Роль азотфиксирующих микроорганизмов в фиторемедиации промышленных углеводородных шламов

Григорьева, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль азотфиксирующих микроорганизмов в фиторемедиации промышленных углеводородных шламов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль азотфиксирующих микроорганизмов в фиторемедиации промышленных углеводородных шламов"

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

РОЛЬ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ в ФИТОРЕМЕДИАЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ УГЛЕВОДОРОДНЫХ ШЛАМОВ

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 3 СЕН 2339

Казань - 2009

003476069

Работа выполнена на кафедре микробиологии ГОУ В ПО «Казанский государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор

Наумова Римма Павловна

доктор биологических наук, профессор

Чиков Владимир Иванович

кандидат биологических наук, Шурхно Равиля Абдулловна

Институт проблем экологии и недропользования АН РТ

Защита диссертации состоится « 24 » сентября 2009 г. в часов СО минут на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при Казанском государственном университете.

Автореферат разослан « 19 » августа 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

3. И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Для промышленных отраслей, связанных с добычей, переработкой углеводородного сырья и химическим синтезом на его основе, характерно образование значительных объемов углеводородсодержащих отходов (шламов), которые по своим характеристикам (III класс опасности) представляют угрозу для окружающей среды и здоровья. населения. Количество таких отходов, образующихся в процессе очистку., промышленных сточных вод, зависит от мощностей предприятия и варьирует от 2 до 10 тыс. т в год. В соответствии с требованиями по, обращению с опасными отходами шламы размещают в специально оборудованных накопителях, что не решает проблему по существу, т.к. переполнение накопителей означает необходимость поиска путей обезвреживания и переработки данной категории отходов. Можно утверждать, что данная проблема не имеет общих решений в мировом масштабе, хотя попытки ее решения предпринимаются в рамках многих национальных и международных проектов.

На фоне дорогостоящих технологий типа сжигания шламов с улавливанием компонентов газовых выбросов надежды на решение Данной проблемы все больше связывают с ■ биотехнологиями, позволяющими обезвреживать углеводородные щламы и тем самым расширить сферу их дальнейшей утилизации. Среди известных биотехнологий фиторемедиация (с участием растений) обладает экономическими и экологическими преимуществами, возможность ее применения для обезвреживания углеводородного . .. шлама нефтехимического 'предприятия продемонстрирована в работе Галиева с соавт. (2005).

Несмотря на различия в происхождении углеводородных шламов, для них характерны высокие нагрузки по органическим загрязнениям, поэтому любой биотехнологический подход, как правило, основан на активизации микробного метаболизма путем корректировки соотношения биогенных элементов, в первую очередь углерода и азота C:N. Как правило, это достигается путем применения минеральных азотных удобрений, которые составляют одну из основных статей расходов при обезвреживании большинства загрязненных объектов.

При реализации технологии фиторемедиации; основанной на микробно-растительных взаимодействиях, необходимо учитывать интересы обоих компонентов ассоциации. Необходимое, для жизнедеятельности микроорганизмов соотношение биогенных элементов C:N:P в загрязненном объекте варьирует в пределах 100:10:1-1000:20:1 (Dibble, Bartha, 1979; Beaudin et al., 1999; Atagana et al., 2003). Нетрудно представить, что для углеводородных шламов, дефицитных по азоту (0-4 rN/кг) на фоне экстремальных нагрузок по органическим загрязнениям (160-300 гС/кг) (Lazar et al., 1999; Якушева с соавт., 2002; Яковлев с соавт., 2002) необходимо большое количество азотных удобрений (порядка 3,5-5 tN/кг шлама) (Vasudevan, Rajaram, 2001; Наумова с соавт., 2008), которое зачастую

является токсичным для микроорганизмов и тем более для растений (Chen et al., 1990; Chaineau et al., 2003).

В свою очередь, в природных экосистемах баланс биогенных элементов поддерживается благодаря обогащению пула доступного азота путем биологической азотфиксации. До 90% запасов азота в почве связано с активностью диазотрофных микроорганизмов (Емцев, Мишустин, 2006).

Прогресс, достигнутый за последние два десятилетия в изучении диазотрофии, радикально изменил представления о распространении данного свойства среди микроорганизмов. Оказалось, что к фиксации атмосферного азота способны многие представители домена Bacteria (Alpha-, Beta-, Gamma, Delta-, Epsilon-Proteobacteria, Cyanobacteria и Firmicutes) и некоторые представители домена Archaea (Zehr et al., 2003; Olsen et al., 2009).

С учетом широкого распространения диазотрофных микроорганизмов и их важной роли в поддержании и стимуляции роста растений особый интерес представляет возможность реализации таких взаимоотношений в условиях токсичных и в то же время дефицитных по азоту углеводородных шламов.

Цель работы - выявить диазотрофные микроорганизмы в составе микрофлоры промышленных углеводородных шламов и оценить их потенциальную роль в фиторемедиации этих отходов.

Основные задачи исследования:

1. Оценить возможность существования диазотрофных микроорганизмов в условиях экологически опасных углеводородных шламов;

2. Охарактеризовать распространение генетических детерминант азотфиксации (ni/H гена) среди аэробных гетеротрофных микроорганизмов, населяющих химический углеводородный шлам;

3. Осуществить лабораторное моделирование фиторемедиации углеводородного шлама предприятия органического синтеза с оценкой масштабов реализации азотфиксирующей активности аборигенной микрофлоры;

4. Оценить физиолого-биохимические особенности культивируемых диазотрофов шлама с точки зрения наличия у них комплекса свойств, обеспечивающих стимуляцию роста растений;

5. Охарактеризовать эффекты бактеризации семян растений-мелиорантов азотфиксирующими изолятами, выделенными из шламов в лабораторном эксперименте при выращивании растений непосредственно в химическом углеводородном шламе;

6. Сопоставить нуклеотидную последовательность гена 16S рРНК перспективных азотфиксирующих изолятов с международной базой данных и провести их филогенетический анализ.

условиях фиторемедиации этих отходов. С использованием молекулярно-генетических методов охарактеризовано распространение генетических детерминант азотфиксации (nifti ген) в составе ДНК бактерий, обитающих в экстремальных условиях углеводородного химического шлама. Осуществлён филогенетический анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, что позволило определить принадлежность аборигенных азотфиксаторов шлама к классу гамма-протеобактерий. Обоснована принадлежность бактерий, выделенных из шлама, к микроорганизмам, стимулирующим рост растений (plant growth promoting (PGP)), благодаря биотехнологически перспективному сочетанию следующих свойств: способность к утилизации компонентов шлама в качестве источников питания, способность к азотфиксации, к продукции индолилуксусной кислоты как биостимулятора из категории ауксинов, способность к растворению труднодоступных соединений фосфора, противопатогенная активность в отношении ряда возбудителей заболеваний растений, вызываемых грибами и растениями.

Впервые достигнуто существенное увеличение накопления биомассы растений-фитомелирантов в условиях их роста на углеводородном шламе при интродукции азотфиксаторов, выделенных непосредственно из данного отхода. Данные диссертационной работы послужили научной основой для создания новой биотехнологии обезвреживания и переработки промышленных углеводородных шламов, которая находится на стадии патентования.

Практическая значимость. Результаты работы способствуют решению насущных проблем обезвреживания экологически опасных отходов, образующихся на предприятиях переработки и использования углеводородного сырья. С эколого-экономических позиций важна продемонстрированная в работе возможность замены коммерческих азотных удобрений биологическим процессом фиксации атмосферного азота при реализации технологии биоремедиации шлама, частью которой является данная работа. Проведенный в работе скрининг шламовых азотфиксирущих бактерий как PGP микроорганизмов позволил выявить пять наиболее ценных изолятов, относящихся к родам Pseudomonas и Enterobacter. Данные лабораторных испытаний по бактеризации семян этими штаммами свидетельствуют о повышении устойчивости растений к шламу и о стимуляции их роста, что демонстрирует возможность усовершенствования технологии обезвреживания и переработки углеводородных шламов, основанной на Кшкробно-растительных ассоциациях, > ; ч ,-

Положения, выносимые на защиту: ; г

1. В промышленных углеводородных шламах впервые обнаружены генетические детерминанты процесса биологической фиксации азота и жизнеспособные диазотрофные бактерии;

2. Масштабы азотфиксирующей активности в процессе моделирования фиторемедиации углеводородного шлама без применения удобрений достаточны для обеспечения роста растений и биодеградации загрязнений в шламе;

3. Большинство диазотрофных бактерий, населяющих углеводородные шламы, сочетают способность к азотфиксации с деструкцией углеводородов и обладают рост-стимулирующим потенциалом в отношении растений-мелиорантов;

Связь работы с научными программами. Работа выполнена в рамках госконтракта АН РТ №09-9.4-38 (2006 г), госконтракта Аналитической Ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП 2.1.1.1005, согласно темплану 1.15.06 «Механизмы регуляции функциональной активности клетки».

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на школах-конференциях молодых ученых "Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии" (Пущино-Тула, 2006) и "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006, 2008), на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2005), на Специализированной конференции Международной водной ассоциации «IWA» «Обработка и утилизация осадков сточных вод: состояние, тенденции и перспективы» (Москва, 2006), на III научной конференции «Промышленная экология и безопасность» (Казань, 2008), на Международной научно-практической конференции «Микробная биотехнология - новые подходы и решения» (Казань, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции "Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития" (Киров, 2007), на Первой межуниверситетской конференции "Bionews" (Казань, 2008), на Итоговых конференциях КГУ (2007-2008гг.), XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха, «Microbial enzymes in biotechnology and medicine» (Казань, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 4 статьи в центральных и международных научных журналах (2 из которых в журналах ВАК РФ), 4 - в сборниках материалов конференций и 4 в тезисах докладов. Подана заявка на патент РФ (№2009114390 от 15.04.09) «Способ подготовки шламов».

Декларация личного участия автора. Автором проведен анализ литературы, лично получено и обработано большинство экспериментальных данных, проведено лабораторное моделирование фиторемедиации шлама. Автор принимал основное участие в написании статей и тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на ji^ страницах машинописного текста, включает /У таблиц и -// рисунков. Библиография насчитывает 480 наименований, из них отечественных и /¿^зарубежных работ.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю - проф. Р.П. Наумовой; официальным оппонентам: проф. В.И. Чикову, к.б.н. Р.А. Шурхно за внимательное отношение к работе; асп.

кафедры микробиологии КГУ A.A. Несмелову за участие в экспериментах и тюмощь в оформлении результатов; доцентам кафедры генетики КГУ: к.б.н. A.A. Ризванову и к.т.н. JI.JI. Фроловой, а также отделу "Биологические методы анализа" Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) за помощь в определении азотфиксирующих микроорганизмов методами молекулярной биологии и биоинформатики; ведущему инженеру кафедры микробиологии КГУ - A.B. Гарусову за помощь в проведении газохроматографического анализа нитрогеназной активности; лаборатории плазмид ИБФМ РАН в лице А.Б. Гафарова за помощь в выделении тотальной ДНК из шламов и почвы; сотрудникам группы молекулярной биологии КИББ КазНЦ РАН: к.б.н. Ю.В. Гоголеву и асп. В.Ю. Горшкову за сотрудничество в экспериментах по антагонистической активности азотфиксаторов с фитопатогенами; НИЧ КГУ в лице Ф.Н. Имамутдинова за помощь в создании и оформлении патента; О.И. Якушевой за плодотворное сотрудничество в области экологической биотехнологии; руководству биологических очистных сооружений ОАО «Казаньоргсинтез» за возможность проведения экспериментов и химических анализов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлись диазотрофные микроорганизмы, обитающие в промышленных углеводородных шламах. В работе использовали углеводородные шламы предприятий химической (ОАО «Казаньоргсинтез» (КОС)), нефтехимической (ОАО «Нижнекамскнефтехим» (НКНХ)) и нефтеперерабатывающей (Уфимский нефтеперерабатывающий завод (УНПЗ)) промышленности. Незагрязненная почва (выщелоченный среднегумусный чернозем) использовалась в качестве контроля и структурирующего агента для шлама при моделировании фиторемедиации. Усредненные пробы шламов и почвы отбирали из верхнего 20-см слоя.

Численность и разнообразие свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов, населяющих углеводородные шламы, оценивали по количеству колоний на селективной безазотистой среде Эшби (Теппер с соавт., 2004), а также путем учета разнообразия и количества микроорганизмов, содержащих в геноме nifii ген, в сообществе аэробных гетеротрофов (выделенных из шламов на мясо-пептонном агаре (МПА)).

Выделение тотальной ДНК шлама проводили с использованием стандартного набора FastDNA SPIN Kit for Soil (Bio 101, США).

Для амплификации т/Н гена использовали метод nested ПЦР, предложенный Widmer et al. (1999).

Филогенетический анализ отобранных диазотрофных 1 изолятов проводили на основании нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК, амплифицированных с использованием стандартных праймеров 16-18s U1F-U1R и просеквенированных на секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (USA). Поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью программного пакета BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST'). Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Филогенетические деревья построены программой Phylip методом максимальной экономии. Визуализация филогенетических деревьев проведена с помощью программы TreeView (http://taxonomv.zooloev.gla.ac.uk/rod/treeview.htmn. Полученные последовательности гена 16S рРНК выделенных из шлама изолятов внесены в базу данных GeneBank (http://ncbi.hlm.nih.gov/Bankit/nph-bankit.cgi).

Азотфиксирующую активность образцов шлама и выделенных изолятов определяли с помощью газовой хроматографии, ацетиленовым методом (Гарусов с соавт., 1999).

Скрининг перспективных для фиторемедиации диазотрофных микроорганизмов был основан на оценке их азотфиксирующей активности, способности утилизировать компоненты шлама, повышать растворимость труднодоступных соединений фосфора, продуцировать фитогормон (индолилуксусную кислоту) и проявлять антагонистическую активность по отношению к фитопатогенам. Скрининг проводили среди изолятов, выделенных на твёрдой среде Эшби при посеве образцов ризосферы устойчивых растений при росте последних в подготовленном шламе.

Способность изолятов утилизировать компоненты шлама оценивали качественно, по росту на модифицированных средах Эшби с использованием гексадекана, полиэтиленгликоля, нафталина и непосредственно шлама в качестве источников углерода и энергии.

Продукцию индолилуксусной кислоты (ИУК) изолятами оценивали фотоколориметрически, с использованием реагента Сальковского на среде, содержащей в качестве предшественника ИУК L-триптофан (Husen, 2003).

Способность изолятов к солюбилизации фосфатов оценивали по просветлению зон вокруг колоний при росте на твёрдой среде, содержащей нерастворимую соль фосфорной кислоты (Beneduzi et al., 2008).

Антагонистическую активность диазотрофных изолятов в отношении фитопатогенных микромицетов (Aspergillus niger, Aspergillus sp, Fusarium sp., Alternaria sp.) и бактерий (Pseudomonas syringae, Ervinia caratovora (SCRI), Xantomonas solunocerum (9049)) оценивали по подавлению роста патогенов при совместном культивировании на картофельно-глюкозном агаре (КГА). Бактериальные фитопатогены были взяты из коллекции Казанского института биофизики и биохимии РАН, грибные патогены выделены из посевного материала растений (овес Avena sativa L.), используемых для фиторемедиации шлама.

Эффекты интродукции отобранных в ходе скрининга диазотрофных изолятов оценивали в лабораторном эксперименте при выращивании гороха {Pisum sativum) и овса (Avena sativa L.) в подготовленном химическом шламе КОС. Семена растений обрабатывали разбавленной суточной культуральной жидкостью изолятов, выросших на мясо-пептонном бульоне, с титром 106 кл/мл. Эффекты бактеризации оценивали по снижению уровня зараженности семян грибными фитопатогенами (методом анализа, семян на питательных

средах по ГОСТ 12044-93) и увеличению накопления биомассы растений при их выращивании в подготовленном химическом шламе КОС.

Моделирование фиторёмедиации химического шлама проводили в 6-и месячном лабораторном эксперименте. Оценивали динамику азотфиксирующей активности, урожай растения-мелиоранта и уровень остаточного загрязнения в следующих вариантах опыта: шл; шл+поч; шл+уд; шл+поч+уд; шл+поч+раст; шл+поч+уд+раст, где шл - химический шлам КОС, специально подготовленный к фиторемедиации; поч - почва (20% от объема шлама); уд - NH4N03 (0,35 гЫ/кг сухого веса шлама); раст - растение-фитомелиорант (плевел Lolliumperenne L.) (90 г/м2).

Содержание хлороформ-экстрагируемых веществ определяли гравиметрически после экстракции образца хлороформом в аппарате Сокслета (Versan et al., 1998).

Общее содержание органического углерода и азота определяли по классическим методикам Тюрина и Къельдаля, соответственно (Аринушкина, 1970). Валовое содержание фосфора определяли фотоколориметрически по образованию фосфорно-молибденового комплекса в соответствии с ГОСТ 26207 (1992)

рН образцов определяли с помощью иономера в водном экстракте, приготовленном в соотношении образец:вода 1:5.

Плотность образцов оценивали согласно ISO 11272:1998.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ВЬЙвление азотфиксирующих микроорганизмов в промышленных углеводородных шламах

Выделение тотальной ДНК из проб шламов и амплификация маркерного гена азотфиксации (и//Н) с этой матрицы (рисунок 1А, Б) впервые позволили установить наличие в исследуемых отходах микроорганизмов, потенциально способных к фиксации атмосферного азота.

А Б

Рис. 1 Выявление «г/Н гена в составе тотальной ДНК, выделенной из образцов шламов и почвы. А - тотальная ДНК; Б - амплификация т]Н гена с тотальной ДНК. 1 -нефтехимический шлам (НКНХ); 2 - химический шлам (КОС); 3 -шлам нефтепереработки (УНПЗ); 4 - почва; 5 - ДНК маркер (1кб)

На безазотистой твердой среде Эшби (рис 2А) выявлено высокое содержание свободноживущих диазотрофных бактерий во всех исследуемых шламах (на уровне 105-106 КОЕ/г) по сравнению с черноземной почвой (104 КОЕ/г). Однако, азотфиксирующая активность исследуемых образцов шламов (0,2-0,4 мг Ыг/кг*ч) оказалась существенно ниже, чем в почве (0,7 мг Ы2/кг*ч) (рис. 2Б).

0,9

нефтехимический шлам НКНХ

химическим шлам КОС

шлам нефшпеработки УНПЗ

Рис.2 Численность диазотрофных организмов (А) и азотфиксирующая активность (Б) в различных шламах по сравнению с почвой

Таким образом, сопоставление численности диазотрофов и нитрогеназной активности шламов, извлеченных из шламонакопителя, свидетельствует о выживании в шламах азотфиксирующей микрофлоры, потенциал которой не реализуется в полной мере. Это может быть связано как с токсическими, так и с неблагоприятными физическими свойствами углеводородных отходов, обуславливающими гипометаболическое состояние микрофлоры (Nikitina et al, 2003; Наумова с соавт., 2008).

Диазотрофные бактерии химического шлама КОС

Для характеристики сообщества истинных азотфиксирующих микроорганизмов использовали сочетание классических

микробиологических методов с методами молекулярной биологии. Принадлежность к группе азотфиксирующих микроорганизмов оценивали по наличию л/уН гена в геноме изолятов, выделенных из нативного химического шлама КОС на богатой среде (МПА).

Численность аэробных гетеротрофных микроорганизмов, выделенных на МПА, в шламе оказалась относительно невысокой - до 107 КОЕ/г (табл. 1). Оказалось, что для шлама характерно относительно низкое микробное разнообразие (нам удалось выявить только 12 различных морфотипов колоний) и доминирование двух представителей в сообществе (до 85%) (рис.

3).

Удивительным оказалось высокое содержание (до 95%) потенциальных азотфиксаторов, содержащих в составе геномной ДНК т/Н ген, в сообществе аэробных гетеротрофов химического шлама КОС (рис. 3). Вероятно, на стадии изначального формирования шлама как твердой фракции сточных вод, перегруженной углеродом и характеризующейся недостатком доступного азота, диазотрофные микроорганизмы получают селективное преимущество и накапливаются в сообществе.

г П//Н - положительные □ nifñ ■ отрицательные

Рис. 3 Структура сообщества аэробных гетеротрофных микроорганизмов химического шлама КОС и распределение способности к азотфиксации (наличие в геноме изолятов nijН гена) среди его представителей

Филогенетический анализ двух доминирующих представителей исследуемого нами сообщества, проведенный на основании последовательности гена малой субъединицы рРНК, позволил отнести их к у-Proteobacteria, роду Stenotrophomonas. Бактерии рода Stenotrophomonas являются близкородственными по отношению к роду Pseudomonas. Помимо недавно установленной способности некоторых представителей рода Stenotrophomonas к азотфиксации (Reinhard et al., 2008), они представляют биотехнологический интерес в связи с защитой растений от фитопатогенов (Wolf et al., 2002) и биоремедиацией загрязненных почв (Binks et al, 1995).

Stenotrophomonas sp.

Азотфнксация в ходе моделирования фиторемедиации шлама

Исходный шлам, извлеченный из накопителя, в связи с его специфическими физическими и химическими свойствами, проявляет 100% фитотоксичность, поэтому технология фиторемедиации не применима непосредственно для таких шламов (Наумова с соавт., 2008а). В связи с этим, A.A. Несмеловым была осуществлена подготовка химического шлама КОС по оригинальному методу (Наумова с соавт., 2009), в условиях которой происходит значительное снижение уровня загрязнений и токсичности, а также оптимизация структуры шлама до уровня, совместимого с ростом растений. В лабораторном эксперименте с подготовленным химическим шламом мы моделировали основные агротехнические приемы, применяемые в технологии фиторемедиации. Удалось выявить некоторые факторы, влияющие на уровень азотфиксирующей активности шлама и оценить ее потенциал и вклад в поддержание роста растений и деградацию углеводородного загрязнения.

Выраженный стимулирующий эффект на активность азотфиксирующей микрофлоры оказывает участие растения-фитомелиоранта и улучшение структуры шлама, связанное с внесением почвы в качестве наполнителя (рис. 4). При этом величина азотфиксирующей активности в вариантах с растениями увеличивалась восьмикратно и достигала уровня более 3 мг Ы2/кг*ч, что превышает потенциал азотфиксации в сельскохозяйственных почвах (Шурхно с соавт., 2004).

