Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль фосфорилирования ДНК-связывающих белков в регуляции транскрипции гена С-МУС человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль фосфорилирования ДНК-связывающих белков в регуляции транскрипции гена С-МУС человека"

Р Г Б ОД

1 6 Л'Щ Гг"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577.214.3.

ИМАМОВА Лаалэ Рафиковна

РОЛЬ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ • В РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНА С-МУС ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 - Молекулярная, биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени ч кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Лаборатории Молекулярных основ онкогенеза (заведующий. - член-корреспондент РАК, профессор. Л.Л. Киселев)

Института молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта.

Научный руководитель: доктор биологических наук A.B. Иткес

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор П.М. Чумаков

кандидат биологических наук Л.Г. Николаев

на заседании диссертационного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В.А. Экгельгардта РАН по адресу 117984, Москва, ул. Вавилова, д. 32. ,,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН

Ведущая организация - Центр "Биоинженерия" РАН

Защита состоится • - 1995 т. в

часов

Автореферат разослан

кандидат химических наук

Ученый секретарь Специализированного совета

Актуальность проблемы.

Яанная ' работа посвящена одной из наиболее важных и актуальных проблем современной молекулярной биология - регуляции транскрипционной активности генов. Изменение транскрипционной активности генов является 'существенным моментом в регуляции многих биологических процессов, включая контроль роста клеток, их дифферекцировку и злокачественное перерождение. Передача внеклеточных сигналов, в том числе от факторов роста, влияющих на экспрессию генов, осуществляется с помощью цитоплазматических сигнальных путей, необходимыми компонентами которых являются протеинкиназы. Одним из механизмов взаимодействия между цитоплазмой и ядром является фосфорилирование и/или дефосфорилирование транскрипционных факторов.

Под контролем фосфорилируемых транскрипционных факторов находятся различные гены, в том числе гены, регулирующие пролиферацию клеток. Контроль клеточной пролиферации представляет собой сложную систему, в которую включено множество взаимодействующих между собой факторов. Нарушение контроля пролиферации является ключевой стадией онкогенеза. В этом процессе важную роль играет семейство генов шус(с-вус, М-шус, I- -шус). Наиболее изученный член этого семейства - ген с-тус, экспрессия которого характерна как для трансформированных, так и для нетрансформированных клеток. Этот ген имеет сложную систему позитивной и негативной регуляции, и его экспрессия строго коррелирует с клеточной пролиферацией. Учитывая сказанное выше, мы предположили, что этот ген может регулироваться через фосфорилирование клеточных транскрипционных факторов и осуществили экспериментальный поиск таких факторов.

Целью настоящей работы было исследование роли фосфорилированных ДНК-связывакших белков в регуляции транскрипции гена с-тус.

Экспериментальные задачи исследования заключались в . следующем:

1. Получить препараты гиперфосфорилированвых клеточных

белков in vitro, а также клетки в культуре, содержащей гиперфосфорилированные белки.

2. Определить влияние ортованадата на дефосфорилирование аминокислотных остатков (т.е. определить, на какие фосфатазы действует ортованадат).

3. Выяснить влияние ингибирования дефосфорилирования на скорость роста клеток.

4. Выявить влияние ингибирования дефосфорилирования, вызванного ортованадата на транскрипцию гена c-myc ¡л vivo и in vitro.

5. Идентифицировать фосфобелки, принимающие участие в регуляции транскрипции гена с-тус.

6. Определить специфические участки связывания возможных ДНК-связывающих белков в промоторной области гена с-тус.

Для выясяения влияния фосфорилирования на активность факторов транскрипции используют активаторы протеинкиназ или ингибиторы фосфатаз. Один из таких ингибиторов фосфатаз ортованадат натрия (Na3V04), который является структурным аналогом фосфата. Он связывается с фосфат-узнающим центром фосфатаз, в том числе протеинфосфатаз; это связывание определяет ингкбиругацее действие ортованадата иа протеинфосфатазы.

Научная новизна и практическое значение работы.

В лизате клеток HeLa обнаружены ранее яе идентифицированные фосфобелки при, инкубации клеток с ортованадатом, натрия. Полный гидролиз белков показал, что молярное соотношение остатков Р-Tyr/P-Ser/P-Thr в клетках, не подвергавшихся действию ортованадата, составляет 1/30/20. После инкубации с 0,1 мМ ортованадата это соотношение сохраняется, однако наблюдается увеличение количества фосфорилированных остатков Туг, Ser и Thr в 2 раза. Следовательно, происходит подавление дефосфорилирования как фосфотирозяновых, так и фосфосериновых и фосфотреониновых остатков. Установлено, что добавление ортованадата и фосфорилирование клеточных белков приводит к усилению транскрипции гена с-тус in vitro со стартов PI, Pia и Р2. Выявлены ДНК-связывающие белки с молекулярными массами 23, 35 и 70 кДа, связывающиеся с промоторной областью гена с-тус только в

фосфорилированной форме. Определены участки связывания указанных белков.

Полученные результаты дополняют известную схему регуляции транскрипции ■ гена с-тус, в частности, вовлекая фосфорилирование/дефоефорилирование в активацию ДНК-связываклцих белков, что весьма важно для понимания природы канцерогенеза и поиска путей возвращения клетки в нормальное пролиферативное - состояние.

Апробация работы.

Основные научные результаты работы представлены на X Российско-Германском симпозиуме "Структура и функция генома" (Суздаль, 1993), на Всероссийской конференции "Геном человека" (Черноголовка, 1993), на конференции "Приоритетные направления генетики" (Москва, 1993), на Международном симпозиуме "Современные тенденции в вирусологии и иммунологии опухолей", > посвященном 100-летию со дня рождения Л.А. Зильбера (Москва, 1994).

Об'ем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждения), выводов и списка цитированной литературы, состоящего из 129 наименований. Работа изложена на ^^страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Влияние ортованадата на рост клеток и экспрессию гена с-шус.

Одна из задач исследования заключалась в выявлении вызванных

ортованадатом изменений содержания фосфобелков в лизате клеток

НеЬа. Для этого лизат инкубировали при 30°С с 0,1 мМ

32

ортованадатом в течение 1,5 часов с т[ Р]АТФ, после чего белки разделяли электрофорезом в денатурирующих условиях. Полученные данные свидетельствуют о том, что инкубация клеточного лизата с

ванадатом приводит к повышению наблюдаемого. уровня фосфорилирования определенных белков. В необработанном вакадатом лизате клеток НеЬа эти белки также фосфорилированы, но в гораздо меньшей степени. Кроме того, происходит фосфорилирование дополнительных белков (Рис. 1.), которые не фосфорилированы в контроле. /

кРа - 94

5*»

* ; - 43 ** - 30

ее-

1 2

20 14,4

Рис.1. Электрофорез фосфобелков

экстракта клеток Не1.а в 5 %

полиакриламидном геле, содержащим

1% 1 - без ортованадата, 2 -

обработанных 0,1 мМ ортованадатом

в течение 1,5 часов в присутствии 32

Р]АТФ. Справа приведены

положения маркерных:, белков: 94кДа - фосфорилаза В, 43кДа - яичный альбумин, 30 кДа - карбоангидраза, 20 кДа ингибитор трипсина,

14,4кДа - о-лактальбумин.

Изменения в содержании фосфорилированных белков в клетках после их обработки ортованадатом определяли в течение коротких интервалов времени (1-6 часов). Данный интервал был выбран потому, что в предыдущих исследованиях, когда клетки инкубировали с ортованадатом в течение нескольких суток, наблюдаемые эффекты'

\

могли быть следствием вторичных процессов. Нас же интересовали изменения, происходящие в клетках при коротких временах обработки ортованадатом, т. е. прямо связанные с такой обработкой.

Исходя из того,' что ортованадат - ингибитор фосфатаз, мы стремились установить, какие аминокислоты в фосфорилированных белках преимущественно фосфорилированы. С этой целью был проведен хроматографический анализ фосфорилированных аминокислот после гидролиза фосфобелков.

: рог

!Р-Бег

. Р-ТИг

Р-Туг

Рис.2.Электрофорез фосфоаминокислот полученных в результате полного гидролиза суммарного белка клеток СаОу : 1 - контрольных, 2 -обработанных в культуре 0,1 мМ ортованадатом в течение 3 часов. Справа приведены положения

стандартных фосфоаминокислот.

