Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль белка гена ретинобластомы и протеинкиназы С при подавлении роста и дифференцировке клеток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль белка гена ретинобластомы и протеинкиназы С при подавлении роста и дифференцировке клеток"

VI О

Международная неправительствен! ая организация ■ФОРУМ"

Агентство биоинформатики и экологии человека

На праь м рукописи

ТОДОРОВ Герман Игоревич

РОЛЬ БЕЛКА ГЕНА РЕТИНОБЛАСТОМЫ И ПРОТПИНКИНАЗЫ С ПРИ ПОДАВЛЕНИИ РОСТА И ДИФФЕГ .¡'НЦИРОВКЕ КЛЕТОК

Специальность

03.00.02 - биофизика 03.00.16 - жология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в научном центре Маунт-Синай госпиталя (Нью-Йорк) и Агентстве биоинформатики и зкологии человека MHO "ФОРУМ".

Научные руководители: Рогальский В.Я., д.м.н.

Хашаев З.Х., д.б.н., Академик МАИ

Официальные оппоненты: Пулатова М.К., д.ф.м.н., профессор Кафиани К.А., д.б.н., профессор

Ведущая организация: Институт молекул^ оной генетики РАН

Защита диссертации состоится ^ддд в часов

на заседании диссертационного Совета Д. 170.01.01. при Агентстве биоинформатики и экологии человека МНО "ФОРУМ" по адресу: 117977, Москва, ГСП-1, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Агентства биоинформатики и экологии человека

Автореферат разослан " ..................../............1995

Ученый секретарь диссертационного Совета к.ф.м.н.

З.М.Шекшеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Регуляция клеточного роста является одной из центральных проблем современной молекулярной биологии. Нормальная регуляция клеточного роста необходима для развития и жизнедеятельности организма, а её нарушение может быть причиной различных заболеваний. В частности, нарушение контроля роста клеток связано с раковыми заболеваниями. Лучшее понимание механизмов таких нарушений будет способствовать разработке новых подходов к лечению рака. Это особенно важно ввиду продолжающегося роста числа раковых заболеваний, что во многом связано с ухудшающейся экологической обстановкой и повышением уровня мутагенных веществ в окружающей среде.

Имеющиеся данные о механизмах регуляции клеточного роста указывают на сложность и многокомпонентность данной системы, в которую входят такие белки как мембранные рецепторы, G-белки, протеинкиназы, фосфатазы, факторы транскрипции и др. Многие из белков, участвующих в регуляции клеточного роста, кодируются онкогенами и антионкогенами. Мутации е указанных генах могут приводить к инициации или промотированию канцерогенеза. Следует отметить, что одной из важных причин таких мутаций являются канцерогенные вещества в окружающей среде.

В то время как онкогены были открыты сравнительно давно и многие подробно изучены, антионкогены стали интенсивно изучаться только в 80-е годы. Особенностью антионкогенов является то, что их нормальное функционирование необходимо для предотвращения неконтролируемого клеточного роста. Мутационная инактивация или делеция антионкогена может приводить к злокачественной трансформации. До настоящего времени молекулярный механизм действия антионкогенов и их белковых продуктов при ингибировании роста нормальных и опухолевь.х клеток остается не ясен. В настоящей работе молекулярный механизм действия а'тионкогенов изучался на примере гена ретинобластомы и его белкового продукта (Rb).

Другой системой, играющей важную роль в регуляции клеточного роста, является группа протеинкиназ типа С (protein kinase С, РКС). РКС участвует в передаче митотических и гормональных сигналов от клеточной мембраны к ядру. Различные воздействия на систему РКС могут влиять на течение клеточного цикла (Weinstein 1990). В данной работе исспеповалась возможная роль PKG в подавлении клеточного роста.

Цель и задачи.

Цель работы состояла в изучении молекулярных механизмов ингибирования нормальных и опухолевых клеток с участием белка, кодируемого геном ретинобластомы, а также протеинкиназы С. Наряду с этим планировалось изучить морфологические изменения, происходящие при подавлении роста и/или индуцировании Д'/срференцировки исследуемых клеток. Были поставлены следующие экспериме?-тальные задачи:

1. Определить внутриклеточную локализацию, изменение биохимических характеристик (степень фосфсрилирования, деградация, и т. д.) и молекулярные мишени белка, продукта гена ретинобластомы, при ингибировании роста и индуцировании дифференцировки лейкозных клеток. Использовать полученные данные для изучения роли Rb в клеточном цикле.