Z 5

3 2

- посев растений

-*-шл -о-шл+почва

-й-шл+уд -о-шл+почва+уд :

-Х-шл+поч+раст -»-шл+поч+уд+раст

Время, нед-

Рис.4 Динамика азотфиксирующей активности в ходе моделирования фиторемедиации химического шлама КОС

сутки "

1 nocea 2 посев

—•—штлочв*рает шги-почв+уд+раст

□ шп*почв+раст вшл+почв+уд+раст

Рис. 5 Характеристика роста растения-мелиоранта (плевел Lottium perenne L.) (А) и общего урожая растений в ходе моделирования фиторемедиации химического шлама КОС

Минеральные азотные удобрения (в виде NH4NO3 1,3 г/кг - половинная доза азота от его необходимого количества для микробной биодеградации загрязнений и корректировки соотношения C:N в шламе до 30:1) ингибировали как азотфиксирующую активность, так и рост растения-мелиоранта (рис. 5А). Общий урожай биомассы растений после первого и второго посевов в варианте с удобрениями был ниже на 30 и 20%, соответственно, по сравнению с вариантом без внесения азота (рис. 5Б). Таким образом, даже сниженное количество удобрений сопоставимое с рекомендуемым для почв, приводит к угнетению роста растений на фоне токсичности самого шлама.

Рис. 6 Убыль углеводородного загрязнения химического шлама КОС в вариантах эксперимента по моделированию фиторемедиации

Сопоставление остаточного уровня загрязнений в вариантах с удобрениями и без них позволило оценить вклад сообщества аборигенных азотфиксаторов в обеспечение растения-фитомелиоранта и микроорганизмов-деструкторов доступным азотом. В варианте с растениями без внесения дополнительного азота (шл+поч+раст), в котором выявили наивысшую азотфиксирующую активность, темпы разложения

углеводородного загрязнения практически сопоставимы с аналогичным вариантом на фоне азотных удобрений (шл+поч+уд+раст) (рис. 6). Таким образом, мы впервые продемонстрировали возможность замены коммерческих удобрений биологическим процессом фиксации азота.

Скрининг перспективных для фиторемедиации диазотрофных микроорганизмов

В связи с тем, что в технологии фиторемедиации интенсивность всех биологических процессов, в том числе и биодеградации загрязнений, во многом зависит от состояния растения-мелиоранта, в последнее время широко исследуют возможности ризобактерий, способных увеличивать рост растений (PGPR) на фоне различных загрязнений. Применительно к шламам в литературе такие данные отсутствуют, но на примере углеводород-загрязненных почв показано положительное влияние таких бактерий на рост растений и темпы фиторемедиации в целом (Hutchinson et al., 2001; Huang et al, 2007).

С целью выявления наиболее биотехнологически перспективных азотфиксаторов для фиторемедиации шлама провели первоначальный скрининг по величине нитрогеназной активности среди изолятов, выделенных нами из различных углеводородных шламов, и отобрали десять наиболее активных (Табл. 1). Дальнейший скрининг среди десяти отобранных изолятов включал оценку их способности к утилизации компонентов шлама и рост-стимулирующих свойств в отношении растений-фитомелиорантов.

Таблица 1

Характеристика азотфиксирующих изолятов, выделенных из шламов

Изолят Источник выделения Нитрогеназная активность, нмоль С2Н4/мл*ч

Gl Ризосфера рогоза в шламе НКНХ 14,2±0,4

G9 Ризосфера плевела в шламе КОС 8,5±0,3

G10 Ризосфера плевела в шламе КОС 13,6±0,3

Gil Предобработанный шлам КОС 5,8±0Д

G12 Исходный шлам НКНХ 5,1±0,2

G17 Предобработанный шлам НКНХ 13,2±0,8

G20 Предобработанный шлам НКНХ 11,4±0,7

G22 Исходный шлам УНПЗ *4,9±0,3

SI Исходный шлам КОС 4,0±0,2

S2 Исходный шлам КОС 4,3±0,5

Все десять исследуемых изолятов являлись истинными азотфиксаторами, с активностью восстановления азота на уровне 4-15 нмоль С2Н4/мл*ч (Табл. 1) сопоставимой с таковой известных свободноживущих азотфиксаторов из рода АгоГоЬаМег (Кау1китаг е1 а1., 2004). Более того, установили наличие в их геноме генов азотфиксации (ш/Н) (рис. 7).

Рис. 7 ПЦР амплификация фрагмента иг/Н гена с геномной ДНК

коллекционных изолятов. М - маркер; 1-10 -индивидуальные изоляты

Удивительным является сочетание диазотрофии с деструкторскими способностями в отношении широкого спектра специфических загрязнений, что впервые показано в нашей работе на примере аборигенных азотфиксаторов шламов. Выявленная нами способность десяти отобранных изолятов расти на среде с добавлением индивидуальных загрязнений или непосредственно шлама свидетельствует об адаптации азотфиксаторов к условиям шлама и демонстрирует их реальное участие в разложении загрязнений отхода. Недавно способность к деградации нефтяных углеводородов была обнаружена у некоторых представителей рода Azospiríllum (Муратова с соавт., 2005).

С точки зрения увеличения доступности для растений других биогенных элементов оценивали способность растворять труднодоступные соединения фосфора, которая достаточно широко распространена среди исследуемых в нашей работе азотфиксирующих бактерий: 6 из 10 изолятов обладали данным свойством. В свою очередь, в работе Хьюзена было показано, что солюбилизация труднодоступных соединений фосфора -достаточно редкое явление среди бактериальных изолятов из категории PGPR: при скрининге было выявлено всего 4 положительных по данному признаку изолята из 14 (Husen, 2003).

Способность к синтезу фитогормонов, чаще всего ауксина - индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), является одним из основных рост-стимулирующих свойств PGPR. Индольные соединения выявлены нами в культуральной жидкости всех исследуемых изолятов на уровне от 0,5 до 9,2 мкг/мл (рис. 8). Для представителей рода Azotobacter, выделенных из местообитания мангровых зарослей и рекомендованных в качестве основы морских биоудобрений, продукция ИУК в среднем составляла 11,5 мкг/мл (Ravikumar et al., 2004), в свою очередь для Pseudomonas, стимулирующих рост растений, характерен синтез ИУК на уровне 3-5 мкг/мл (Воронин, 1998). Таким образом, многие коллекционные изоляты, выделенные из шламов, рассматриваются нами как потенциальные стимуляторы роста растений.

niíH-

123456789 ЮМ

аг юоо п.о. Ф 750 п.с.

Рис. 8 Продукция индолил-3-уксусной кислоты (ИУК)

азотфиксирующими изолятами

G9 G10 G11 G12 G17 G20 G22 S1 S2

изоляты

Еще одним механизмом положительного влияния микроорганизмов на растения является способность подавлять рост фитопатогенов. Совместное культивирование на твердой питательной среде изучаемых азотфиксаторов с различными фитопатогенными микромицетами и бактериями позволило выявить неспецифическое и специфическое в отношении отдельных фитопатогенов антагонистическое воздействие некоторых азотфиксирующих изолятов (табл. 2). Видоспецифичный антагонизм скорее всего связан с выделением в среду тех или иных антибиотиков, тогда как угнетающее действие на широкий спектр фитопатогенов может быть опосредовано продукцией сидерофоров (Воронин, 1998; Husen, 2003).

Таблица 2

Антагонистическая активность изолятов по отношению к фитопатогенным микромицетам и бактериям (по зоне ингибирования роста

фитопатогена, мм)

........изолят патоген^^ Gl G9 G10 Gl! G12 G17 G20 G22 S1 S2 '

Aspergillus niger - - - - - 5 12 - - -

Aspergillus sp. 7 10 - - - 11 11 - - -

Fusarium sp. - - - - - 13 14 - - -

Alternaria sp. 7 8 7 5 4 11 22 - - 6

Ervirtia caratovora 13 5 - - - 16 7 - - -

Xantomonas solunocerum 20 7 9 - 15 25 19 - - -

Pseudomonas syringae - - - - - - - 3 - -

Изоляты 017 и в20 проявили широкий спектр антигрибной активности на примере четырех наиболее распространенных видов фитопатогенных микромицетов (рис. 9).

Рис. 9 Подавление роста фитопатогенных микройицетов Alternaría sp (а, б) и Aspergillus niger (в) изолятами G17 и G20

В опыте с бактериальными фитопатогенами наибольшая антагонистическая активность изолятов выявлена в отношении ХаЫотопа5 5о1ипосегит. Наибольшей антибактериальной активностью обладал изолят 017 (рис. 10).

caratovora (а),

Xantomonas solunocerum (б).

Рис. 10 Подавление роста фитопатогенных бактерий изолятом G17: Erwinia

Сравнивая полученные данные по величине зон подавления роста фитопатогенов с данными патентной литературы, можно сделать вывод, что некоторые исследуемые изоляты обладают высокой антагонистической активностью и могут играть роль в биоконтроле ряда заболеваний растений. По интенсивности и спектру антагонистической активности в отношении грибных фитопатогенов изоляты Gl, G9, G17 и G20 сопоставимы со штаммами бактерий Azotobacter vinelandii ИБ4 (Логинов с соавт., 2005) и Azotobacter chroococcum (Кандыба, Назаров, 2006), состоящих в основе запатентованных биологических препаратов для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям.

Эффекты бактеризации семян растений

Бактеризация семян в сочетании с фитопатологической экспертизой позволила выявить влияние исследуемых азотфиксирующих изолятов на возбудители семенных инфекций, а также на прорастание семян растений.

По итогам анализа антагонистических свойств исследуемых диазотрофов (Табл. 2) были отобраны четыре наиболее активных изолята (Gl, G9, G17 и G20) для оценки их потенциала в защите растений.

Предварительная фитоэкспертиза семян овса (Avena saliva L.) показала, что посевной материал в разной степени инфицирован следующими патогенами: Alternaria sp., Fusarium sp., Aspergillus sp., Pénicillium sp. (рис. 11). Предсшшпелн данных родов широко распространены в почвенных экосистемах (Шурхно с соавт., 2004)

В нашем эксперименте обработка семян смесью четырех отобрайных изолятов позволила на 90% снизить зараженность семян и на 20% повысить их прорастание (табл. 3), что подтверждает их антагонистический потенциал.

Таблица 3

Эффект бактеризации семян овса смесью изолятов 01, С9, С17, й20

Вариант опыта Зараженные семена, % Проросшие семена, %

С бактеризацией 5±3 99±1

Без бактеризации 67±8 85±5

Совокупный рост-стимулирующий потенциал изолятов азотфиксаторов мы оценили в лабораторном эксперименте при бактеризации семян растений и посеве их непосредственно в шлам.

В качестве наиболее устойчивых к шламу КОС растений ранее уже были отобраны овес (Avena sativa L.) и горох (Pisum sativum L.). Эффекты интродукции азотфиксаторов наиболее ярко выражены на горохе (Pisum sativum): продемонстрировано увеличение общей биомассы растений от 1,5 до 2,5 раз (рис. 12), при этом некоторые изоляты способствовали развитию корневой системы, стимулировали образование клубеньков.