Полный гидролиз белков из линии клеток СаОу (одна из разновидностей линий НеЬа) показал, что молярное соотношение остатков Р-Туг/Р-Бег/Р-ТЬг в контрольном образце (клетки не подвергали инкубации с вакадатом) составляет 1/30/20. После инкубации клеток с 0,1 мМ ортованадатом в течение 3-х часов это соотношение сохраняется, однако при этом наблюдается увеличение содержания фосфорилированных остатков тирозина, серина и треонина в 2 раза. Следовательно, происходит подавление дефосфорилирования как фосфотирозиновых, так и фосфосериновых и фосфотреониновых остатков (Рис. 2.).

Параллельно в культуру клеток СаОу, преинкубированную с 0,1

мМ ортоганадатом в течение 1, 3 и 6 часов, добавляли 13Н]тимидик в-количестве 1 мкКв/мл и выдерживали клетки в течение "15 минут. Оказалось, что включение [3Н]тимидина в ДНК растущих клеток не изменяется на протяжении 6-ти ■ часов инкубации с ванадатом (Рис.3), напротив, в клетках, преинкубированных без сыворотки (рост замедлен), наблюдается увеличение уровня включения 13Н]тимидина т>' ДНК' 'а 2 раза.

40-

30-

_Я 20-

10-

1-г

г

ю

- в

- 1

X X

Рис.3.А. Включение [ Н ]тимидина в клетки, обработанные 0,1 мМ ортованадатом, находящиеся 1 - в стадии логарифмического роста, 2 - при подавлении роста в отсутствии сыворотки (рост замедлен); 3 - содержание РНК с-шус в растущих клетках (сканирование рентгеновской пленки на (Рис.3.В)..

3

9® ® $ туе

0 3 6 9

0 1/4 16

©ее • о®

1 з 6

'о:.

Рис.3.Б. Дот-гибридизация тотальной РНК из клеток СаОу, преинкубированных с 0,1 мМ ортованадатом. В качестве зонда для.' гибридизации был использован фрагмент гена \-myc 1 и

фрагмент гена Время преинкубации показано в

часах.

Содержание мРНК онкогенов туе и /о£г определяли методом дот-гибридизации. Было показано (Рис. З.В), что содержание РНК с-тус в клетках, " находящихся в стадии экспоненциального роста возрастает при - -инкубации клеток ■ в -течение -6 - часов с ортованадатом. Содержание РНК с-1о$ при этом остается на прежнем уровне. Наблюдаемое увеличение уровня РНК гена с-тус может быть результатом усиления транскрипции данного гена и/или неспецифического повышения стабильности мРНК. Отсутствие параллельного роста содержания РНК генов с-тус и с-1о5 указывает на то, что усиление экспрессии гена с-тус является специфическим (Рис. З.В). Следовательно, увеличение уровня мРНК гена с-тус после инкубации клеток с ортованадатом является результатом активации транскрипции. В клетках, преинкубированных без сыворотки, содержание РНК с-тус незначительно по сравнению с растущими клетками и невозможно определить ее содержание достоверно с использованием данного, метода.

Для полного анализа эффекта активации экспрессии гена с-тус з клетках СаОу после их инкубации с ортованадатом мы использовали

метод блот-гибрядизации ро 1 у(АВидно (Рис.4., дорожки 2 и 3 ), что содержание мРНК гена с-тус возрастает в результате обработки клеток ортованадатоы, т.е. эффект, зарегистрированный, на уровне дот-гибридизации, соответствует . росту . содержания нормальной зрелой мРНК с-тус.

Таким образом, гиперфосфоцяишдддадше клеточных белков в культуре вызывает активацию траисадяиздвя гена с-тус. При '.этом преимущественное увеличение урожая фмфотирозила по. сравнению с фосфосерилом и фосфотреонилом ее оЬязательно " для активации процесса клеточной пролиферации а усиления экспрессии гена'с-шус. Отметим в этой связи, что механизм регуляции процесса пролиферации при ломопи фосфоряапджюшия белков не выяснен. Возможно, описаиное в литературе уввшгчкние уровня фосфотирозила в белках клеток, инкубировавшее с вртованадатом в течение нескольких суток, служит не зривиной, а следствием усиления экспрессии протоонкогенов и активации пролиферации, вызванной ортованадатом.