2. Определить активность мембраносвязанной и цитозольной РКС при воздействиях, влияющих на скорость роста клеток, на примере фибробластов человека. Определить роль изоформ РКС.

3. Изучить особенности морфологических изменений, наблюдаемых при подавлении роста и индуцировании дифференцировки опухолевых клеток, на примере лейкозных клеток. •

Научная новизна работы.

1. Впервые показано, что при подавлении клеточного роста и индуцировании дифференцировки клеток белок, продукт гена ре ,'инобластомы (Rb), накапливается в ядрышках клеток. Также показано, что в дифференцирующихся клетках белок Rb подвергается частичному протеолизу с образованием функционально активного С-концевого фрагмента. Было установлено, что Rb подавляет синтез рибосомной РНК, связываясь с фактором транскрипции UBF. Найден внутримолекулярный сайт белка Rb, ответственный за такое связывание.

2. Впервые показано, что подавление клеточного роста в нормальных клетках может быть связано с физиологическим повышением активности протеинкиназы С. При этом показано, что при подавлении роста человеческих фибробластов повышается уровень альфа изоформы протеинкиназы С. Ингибиторы протеинкиназы С ослабляют, а активаторы усиливают такое ингибирование клеточного роста.

3. Впервые обнаружены явления осциллирующего и преждевременного цитокинеза в культурах лейкозных клеток в условиях контакта с фибробластами, а также среди клеток эмбрионального костного мозга.

Практическая ценность.

Полученные данные о механизмах ингибирования клеточного роста могут быть использованы для разработки новых подходов к лечению рака и, в частности, терапевтических методов, направленных на стимуляцию или восстановление функции гена ретинобластомы и его продукта, а также методов, основанных на селективном воздействии на те или иные изоформы РКС. Дальнейшее исследование обнаруженных явлений осциллирующего и преждевременного цитокинеза может способствовать лучшему пониманию происхождения лейкоза, а также разработке методов его мониторинга и лечения.

Апрс-Зация работы.

Материалы работы были представлены на 83-ем (1992) и 85-ом (1994) съездах Американской Ассоциации по Исследованию Рака и на 3-ей Международной конференции по регуляторам гематопоэза (1993, Париж).

Объем и структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного

текста и содержит рисунков. Список литературы включает

наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение механизма участия белка гена ретинобластомы (Rb) в подавлении клеточного роста

1.1. Накопление в ядрышках и частичный протеолиз Rb при подавлении роста и индуцировании дифференцировки клеток.

В первоначальном эксперименте внутриклеточную локализацию Rb определяли при подавлении роста клеток остеосаркомы U-2 ингибитором клеточного роста NCPI (natural ceil proliferation inhibitor; Rogalsky et ai 1991). Локализацию Rb определяли иммуногистохимическими методами с использованием моноклональных мышиных антител, специфичных к Rb, и вторичных антител, специфичных к мышиным иммуноглобулинам и

конъгогированных с пероксидазой. Было обнаружено накопление Rb в ядрышках клеток, рост которых был подавлен, тогда как в контроле такое явление не наблюдалось.