Рис. 11 Фитоэкспертиза семян овса

Рис. 12 Влияние бактеризации семян на рост гороха (Pisum sativum L.) и овса (Avena sativa L.) в химическом шламе

8 горох 0 овес

<ьч #

Иэоляты диаэотрофов

Таким образом, расширенный скрининг на основании биохимических исследований и оценкой непосредственного влияния на рост растений в шламе позволили выявить пять биотехнологически перспективных изолятов -Gl, G9, G10, G17 и G20, среди азотфиксаторов, выделенных из шламов.

Филогенетический анализ этих изолятов, основанный на последовательности гена 16S рРНК, позволил установить их систематическое положение и выявить родство с родами Pseudomonas и Enterobacter (рис. 13).

_Pseudomonas aeruginosa 57

[FJ972538.1 ~11G17; G20|

Gluconacetobacter díazotrophicus H12 FJ357339.1

Enterobacter sp. gx-25 FJ823048

Shigella flexnerl G3 FJ839361.1

gamma proteobacterium EU447512

Рис. 13 Филогенетическое родство исследуемых изолятов (01, С9, 010, 017, 020), основанное на гомологии фрагмента гена 16Э рРНК с имеющимися в базе данных организмами

Известны примеры биоремедиации органических згрязнений в почве при интродукции PGPR из родов Pseudomonas и Enterobacter, при этом они играли роль в повышении устойчивости растений и увеличении роста последних при углеводородном загрязнении почвы (Huang et al., 2005) и в присутствии полиароматических углеводородов (Huang et al., 2004).

•»MethaniKOceu* nvtripekjJ» S? -fbirkhoidftriftftp. Tltfl

- McAf^ene« fs«*8*

- Frerikia sp. EANlpec -fnierobcdcrdoöcap e train NBS

- Azotobacter vinelwxH «train M-A

- A¿9Mx>CUr V*irOOCtK*»tl KlriMIl 1-tbCie

- rnwmbflrfiv Y-l

Arcfcae«

(J-Prcteobacteria Actinobecteria

V- Prot«ob»d«ria

Sl, S2 0753MS.1 G9, GiO FG763Í35.Í G17, S20 «5763634

j * i—

1------1 ILO

» ......

Nwlet PCC /ТЛ

Ck*trldiumbotulinum A »tr. ATCC 19307

fctdta sp, BT97

AztnpHlum ЬглЯея je

SnorWicbknn nwBotf «train CCNWS40S13

КЫгоЫит ц>. CCBAU 2ЯЯ4

Cyenobacteria Rrmicutes

O-Proteobkcteria

Рис. 14 Филогенетическое дерево на основе последовательности гена 16S рРНК, включающее последовательности 14 азотфиксирующих микроорганизмов, выбранных из базы данных как представителей различных систематических групп, и экспериментально полученные последовательности гена 16S рРНК диазотрофных изолятов шлама (в рамке). Экспериментальные последовательности внесены в базу данных Gene Bank, их номера приведены после обозначения изолята.

Несмотря на широкие метаболические способности азотфиксаторы, выделенные из шламов 'представлены достаточно узкой группой близкородственных организмов, относящихся y-Proteobacteria, на филогенетическом дереве, отражающем многообразие азотфиксирующих микроорганизмов (Рис. 14).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые выявленные нами в промышленных углеводородных шламах азотфиксирующие микроорганизмы, оценка их таксономической принадлежности и физиолого-биохимических свойств, позволяют рассматривать данные отходы как уникальную экологическую нишу для сохранения узкого круга диазотрофных микроорганизмов, которые, как оказалось, играют важную роль в процессе фиторемедиации шлама путем снабжения биоценоза доступным азотом, участия в деградации загрязнений и поддержания роста растений в экстремальных условиях углеводородного отхода. Полученные результаты следует рассматривать с позиций новой концепции диазотрофии в антропогенной экосистеме, ключевые параметры которой принципиально отличаются от таковых природных экосистем и агроэкосистем. Выявленные закономерности выживания диазотрофов, их видового разнообразия, взаимодействия с растениями-фитомелиорантами положены в основу новой технологии фиторемедиации углеводородных шламов, частью которой является данная работа.

ВЫВОДЫ

1. В твердых отходах (шламах) нефтепереработки, нефтехимии и органического синтеза впервые обнаружены генетические детерминанты процесса азотфиксации (фрагменты иг/Н гена), а также жизнеспособные азотфиксирующие микроорганизмы на уровне 105-106 КОЕ/г, активность которых не превышала 0,5 мг Ы2/кг шлама«ч;

2. В сообществе аэробных гетеротрофных микроорганизмов химического шлама до 85% представителей содержат в своем геноме и(/Н ген, при этом до 95% этих микроорганизмов представлены родом 51епоХгорНотопа$\

3. При добавлении к химическому шламу почвы и выращивании устойчивых растений в отсутствие удобрений уровень азотфиксирующей активности возрастает пятикратно, при этом темпы разложения углеводородного загрязнения сопоставимы с аналогичным вариантом, включающим применение азотных удобрений;

4. Создана коллекция азотфиксирующих изолятов, выделенных из шламов, сочетающих способность к утилизации компонентов шлама (многоатомные спирты, алканы, ПАУ) с рост-стимулирующим потенциалом в отношении растений (растворение труднодоступных соединений фосфора, синтез фитогормонов (индолилуксусная кислота), антагонистическая активность против бактериальных и грибных фитопатогенов);

5. При бактеризации семян азотфиксаторами, выделенными из углеводородных шламов, на 90% снижается количество зараженных семян

фитопатогенными микромицетами, и до 2,5 раз увеличивается биомасса растений при выращивании их в условиях химического шлама;

6. На основании анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК установлено, что наиболее перспективные с точки зрения

фиторемедиации штаммы азотфиксаторов относятся к родам Pseudomonas и Enterobacter, входящим в группу у-протеобактерий.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Наумова Р.П. Предобработка твердого химического отхода перед его биоремедиацией [Текст] / Р.П. Наумова, В.Н. Кудряшов, A.A. Несмелов, P.P. Гафуров, И.Р. Мухаметшин, P.P. Баширов, Т.В. Григорьева // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе.- 2008,- №4,- С. 29-31.

2. Наумова Р.П. Предварительная оценка потенциала фиторемедиации твердых химических отходов [Текст] / Р.П. Наумова, В.Н. Кудряшов, Т.В. Григорьева, P.P. Гафуров, И.Р. Мухаметшин, Р.Х. Хузаянов, A.A. Несмелов // Ученые записки Казанского государственного университета. Естественные науки,-2008.-Т. 150.-кн. 2.-С. 155-166.

3. Naumova R.P. Diazotrophs originated from petrochemical sludge as a potential resource for waste remediation [Text] / R.P. Namova, T.V. Grigoreva, A.A. Rizvanov, V.Y. Gorshkov, N.V. Kudrjashova, A.V. Laikov // World Applied Sciöftce Journal.- 2009.- V.6, N. 2.- P. 154-157. ..

4. Якушева О.И. Новый подход к обезвреживанию нефтешлама с целью последующей фиторемедиации [Текст] / О.И. Якушева, Т.В. Григорьева, P.A. Галиев, A.A. Несмелов, Р.З. Юсупов, Р.П. Наумова; Казан- гос. ун-т,-Казань, 2006.- 16 е.- Деп. в ВИНИТИ 11.01.2007, № 17-В2007.

5. Галиев P.A. Токсикорезистентные растения для ремедиации твердых отходов (шламов) нефтехимического производства [Текст] / P.A. Галиев, О.И. Якушева, Т.В. Григорьева, А.Р. Якупов, Д.К. Мустафин // 9-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: Сб. тезисов,- Пущино, 2005.- С. 341.

6. Григорьева Т.В., Биотехнологическое обезвреживание опасных твёрдых отходов нефтехимии [Текст] / Т.В. Григорьева, P.A. Галиев, Р.П. Наумова // Всероссийская выставка научно-технического творчества молодёжи: Сб. материалов.- Москва, 2005.- С.204-205.

7. Григорьева Т.В. Оценка потенциала ремедиации нефтешлама при варьировании дозы минеральных удобрений и почвы [Текст] / Т.В. Григорьева, Г.А. Ситдикова, Р.П. Наумова // 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: Сб. тезисов.-Пущино, 2006.-С. 365.

8. Григорьева Т.В. Оценка потенциала биоремедиации твердых отходов нефтехимии [Текст] / Т.В. Григорьева, P.A. Галиев, A.A. Несмелов, Р.З. Юсупов, О.И. Якушева, Р.П. Наумова // Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии»: Сб. статей.- Пущино-Тула, 2006.- С. 90.

9. Григорьева Т.В. Отбор свободноживущих диазотрофов для защиты растений [Текст] / Т.В. Григорьева, Е.Г. Иванова И Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития»: Сб. материалов.-Киров, 2007,-С. 187-189.

10. Григорьева Т.В. Азотфиксирующие аборигены химических шламов

- перспективный ресурс экологической биотехнологии [Текст] / Т.В. Григорьева, А.А. Ризванов, Ю.В. Гоголев, А.В. Лайков, Р.П. Наумова // 12-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология

- наука XXI века»: Сб. тезисов,- Пущино, 2008.- С. 260.

11. Grigoryeva T.V. Nitrogen fixing bacteria inhabiting hazardous industrial wastes [Text] / T.V. Grigoryeva, A.A. Rizvanov, Y.V. Gogolev, A.V. Laikov, R.P. Naumova // Proceedings of the First interuniversity conference on modem biology «Bio-news».- Kazan, 2008,- P. 25.

12. Naumova R.P. Development of biotechnologies for industrial toxic wastes remediation [Text] / R.P. Naumova, O.I. Yakusheva, T.V. Grigoryeva, A.A. Rizvanov, A.A. Nesmelov, A.V. Laikov // Abstracts of the XIV international conference «Microbial enzymes in biotechnology and medicine».- Kazan, 2009,-P. 28-29.

Отзывы на автореферат просьба отправлять по адресу:

420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

Отдел аспирантуры, диссертационный совет Д212.081.08.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59,541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 91.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управление.» МПТР РФ. Подписано в печать 19.08.2009г. Усл. п.л 1,4 Заказ № К-6729. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Григорьева, Татьяна Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Проблема углеводородных отходов

1.2 Стратегия биоремедиации углеводородных шлмаов

1.3 Фиторемедиация

1.4 Роль ризобактерий, стимулирующих рост растений (PGPR)

1.4.1 Детоксикация

1.4.2 Синтез регуляторов роста растений

1.4.3 Фиксация атмосферного азота

1.4.4 Улучшение фосфорного питания растений

1.4.5 Продукция сидерофоров

1.4.6 Синтез антибиотиков

1.5 Классификация и экология свободноживущих диазотрофов

1.6 Биохимия азотфиксации и строение нитрогеназы

1.7 Генетика и регуляция азотфиксации

1.8 Методы исследования азотфиксирующих микроорганизмов

1.9 Влияние экологических факторов на азотфиксацию 40 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 46 2.1 Выявление биологической фиксации азота в промышленных 46 углеводородных шламах

2.1.1 Объект исследования

2.1.2 Отбор и хранение проб

2.1.3 Микробиологический посев

2.1.4 Выделение ДНК и амплификация niftl гена

2.1.5 Филогенетический анализ

2.1.6 Оценка азотфиксирующей активности 53 2.2. Моделирование фиторемедиации шлама

2.3 Скрининг диазотрофных бактерий, перспективных для 55 фиторемедиации шламов

2.3.1 Способность изолятов утилизировать компоненты шлама

2.3.2 Продукция индолилуксусной кислоты (ИУК)

2.3.3 Способность к солюбилизации фосфатов

2.3.4 Антагонистическая активность диазотофов по отношению 57 к фитопатогенам

2.3.5 Рейтинговая система оценки биотехнологического 58 потенциала

2.4 Эффекты бактеризации семян растений азотфиксаторами

2.4.1 Фитоэкспертиза семян

2.4.2 Инокуляция семян

2.4.3 Рост растений в шламе

2.5 Химические методы анализов

2.6 Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Выявление азотфиксирующих микроорганизмов в 62 промышленных углеводородных шламах

3.2 Характеристика сообщества азотфиксаторов химического 64 шлама

3.3 Моделирование фиторемедиации и оценка 68 азотфиксирующего потенциала шлама

3.4 Скрининг перспективных для фиторемедиации 73 диазотрофных микроорганизмов шлама

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль азотфиксирующих микроорганизмов в фиторемедиации промышленных углеводородных шламов"

Актуальность работы. Для промышленных отраслей, связанных с добычей, переработкой углеводородного сырья и химическим синтезом на его основе, характерно образование значительных объемов углеводородсодержащих отходов (шламов), которые по своим характеристикам (III класс опасности) представляют угрозу для окружающей среды и здоровья населения. Количество таких отходов, образующихся в процессе очистки промышленных сточных вод, зависит от мощностей предприятия и варьирует от 2 до 20 тыс. т в год [Jean et al., 2001; Bhattacharyya et al., 2003]. В соответствии с требованиями по обращению с опасными отходами шламы размещают в специально оборудованных накопителях, что не решает проблему по существу, так как переполнение накопителей означает необходимость поиска путей обезвреживания и переработки данной категории отходов. Можно утверждать, что данная проблема не имеет общих решений в мировом масштабе, хотя попытки ее решения предпринимаются в рамках многих национальных и международных проектов.

На фоне дорогостоящих технологий типа сжигания шламов с улавливанием компонентов газовых выбросов надежды на решение данной проблемы все больше связывают с биотехнологиями, позволяющими обезвреживать углеводородные шламы и тем самым расширить сферу их дальнейшей утилизации. Среди известных биотехнологий фиторемедиация (с участием растений) обладает экономическими и экологическими преимуществами [Kramer, 2005], возможность ее применения для обезвреживания углеводородного шлама нефтехимического предприятия продемонстрирована в работе Галиева с соавт. (2005).

Несмотря' на различия в происхождении углеводородных шламов, для них характерны высокие нагрузки по органическим загрязнениям, поэтому любой биотехнологический подход, как правило, основан на активизации микробного метаболизма путем корректировки соотношения биогенных элементов, в первую очередь углерода и азота C:N [van Hamme et al., 2003; Atagana et al., 2003; Aichberger et al., 2005]. Как правило, это достигается путем применения минеральных азотных удобрений, которые составляют одну из основных статей расходов при обезвреживании большинства загрязненных объектов.

При реализации технологии фиторемедиации, основанной на микробно-растительных взаимодействиях, необходимо учитывать интересы обоих компонентов ассоциации. Необходимое для жизнедеятельности микроорганизмов соотношение биогенных элементов C:N:P в загрязненном объекте варьирует в пределах 100:10:1-1000:20:1 [Dibble, Bartha, 1979; Beaudin et al., 1999; Atagana et al., 2003]. Нетрудно представить, что для углеводородных шламов, дефицитных по азоту (0-4 rN/кт) на фоне экстремальных нагрузок по органическим загрязнениям (160-300 гС/кг) [Lazar et al., 1999; Якушева с соавт., 2002; Яковлев с соавт., 2002] необходимо большое количество азотных удобрений (порядка 3,5-5 rN/кт шлама) [Vasudevan, Rajaram, 2001; Наумова с соавт., 2008а], которое зачастую является токсичным для микроорганизмов и тем более для растений [Chaineau et al., 2003].

Прогресс, достигнутый за последние два десятилетия в изучении диазотрофии, радикально изменил представления о распространении данного свойства среди микроорганизмов. Оказалось, что к фиксации атмосферного азота способны многие представители домена Bacteria (Alpha-, Beta-,Gamma-, Delta-, Epsilon-Proteobacteria, Cyanobacteria и Firmicutes) и некоторые представители домена Archaea [Zehr et al., 2003; Olsen et al., 2009].

Основные задачи исследования:

2. Охарактеризовать распространение генетических детерминант азотфиксации (nifii гена) среди аэробных гетеротрофных микроорганизмов, населяющих химический углеводородный шлам;

Научная новизна. Результаты диссертационной работы расширяют представления об экологии азотфиксирующих микроорганизмов и о их физиолого-биохимических свойствах. Впервые показана принципиальная возможность существования азотфиксирующих микроорганизмов в промышленных углеводородных шламах и реализация их активности' в условиях фиторемедиации этих отходов. С использованием молекулярно-генетических методов охарактеризовано распространение генетических детерминант азотфиксации (nifН ген) в составе ДНК бактерий, обитающих в экстремальных условиях углеводородного химического шлама. Осуществлен филогенетический анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, что позволило определить принадлежность аборигенных азотфиксаторов шлама к классу гамма-протеобактерий. Обоснована принадлежность бактерий, выделенных из шлама, к микроорганизмам, стимулирующим рост растений (plant growth promoting (PGP)), благодаря биотехнологически перспективному сочетанию следующих свойств: способность к утилизации компонентов шлама в качестве источников питания, способность к азотфиксации, к продукции индолилуксусной кислоты как биостимулятора из категории ауксинов, способность к растворению труднодоступных соединений фосфора, противопатогенная активность в отношении ряда возбудителей заболеваний растений, вызываемых грибами и бактериями.

Данные диссертационной работы послужили научной основой для создания новой биотехнологии обезвреживания и переработки промышленных углеводородных шламов, которая находится на стадии I патентования.

Практическая значимость. Результаты работы способствуют решению насущных проблем обезвреживания экологически опасных отходов, образующихся на предприятиях переработки и использования углеводородного сырья. С эколого-экономических позиций важна продемонстрированная в работе возможность замены коммерческих азотных удобрений биологическим процессом фиксации атмосферного азота при реализации технологии биоремедиации шлама, частью которой является данная работа. Проведенный в работе скрининг шламовых азотфиксирущих бактерий как PGP микроорганизмов позволил выявить пять наиболее ценных изолятов, относящихся к родам Pseudomonas и Enterobacter. Данные лабораторных испытаний по бактеризации семян этими штаммами свидетельствуют о повышении устойчивости растений к шламу и о стимуляции их роста, что демонстрирует возможность усовершенствования технологии обезвреживания и переработки углеводородных шламов, основанной на микробно-растительных ассоциациях.

Положения, выносимые на защиту:

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на школах-конференциях молодых ученых "Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии" (Пущино-Тула, 2006) и "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006, 2008), на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2005), на Специализированной конференции Международной водной ассоциации «IWA» «Обработка и утилизация осадков сточных вод: состояние, тенденции и перспективы» (Москва, 2006), на III научной конференции «Промышленная экология и безопасность» (Казань, 2008), на Международной научно-практической конференции «Микробная биотехнология - новые подходы и решения» (Казань, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции "Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития" (Киров, 2007), на Первой г межуниверситетской конференции "Bionews" (Казань, 2008), на Итоговых конференциях КГУ (2007-2008гг.), XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха, «Microbial enzymes in biotechnology and medicine» (Казань, 2009).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 12 работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Григорьева, Татьяна Владимировна

выводы

1. В твердых отходах (шламах) нефтепереработки, нефтехимии и органического синтеза впервые обнаружены генетические детерминанты процесса азотфиксации (фрагменты nif.Н гена), а также жизнеспособные азотфиксирующие микроорганизмы на уровне 105-106 КОЕ/г, активность которых не превышала 0,5 мг N2/kt шлама*ч;

2. В сообществе аэробных гетеротрофных микроорганизмов химического шлама до 85% представителей содержат в своем геноме niJH. ген, при этом до 95% этих микроорганизмов представлены родом Stenotrophomonas;

5. При бактеризации семян азотфиксаторами, выделенными из углеводородных шламов, на 90% снижается количество зараженных семян фитопатогенными микромицетами, и до 2,5 раз увеличивается биомасса растений при выращивании их в условиях химического шлама;

6. На основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК установлено, что наиболее перспективные с точки зрения фиторемедиации штаммы азотфиксаторов относятся к родам Pseudomonas и Enterobacter, входящим в группу у-протеобактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Григорьева, Татьяна Владимировна, Казань

1. Аринушкина, Е.В. Руководство по химическому анализу почв Текст./ Е.В. Аринушкина. М.: МГУ. - 1970. - 487 с.

2. Бабьева, И.П. Биология почв: учебник. 2-е изд., перераб. и доп./ И.П. Бабьева, Г.М. Зенова. - М.: МГУ, 1989. - 336 с.

3. Блукет Н.А. Ботаника с основами физиологии растений и микробиологии изд. 2-е, перераб. и доп. Текст./ Н. А. Блукет, В.Т. Емцев.- М.: «Колос», 1974.-С. 534-547.

4. Воронин, A.M. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений Текст./ А. М. Воронин // Соросовский образовательный журнал. — 1998. №10. - С. 25-31.

5. Браун, И.Э. Микроорганизмы ризосферы — приспособленцы, грабители или благодетели? Текст./ И.Э. Браун // Почвенная микробиология. М.: Колос, 1979.-С. 36-53.

6. Гармаева, Н.Ц. Изменение активности азотфиксации в лугово-черноземной мерзлотной почве при разложении растительных остатков Текст./ Н.Ц. Гармаева // Вопросы метаболизма почвенных микроорганизмов. — Новосибирск: Наука. Сиб. Отд-ние, 1981. С. 77-89.

7. Гарусов, А.В. Биомониторинг почвы Текст./ А.В. Гарусов, Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова. Казань: КГУ. - 1999. - 47 с.

8. ГОСТ 26261 «Методы определения валового фосфора, валового калия». -М.: Издательство стандартов, 1984.

9. Градова, Н.Б. Использование бактерий рода Azotobacter при биоремедиации нефтезагрязненных почв Текст./ Н.Б. Градова, И.Б. Горнова, Р. Эддауди, Р.Н. Салина // Прикладная биохимия и микробиология. — 2003. — Т. 39. -№3.- С. 318-321.

10. Добровольская, Т.Г. Структура бактериальных сообществ Текст./ Т.Г. Добровольская. М.: ИКЦ Академкнига, 2002. - 282с.

11. Емцев, В.Т. Микробиология: учебник для вузов Текст./ В. Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. 5-е изд., перераб. и доп. - М.: Дрофа, 2006. — 445 с.

12. Заварзин, Г.А. Современные бактерии и бактериальные сообщества Текст./ Г.А. Заварзин // Бактериальная палеонтология / Ред. А.Ю. Розанов.-М.: ПИН РАН, 2002.- С. 6-35.

13. Игнатов, В.В. Биологическая фиксация азота и азотфиксаторы Текст./ В.В. Игнатов // Соросовский образовательный журнал.- 1998. -№ 9- С.28-33.