-.28S -Î18S

Рис.4. Содержание РНК с-аус ' в клетках ¡CaOv в культуре. - Блот -гибридизация poly(A)+-PHK из клеток CaOv (растущих),

претофбированных с 0,1 мМ ортованадатом: 1-0, 2,3 — 6 часов часов. Справа приведены . положения 28S и 18S рибосомных РНК.

Влияние ортошгжадята на транскрипцию гена »-горе i a vitro.

Для выяснения характера! изменения транскрипции в присутствии ортованадата анализировала иргкскрипцию плазмид, содержащих-участки в ' регуляторной области гена с-шус различной длины. Плазмида pUMCl содержала участия гена с-ту с от -101 до +1185, считая от точки иницсашш травстртпции для промотора Pj. При этом была удалена большая часть 5*-о6жасти с содержащимися в ней позитивными и негативными: регулжторными участками, но сохранен участок, ранее идентифицированный как IRS-повобньш - —7б/-б7 (Alexandrova et' al., ЮТ» Tnrpaev et . al., 1991).. Эту конструкцию использовали в качггстае матрицы для транскрипции in vitro.

Ftec-5. Анализ методом зашиты от гиздролиза РНКазой А . (РНК-РНК гибридизация в растворе (RNA protection assay). Препарат РНК, подученный в реакции транскрипции ¡m ti tro :1-с 0,1 »AI ортованадатом, 2— с 30 мкМ ортованадатом, 3 - без аргговаяадата. Р}, Pja, ~ старты 12 3 транскрипции гена с-тус.

Транскрипты гена с-тус выявляли методом РНК-РНК гибридизаш-.п в растворе. Для синтеза меченого РНК-зонда использовали плазмиду PUS-8, сконструированную на основе вектора pGEM-l, содержащую фрагмент гена с—тус от -101 до +514 в антисмысловой ориентации по отношению к промотору Т . Гибридизация с препаратом РНК, полученной в реакции'/л vitro, с меченым РНК-зондом позволила выяснить, что инициация транскрипции гена с-тус, если судить по размерам транскриптов, происходила со стартов Р^., Р1а, Р^ (Рис. 5). При отсутствии ортованадата транскрипция была незначительной; добавление ортованадата к транскрипционной смеси приводило к усилению транскрипции при увеличении концентрации ортованадата. Это позволило предположить присутствие в системе регуляторных белков, активных в фосфорилированной форме, активирующих транскрипцию гена с-шус.

Анализ взаимодействия гена с-шус с белками из экстракта клеток после инкубации с ортованадатом.

Для проверки предположения о существовании регуляторных

фосфобелков, появляющихся после инкубации лизата с ортованадатом,

у

мы использовали технику сдвига электрофоретической полосы. Поскольку при этом свободный фрагмент движется быстрее взаимодействующего с белком, то появляется 'возможность "наблкшагь образование ДНК-белкового, комплекса. В опытах использовали клеточный экстракт, предварительно инкубированный с 0,1 мМ ортованадатом в течение 1,5 часов. В качестве контроля использовали экстракт, не обработанный ортованадатом.

Фрагменты ДНК геиа с-тус получали, используя плазмиды pUEXO и рША; полученные в результате расщепления фрагменты соответствовали участкам гена с-шус с координатами -101/+71 и +1/+71. Эти участки соответствуют промоторной области гена с-тус\ они, как следует из результатов опытов по транскрипции, необходимы для инициации транскрипции со стартов Р^, Р^а и ?2 в присутствии ортованадата. В качестве неспецифического конкурента использовали ДНК из спермы лосося.

Фрагмент .гена с-тус с координатами от- -101 до .+71 образовывал два комплекса с белками экстракта клеток HeLa,

обработанных ортованадатом (Рис. 6, дорожха £ ). Использование фрагмента с координатами +1/+71 также приводило к образованию двух комплексов (Рис. б, дорожка 4 )• Необходимо отметить, что белки, присутствующие в необработанном ортованадатом лизате (Рис. б, дорожка 2 ), также образуют комплексы с фрагментом гена с-туе, однако они не соответствуют комплексам, образующимся., после инкубации лизата с ортованадатом..

ОС

Л

1 2

Рис.б. Электрофорети^еский анализ комплексов белков 32

экстракта клеток НеЬа с [ Р] - меченными фрагментами гена с-тус. Экстракт клеток был преинкубирован: 1, 3 - с 0,1 ыМ ортованадатом, 2 - без ортованадата.

1,2 - фрагмент гена с-тус Ачя\\/ХЪо\. 3 - фрагмент гена с-тус 5та\fXhol.

Комплексы связывания (са, сЬ, сс) соответствуют фосфобелкам на двумерном гель-электрофорезе (рис. 7).

Таким образом, ингибирование фосфатаз ортованадатоы приводи-! к активации фосфорилированных ДНК-свячыватацих белков; эти белки образуют специфические комплексы с ДНК промоторной области гена с-тус. ' . • . . • ■

Определение молекулярной массы фосфобелков, образующих ДНК-белковые комплексы.

Для определения молекулярной массы фосфобелкоа, участвующих

в образовании описанных зыше комплексов, применяли ~ те же

конструкции, что и в предыдущем опыте. Анализируемые белки

обнаруживали, используя технику пвумерногс электрофореза с

немеченым фрагментом ДНК и клеточным экстрактов, необработанным

ортованадатоы; данный экстракт содержал гиперфасфорилированные 32

белки, меченные т1 Р]АТФ.. В первом направлении проводили стандартный сдвиг электрофоретической полосы, вырезали нужные дорожки (Рис. б, дорожки 1 и 2) и проводили электрофорез белков в денатурирующих условиях (по Лэмли) в перпендикулярном направлении.

Двумерный эректорфорез показал, что два белка с молекулярными массами 23 кДа и 35 кДа принимают участие в связывании с фрагментом ДНК с координатами +1/+71 (Рис. 7. А).

С фрагментом "гена с-тус (координаты -101/+71) могут связываться одновременно три белка: помимо белков с молекулярными массами 23 и р35 кДа появляется белок с молекулярной массой 70 кДа. В данном -случае эти белки образуют единый ДНК-белковый .комплекс (Рис. 7.В). Мы не обнаружили белков, вовлекаемых в минорный комплекс с фрагментом —101/+71. Возможно, этот комплекс не содержит фосфобелков.

В качестве контроля мы использовали одномерный электрофорез-свободных фосфобелков в трис-боратном буфере.

Т с1ь

кОа

- 94

- 67

- 43.

- 30

- 20

сс

В ^ кйа

- -94

-67

-43 -30

I

— 20

Рис.7. Двумерный гель-электрофорез белков из экстракта

клеток НеЬа, преинкубированного с 100 мкМ ортованадатом в

32

присутствии г[Р]АТФ: А- фрагмент гена с-шус Ача11/ХЬо1; В -фрагмент гена: с-шус 5та1/ХЬо1. Справа приведены положения маркерных белков. Стрелки указывают на специфические фосфобелки. Позиции комплексов, регистрируемых в первом направлении, отмечены как са, сЬ, сс (см. Рис. 6).

Этот контрольный опыт позволил об'яснить причину отсутствия на картине; полученной при двумерном ' электрофорезе, других фосфобелков, которые присутствуют в клеточном экстракте (см. Рис.

1). Без инкубации с ванадатом не связакпые : ДНК фосфобелки агрегируют между собой и остаются на старте, т.е. после инкубации с ванадатом при проведении электрофореза в трис-боратном буфере выявляются " только полосы, соответствующие ' ДНК-белковым комплексам. Следовательно, в указанных условиях не наблюдается появления диагонали свободных фосфобелков.

Таким образом, выявлено существование трех ДНК-связываюших фосфобелков, которые узнают определенные последовательности в промоторной области гена с-тус.

Локализация участков связывания белков , . с геном с-тус.

Для определения участков связывания бглкои экстракта клеток HeLa с геном с-гаус использовали метод защиты от ДНКазы I. Выделяли и анализировали комплексы с белками, полученные в тех же условиях, что и в опыте по сдвигу электрофоретической полосы. В качестве маркера использовали те же фрагменты ДНК, секвенированные по методу Максама-Гилберта, что позволяло определить участки связывания фосфорилированных белков с последовательностью ДНК гена с-шус. Комплекс подвергали обработке ДНКазой !, которая вызывала статистическое растепление "анализируемого фрагмента. Нуклёотидные последовательности, взаимодействующие с белком, расщеплению не подвергались.

На фрагменте ДНК гена с-шус +1/+71 найдено два участка связывания: +7/+16 (GAGCTGTGCT) и +38/+42 (GCCCC) (Рис. 8.А).

Участок +7/+16 представлен последовательностью GAGCTGTGCT, которая не относится к уже известным участкам связывания факторов. Можно предположить, что существует новый фактор(ы), способный узнавать данный участок. Данный район располагается в непосредственной близости от старта Pj, что дает возможность предположить дополнительно, что в образовакич комплекса принимают участие фосфорилированные компоненты РНК-полимаразы II (Arias et al., 1991, Laybourn et al., 1990), а не собственно транскрипционный фактор(ы).

Участок +3S/+42 представлен последовательностью GCCCC,

которая находится внутри 17-членного GC-богатого района от +31 до +47. Описано два транскрипционных фактора - АР-2 (Roesler et. al., 1988) и Spl (Jackson et. al., 1993), связывающиеся с GC-богатой ■ последовательностью и чья активность регулируется фосфорилированием. Фактор АР-2 принимает участие в сАМР-зависимом пути (Imagawa et. al., 1987, Hyman et. al., 1989, Medcalf et. al., 1989), но нет данных, что он сам может быть фосфорилирован. Не исключено, что фосфорилированные белки 23 кДа и 35 кДа, связывание которых показано в данной области, могут взаимодействовать с АР-2 и регулировать его активность. Spl также связывается с GC-богатой последовательностью, однако вовлечение этого фактора в фосфорилированной форме в процесс регуляции транскрипции гена с-шус кажется маловероятным. Очищенный фактор Spl представляет собой белок р95 (р105), который фосфорилируется ДНК-зависимой протеинкиназой, и мы должны были, кроме белков 23 кДа и 35 кДа, идентифицировать и р95 (р105).

На фрагменте ДНК гена с-шус -101/+71 видно, что сохраняются участки связывания для белков с молекулярной массой 23 кДа и 35 кДа. Кроме того, появляется еще один участок связывания - -78/-63 (GGGGAAAAGAAAAAAG), который соответствует 1SRE (Рис.8.В).

С 1SRE нуклеотидной последовательностью GGGGAAAAGAAAAAAG связывается белок с молекулярной массой 70 кДа, так как двумерный гель-электрофорез показал, что данный белок связывается только с фрагментом ДНК -101/+73. Нами ранее показано, что существует регуляторный белок (no-видимрму, не 70 кДа) в экстракте из линии клеток HeLa\ который связывается с этим участком (Alexandrova et al., 1990, Turpaev et al., 1991); при удалении области, содержащей последовательность 1RS, инициируется транскрипция с промотора Ij, т. е. этот промоторный участок контролирует транскрипцию с неканонических точек инициации, находящихся в первом интроне гена.

1234 5678

Рис.8.А. Электрофоретический анализ связывания фосфобелков экстракта клеток HeLa с ДНК гена с-шус (футлринт). Комплекс фрагмента Avall/Xhol гена с-шус с фосфобелками из экстракта клеток HeLa, инкубированного с 0,1 ыМ ортованадата. Фрагмент метили по участку узнавания эндонуклеазой .Avail (1,2,3,4) и' Xhol (5,6,7,8).

1.2 - без экстракте; 3,4 - с 3 и белка из экстракта;

1.3 - 1 минута инкубации с ДНКазой I; 2,4 - 3 минуты инкубации с ЛНКазой I.

5,6 - без экстракта; 7,8 - с 3 мг белка из экстракта;

5,7-1 минута инкубации с- ДНКазой I; 6,8 - 3 минуты инкубации с ДНКазой I.

Участки - зашиты • от ДНКазы ■ А■ показаны скобками с соответствующей нуклеотидной последовательностью.

1234 5678

Рис.8.В. Электрофоретический анализ связывания фосфобелков экстракта клеток HeLa с ДНК гена с-гаус (футпринт). Комплекс фрагмента Smal/Xhoi гена с-тус с фосфобелками из экстракта клеток HeLa, инкубированного с 0,1 мМ ортованаяата. Фрагмент метили по участку узнавания эндонуклеазой XhoI (1,2,3,4) и 5ша1(5,'6,7,8).

1.2 - с 3 мг белка из экстракта; 3,4 - без экстракта;

1.3 - 1 минута инкубации с ДНКазой I; 2,4 — 3 минуты

инкубации с ДНКазой I.

5.6 - с 3 мг белка из экстракта; 7,8 - без экстракта;

5.7 - .1 минута инкубации с ДНКазой I; 6,8 - 3 минуты

инкубации с ДНКазой I.....

Участки зашиты от ДНКазы 1 показаны скобками с соответствующей нуклеотидной последовательностью.

Таким образом, участок IRS может функционировать как негативный регуляторный элемент. Помимо этого, фосфорилирование белка 70 кДа способствует его .связыванию с этой же последовательностью и активации транскрипции с промотора Pj, Pj и Р2.

Фосфобелок 70 кДа может быть членом семейства интерферон-зависимых факторов. Пост-трансляционная модификация белков с помощью фосфорилирования может быть вовлечена в регуляцию их активности. С другой стороны, данный богатый пуринами участок похож на^ последовательность, . необходимую для связывания факторов, относящихся к Ets семейству. Эти факторы связываются с участками, содержащими ядро, состоящее из GGAA или CCA (Gutnan et. al., 1991, Karim et. al., 1990) - участков,' которые содержатся в последовательности гена с-тус. Ets-родственные белки фосфорилируются различными протеинкиназами (Koizumi et. al., 1990, Murakami"et. al., 1993), их фосфорилирование регулируется митогенами (fujiwara et. al., 1988, Pognonec et. al.,- 1988) и зависит от фазы клеточного цикла (Fleischman et. al., 1993). Можно предположить, что транскрипционные факторы, относящиеся к семейству Ets, вовлекаются в регуляцию транскрипции гена с-тус.

1-й эвзон 1-й интрон

1813

1 - GGGGAAAAGAAAAAAG (-78/-63) 2— GAGCTGTGCT (+7/+16) 3 - GCCCC ( + 38/+42)

Рис.9. Схема расположения участков, защищенных от ДНКазы I (1,2,3), на гене с-тус; внизу приведены куклеотидные последовательности, соответствующие данным участкам.

Помимо сказанного выше, нельзя исключить возможность того, что фосфорилированные белки, идентифицированные в данной работе,

/

могут быть новыми регуляторными факторами. На Рис. 9 приведена схема расположения участков связывания фосфобелков экстракта-клеток HeLa с промоторной областью гена с-тус.

ВЫВОДЫ.

X. Обработка клеток в культуре ортованадатом приводит к увеличению Уровня фосфорилирования клеточных белков, причем содержание в белках фосфосериновых, фосфотреониновых и фосфотирозиновых остатков возрастает в одинаковой степени. Этот процесс сопровождается активацией пролиферацией клеток и увеличением уровня экспрессии гена с-тус.

2. Инкубация лизатов клеток HeLa с ортованадатом вызывает накопление фосфобелков; использование таких лизатов в качестве v транскрипционной системы приводит к актизации транскрипции гена с-тус /л vitro.

3. В экстракте ' клеток HeLa обнаружено три фосфобелка, специфически связывающихся с ДНК гена с-тус. Их связывание коррелирует с усилением транскрипции гена с-тус in vitro.

4. В промоторной области гена ~ с-тус обнаружены три участка, узнаваемые фосфобелками экстракта клеток HeLa.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. A.V. Itkes, L.R. Imamova, N.M. Alexandrova, 0.0. Favorova, and L.L. Kisselev. Expression of c-myc Gene in Human Ovary Cacinoma Cells Treated with Vanadate. Exp. Cell Res., 188, 169-171, 1990.

2. L.R. Imamova and A.V. Itkes. Enhancement of in vitro transcription of human c-myc correlates with the binding of phosphorylated protein factors from HeLa cell extract. Biochem. Mol. Biol. Intern., January, 1995. In press.

N

Подписано к Отпечатано ва ротапринте в Производственном комбинате Литературного фонда

печати оЦ . X (( 199 ]/т. Формат бумаги 30x42/4. -' Объем О п. я. Зак. Тир. 100