Основная роль ядрышек состоит в синтезе рибосом, от которого зависит общий синтез белка и, следовательно, преодоление клеткой точки рестрикции клеточного цикла. С другой стороны, известно, что потеря функциональной активности Rb приводит к неконтрогируемому росту некоторых типов клеток. На основании этих соображений и в сеете полу-'^нных данных по накоплению Rb в ядрышках нами была выдвинута гипотеза о возможной роли Rb в синтезе .рибосом. Дальнейшие исследования проводились на системе более удобной в экспериментальном отношении. Использовались клетки миелоидного лейкоза U937, на которые воздействовали 12-0-тетрадеканоилфорбол ацетатом (ТРА, 12-O-tetradecanoyiphorbol acetate). Обработка ТРА вызывает резкое подавление роста и индуцирует дифференцирог-ку клеток U937. Данная система позволяет наработать большое количество клеточного материала в короткие сроки. Локализацию Rb изучали как иммунопероксидазным методом, -ак и методом иммунофлуоресценции. Было показано, что при подавлении роста и индуцировании дифференцировки U937 происходит накопление Rb в ядрышках. Эти данные были воспроизведены в экспериментах с двумя типами мышиных моноклонапьных антител, специфичных к различным эпитопам Rb. В качестве вторичных антител использовались овечьи антитела, специфичные к мышиным иммуноглобулинам и конъюгированные с пероксидазой или флуоресцеином. Соответствие зон накопления Rb ядрышкам клеток было подтверждено иммунофлуоресцентным окрашиванием ядрышек с использованием человеческих антител, специфичных к фибрилларину - белку, характерному для ядрышковых структур. В качестве вторичных антител использовались козлиные антитела, специфичные к человеческим иммуноглобулинам и меченые родамином. При наблюдении флуоресценции под микроскопом зоны окрашивания на Rb (флуоресцеиноЕая метка) в клетках, дифференцированных ТРА, полностью совпадали с окрашиванием на ядрышковый маркер

фибрилларин (родаминовая метка). В_недифференцированных клетках при

окрашивании на Rb ядра прокрашивались равномерно.

Ядрышки, выделенные из клеток U937 после инкубирования с 10"7 ТРА в течение 36 часов, анализировали методом иммуноблоттинга. Для получения достаточного количества материала клетки перед обработкой ТРА выращивались до плотности 1 млн/мл. Ядерные и ядрышковые фракции были выделены из клеток, обработанных ТРА, а также из контрольных клеток. Из

фракций были взяты аликвоты. содержащее равные количества fer/з. проанализированы методом иммуноблоттинга с испсльгсеа-иеи поликлональных аффинно-очищенных антител, специфичных к С-ксн_г5с.'у участку Rb. Специфичность связывания эрвичных нтител с р?.Ь npce.-jca-v. блокируя антитела специфическим С-концевым пептидом Rb s "Z'-rcrse контроля. Результаты иммунсблоттинга представлены на Рис.1, /нтакт-сму Pc соответствует полоса 110 Да. Полоса 60 кДа соответствует C-KCi-uesev/ фрагменту Rb (ГЬ 60). В я,грах недифй оенциосванных клетск псису-с-зовгл интаггный Rb (полоса 4), тогда как в лдрькихах F.b не наблюдался (гог.ссз 2) 5 ядрах клеток, обработанных ТРА, преобладал Rb-60 (полоса 3): при з*ом zî-ньй фрагмент присутствовал в пдрышчах (полоса 1). <\южно заклгсч^ь. -—: пси дифференцировке U937 под действием ТРА, с одной стороны. пссисод>т частичный протеолиз Rb с образованием С-крнцевого фрагмента mscccw :<огз 60 кДа и, с другой стороны, происходит накопление этого cbparw~'--a 5 ядрышках.. В этой связи интересны работы, показь,=а1сщ>'б. <-~: функциональная активность Rb связана с его С-кснцевым фрагментом иасссй около 60 кДа (Edward? \t al 1992, Qin et al 1: 92).

i<iio кДа

Шш

и,

.'<бо кДа

А

Рис. 1 Транслокация и частичный протеолиз белка ретинобластсмы 1рс; = клетках 11937, обработанных 10"7 М ТРА в течение 26 ча:се (иммуноблоттинг). 1- Ядрышковый экстракт из клеток, обсасо*ан:-=..1 ТРА; 2- Ядрышковый экстракт из клеток контроля; 3- Ядернь* экстракт из клеток, обработанных ТРА; 4- Ядрышковый экстракт /<с-клеток контроля.

Для оценки степени фосфорилирования Rb был проведен иммуноблоттинг ядерных экстрактов клеток 'J937, полученных из культуры с плотностью 1 млн/мл (экспоненциальный рост) и из культуры с плотностью 2 млн/мл (снижение скорости роста). Было показано, что в первом случае преобладает гиперфосфорилированная форма Rb (115 кДа), а в последнем гипофосфорилированная (110 кДа). Как было ранее показано в ряде работ, гипофосфорилированная форма Rb является функционально активной, в то время как гиперфосфорилированная - неактивна (Chen et al 1989, Goodrich et al 1991).

1.2. Корреляция подавления синтеза pPHK с накоплением Rb в ядрышках клеток. Подавлен<ие транскрипции рДНК белком Rb in vitro.

На основании данных по накоплению Rb в ядрышках при подавлении роста и дифференцировке клеток была выдвинута гипотеза о возможном влиянии Rb на уровень синтеза рибосом и, в частности, на синтез рибосомной РНК (рРНК).

Урсйень синтеза рРНК в клетках U937 в процессе дифференцировки под действием ТРА узучали методом импульсного мечения ядер через 24 и 35 часов после добавления ТРА. Ядра из обработанных клеток и контроля выделяли и метили по РНК как описано в (Asubel et ai, 1987). Уровень транскрипции рРНК определяли путем гибридизации РНК, синтезированной in vitro, с 5'-концевым участком гена рДНК человека, иммобилизованным на нитроцеллюлозе. Было установлено, что в дифференцирующихся клетках U937 синтез рРНК подавлен (Рис. 2). При этом тотальная РНК не изменялась.

В некоторых наших экспериментах по транскрипции рДНК in vitro был использован химерный белок GST-Rb, содержащий фрагмент Rb (аминокислотные остатки 394-928) и глютатион-З-пероксидазу, а также мутантная форма GST-Rb209 с заменой фенилаланина на цистеин в позиции 706 белка Rb. Как было показано ранее в рядеузабот (Kaye-et-aUggo^-Huanq et al— 1991), GST-Rb обладает активностью интактного Rb, в тогда как GST-Rb209 -неактивен.

Рис

24 ч

ТРА

еткво» 1

36 ч

2. Снижение уровня синтеза рРЙК в дифференцирующихся клетках и937 через 24 и 36 часов после обработки ТРА. Уровень синтеза определяли методом импульсного мечения ядер по РНК и гибридизацией с 5'-концевым фрагментом

рДНК, иммобилизо-ванным на нитроцеллюлозе. 1,3- контроль; 2. 4 - клетки, обработанные ТРА.

о _

а. £

>, ^

'5 с

-а я

~ п.

-а ы

Ч о

<и —

П л

К п.

ё н

100 80 60 40 20 0

г.".--. ¡..=

«¡ii 1

ш is i ".. J К*

l-s Ш №

fi

s?3 ¡эт t§!

1 2

I 1

т i' J&

GST-Rb (цд) - 0.2 GST-Rb 209 (цд) - -

3

0.4

4

0.5

0.2 0.5 0.7

Рис. 3 Влияние GST-Rb и GST-Rb 209 на транскрипцию рДНК in vitro. GST-Rb и GST-Rb 209 являются химерными белками глютатион-S-трансферазы и С-концевого фрагмента Rb (дикого типа Rb и мутанта с заменой фенилаланина на цистеин в позиции 706. соответственно).

Нами бы го показано, что GST-Rb подавлял транскипцию рДНК, в то время как GST-r!b209 б тех же концентрациях влиял на транскрипцию незначительно (Рис. 3). Следует отметить, что фрагмент Rb, входящий в состав химерного белка (ЗЭ4-928). практически совпадает с С-концевым фрагме том Rb, обнаруженным в ядрышках U937 клеток, дифференцированных под действием ТРА.

1.3. Связывание Rb с фактором ЦБР.

На основании вышеприведенных данных было высказано предположение, что Rb воздействует на один из активаторов РНК-полимеразы 1. Среди целого ряда белков, с которыми Rb связывается in vitro, присутствовал фактор UBF, являющийся активатором транскрипции РНК-полимеразы 1 (Shan et al 1992).

Нами были проведены эксперименты по транскрипции in vitro, в которых изучалось возможное влияние Rb на стимуляцию транскрипции рДНК фактором U8F. При этом из системы транскрипции на основе экстракта из клеток гепатомы Новикова предварительно удаляли UBF (хроматографией на DEAE-Sephadex). Кроме того, чтобы исключить возможное влияние следов UBF, б части экспериментов использовалась высокая концентрация рДНК-матрицы. Было показано, что как интактный Rb, так и его С-концевой фрагмент, содержащий остатки 394-928. блокируют стимуляцию транскрипции рДНК фактором U8F. При этом они не влияют на базапьную транскрипцию в отсутствии UBF (Рис 4). GST-Rb также блокировал стимуляцию транскрипции фактором UBF (Рис.51 Было также показано, что ингибирующее действие Rb может быть предотвращено избытком UBF(no сравнению с эквимолярным соотношением).

В эксперименте с GST-Rb 209, содержащем замену фенилаланина на цистеин в позиции 706 фрагмента Rb, блокирование стимуляции транскрипции рДНК фактором UBF не наблюдалось (Рис.5). Кроме того, была проведена аффинная хроматографии экстрактов гепатомы Новикова на глютатион-Сефарозе с иммобилизованным GST-Rb, при которой наблюдалось связывание UBF. В эксперименте по аффинной хроматографии на чистой глютатион-Сефарозе (без иммобилизованных лигандов) или с иммобилизованным GST-Rb209 связывание UBF не наблюдалось. Эти данные позволяют предположить, что Rb взаимодействует с UBF непосредственно, причем сайт взаимодействия включает фенилаланин 706.

1 2 3 4 '5 6 UBF ---+++

Рис. 4 Влияние интактного Rb и его С-концевого фрагмента ЯЬ(фр) на уровень транскрипции рДНК in vitro. За 100% (1) взята транскрипция под действием фракции ядерного экстракта, не содержащей UBF. Для исключения влияния следов UBF, использовалась высокая концентрация рДНК матрицы. 2 - добавление интактного Rb; 3- Rb№p); 4-UBF; 5 - UBF и Rb; 6 - UBF и ЯЬ(фр).

Известно, что белки ряда вирусов, взаимодействующие с Rb. и в том числе белок Е7 вируса человеческой папилломы содержат консенсус leu-x-cys-x-glu (Wand et al 1993, Dyson et al 1989V В наших исследованиях было показано, что пептид белка Е7 вируса человеческой папилломы, содержащий консенсус leu-x-cys-x-glu, блокирует связывание Rb с UBF. GST-Rb или GST-Rb209 иммобилизовали на гранулах глютатион-Сефарозы (гранулы инкубиссвали с лизатами E.Coli, содержащими Rb: лизаты были получены как описано б работе: Shan et al 1992). При инкубировании гранул с экстрактами гепатомы Новикова добавление пептида Е7 блокировало связыване UBF с GST-Rb. При добавлении неактивной формы пептида Е7* в качестве контроля блокирование взаимодействия Rb и UBF не наблюдалось (подробная структура пептидов Е7 и Е7* списана в работе: Wand et al 1993). Связывания GST-Rb209 с UBF также не наблюдалось.

§

er §

'5 с я

- о,

- «

о о Е л

S о, о Ь

100 -i 80 -6040 20 0

DE-175 UBF GST-Rb GST-Rb 209

+ 3+

Рис. 5 GST-Rb подавляет стимуляцию фактором UBF транскрипции рДНК in viiro. GST-Rb 209, содержащий неактивный фрагмент Rb. не влияет на транскрипцию рДНК; DE-175 - фракция экстракта гепатомы Новикова, не содержащая UBF.

Полученные результаты указывают на то, что UBF и белки трансформирующих вирусов связываются с одним и тем же участком Rb. Это позволяет предположить, что роль вирусных белков в злокачественной трансформации клеток включает болкирование связывания Rb с UBF.

Дополнительное подтверждение биологической роли связывания Rb с UBF было получено в экспериментах по иммунопреципитации. Ядерные экстракты инкубировали с UBF-специфическими антителами, иммобилизованными на protein A-agarose. Связанные белки анализировали методом иммуноблоттинга. Было показано, что иммунопреципитаты содержали UBF и Rb, тогда как при добавлении к экстрактам пептида Е7 в преципитатах обнаруживался только UBF(a Rb отсутствовал).

Было также показано, что в U937 клетках, обработанных ТРА. наряду с накоплением Rb в ядрышках увеличивается содержание комплекса Rb-UBF (Рис.6-а). При этом, результаты иммуноблоттинга указывают на то, что

увеличение содержания омплекса ИЬ-иВР происходит не за счет увеличения общего содержания ИЬ и 11ВР в клетках, обработанных ТРА (Рис.6-6). Полученные данные указывают на реальное существование комплекса Рэ-иВР в клетках. Увеличение содержания такого комплекса коррелирует с замещением роста и дифференцировкой клеток , а также с накоплением ЯЬ в ядрышках, что указывает на активную роль образования такого комплекса в подавлении синтеза белка при переходе от пролиферации к состоянию покоя и/или дифференцировке.

^ 24 М 36 Ч

ТРА + +

. „ - . --рь

1 2 3 4 5

б

ТРА

24 Ч

36 Ч

ивя РЬ

1

3

4

Рис. 6 Дифференцирование лейкозных клеток 1Ш7 за счет обработки 10' ТРА приводит к увеличению количества РЬ, связанного с иВР. (а| -ИЬ, полученный ко-иммунопреципитаиией с использованием антител, специфичных к 11ВР. При этом общее содержание № или иВР в клетках не возрастает (б).

1.4 Динамическая модель роли ЯЬ в клеточном цикле. На основании полученных данных предложена динамическая модель роли ИЬ в клеточном цикле (Рис.7). Синтез рРНК является ключевой стадией синтеза рибосом и, таким образом, в значительной мере определяет скорость общего синтез белка в клетке. Блокируя стимуляцию синтеза рРНК фактором 11Е=, рЯЬ участвует в поддержании белкового синтеза в стационарном состоянии, когда сохраняется общий белковый балланс клетки (фаза во). Данная модель

+

+

коррелирует с полученными данными о том, что Rb подавляет стимуляцию синтеза рРНК фактором UBF, но не влияет на базапьный синтез рРНК. Кроме того, известно, что Rb активен именно в фазах GO и ранней G1. Микроинъекция функционально активного Rb в клетки в ранней G1 фазе блокирует дальнейшее развитие клеточного цикла, в то время как микроинъекции на более поздних этапах не имеют эффекта (Goodrich et at 1991).

Целый ряд событий может приводить к инактивации Rb: фосфорилирование (обратимая инактивация), мутации гена Rb (необратимая инактивация), а также связы вание с белками трансформирующих вирусов. Согласно полученным нами данным (см. выше), вирусные белки, взаимодействующие с Ro, имеют сродство к тому же сайту, с которым связывается UBF.

' При инактивации Rb (за счет фосфорилирования, мутаций, вирусных белков, и. т. д.) UBF стимулирует синтез рРНК. В результате, синтез рибосом и, следовательно, общий синтез белка возрастает, сдвигая соотношение ДНК/белек в сторону белка. В результате роста белковой массы клетка вступает в фазу G1 и проходит точку рестрикции клеточного цикла, что приводит к необратимой активации механизмов репликации и митоза. Если инактивация Rb сис -эмы была обратимой, то, по завершении цикла, клетка может вернуться в фазу GO. Однако, если (а) инактивация Rb была необратимой или (б) инактивация Rb была обрат/мой. но продолжает действовать митотический сигнал (он может быть как внешним, в случае нормальных клеток, так и внутренним, в случае некоторых опухолезых клеток), то клетка вступит в новый цикл.

Следует отметить, что обсуждаемый механизм действия, связанный с подавлением синтеза рРНК, не исключает возможной роли Rb в регуляции других клеточных систем.

2. Исследование активности протеинкиназы С при подавлении роста клеток.

Активность протеинкиназы С (РКС), являющейся одним из центральных элементов системы передачи сигнала в клетках животных и человека, определяли при воздействии на фибробласты костного мозга человека ингибитором клеточной пролиферации (NCPI) и фактором некроза опухолей альфа (TNFa). Известно, что активация РКС во многих случаях сопровождается связыванием ф>ермента с клеточными мембранами. В связи с этим активность

ФазаОО

ЯЬ активен и связан с иВР

Базальный уровень транскрипции рДНК

Равновесие белковой массы клетки (общий синтез белка оавен деградации)

Fib

активен

ИНАКТИВАЦИЯ Rb

(фосфорилирование, связывание с Бирусными белками, мутации)

1

Фаза G1

Rb неактивен, саязывание с UBF Rb

нарушено неактивен

USF стимулирует транскрипцию р^НК

Рост белковой массы клетки

I

ТОЧКА РЕСТРИКЦИИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

Продвижение клетки по фазам цикла становится необратимым.

Митотические сигналы различным клеточным системам, синтез компонентов ядра, белков репликации, гистоноэ и т. д.

г

Фазы S. G2 и М

Рис.7 Роль взаимодействия ЯЬ и иВР в клеточном цикле (пунктирной стрелкой обозначена возможность дополнительных механизмов влияния ЯЬ на клеточный цикл)

мембраносвязанной и цитозольной РКС определяли раздельно. Стандартизованные экстракты из мембранной или цитозольной фракций клеток добавляли в реакционную смесь, содержащую активаторы РКС (ТРА, фосфатидилсерин и Са2"1") и синтетический пептид с высокой специфичнс -пью к фосфорилированию РКС (подробнее см. Яода^ку е1 а1 1992). Контрольные образцы не содержали активаторов РКС.

Скорость роста фибробластов определяли, измеряя синтез ДНК методом включения [3Н]-тимидина.

ЫСР1 является беяк зым фактором (около 7 кДа), секретируемым фибробластами при образовании монослоя. ЫСР1 способен подавлять рост фибробластов и клеток остеосаркомы, а также вызывать дифференцировку лейк зных клеток 1)937, НЬбО и лейкоцитов периферической крови лейкозных больных (ЯодаЬку е! а11991).

При воздействии на фибробласты культуральной среды, содержащей №СР1, скорость их роста значительно снижалась (через 72 часа синтез ДНК составлял 22% от контроля). При этом, через 72 часа после обработки ЫСР1 активность мембраносвязанной РКС возрастала более чем в 11 раз. а цитозольной более чем в 2 раза ^ ¡с. 8). Следует отметить, что спустя две недели после обработки ЫСР1 такой повышенный уровень РКС все еше присутствовал (на графике не показано). Ингибитор РКС неомицин нейтрализовал ингибирующее действие ЫСР1 на рост клеток, в то время как ТРА, активатор РКС, усиливал подавление роста.

Воздействие ТМРа сопровождалось стимуляцией роста фибробластов и снижением скорости синтеза ДНК. При этом наблюдалось снижение как мембраносвязанной, так и свободней РКС.

Полученные данные указывают на возможную связь между активацией РКС и подавлением клеточного роста в некоторых типах клеток.

Была также изучена роль отдельных подеидов протеинкиназы С в ингибировании роста фибробластов под действием ЫСР1. Методом иммуноблоттинга анализировалась активность следующих подвидов РКС: а,(3.у,5,е,г|. Было показано, что при ингибировании роста фибробластов происходит увеличение активности РКСи.

Предполагается, что роли различных видов РКС в регуляции клеточного цикла могут существенно различаться. В этой связи направленные воздействия на систему РКС (например, в терапевтических целях) должны учитывать специфику изоформ данной киназы.

о £ а.

<

О

чЦитозольная | | | I |_I_I I

О 2 24

ВРЕМЯ (часы)

О

Рис. 8 Активность РКС (мембраносвязанной и цитозольной) и синтез ДНК при подавлении роста эмбриональных фибробластов костного мозга действием К1СР1 (добавлялась культуральная среда, содержащая ЫСР1; разведение 1:2). Каждая точка соответствует среднему трех независимых опытов.

3. Явления полицитокинеза, осциллирующего цитокинеза и преждевременного цитокинеза.

В процессе исследования молекулярных механизмов подавления клеточного роста мы также изучали морфологические изменения, наблюдаемые при ингибировании роста и дифференцировке клеток. При этом было показано, что совместное культивирование фибробластов и лейкозных клеток приводит к задержке роста и дифференцировке последних. Это действие передается через среду культивирования посредством фактора ЫСР1 и, возможно, других

регуляторсз роста. При совместном культивировании фибробластов и клеток миелоидкого лейкоза HL-60 клетки прекращали рост и находились длительное время в фазе GO. При замене среды и отделении от фибробластса лэйко?,;ые клетки восстановили способность к размножению, но проявляли ряд необычных свойств. Значительная часть подученных клеток (мы назвали их HL-60-F) была многоядерной, чего практичес и не наблюдалось в ис-одной линии HL-60. Дальнейшее наблюдение показало. -<то клетки HL-60-F способны делиться а три или более дочерних клетки (полициток/нез). При этом было обнаружено, что ядра таких клеток могут делиться в анаоазе (преждевременный цитокинез). Интересно, что в процессе преждевременного цитокинеза хромосомы могут быть захвачены в цитоплазматическом мостике между клетками, что, по-видимому, приводит к разрыву хромосомы при расхождении клеток. Также было установлено, что после деления клетки могут сливаться, вновь образуя одну клетку, причем возможны последовательные циклы деления и слияния (осциллирующий цитокинез).

Данные процессы были документированы многочисленными последовательными снимками живых культур с помощью инверт1оованного микроскопа при 37°С и цитологическим анализом окрашенных слайдов. Было также показано, что HL-60-F способны вызывать образование опухолей у мышей с ослабленной иммунной системой (nude-mice).

Описанные явления наблюдались та-эке в культурах клеток человеческого эмбрионального костного мозга. Выдвинута гипотеза, что описанные процессы могут являться одной из причин хромосомных аберраций.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что при подазлении роста (остеосаркома U-2) и индуцировании ди£х|эеренцироеки клетск (лейкозные клетки U937) белок ретинобластомы (Rb) накапливается в ядрышках.

-2.—Показано._что_Rb,_связываясь с Фактором UBF. подавляет

транскрипцию рибосомной ДНК. Найден внутримолекулярный сайт белка Rb, ответственный за такое связывание.

3. Показано, что в дифференцирующихся клетках Rb белок подвергается частичному протеолизу с образованием функционально активного С-концевого фрагмента массой 60 кДа.

4. Предложена динамическая модель роли Rb в клеточном цикле.

5. Показано, что подавление клеточного роста может бьггь связано с физиологическим повышением активности протеинкиназы С (РКС). При этом ингибиторы РКС блокируют, а актива- 'юы усиливают такое ингибирование клеточного роста. Установлено, что г.ри подавлении роста человеческих фибробластов псоышается уровень РКСа.

6. Обнаружены явления осциллирующего и преждоременного цитокинеза, а также полицитокинеза в культурах лейкозных клеток, находившихся в длительном контакте с фибробластами, а также среди клеток эмбрионального костного мозга. Выдвинута гипотеза о возможной роли этих процессов в возникновении хромосомных аберраций.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных автором по.теме диссертации.

1. Rogalsky, V., Todorov, G., Den. T., Ohnuma, T. Increase in protein kinase С activity is associated with human fibroblast growth inhibition. FEBS Letters, 304, 2/3: 153-156 (1992).

2. Rogalsky, V., Todorov, G., Den. T., Ohnuma, T. Negative regulation of tumor and normal cell growth is associated with increase in protein kinase C. American Association for Cancer Research, Annual Proceedings, 33: 70 (1992).

3. Rogalsky, V., Todorov, G., Moran, D. Translocation of retinoblastoma protein associated with tumor cell growth inhibition. Biochemical & Biophysical Research Communications, 192:1139-1146 (1993)

4. Rogalsky, V., Todorov, G., Moran, D. Retinoblastoma protein translocation: possible mechanism of negative regulation of cell growth. The negative Regulation of hematopoesis from fundamental aspects to clinical application. Les Editions Inserm, 115-117(1993).

5. Rogalsky, V., Todorov, G., Den. T. Inhibition of human fibroblast growth involves activation of protein kinase С alpha. American Association for Cancer Research, Annual Proceedings, 35: 81(1994).

6. Cavanaugh, A., Hempel, W., Taylor, L., Rogalsky.V., Todorov, G., Rothblum, L. (1995) The retinoblastoma gene product blocks the activation by the RNA polymerase I transcription factor UBF. Nature, 374: 177-180 (1995).

Rb - белок гена ретинобластомы.

ЯЬ(фр.) - С-концевой фрагмент белка гена ретинобластомы массой около 60 кДа.

GST-Rb - химерный белок, состсящий из глютатион-Э-пероксидазы и

С-концевого фрагмента Rb (остатки 394-928). GST-Rb - идентичен GST-Rb, за исключением замены фенилаланина на цистеин в позиции 706 Rb.

ТРА - 12-Отетрадеканоилфорбол ацетат (12-0-tetradecanoylphorbol acetate).

РКС - протеинкиназа С (protein kinase С)

NCPI - ингибитор роста клеток (natural cell proliferation inhibitor).

TNFa - фактор некроза опухолей альфа (tumor necrosis factor alpha)

UBF - один из факторов транскрипции рДНК (upstream binding factor).

Список сокращений