14. Изменение 410 к постановлению правительства РФ №344 от 01.08.2005

15. Ильинский, В.В. Азотно-фосфорные удобрения для стимуляции биодеградации нефтяных углеводородов в морской воде Текст./ В.В. Ильинский, М.Н. Семяняко, С.Г. Юферова, Н.Н. Трошина, Т.В. Коронелли // Вестник МГУ. Серия биология, 1991. -№2. С. 63-67.

16. Кандыба, Е.В. Штамм бактерий Azotobacter chroococcum, обладающий широким спектром фунгицидного действия и биопрепарат на его основе / Е.В. Кандыба, А.Г. Назаров // Патент RU 2289620 С1 опубл. 20.12.2006.- 7с.

17. Киреева, Н.А. Фитотоксичность антропогенно-загрязненных почв Текст./ Н.А. Киреева, Г.Г. Кузяхметов, A.M. Мифтахова, В.В. Водопьянов.-Уфа: Гилем, 2003.- 266 с.

18. Клевенская, И.Л. Фиксация азота свободноживущими микроорганизмами. Сообщение 3: Влияние растительности на процесс биологической фиксации азота Текст./ И.Л. Клевенская //Изв. СО АН СССР. Сер. биол. наук.- 1976. №15, вып. 3. - С. 17-21.

19. Клевенская, И.JI. Биологическая фиксация азота. Сообщение 5: Влияние на азотфиксацию концентраций в среде связанного азота Текст./ И.Л. Клевенская //Изв. СО АН СССР. Сер. биол. наук.- 1978. №5, вып. 1. - С. 1623.

20. Клевенская, И.Л. Активность азотфиксирующих экто- и эндоризосферных ассоциаций, образуемых дикорастущими травами Горного Алтая Текст./ И.Л. Клевенская // Вопросы метаболизма почвенных микроорганизмов. Новосибирск: Наука. Сиб. Отд-ние, 1981. - С. 65-77.

21. Колешко, О.И. Экология микроорганизмов почвы: Лаб. Практикум Текст./ О.И. Колешко. -М.: Вышейшая школа, 1981. — 176с.

22. Кравченко, И.К. Азотфиксирующая активность торфяной почвы верхового болота Текст./ И.К. Кравченко, Е.В. Дорошенко // Микробиология. 2003. - Т. 72. - №1. - С. 111-116.

23. Кравченко, А.В. Роль триптофана в корневых экзометаболитах для фитостимулирующей активности ризобактерий Текст. / А. В. Кравченко, Т. С. Азарова, Н. М. Макарова, И. А. Тихонович // Микробиология. — 2004. — Т.73, №2. С. 195-198.

24. Кретович, В.Л. Биохимия усвоения азота воздуха растениями Текст./ В.Л. Кретович.- М.: Наука, 1994. 168 с.

25. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1990. - 352с.

26. Ландина, М.М. Влияние плотности и влажности почвы на ее биологическую активность, процесс азотфиксации и состав почвенного воздуха Текст./ М.М. Ландина, И.Л. Клевенская // Почвоведение. 1984. -№5.-С. 75-84.

27. Львов, Н.П. Молибден в ассимиляции азота у растений и микроорганизмов: 43-е Баховское чтение Текст./ Н.П. Львов. М.: Наука, 1989. 87с.

28. Мавроди, Д.В. Структурно-функциональная организация генов Pseudomonas fluorescens, кодирующих ферменты биосинтеза феназин-1-карбоновой кислоты Текст. / Д.В. Мавроди, В.Н. Ксензенко, Б.М. Чатуев // Молекулярная биология. 1997. - Т.31. - С. 76-82.

29. Марченко, А.И. Фиторемедиация почв, загрязненных нефтепродуктами: опыт Канады Текст./ А.И. Марченко, М.С. Соколов // АГРО XXI. 2001. -№1. - С.20-21.

30. Минеев, В.Г. Агрохимия: Учебник Текст./ В.Г. Минеев.- М.: Изд-во МГУ, Изд-во «Колос», 2004.- 720 с.

31. Мишустин, Е.Н. Микробиология: учебник для вузов Текст./ Е.Н. Мишустин, В.Т. Емцев. 3-е изд. - М.: Агропромиздат, 1987. - 368 с.

32. Моссе, Б. Аспекты анатомии корня, важные для микробиолога Текст./ Б. Моссе // Почвенная микробиология. — М.: Колос, 1979. — С. 58-86.

33. МУ 2.1.7.730-99 Методические указания "Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 7 февраля 1999 г.).

34. Муратова, А.Ю. Нефтеокисляющий потенциал ассоциативных ризобактерий рода Azospirillum Текст./ А.Ю. Муратова, О.В. Турковская, Л.П. Антонюк, О.Е. Макаров, Л.И. Позднякова, В.В. Игнатов // Микробиология.- 2005.- Т. 74.- №2.- С. 248-254.

35. Наумова, Р.П. Методы химического мониторинга нефтезагрязнённых осадков и почв Текст./ Р.П. Наумова, Е.В. Никитина, О.И. Якушева, С.К. Зарипова, А.В. Гарусов, A.M. Зиганшин. — Казань: ЮГУ, 2004. С. 4-11.

36. Никитина, Е.В. Биоремедиация отходов нефтехимического производства с использованием компостирования Текст. / Е.В. Никитина, О.И. Якушева, А.В. Гарусов, Р.П. Наумова // Биотехнология. — 2006. №1. — С.53-61.

37. Плакунов, В.К. Основы энзимологии Текст./ В.К. Плакунов. М.: Логос, 2001.-128с.

38. Смирнов, В.В. Бактерии рода Pseudomonas / В.В. Смирнов, Е.А. Киприанова.- Киев: Наук, думка, 1990.- С. 84 111.

39. Соколов, М.С. Биологическая защита растений в США Текст./ М. С. Соколов, Е. В. Литвишко // Защита растений.- 1993.- №11.- С.18 — 20.

40. Теппер Е.З., Практикум по микробиологии: Учебное пособие для вузов Текст./ Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева,- М.: Дрофа, 2004. — 256с.

41. Шумный, В.К. Биологическая фиксация азота Текст./ В.К. Шумный [и др.]; отв. ред. В.К. Шумный, Т.К. Сидорова. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1991.-271 с.

42. Шурхно, Р.А. Микробиологический статус ризосферы многолетних бобовых трав как критерий оценки и прогноза состояния почвы Текст./ Р.А. Шурхно, О.Л. Шайтанов, Р.Г. Гареев, Р.П. Наумова // Сельскохозяйственная Биология, 2004. -№3. С. 61-66.

43. Яковлев, В. Экологические проблемы Нефтеюганского региона Текст./ В. Яковлев, Г. Галеева, Л. Нуртдинова // Вестник инжинирингового центра ЮКОС. 2002. - №4.- С. 61-63.

44. Adam, G. Influence of diesel fuel on seed germination Text./ G. Adam, H. Duncan // Environmental Pollution. 2002. - V. 120. - P.363-370.

45. Adler, P.R. Bioremediation of phenolic compounds from water with plant root surface peroxidases Text./ P.R. Adler, R. Arora, A. El Ghaouth, D.M. Glenn, J.M. Solar // Journal of Environmental Quality. 1994. - V. 23. - P. 1113-1117.

46. Aichberger, H. Potential of preliminary test methods to predict biodegradation performance of petroleum hydrocarbons in soil Text./ H. Aichberger, M. Hasinger, R. Braun, A.P. Loibner // Biodegradation. 2005. - V. 16.-P. 115-125.

47. Aislabie, J. Potential for biodegradation of hydrocarbons in soil from the Ross Dependency, Antarctica Text./ J. Aislabie, M. McLeod, R. Fraser // Applied Microbiology and Biotechnology. 1998. - V. 49. - P. 210-214.

48. Amellal, N. Distribution and location of poly cyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and РАН-degrading bacteria within polluted soil aggregates Text./ N.

49. Amellal, J.-M. Portal, T. -Vogel, J. Berthelin // Biodegradation.- 2001.- V.12.- P. 49-57.

50. Anderson, T.A. Bioremediation in the rhizosphere Text./ T.A. Anderson, E.A. Guthrie, B.T. Walton// Environmental Science and Technology.- 1993.- V.27.- P. 2630-2636.

51. Aprill, W. Evaluation of the use of praire grasses for stimulating polycyclic aromatic hydrocarbon treatment in soil Text./ W. April, R.C. Sims // Chemosphere. 1990. -V. 20. - P. 253-265.

52. Aquilanti, L. Comparison of different strategies for isolation and preliminary identification of Azotobacter from soil samples Text./ L. Aquilanti, F. Favilli, F.Clementi // Soil Biology and Biochemistry. 2004. - V.36. - P. 1475 -1483.

53. Atagana, H.I. Optimization of soil physical and chemical conditions for the bioremediation of creosote-contaminated soil Text./ H.I. Atagana, R.J. Haynes, F.M. Wallis // Biodegradation. 2003. - V. 14. - P. 297-307.

54. Atlas, R.M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: An environmental perspective Text./ R.M. Atlas // Microbiology Reviews. — 1981. — V. 45.-P. 180-209.

55. Atlas, R.M. Hydrocarbon biodegradation and oil-spill bioremediation Text./ R.M. Atlas, R. Bartha // In: Advances in Microbial Ecology (Edited by K.C. Marshall). New York: Plenum Press. - 1992. - V. 12. - P. 287-338.

56. Bagwell, С. E. Physiological diversity of the rhizosphere diazotroph assemblages of selected salt marsh grasses Text. / С. E. Bagwell, Y. M. Piceno, A. Ashburne-Lucas, C. R. Lovell // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. - P. 4276-4282.

57. Balba, M.T. Bioremediation of oil-contaminated soil: microbiological methods for feasibility assessment and field evaluation Text./ M.T. Balba, N. Al-Awadhi, R. Al-Daher // Journal of Microbiological Methods. 1998. - V. 32. - P. 155-164.

58. Bartel, B. Auxin biosynthesis Text./ B. Bartel // Annual Review in Plant Physiology and Plant Molecular Biology.- 1997.- N. 48.- P. 51-66.

59. Bartha, R. Biotechnology of petroleum pollutant biodegradation Text./ R. Bartha//Microbial Ecology. 1986. - V.l2. - P. 155-172.

60. Beaudin, N. Identification of the key factors affecting composting of a weathered hydrocarbon-contaminated soil Text. / N. Beaudin, R.F. Caron, R. Legros, J. Ramsay, B. Ramsay // Biodegradation. 1999. - V. 10. - P. 127-133.

61. Belay, N. Dinitrogen fixation у a thermophilic methanogenic bacterium Text./ N. Belay, R. Sparling, L. Daniels // Nature.- 1984.- V. 312.- P. 286-288.

62. Bhattacharyya, J.K. Treatment and disposal of refinery sludges: Indian scenario Text./ J.K. Bhattacharyya, A.V. Shekdar // Waste Management and Research.- 2003,- V. 21.- N. 3.- P. 249-261.

63. Binks, P.R. Degradation of RDX by Stenotrophomonas maltophilia PB1 Text./ P.R. Binks, S. Nicklin, N.C. Bruce // Applied Environmental Microbiology. 1995. -V.61. -P.1813-1322.

64. Bossert, I. The fate of petroleum in soil ecosystem Text./ I. Bossert, R. Bartha // Petroleum Microbiology / R.M. Atlas. New York, 1984. - P. 435-473.

65. Braun, S.T. Molecular evidence for zooplankton-associated nitrogen-fixing anaerobes based on amplification of the nifH gene Text. / S. T. Braun, L. M.

66. Proctor, S. Zani, M. T. Mellon, J. P Zehr // FEMS Microbiology Ecology 1999. V. 28.-P. 273-279.

67. Biirgmann, H. New molecular screening tools for analysis of free-living diazotrophs in soil Text./ H. Biirgmann, F. Widmer, W. Von Sigler, J. Zeyer // Applied Environmental Microbiology. 2004. - V.70, No 1. - P.240-247.

68. Burauel, P. Formation and long-term fate of non-extractable residues in outdoor lysimeter studies Text./ P. Burauel, F. Fuhr // Environmental Pollution. -2000. V.108. -P.45-52.

69. Burns, R.C. Nitrogen fixation in bacteria and higher plants Text./ R.C. Burns, R.W.F. Hardy. Berlin: Spring-Verlag, 1975, New-York, Heidelberg, 1975.-P. 1-189.

70. Cerniglia, C.E. Microbial metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons Text./ C.E. Cerniglia // Advances in Applied Microbiology. 1984. - V. 30. - P. 31-37.

71. Chaillan, F. Factors inhibiting bioremediation of soil contaminated with weathered oils and drill cuttings Text./ F. Chaillan, C.H. Chaineau, V. Point, A. Saliot, J. Outdot // Environmentall Pollution.- 2006.- V. 144.- N. 1.- P. 255-265.

72. Chaineau, C.H. Bioremediation of a crude oil-polluted soil: Biodegradation, leaching and toxicity assessments Text. / C.H. Chaineau, C. Yepremian, J.F. Vidalie, J. Ducreux, D. Ballerini // Water, Air and Soil Pollution. 2003. - V. 144. p. 419-440.

73. Cunningham, S.D. Remediation of contaminated soils with green plants an overview Text./ S.D. Cunningham, W.R. Berti // In Vitro Cell. Dev. Biol. 1993. -V. 29.-P. 207-212.

74. Cunningham, S.D. Phytoremediation of contaminated soil Text./ S.D. Cunningham, W.R. Berti, J.W. Huang // Trends Biotechnology 1995. - V.13. -P.393-397.

75. Dobereiner, J. Selective infection of maize roots by streptomicin-resistant Azospirillum lipoferum and other bacteria / J. Dobereiner, V.L.D. Baldani // Canadian Journal of Microbiology.- 1979.- V. 25.- N.l 1.- P. 1264-1269.

76. Dibble, J.T. The effect of environmental parameters on the biodegradation of oily sludge Text./ J.T. Dibble, R. Bartha // Applied and Environmental Microbiology. 1979. - V. 37. - P. 729-739.

77. Dixon, R. Genetic regulation of biological nitrogen fixation Text./ R. Dixon,

78. D. Kahn // Nature reviews. Microbiology. 2004. - V.2. - P.621-631.

79. EI-Nawawy, A.S. Biodegradation of oily sludge in Kuwait soil Text./ A.S. El-Nawawy, I.H. El-Bagouri, M. Abdal, M.S. Khalafai // W.J. Microbiol. Biotechnol. 1992. -V. 8.-N. 6.-P.618-620.

80. Faure, D. Comparative studies of substrates and inhibitors of Azospirillum and Puricularia orizae laccases Text./ D. Faure, M.L. Bouillant, L. Bally // Applied and Environmental Microbiology. 1995. -N.61. -P.1141-1146.

81. Fiores, H.E. Underground plant metabolism: the biosynthetic potential of roots Text./ H.E. Fiores, C. Weber, J. Puffett // Plant roots / Y. Waisel, A. Eshel, U. Kafkafi. New York: Marcel; Dekker.- 1996.- P. 931-956.

82. Galiev, R.A. Ecologically hazardous petrochemical sludges as a nutrient source for microorganisms Text./ R.A. Galiev, A.M. Ziganshin, O.I. Yakusheva,

83. E.V. Nikitina, S.A. Zaripov, A.V. Naumov // Environmental Radioecology and Applied Ecology. 2003. - V.9. -N. 4. - P. 18-28.

84. Geiselbrecht, A.D. Enumeration and phylogenetic analysis of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading marine bacteria from Puget Sound sediment /

85. A.D; Geiselbrecht, R.P. Herwig, J.W. Deming, J.T. Staley// Applied and Environmental Microbiology.- 1996.- V. 62.- P. 3344-3349.

86. Gibson, D.T. Microbial degradation of aromatic hydrocarbons Text./ D.T. Gibson, V. Subramanian // In: Microbial Degradation of Organic Compounds (Edited by D.T. Gibson). New York: Dekker. - 1984. - P. 181-282.

87. Glaser, A. N. Microbial biotechnology: fundamental of applied1 microbiology Text. / A. N. Glaser, H. Nikado. New York: Freeman W. H. and Comp, 1988. P. -662.

88. Glick, B.R. Phytoremediation: synergetic use of plants and bacteria to clean up the environment Text./ B.R. Glick // Biotechnology Advances. 2003. - V.21. - P.383-393.

89. Glick, B.R. Modulation of plant ethylene levels by the bacterial enzyme ACC deaminase Text./ B.R. Glick // FEMS Microbiology Letters.- 2005.- V. 251.- N. l.-P. 1-7.

90. Gogoi, B.K. A case study of bioremediation of petroleum-hydrocarbon contaminated soil at a crude oil spill site Text./ B.K. Gogoi, N.N. Dutta, P. Goswami, T.R.K. Mohan // Advance in Environmental Research. V.7. - 2003. -P.767-782.

91. Gunawardena, V. Function of root border cells in plant deference Text. / V. Gunawardena, S. Miyasaka, X. Zhao, M.C. Hawes // Trends in Plant Sciences. -2000. V.5. - P. 128-133.

92. Hart, T.D. Roles of microbial polymers in the rhizosphere Text./ T.D. Hart, A.H. Clamberlain, Y.M. Lynch // 15th World Congr. Soil Sci. Acapulco, July, 1994.-V. 4.-P. 46-47.

93. Hawes, M.C. Function of root border cells in plant health: pioneers inrhizosphere Text./ M.C. Hawes, L.A. Brigham, F. Wen, H.H. Woo, Y. Zhu // Annual Review of Phytopathology. 1998. - V.36. - P.311-327.

94. Hejazi, R.F. Landfarming operation of oily sludge in arid region—human health risk assessment Text./ R.F. Hejazi, T. Husain, F.I. Khan // Journal of Hazardous Materials. 2003. - V.99. - P.287-302.

95. Herbes, S.E. Microbial transformation of polyaromatic hydrocarbons in pristine and petroleum-contaminated sediments Text./ S.E. Herbes, L.R. Schwall // Applied and Environmental Microbiology. 1978. - V. 35. - P. 306-316.

96. Huang X. D. Multi-process phytoremediation system for removal of polycyclic aromatic hydrocarbons from contaminated soils / X. D. Huang, Y. El-Alawi, D. M. Penrose, B. R. Glick, В. M. Greenberg // Environ. Pollut. 2003. -In press.

97. Huang, X.-D. Responses of three grass species to creosote during phitoremediation Text./ X.-D. Huang, Y. El-Alawi, D. M. Penrose, B. R. Glick, В. M. Greenberg // Environmental Pollution.- 2004 V.130. - P. 453 - 463.

98. Hugh, R. Pseudomonas maltophilia, an Alcaligenes like species Text./ R. Hugh, E. Ryschenko // Journal of General Microbiology. 1961. - V.26. - P. 123132.

99. Husen, E. Screening of soil bacteria for plant growth promoting activities in vitro Text./ E. Husen // Indonesian Journal of Agriculture Science.- 2003.- V.4.-N. l.-P. 27-31.

100. Hutchinson, S.L. Phytoremediation of aged petroleum sludge Text./ S.L. Hutchinson, M.K. Banks, A.P. Schwab // Journal of Environmental Quality. -2001. — V.30. — P.395-403.

101. Ishizuka, J. Trends in biological nitrogen fixation research and application Text./ J. Ishizuka //Plant and Soil. 1992.-N. 141.-P. 197-209.

102. Jean, D.S. Direct sludge freezing using dry ice Text./ D.S. Jean, D.J. Lee,

103. C.V. Chang // Advances in Environmental Research. 2001. - V. 5. - N. 2. - P. 145-150.

104. Jobson, A. Microbial utilization of crude oil Text./ A. Jobson, F.D. Cook,

105. D.W.S. Wastelake // Applied Microbiology. 1972. -V. 32. - P. 1082-1089.

106. Johnson, D.L. Soil microbial response during the phytoremediation of a PAH contaminated soil Text./ D.L. Johnson, D.R. Anderson, S.P. McGrath // Soil Biology and Biochemistry. 2005. - V. 37. - P. 2334-2336.

107. Jonasson, S. Litter, warming and plants affect respiration and allocation of soil microbial and plant C, N and P in arctic mesocosms Text./ S. Jonasson, J. Castro, A. Michelsen // Soil Biology & Biochemistry. 2004. - V.36. - P. 11291139.

108. Juvonen, R. A battery of toxicity tests as indicators of decontamination in composting oily waste Text./ Ecotoxicological Environmental Safety. — 2000. — V. 47, N. 2.-P. 165-166.

109. Karpati, E. Interaction of Azospirillum lipoferum with wheat germ agglutinin stimulates nitrogen fixation Text./ E. Karpati, P. Kiss, T. Ponyi et al. // Journal of Bacteriology. 1999. - V.181, N.13. - P. 3949-3955.

110. Kennedy, I.R. The current and potential contribution of asymbiotic nitrogen fixation to nitrogen requirements on farms: a review Text./ I.R. Kennedy, N. Islam // Australian Journal of Experimental Agriculture. 2001. - N. 41. - P. 447457.

111. Kirchmann, H. Biodegradation of petroleum-based oil wastes through composting Text./ H. Kirchmann, W. Ewnetu // Biodegradation. 1998. - V. 9. -N. 2.-P. 151-156.

112. Klokk, Т. Effects of oil pollutions on the germination and vegetative growth of five species of vascular plant Text./ T. Klokk // Oil and Petrochemical Pollution. 1984. -V. 2. - P. 25-30.

113. Klug, M.J. Utilization of aliphatic hydrocarbons by microorganisms Text./ M.J. Klug, K. Markovetz // Advances in Microbial Physiology. 1971. - V. 5. - P. 1-39.

114. Klugkist, J. Inhibition of nitrogenase activity by ammonium chloride in Azotobacter vinelandii Text./ J. Klugkist, H. Haaker // Journal of Bacteriology.-1984.-V.157.-N.1.-P. 148-151.

115. Kramer, U. Phytoremediation: novel approaches to cleaning up polluted soil Text./ U. Kramer // Current Opinion in Biotechnology.- 2005.- V.16.- N. 2.- P. 133-141.

116. Krueger, J.P. Use of dicamba degrading microorganisms to protect dicamba susceptible plant species Text./ J.P. Krueger, R.G. Butz, D.J. Cork // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1991. - V.39. - P.l000-1003.

117. Lawlor, K. Long-term effect of crude oil contamination and bioremediation in a soil ecosystem Text./ K. Lawlor, K. Sublette, K. Dunkan, E. Levetin, P. Buck etal.//Bioremediation.-1997.-V. l.-N. l.-P. 41-51.

118. Leahy, J.G. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment Text./ J.G. Leahy, R^R. Colwell // Microbiological Reviews.- 1990.- P. 305-315.

119. Leigh, J.A. Nitrogen fixation In methanogens: the archaeal perspective Text./ J.A. Leigh // Current Issues Molecular Biology.- 2000.- V. 2.- N. 4.- P. 125-131.

120. Lin, Q. The combined effects of phytoremediation and biostimulation in enhancing habitat restoration and oil degradation of petroleum contaminated welands Text./ Q. Lin, I.A. Mendelssohn // Ecological Engineering. 1998. -V.10. -P.263-274.

121. Liu, C.M. Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae Text./ C.M. Liu, P.A. Mclean, C.C. Sookdea, F.C. Cannon // Applied and Environmental Microbiology. 1991. - V.57. - P. 1799-1804.

122. Lucy, M. Applications of free living plant growth-promoting rhizobacteria Text./ M. Lucy, E. Reed, Bernard R. Glick // Antonie van Leeuwenhoek, 2004, 86: 1-25.

123. Madigan, M.T. Brock biology of microorganisms. Ninth edition Text./ M.T. Madigan, J.M. Martinko, J. Parker.- New Jersey: Prentice — Hall, Inc. Upper Saddle River, 2000.- 99lp.

124. Macek, T. Exploitation of plants for the removal of organics in environmental remediation Text./ T. Macek, M. Mackova, J. Kas // Biotechnology Advances. 2000. -V. 18. - P.23-34.

125. Mills, S.A. Evaluation of phosphorous sources promoting bioremediation ofdiesel fuel in soil Text./ S.A. Mills, W.T. Frankenberger. // Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 1994. - V. 53. - P. 280-284.

126. Mishra, S. Evaluation of inoculum addition to stimulate in situ bioremediation of oily-sludge-contaminated soil Text./ S. Mishra, J. Jyot, R.C. Kuhad, B. Lai //Appl. and Environ. Microbiol. -2001. V.4. - P. 1675-1681.

127. Nikitina, E.V. Distribution and physiological state of microorganisms in petrochemical oily sludge Text. / E. V. Nikitina, О. I. Yakusheva, S. A. Zaripov, R. A. Galiev, A. V. Garusov, R. P. Naumova // Microbiology 2003. - V. 72, № 5. -P. 621-627.

128. Normand, P. Phylogeny of nitrogenase sequences in Frankia and other nitrogen-fixing microorganisms Text./ P. Normand, J. Bousquet // Journal of Molecular Evolution. 1989. - N. 29. - P. 436-447.

129. Nuntagij, A. Aerobic nitrogen fixation during the biodegradation of lignocellulosic wastes Text./ A. Nuntagij, C. Lassus, D. de Sayag, L. Andre // Biological Waste. 1989. - V. 29. - N. 1. - P. 43-61.

130. Olson, J.B. N2-fixing microbial consortia associated with the ice cover of Like Bonney, Antarctica Text./ J.B. Olson , T.F. Steppe, R.W. Litaker, H.W. Paerl // Microbial Ecology. 1998. - V.36. - P. 231-238.

131. Oudot, J. Hydrocarbon weathering and biodegradation in a tropical estuarine ecosystem Text./ J. Outdot, E. Dutreux // Marine Environmental Research. -1989.-V. 27.-P. 195-213.

132. Ouyang, W. Comparison of bio-augmentation and composting' for remediation of oily sludge: a field-scale study in china Text./ W. Ouyang, H. Liu, V. Murygina, Y. Yu, Z. Xiu, S. Kalyuzhnyi // Process Biochemistry. 2005. -V.40. - P.3763-3768.

133. Palleroni, N.J. Stenotrophomonas, a new bacterial genus for Xanthomonas maltophilia Text./ N.J. Palleroni, J.F. Bradbury // International Journal of Systematic and Bacteriology.- 1993.- V. 43.- P. 606-609.

134. Perry, J.J. Microbial metabolism of cyclic alkanes Text./ JJ. Perry // In: Petroleum Microbiology (Edited by R.M. Atlas). Macmillan Inc. - 1981. - P. 62128.

135. Peters, J.W. Nitrogenase structure and function: a biochemical-genetic perspective Text./ J.W. Peters, K. Fisher, D.R. Dean // Annual Reviews of Microbiology. 1995. - V. 49. - P. 335-366.

136. Pfender, W.F. Microbial community structure and activity in wheat straw after inoculation with biological control organisms Text./ W.F. Pfender, V.P. Fieland, L.M. Ganio and R.J. Seidler // Applied Soil Ecology.- 1996.- V.3.- N. 1.-P. 69-78.

137. Poly, F. Comparison of nifH gene pools in soil and soil microenvironments with contrasting properties Text./ F. Poly, L. Ranjard, S. Nazaret, F. Gourbiere, L.J. Monrozier // Applied Environmental Microbiol. 2001. - N. 67. - P. 22552262.

138. Rhykerd, R.L. Impact of bulking agents, forced aeration, and tillage on remediation of oil-contaminated soil Text./ R.L. Rhykerd, B. Crews, K.J. Mclnnes, R.W. Weaver // Bioresource Technology.- 1999.- V. 67.- N. 3.- P. 279285.

139. Rudnick, P. Regulation of nitrogen fixation by ammonium in dazotrophic species of proteobacteria Text./ P. Rudnick, D. Meletzur, A. Green, C.Kennedy // Soil Biol. Biochem. 1997. - V.29. -P.831-841.

140. Saagua, M.C. Microbiological characterization of a coce oven contaminated site and evaluation of its potential for bioremediation / M.C. Saagua, L. Baeta-Hall, A.M. Anselmo // World Journal of Microbiology Biotechnology.- 2002.-V.18.- P. 841-845.

141. Salisbury, F.B. The role of plant hormones Text./ F.B. Salisbury // In Plant-Enviroment Interactions. Ed. R.E. Wilkinson, New York, USA, 1994. P. 39-81.

142. Shaffer, B.T. Temporal and spatial distribution of the nifH gene of N2-fixing bacteria in forest and clearcuts in western Oregon Text./ B.T. Shaffer, F. Widmer; L.A. Porteous; R.J. Seidler // Microbial Ecology. 2000. - V. 39. - P.12-21.

143. Shaw L.G. Biodegradation of organic pollutans in the rhizosphere / L.G. Shaw, R.G. Burns // Adv. Appl. Microbial. 2003. - V. 53. - P. 1-60.

144. Siciliano, S.D. Bacterial inoculants of forage grasses enhance degradation of 2-chlorobenzoic acid in soil Text./ S.D.Siciliano, J.J. Germida // Environmental Toxicology and Chemistry. 1997. - V.16. - P. 1098-1104.

145. Siciliano, S.D. Mechanisms of phitoremediation: Biochemical and ecological interactions between plants and bacteria Text./ S. D. Siciliano, J. J. Germida // Environ. Rev. 1998-Vol. 6, №1.-P. 1098 - 1104.

146. Siciliano, S.D. Selection of specific endophytic bacterial genotypes by plants in response to soil contamination Text./ S.D. Siciliano, N. Fortin, A. Mihoc et al. // Applied and Environmental Microbiology.- 2001.- V. 67.- N.6.- P. 2469-2475.

147. Singer, M.E. Microbial metabolism of straight-chain and branched alkanes Text./ M.E. Singer, W.R. Finnerty // In: Petroleum Microbiology (Edited by R.M. Atlas). New York: Macmillan. - 1984. - P. 1-59.

148. Singer, A.C. Secondary plant metabolites in phytoremediation and biotransformation Text./ A.C. Singer, D.E. Crowley, I.P. Thompson // Trends in Biotechnology. 2003. -V. 21. -N. 3. - P. 123-130.

149. Skipper, H.D. Bioremediation of contaminated soils Text./ H.D. Skipper // In: Principles and Applications of Soil Microbiology (Edited by D.M. Sylvia). NJ: Prentice Hall, Upper Saddle River. 1999. - P. 469-481.

150. Stevenson, F. Lipids in soil Text./ F. Stevenson //Journal of American Oil Chemistry Society. 1966. - V.43. - P.203-210.

151. Ueda, T. Remarkable N2-fixing bacterial diversity detected in rice roots by molecular evolutionary analysis of nifiH gene sequences Text./ T. Ueda, Y. Suga, N. Yahiro, T. Matsuguchi // Journal of Bacteriology. 1995. - V. 177, N. 5. - P. 1414-1417.

152. Van Hamme, J.D. Recent advances in petroleum microbiology Text./ J.D. Van Hamme, A.Singh, O.P. Wards // Microbiology and Molecular Biology Reviews.- 2003.- V. 67.- N. 4.- P. 503-549.

153. Vasudavan, N. Bioremediation of oil sludge-contaminated soil Text. / N. Vasudavan, P. Rajaram // Environment International.- 2001.- V. 26. P. 406-411.

154. Venosa, A. Efficacy of commercial products in enhancing oil biodegradation in closed laboratory reactors Text./ A. Venosa, J.R. Haines, W. Nisamaneepong,

155. R. Govind, S. Pradhan, B. Siddique // Industrial Microbiology. 1992. - V.10. -P.13-23.

156. Weissenfels, W.D. Degradation of phenanthrene, fluorine, fluoranthene by pure bacterial cultures Text./ W.D. Weissenfels, M. Beyer, J. Klein // Applied Microbiology and Biotechnology. 1990. -V. 32. - P. 479-484.

157. Williams, R.T. Composting of explosives and propellant contaminated soils under thermophilic and mesophilic conditions Text./ R.T. Williams, P.S. Ziegenfuss, W.E. Sisk // Journal of Industrial Micribiology. 1992. - V. 9. - P. 137-144.

158. Zablotowica, R.M. Compatibility of plant growth promoting rhizobacterial strains with agrochemicals applied to seed Text./ R.M. Zablotowica, C.M. Press, N. Lyng, G.L. Brown, J.W. Kloepper// Canadian Journal of Microbiology.- 1991.-V. 38.- P. 45-50.

159. Zehr, J.P. Diversity of heterotrophic nitrogen fixation genes in a marine cyanobacterial mat Text. / J.P. Zehr, M. Mellon, S. Braun, W. Litaker, T. Steppe, H. W. Paerl // Appl. and Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 2527-2532.

160. Zehr, J.P. New nitrigen-fixing microorganisms detected in oligotrophic oceans by amplification of nitrogenase (nifH) genes Text./ J.P. Zehr, M.T. Mellon, S. Zani // Applied and Environmental Microbiology. 1998. - V.64. - P. 3444-3450.

161. Zehr, J.P. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure: a cross-system comparison Text./ J.P. Zehr, B.D. Jenkins, S.M. Short, G.F. Steward // Environmental Microbiology 2003. - V. 5, № 7. - P. 539-554.

162. Zhuang, X. New advances in plant growth-promoting rhizobacteria for bioremediation Text./ Zhuang X. Chen J., Shim H., Bai Z. // Environment International. 2007. - V.33. - N.3. - P.406 - 413.

Информация о работе

Григорьева, Татьяна Владимировна
кандидата биологических наук
Казань, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Роль азотфиксирующих микроорганизмов в фиторемедиации промышленных углеводородных шламов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы