademann U., Jaattela M. 1999. Apoptosis induced by vitamin D compounds in breast cancer cells is inhibited by Bcl-2 but does not involve known caspases or p53. Cancer Res. 59: 4848-4856.

97. Matsumura H., Shimizu Y., Ohsawa Y., Kawahara A., Uchiyama Y., Nagata S. 2000. Necrotic death pathway in Fas receptor signaling. J. Cell Biol. 151: 1247-1256.

98. McDonald PP, Fadok VA, Bratton D, Henson PM. 1999. Transcriptional and translational regulation of inflammatory mediator production by endogenous TGF-beta in macrophages that have ingested apoptotic cells. J Immunol. 163(11): 6164-72.

99. Medzhitov R., Janeway, C.A. 1997. Innate immunity: impact on the adaptive immune response. Current Opinion in Immunology. 9 (1): 4-9.

100. Melino G., Bernassola F., Knight R.A., Corasaniti M.T., Nistico G., Finazzi-Agro A. 1997. S-nitrosylation regulates apoptosis. Nature. 388: 432-433.

101. Mevorach D., Mascarenhas J.O., Gershov D., Elkon K.B. 1998. Complement-dependent clearance of apoptotic cells by human macrophages. J Exp Med. 188(12): 2313-20.

102. Michlewska S., McColl A., Rossi A.G., Megson I.L., Dransfield I. 2007. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40(4): 267-73.

103. Monnier V., Sell D.R., Nagaraj R.H., Miyata S. 1991. Mechanisms of protection against damage mediated by the Maillard reaction in aging. Gerontology.;37(l-3):152-65. Review.

104. Naskalski J.W., Marcinkiewicz J., Drozdz R. 2002. Myeloperoxidase-mediated protein oxidation: its possible biological functions. Clin Chem Lab Med. 40: 463-8.

105. Nathan C. 2002. Points of control in inflammation. Nature. 420(6917): 846-52. Review.

106. Nicholls S.J., Hazen S.L. 2005. Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vase Biol. 25: 1102-11.

107. Nuutila J., Lilius E.M. 2005. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65: 93.

108. Oka K., Sawamura Т., Kikuta K., Itokawa S., Kume N., Kita Т., Masaki T. 1998. Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor 1 mediates phagocytosis of aged/apoptotic cells in endothelial cells. Proc Natl Acad Sci USA. 95(16): 9535-40.

109. Okada H., Мак T.W. 2004. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells. Nature Reviews Cancer. 4: 592-603.

110. Panasenko O.M, Spalteholz H., Schiller J.U. Arnhold J.U. 2003. Myeloperoxidase-induced formation of chlorohydrins and lysophospholipids from unsaturated phosphatidylcholines. Free Radical Biology & Medicine. 34: 553-562.

111. Panasenko O.M., Evgina S.A., Aidyraliev R.K., Sergienko V.I., Vladimirov Y.A. 1994. Peroxidation of human blood lipoproteins induced by exogenous hypochlorite generated in the system of myeloperoxidase + H2O2 + СГ. Free Radical Biol. Med. 16: 143-148.

112. Park S.Y., Lee S.M., Shin S.W., Park J.W. 2008. Inactivation of mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase by hypochlorous acid. Free Radic Res. 42(5): 467-73.

113. Pattison D., Davies M.J. 2001. Absolute rate constants for the reaction of hypochlorous acid with protein side chains and peptide bonds. Chem Res Toxicol. 14(10): 1453-64.

114. Peskin A.V., Winterbourn C.C. 2001. Kinetics of the reactions of hypochlorous acid and amino acid chloramines with thiols, methionine, and ascorbate. Free Radical Biology & Medicine. 30: 572-579.

115. Peskin A.V., Winterbourn С.С. 2003. Histamine chloramine reactivity with thiol compounds, ascorbate, and methionine and with intracellular glutathione. Free Radic Biol Med. 35: 1252-60.

116. Piatt N., Suzuki H., Kuxihara Y., Kodama Т., Gordon S. 1996. Role for the class A macrophage scavenger receptor in the phagocytosis of apoptotic thymocytes in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 93(22): 12456-60.

117. Podrez E.A., Abu-Soud H.M., Hazen S.L. 2000. Myeloperoxidase-generated oxidants and atherosclerosis. Free Radical Biol. Med. 28: 1717-1725.

118. Polyak K., Xia Y., Zweier J.L., Kinzler K.W., Vogelstein B. 1997. A model for p53-induced apoptosis. Nature. 389: 300-305.

119. Prutz W.A. 1998. Interactions Of Hypochlorous Acid With Pyrimidine Nucleotides, And Secondary Reactions Of Chlorinated Pyrimidines With GSH, NADH, And Other Substrates. Archives Of Biochemistry And Biophysics. 349: 183-191.

120. Prutz W.A. 1999. Consecutive halogen transfer between various functional groups induced by reaction of hypohalous acids: NADH oxidation by halogenated amide groups. ArchBiochem Biophys. 371(1): 107-14.

121. Pullar J.M., Vissers M.C., Winterbourn C.C. 2000. Living with a killer: the effects of hypochlorous acid on mammalian cells. IUBMB Life. 50(4-5): 259-66. Review.

122. Pullar J.M.,. Winterbourn C.C., Margret Vissers C.M. 1999. Loss of GSH and thiol enzymes in endothelial cells exposed to sublethal concentrations of hypochlorous acid. Am. J. Physiol. 277: H1505-H1512.

123. Ren Y., Silverstein R.L., Allen J., Savill J. 1995. CD36 gene transfer confers capacity for phagocytosis of cells undergoing apoptosis. J Exp Med. 181(5): 1857-62.

124. Rigotti A., Acton S.L., Krieger M. 1995. The class В scavenger receptors SR-B1 and CD36 are receptors for anionic phospholipids. J. Biol. Chem. 270: 16221-16224.

125. Roberts L.R., Adjei P.N., Gores G.J. 1999. Cathepsins as effector proteases in hepatocyte apoptosis. Cell. Biochem. Biophys. 30: 71-88.

126. Roman R.M., Wendland A.E., Polanczyk C.A. 2008. Myeloperoxidase and coronary arterial disease: from research to clinical practice. Arq Bras Cardiol. 91(1): 11-19.

127. Rosen A., Casciola-Rosen L. 1999. Autoantigens as substrates for apoptotic proteases: implications for the pathogenesis of systemic autoimmune disease. Cell Death Differ. 6(1): 612. Review.

128. Rubartelli A., Poggi A., Zocchi M.R. 1997. The selective engulfment of apoptotic bodies by dendritic cells is mediated by the alpha(v)beta3 integrin and requires intracellular and extracellular calcium. Eur J Immunol. 27(8): 1893-900.

129. Saikumar P., Dong Z., Weinberg J.M., Venkatachalam M.A. 1998. Mechanisms of cell death in hypoxia/reoxygenation injury. 25: 3341-3349.

130. Savill J., Dransfield I., Gregory C., Haslett C. 2002. A blast from the past: clearance of apoptotic cells regulates immune responses. Nat Rev Immunol. 2: 965-975.

131. Savill J., Hogg N., Ren Y., Haselett C. 1992. Thrombospondin cooperates with CD36 and the vitronectin receptor in macrophage recognition of neutrophils undergoing apoptosis. J. Clin. Invest. 90: 1513-1522.

132. Schlegel R.A., Krahling S., Callahan M.K., Williamson P. 1999. CD14 is a component of multiple recognition system used by macrophages to phagocytose apoptotic lymphocytes. Cell Death Differ. 6: 583-592.

133. Schraufstatter I.U., Browne К., Harris A., Hyslop P.A., Jackson J.H., Quehenberger O. Cochrane C.G. 1990. Mechanisms of hypochlorite injury of target cells. J. Clin. Invest. 85: 554-562.

134. Schrijvers D.M., De Meyer G.R., Kockx M.M., Herman A.G., Martinet W. 2005. Arterioscler Thromb Vase Biol. 25(6): 1256-61.

135. Scott R.S., McMahon E.J., Pop S.M., Reap E.A., Caricchio R., Cohen P.L., Earp H.S., Matsushima G.K. 2001. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411(6834): 207-11.

136. Servaty R., Schiller J., Binder H., Kohlstrunk В., Arnold K., 1998. IR and. NMR Studies on the Action of Hypochlorous Acid on Chondroitin Sulfate and Taurine. Bioorganic Chemistry. 26: 33^13.

137. Solary E., Droin N., Bettaieb A., Corcos L., Dimanche-Boitrel M-T., Garrido C. 2000. Positive and negative regulation of apoptotic pathways by cytotoxic agents in hematological malignancies 14, 10: 1833-1849.

138. Somersan S., Bhardwaj N. 2001. Tethering and tickling: a new role for the phosphatidylserine receptor. J Cell Biol. 155(4): 649-59.

139. Strasser A., O'Connor L., Dixit V.M. 2000. Apoptosis signaling. Annu. Rev. Biochem. 69: 217-245.

140. Takizawa F., Tsuji S., Nagasawa S. 1996. Enhancement of macrophage phagocytosis upon iC3b deposition on apoptotic cells. FEBS Lett. 397(2-3): 269-72.

141. Tang X., Halleck M.S., Schlegel R.A., Williamson P. 1996. A subfamily of P-type ATPases with aminophospholipid transporting activity. Science. 272: 1495-1497.

142. Thomas E.L., Grisham M.B., Melton D.F., Jefferson M.M. 1985. Evidence for a role of taurine in the in vitro oxidative toxicity of neutrophils toward erythrocytes. J Biol Chem. 260(6): 3321-9.

143. Tsutsui H., Ide Т., Kinugawa S. 2006. Mitochondrial oxidative stress, DNA damage, and heart failure. Antioxid Redox Signal. 8: 1737-1744.

144. Ueda S., Nakamura H., Masutani H., Sasada Т., Yonehara S., Takabayashi A., Yamaoka Y., Yodoi J. 1998. Redox regulation of caspase-3(-like) protease activity: regulatory roles of thioredoxin and cytochrome c. J Immunol. 161(12): 6689-95.

145. Ura S., Nishina H., Gotoh Y., Katada Т., 2007. Activation of the JNK pathway by MST1 is essential and sufficient for the induction of chromatin condensation during apoptosis. Mol. Cell. Biol. 10: 00199-07.

146. Van den Dobbelsteen D.J., Nobel C.S., Schlegel J., Cotgreave I.A., Orrenius S., Slater A.F. 1996. Rapid and specific efflux of reduced glutathione during apoptosis induced by anti-Fas/APO-1 antibody. J Biol Chem. 271(26): 15420-7.

147. Vandivier R.W., Fadok V.A., Ogden C.A., Hoffmann P.R., Brain J.D., Accurso F.J., Fisher J.H., Greene K.E., Henson P.M. 2002. Impaired clearance of apoptotic cells from cystic fibrosis airways. Chest. 121(3 Suppl): 89S.

148. Varghese J., Khandre N.S., Sarin A. 2003. Caspase-3 activation is an early event and initiates apoptotic damage in a human leukemia cell line. Apoptosis. 8(4): 363-70.

149. Vercammen D., Brouckaert G., Denecker G., Van de Craen M., Declercq W., Fiers W., Vandenabeele P. 1998. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J. Exp. Med. 188: 919-930.

150. Verhoven В., Schlegel R.A.,Williamson P. 1995. Mechanisms of phosphatidylserine exposure, a phagocyte recognition signal, on apoptotic T lymphocytes. J. Exp. Med. 182: 1597-1601.

151. Vile G.F., Rothwell L.A., Kettle A.J. 2000. Initiation of rapid, P53-dependent growth arrest in cultured human skin fibroblasts by reactive chlorine species. Arch Biochem Biophys. 377(1): 122-8.

152. Vissers M.C., Carr A.C., Chapman A.L. 1998. Comparison of human red cell lysis by hypochlorous and hypobromous acids: insights into the mechanism of lysis. Biochem. J. 330: 131-138.

153. Vissers M.C., Carr A.C., Winterbour C.C. 2001. Fatty acid chlorohydrins and bromohydrins are cytotoxic to human endothelial cells. Redox Rep. 6(1): 49-55.

154. Vissers M.C., Pullar J.M., Hampton M.B. 1999. Hypochlorous acid causes caspase activation and apoptosis or growth arrest in human endothelial cells. Biochem J. 344(2): 4439.

155. Vissers M.C., Stern A., Kuypers F., van den Berg J., Winterbourn C.C. 1994. Membrane changes associated with lysis of red blood cells by hypochlorous acid. Free Radic. Biol. Med. 16: 703-712.

156. Vissers M.C., Winterbourn C.C. 1995. Oxidation of intracellular glutathione after exposure of human red blood cells to hypochlorous acid. Biochem. J. 307: 57-62.

157. Vogt W., Hesse D. 1994. Oxidants generated by the myeloperoxidase-halide system activate the fifth component of human complement, C5. Immunobiology. 192(1-2): 1-9.

158. Volbracht C., Leist M., Kolb S.A., Nicotera P. 2001. Apoptosis in caspase-inhibited neurons. Mol. Med. 7: 36-48.

159. Wagner B.A, Buettner R., Oberley L.W., Darby J., Burns P. 2000. Myeloperoxidase is involved in H202-induced apoptosis of HL-60 human leukemia cells. J Biol Chem. 275(29): 22461-9.

160. Weiss S.J., Klein R., Slivka A., Wei M. 1982. Chlorination of taurine by human neutrophils. Evidence for hypochlorous acid generation. J Clin Invest. 70(3): 598-607.

161. Weiss S.J., Lampert M.B., Test S.T. 1983. Long-lived oxidants generated by human neutrophils: characterization and bioactivity. Science. 222(4624): 625-8.

162. Weitzman S.A., Gordon L.I. 1990. Inflammation and cancer: Role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood. 766: 655-663.

163. Whiteman M., Hooper D.C., Scott G.S., Koprowski H., Halliwell B. 2002. Inhibition of hypochlorous acid-induced cellular toxicity by nitrite. Proc Natl Acad Sci USA. 99(19): 12061-6.

164. Whiteman M., Rose P., Siau J.L., Halliwell B. 2003. Nitrite-mediated protection against hypochlorous acid-induced chondrocyte toxicity: a novel cytoprotective role of nitric oxide in the inflamed joint? Arthritis Rheum. 48(11): 3140-50.

165. Williamson P., Schlegel R.A. 2002. Transbilayer phospholipid movement and the clearance of apoptotic cells. Biochim Biophys Acta. 1585(2-3): 53-63. Review.

166. Winterbourn C.C. 1985. Comparative reactivities of various biological compounds with myeloperoxidase-hydrogen peroxide-chloride, and similarity of the oxidant to hypochlorite. Biochim Biophys Acta. 840: 204-10.

167. Winterbourn C.C., Brennan S.O. 1997. Characterization of the oxidation products of the reaction between reduced glutathione and hypochlorous acid. Biochem. J. 326: 87-92.

168. Winterbourn C.C., van den Berg J.J., Roitman E., Kuypers F.A. 1992. Chlorohydrin formation from unsaturated fatty acids reacted with hypochlorous acid. Arch Biochem Biophys. 296(2): 547-55.

169. Woodle E.S., Smith D.M., Bluestone J.A., Kirkman W.M. 3rd, Green D.R., Skowronski E.W. 1997. Anti-human class I MHC antibodies induce apoptosis by a pathway that is distinct from the Fas antigen-mediated pathway. J. Immunol. 158: 2156-2164.

170. Wright C.E., Tallan H.H., Lin Y.Y., Gaull G.E. 1986. Taurine: biological update. Annu Rev Biochem. 55: 427-53.

171. Xiang J., Chao D.T., Korsmeyer S.J. 1996. Bax-induced cell death may not require interleukin 1 P-converting enzymelike proteases. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 93: 1455914563.

172. Xue L., Fletcher G.C., Tolkovsky A.M. 1999. Autophagy is activated by apoptotic signalling in sympathetic neurons: an alternative mechanism of death execution. Mol. Cell Neurosci. 14: 180-198.

173. Yamamoto Т., Imoto S., Sekine Y., Sugiyama K., Akimoto Т., Muraguchi A., Matsuda T. 2004. Involvement of NF-кВ in TGF-p-mediated uppression of IL-4 signaling. Biochem. and Biophys.l Research Commun. 313(3, 16): 627-634.

174. Zeevalk G.D., Razmpour R., Bernard L.P. 2008. Glutathione and Parkinson's disease: Is this the elephant in the room? Biomedicine & Pharmacotherapy. 62(4): 236-249.

175. Zhao W., Robbins M.E. 2009. Inflammation and chronic oxidative stress in radiation-induced late normal tissue injury: therapeutic implications. Curr Med Chem. 16: 130-143.

Информация о работе

Ковалева, Анастасия Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль гипохлорита в регуляции апоптоза и фагоцитоза миелоидных клеток in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Роль гипохлорита в регуляции апоптоза и фагоцитоза миелоидных клеток in vitro ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль гипохлорита в регуляции апоптоза и фагоцитоза миелоидных клеток in vitro"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковалева, Анастасия Михайловна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль гипохлорита в регуляции апоптоза и фагоцитоза миелоидных клеток in vitro"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ковалева, Анастасия Михайловна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалева, Анастасия Михайловна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль гипохлорита в регуляции апоптоза и фагоцитоза миелоидных клеток in vitro
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия