Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РИБУЛОЗОДИФООФТКАРБОКСИЛАЗА-ОКСИГЕНАЗА И МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕРОДА В ЛИСТЬЯХ ВОЛОСНЕЦА СИТНИКОВОГО

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "РИБУЛОЗОДИФООФТКАРБОКСИЛАЗА-ОКСИГЕНАЗА И МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕРОДА В ЛИСТЬЯХ ВОЛОСНЕЦА СИТНИКОВОГО"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРдеНА ЛЕНИНА ИНСТШУТ ШХИМИИ ШШИ А.Н.БАХА

^ 3 На правах рукописи

СЕИТОВА ТЫНШГЫК АППАССЕНА

РИЕ/ЛОЗОдаЮСЙАТКАРВСКСИЛАЗА-ОКСЖЕНАЗА И МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕРОДА В ЛИСТЬЯХ ВОЛОСИЩА сишиссвого

03,00,04 - биологическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1979

Работе выполнена в лаборатории автотрофной ассимиляции углерода фдена Ленина Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР

Научный руководитель: кандидат химических наук, старший научаый сотрудниц Н.Г.Доман

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

■ А.К.Романова доктор биологических наук Э.Г.Евстигнеева

Ведунее учреждение: Институт фиэиологеи растений

им.К.А.Тимирязева АН СССР

Заи(ита 'Диссертации состоится " г.

в " " час.» на заседании Специализированного Совета по присуждению ученой степени кандидата наук ис 002.96.01) а Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР 1117071» Москва, В-71, Ленинский пр.,33, корп.2) '

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литература АН СССР ионинский пр., 33, корп.1)

Автореферат разослан

»С " ^ 1979 Р.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

II. К. Молчанов

Актуальность проблемы. «Одном »а няи«пт» п^риу „р»*,.,... _ стоящи ь настоящее время перед-человечество«, является недостаток белка,-»..Ревагцвеусловне необходимое:для синтеза белка, -обеспечение растешкГвзото«". ДКретович, 1972).

: Присутствие азота.в питании-растений*оказывает существенное влияние.на интенсивность фотосинтеза, аа качественную направленность обраэуюоихся продуктов, приводит к увеличению синтеза белка и ек-~ тнвностк ферментов ^«синтетического метаболизма'углерода. Интея-сяввость фотосинтез апрм азотном питании зависит как от количества к форм«:азотистых соединения, используемых.растениями,,так й от объекта исследования. '

Волоснац чомкокодосник) ситниковый- "Бозойскиа" б1^виа (рваь-Ьлшь&с^в) ^и&сеив. - одна из самых перспективных-пастбищных: трав, , кироко внедряемая в настоящее время для улучшения малопродуктивных, сенокосов, пвстбиц и освоения солонцовых земель Казахстана. Увеличении продуктивности*этой культуры придается большое значение в связи с далневиим.развитием хивотноводстве, в частности».овце--■водства, поголовье которого в республике в ближайшие годы планируется довести до 50 иле.

Продуктивность растения, зависящая от интенсивности и направленности фотосинтетического метаболизма, определяется в своп оче-, редь ахтивностьп рибудозоди{осфаткарбоксилаза (,РДЭК) - ключевого Фермгнта восстзназитедыгого пенгозофосфатного цикла1ВПФЦ), являвшегося самый распространенным белкой в природе. В определенных условиях фотосинтеза. проявляется оксигеназкая функция этого фермента, в ре эстете .чего происходит необратимое окисление рибулозо-1,5-дя-фоС^ата 1РД5) до фосфогликолево» и фосфоглицериновой кислот В связи с регуляцией фотослнтетического метаболизма изучение физико-химических свойств, молекулярной организации РД1К - оксигеназы является весьма актуальной задачей.;

. Цеяь и задачи иссле^озастя. Цель» данной работа является исследование фотосинтетического метаболизма углерода в листьях волоснеца ситникового в связи с цовьшением продуктивности культуры. Исходя из цел» работы, были поставлены следующие задачи: 14

- изучение особенности путей включения 14С из "с^ в продукты кратковременного фотосинтеза волоснеца ситникового, выращенного на различных источниках азота;

. - исследование влияния различных источников азота на биоката-

датическую активность ферментов: [углеродного, «атабоозиа;

¡. .. ..

{■ Г.».*,.л I., -

-изучение свойств молекулярной организации н.четвертичной структура РДФК - оксигеназы -"'клячё во г о'^Фе ри ё н та: фот о си нте за волоснеца ситникового; ■ ~' ': ^ * ''" - '"■"■"...■'

" Научна^ новизна' работы. Изучение'зависимоста фотосинтеТиче.ской ассимиляции ^COg листьямиволоснеца ситникового и активности ряда фе ¡ментов фотосинтетического метаболизма углерода в экстрактах из ■ листьев волоснеца ситникового, выращенного;на различных источниках. азота иквимолярные количестве),' показало, что 'ему они я ныв соли и, особенно,'мочевина по сравнению с нитратаии и контроле« вызывают ускорение и увеличение включения из 14С02 в органические кислоты, аминокислоты и повышают активность' ферментов,' При''выращивании растении на мочевине по сравнена» с нитратсии и контролен содержа-■' ние бэлкз. в,листьях волоснеца'ситникового и, прежде всего, РДФК--оксигеназы увеличивается в 1,6 и З.О роза, соответственна,

В результате проведенных исследований разработай новыаспособ очистки. РД5К-оксигзназы, позволяющий получить в препаративных количествах высокоактивный гомогенный Фермент из листьев волоснеца ситникового. Разработан полярографические метод определения океигеназ- , иои активности íД-5К-окси га н азы . Показано, что гомогенны* фермент- . кш! препарат обладает наряду с оксигеназной активностью и кврбокси-лазиоа активностью* Установлен молекулярный:вес (¿ермента и лпреде~ . лев вчинокаслотнии состав, исследована четвертичная структура.РДФК-оксигеиаэы. При этомпоказано; что иолекула фермента состоит.из двух видов субъединиц*- восьшг больших IЬ ) и восьми палых Л ^ )., Определен молекулярный вес этих субъедяниц.;В результате'электрон-' нодокроеконического исследования методом трехыерноН реконструкции построена иодёль РДЭК-оксигеназы. Обнаружено, что структура моленули двухслойна, каждый слой состоит из четырех' La димеров, расположенных с симметрией 4¿,по вераинви двух квадратов, повернутых друг относительно друга:иа 40° вокруг обод« оси 4-го порядка,- Модель РД-5К-оксягаиаз11 из листьев волоснеца ситникового существенно отлкчзатса от "первой" «одели': рдьк и» листьев табака.

арготическая ценность работц..Полученные в работе данкые .углубляют наши знания о влиянии различных источников взота на состав и дин анику накопления продуктов фотосинтеза, на активность фериев-тоэ фатосйн;утмчосного метаболизма углерода и содержание бедка листьях волоснеца ситникового.

?эзраЗотаиный способ выделения в препаративных количествах royo генной PüíK-оксигеаазы из листьев водоезеца ситникового наряду с

получевными нами сведениями о структура я свойствах этого фермента вносит.-также определенный вклад в развитие фундаментальных исследований б области энзимологии.

Апробация работы. Основные под сияния диссертации доложены и озсуждекы, на: • .

- 12-ом Научно-координационном,совещании и симпозиуме по теиз: "Изучение первичных и вторичных продуктов фотосинтеза и их метаболизм в растекиях", разрабатываемой СЗВ» Прага, 1976;

-Конкурса на лучшуо научную работу Института биохимии ни.А.К. Баха. АН СССР, посвященном 60-летию Великое Октябрьской: Социалиста-ческоиреволвдии, Цосква, 1977;

.. - Совместной заседания лаборатории фотобиохимии и лаборатории автотрофной ассимиляция углерода Ордена Ленина Института биохимии ИИ. i.К.Баха АН СССР, Москва, 1978.

, Публикации. По полученнымрезультатаи.исследования опубликовано 10 работ.

OJbejfjJaíOTM. Диссертация состоит из введем», обзора лиГерату ра, экспериментальной части, выводов; изложена на 144 страницах машинописного текста, содержат II таблиц а 23 рисунков. Список литературы вклнчвет 280 публикаций, яз них 57 отечественных я 223 зарубежных. .

: МАТЕРИАЛ И ИЕТОДр! ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования является волоснец (.локкоколоскжк) ситниковая "БОЗОЙСКИЙ* üljKua (peatbjroatactos) junceus -многолетний злак, селекционшй сорт (.Векмухзмедоа, I975Í, районированный в 16 областях Казахстана яа площади более 30 тыс.га. К концу десятой пятилетки площадь под посевам» этой культуры планируется довести до 100 тыс.га. о

Волоснец ситниковый выращивала в оракжерееЛ23-25 С) при естественной освещении, в водной культуре. В основу питательных сред взята смесь Прянишникова с добавлением микроэлементов и различных источников азота: кко3, ин^ко^, (кНц.^иро^.,(ннг )гсо в зквлио-лярных по азоту количествах 16 ниодь - 84 мг на литр).

Контролем служили растения, выращенкие на той же питательное среде, за исключением азота. Величина рН всех сред 7,0. В дальнейшей работе использовалась листья 2-х недельных растения.

б

Интенсивность ассаиилгдии углекислоты -лвсЕ>яаи волосяеца ситникового изучали изотопны» методой. Углерод 14с П0РЛ0Щ8ЛСЯ ЛИСТБЯ-иа а веде газообразного Экспонирование листьев в атмосфере

с ^4С02 проводили в течеаие 5,15,30,60,120 секунд. Фиксацию опыта о^ го материала проводила кипядаа■ОД этанолом в течение X ими.

Ранние продукты кратковременного фотосинтеза-определяли методом двумерной восходящей хроматографии .аа бумаге ^Володарская типа "медленная" 32x43 см>. Локализацию радиоактивных стабильных продув тс» определяли путем совмввдния хроматограмм с рентгеновской пленкой BI-I, Рт-1 или Agfa ноentgenfiitnfabriic 41ДР). Радиоактивность каждого:пятна на хроиатограмме просчитывали с поиощьо торцового счетчика. .-'

Для зязимологичесюих исследования использовали бесялеточные экстракты из листьев волоснаца ситникового. Для этого определенную навеску листьев растирали в фарфоровой ступке в 5-кратном объеме 0,06 U трис-НИ буфера, рН 8*1, содержащего О,W М MgCl^ ,0,01 Ц дитиотреитолЛДИ). Полученный гоиогеяат фильтровали через полотно х центрифугировали а течение 30 шин, пря ЕЗОООе- • Супернатант V экстракт) использовали для определения актива ос та ферментов. Все вышеуказанные операции проводили при 2°С. - •

Определение активности ,карбоксилиру»щих ферментов проводили радиометрическим методом Проханова с сотр., 1968).

Активность ржГозо&)С$атиаомеразы (,КЙ) (. Axelrod, laag, 195*) и фос$орибулокинбзыЧФРК) (.Hur-wita, 19бй), определяли ко л ори «е.уи* чески в модификации (.Ромаяоза с сотр., 1Э73). Активность ЗД$-о:ся-ганазы определяли-полярографически llioriu^r et al. ,1975 J- Актггъ-ность НАД- и ЩДО-малатдегидрог&наэа (.НАД-ВДГ) 1 Octoa, 1955* J и глицеральдагидфосфатдегадро^еназы ЧНАДО) НАДО-ГАФД 4 Нвьег- et «1., 1963) определяли ка спектрофотометре таи г •по окислению восстановленных фор» НАД а ВДФ. За единицу активности фериепта принимали количество фермента, катализирующее превращение! мкмоль субстрэ-те за I иин. в условиях опыта;, удельную активность выражали числом единиц-активности aa l ur балка. Определение белка*в растворах проводила по методу ДоуриЧЬокхз al., 1951).

Очистку РДФК-оксигенав» проводили по специально разрэботанноыу нами способу. Способ получения рибулозодифосфаткарбоксилазьг-оксиге-пезы заявка на изобретение 2533758/04 о* 9,08.77« рзшэние о выдаче авторского свидетельства от 24.02.76. Определение ашшокиолотяого состава в шдродизатах белка проводили на аминокислотном анализэто-

ре4101-^ ^Швеция) ^»ск-эдактро^рв^.в 7»5?.поли8«рнлададно« ге-. ле пр« ра'8,0>оли во методу Дззиса С СауЧу ,196+ ). ' Разделений гомогенного балка ка сувьединицы проводили по методу Каватина ци—*'

, \уИйаап,1971 }. Седимеитационкий анализ'.рдфк-оксагепаэи для. проверки гомогенности Ферментного препарата'и определения молекулярного веса проводил* методом седамеитационного рЛновесия втон-вомслое о прииев'ениеи'тгкмой оптяяил±а±лэ,' 1961. { Воуэн, 1973) .». аналитической ультрацойтрифуге^рШсо,, ;иодэль к1сша1. Спыти- ' '»ели.в аналитическом ротор© типе ли-о и,ли-а.

. Здектроинва микроскопия,^ Препарат гомогенной рдФК-оксягеназы. 10,5 «Г (Золка »1 мл 0,025 >1 трис НС1 буфера,.рН 8»0) исследовали в электронном^иикроскопе 1ш-юо'ь Л Япония) при увеличении 50000 и ускорявдем напряжении 80 кв*. Негативное контрастирование осуществляла -8Л-иии ра ста ор ои 'у ре нил эцз г зга. . ...

• результат» иссладшюй '■■" ■/

- Фотосиитатачеекая-ассимиляция"^СОя' листьями волосаапа ситникового, выращенного на различных источниках азота

В настоящее время известно, что кинетика состава кратковрзкен-ных продуктов фотосинтетической ассимиляции СО^, как правило, отражает характер обиена веществ растительного организма (.Домая, 1958; Домак, Ваклйяова, 1972). .:

Исследование вклячвнйл 14С из "С02 в состав стабильных продуктов кратковременного фотосинтеза волоснеца ситникового показало, что 95-97? ассимилированного ^С обнаруживается в спиртоводорзотво-рииой фракции» Кинетические опыты показали," что с увеличенной времени экспонирования листьев волоснеца ситникового в присутствии -' 14С02, радиоактивность стабильно продуктов фотосинтеза увелзчиаа-' етсн пропорционально времени, тем сама« отражая наличие условий в данном опыте. Слизких'к условиям стационарного фотосинтеза.

■ Идентификация состава стабильных продуктов кратковременного . фотосинтеза листьев волоснеца ситникового, выращенного на различных источниках азота, показала, что сравнительно за короткое время 15-120 сек), 14С включается в состав различных органических соединений 1табд.1), среди-которых фосфоглицериновая кислота 1<5Ш, фосфорные -эфиры'Сахаров 1ФЭС), свободные нефосфорилироаанные сахара, органические кислоты и'аминокислоты. Во всех вариантах оиита при 5 сек. экспозиции основная масса 14С 175,844,6% от сЗдая радаоак-

в'. 7; •'•?;'

тивности) обавру*ив89тся в *ГК ж ФЭС; радиоактивность котогых" \ уменьшается с увзличааиби вреивни экспоэиции. Такии^бразои. пра . -кратковременной фотосинтезе - листьев "волоснеца;ситникового основная иасса ^С включается» прежде всего,: » продукты ВПвц; ; '

Постепенное уменьшение радиоагаиввостн мих сое:дане1га1г с-увеличением времени экспозиции отражает,первичностьих образования;:

Эти данные поэводяют отнэсгиволоснецситниковый к растениям-с "С-3" путем фотосинтетического метаболизма углерода,- ключевым-

которого является1РДОК» - ' ТА .".'■', '

При взотнеи дефиците^ основная масса также обнаруживается; а ФГК и ФЭС а фосфоенолпнрувате (.ФЕП) .йхнеко следует отметить^ что ' наряду с фосфорялированными сажарвмя эначиельныа процэнт ^С ввлю-чается в нефосфоралвровавныв сахара* радиоактивность которых представлена в основном.сахарозой»,Увеличение синтеза нефосфорижировав -рих Сахаров приазотном дефицита отмечается и у ряда других.: растений 1 ТоД.ьёгС,паев¿1966» Неишш, ,196б( - Андреева, 1969; .Карпилсо, - : 1970; 11аслова, 1970). Это явление можно объяснить, как следствие ограниченного оттока метаболитов ВПФЦ на синтез.органических квелот. ' и аминокислот принедостатке азота в питании растений.-

Что касается органических кислот и еминоквслотЧтвбл.1), то образование их'происходит, возмохно,путои рада ферментативных превращения ФПС и. ФЕП и особенно связано с карбоксидированием ФЕП.По-видимому» путь вторичного карбоксилировении в метаболизме волосне- . ца ситникового имеет больное значение, о чем свидетельствует значительное включение ^ в ФЕИ. .

Органические кислоты представлены в:основном яблочной и лимонной кислотами. йа хроматограммах-обнаружены следы фумеровои'и интар-ной кислот; Незначительный процент вхдючения*4С в органические кислоты при кратковременном фотосинтезе листьев волоснеца ситникового обьясннется тем, что эти соединения не накапливается, а постоянно расходуются на синтез аминокислот в реакциях аииниравапия ' и пгресанирования 1Кротоьич, 1965). Следует отметить, что отсутствие езотэ в питании юлоснеца ситникового остро сказывается на синтезе оргэзичеекмх кделот.'праэтоа включение1^ в эти.сосдинекап практически не происходит при всех экспозициях. ' ; ' .'::■

Анализ теблицы'1 показывает, что при кратковременном фотосин-' 163« 'С включается в состав нескольких аминокислот, радиоактивность кагор;* вирежгкнья з процентах зевлса? кех от варианта опыта, так а "

вренави вксяоаиции:. оС- алааяк;18,0-30,(#), аспарагаковзя кислота

серив ♦ глицияЛ2,5-5,С^>, глутаминовая41,1^4,5^).-Радиоактивность!аминокислот увеличивается*с увеличением времени экспонирования и одновременным уменьшение« в ФЕП, тем самым отражая сопряженность метвболизйа.этих соединений; Особенностью волос-неца ситникового^, пря:кратковременном фотосинтезе с 14С02, является высокая-радиоактивность оС-аланина.'. Синтез. «с-а лани на происходит в результате восстановительного ¿минирования ОЕЛ (.ос!разовая»ого из ФШ 1Кретович,.Бундель,Х948),-радиоактивность которого у волосие-цаситаакового,квк выло ухе отмечено, значительная. Кроме того, Ф ВДиохе тле гкоги дроги з овать свдо свободной пировияоградной кислоты 1ПШО ^ в-результате аереакинироввния которой также образуется

«¿-вдвиияЧ йЪврка «Ъ ,а1., • • . «с- аланин •

ч ■■ , ,* V Л ПВК ^^С- аланин.'

ФПС выступает в роля^близкого предшественника; не. только при <*ото-сннтетяческон^ образовании «с- аленнка, но и при синтезе серин + гдщиН'ЛСедиванова, 1966),;радиоактивность этих соединений у волос-вецв ситникового обнаруживается-уже-»-первые секунды экспонирования

Среди продуктов кратковреиенногофотосинтеза листьев волоснэда "адтннкового идентифицированы аспарагаяовая и глутаминовая кислот, которые:образуются путем.восстановительного аиинированяа. ссютвет-ствукдиг хетоааалогов лНретовжч-с сотр., 1565,1969)'. Включение 14С в вспарагжковув кислоту происходит уже при 5 сек., незначительно нарастая с увеличением экспонирования листьев в присутствии *С02. Результата налах исследований'показывает, что образование глутамк-новой кислоты происходят позднее, чем синтез «¿-аланина и эспара-.гинобой кислоты* Более низкий процент включения 14С в глутаиииову» кислоту свидетельствует об интенсивных реакциях ее переаминироваяия .с другими метаболитами ЛКретович, 1961).

Работами рада авторов к £ддреева, 1969;

Карпялова, Ыаслова,-1970; Андреева с сотр., 1971) установлено, что синтез, белка в хлороилзстах зависит от обеспеченности растений азотом;: •

Положительное влияние азота на синтез белка-в листьях волосне-ца ситникового наблвдается во всех исследованных нами источниках азота; В присутствии кно5) кнчко^1 (ш4;)2нр04-1 (ин2)2со . содер-

•.. ■. - ■ ■ >..-.- ■ ' ТаАювда I -

.'." Распредаланйё С14 opa фотосантетаческой ассмишщ a лясгьяка ролоснеца ситнакоюго ■ (в % от сушарногоколичеотва радиоуглерода меченых соединваий, обнаруженных на хрсвдтогрэкме),

l ; [йои,сек.j.. . j . i ¡ ( . | i - ¡ Ta j" ТЭ í [НвшЯ

HH^VUj 5 35.0 3410 6.4 4.0 ; ■ Т.О. '10.8 2.4 2.4 3.5 - ^ - ■

Шз

5

. 15 30 : 60 120

5

..... 15

■■=■■■.■■ ■.■■.. - . 60120

■■'IVB4Í3HPO4V -5'

л" • ' ' ' '30 . 60

.-:'■ 120 jS

30 60 ' 120

Контроль • 5 без : ,15 азота 30

.' 60 .120.

. 35,0 34,0 6,4

30,0 28,4 , 5,1

25,0 .37,0 3,1

23,0 26 0 3,0

XSÍO ' 14,0 2,2

24,0 42,2 ' 8,6

4,0

4 5 3,2 6,0 6¡6

25;Ó 45;O S;4 : Í'I

; 25,3 44,0 3,8

. 26,0 40,6 3,6

28.7 30,0 2,1

28.8 39,3 3,2 18,8 46 3 " -21,8 35,2 II 8 29 1515 726^3

11,6 33,3

13 9 34,1

19 2 31 3

19,5 28,6

13¡2 : 26,1

35,5 40,4 3S,0v '35,1

37,? 25,6- 16,8

33 8 17,0 10,7

30,2 13 6 5,9

4,0 5,3. 5,0

. - 4,5 4,0 5,0

5,0 6,0

5 2 , 5,0

7.4 .4,0 3,4

1:8

I5;í ■ 12,4

7.5

8.6

7,2:

7,0

5 8 8,0 8,5

0,7 0,3 ■1.0 1,7 2,0

■>-■>'1:8 ; 2,4

: 1,3 ,21 " 2,6 3,0

. ■ 3,2

.1.6 2,0 : .4,0 . 4 0. 4,5

M

6,3 1,1

6,2 . . 2,0

1,0. '10,8 2,4 2,4

1,2 20,0 2,0 2,2

,1,2 12,0 2,8 '2,3

- 2,1 20,0 3,6 3,0

2,4 29,0 4,0. . 3,5

8.5 2,7 2,0 6,0 2,0 2 4

7.6 2,7 3,5 .5,5 1 5 8,8 3,4 • 3,8.. 2,0 - 3 O

12,0 4 lo 5,0 2,0 6 *5

8,0 4,4 3,5

II 6 3,2 2,2

12,0 4,2 2,8

16 5 4,7 . 3 6

21,0 4,0 4,2

30,0 .3,2:

29,0 3,0

26,0 3,7

24,0 3,0 .26,0,. 5,o

4~,i 3~,2

3 2 ЗД 5,0 2,3

4 9 3 3

0,5 0,8 1.0 1,7 2,3

3,5 —

3,0 3,6

3,5 4,2 2,7

3,0 6,4 3 9

з;о,ioto е;з

.0.4. 0,7 1,2 1,7

5,0 - 2,0

5.5 1,3

5 6 4 8 -4 7 .11 0 2,6 •5,0 4,0 , 3,2 .

4,0 - 1,9

4,0 2,2 -

2.6 3,0 2,0 4,9 3,0: 5,0

-

: - ' 8,4

- 12 4.

- 21,8 2,0 30,0

.1,7 1,4 3,2 0,2

S~7 7,0

жавие растворимого бедка в экстракте на I г сырой биомассы листьев увеличивается-в 1,2; 1,6; 1,8; 2,0 раза, -соответственно, по сравве-ввю с контролем.> •

Различные источника азота, особенно мочевина, существенно влияет на.фотосиктатическиВ;мвтаболизм:углерода, направляя его в сторону синтеза аминокислот и белков на них образущнхся.При этом следует отметить, что включение 14С в «с-алания 15-120'сек) в варианте hh^ííOj и (кнз составляет соответственно 10,8-29,055 ■ 30,0-26,056; в то время как, в варианта кж>3 нкоатроле - 8,512, Oft и 4,4-4,356..Столь ярко выраженная зависим ость содержания -аданика и белка при выращивании волоснеца ситникового в а №г)2С0 и hh^kcj отмечена впервые и, по-видзиому, пожат считаться характерной особенность» этого раставка.

Влияние различных источников азота да активность Ферментов фот о синтетического метаболизма углооода волосме;;а ситникового

Известно, что фиксация углекислоты растениями осуществляется в реэультате-последовательяого действия.трех.ферментов ВП5Ц, РФИ,• ФРК.Я РДЯС I, Gut^le et el*. ,1964; Weiss dach et al. 1954 ), или "фазы карбоксилированая'" как принято условно называть этот участок ВПФЦ. •

•Наблюдаемое включение Н rCftj экстрактами из листьев волоснеца ситникового в присутствии Р5Ф ■■ Ай в кислотоустойчивые продукты реакции свидетельствует о функционирование РЭД, ФРК, PJftK в-листьях ' этого растения. .

В дальнейшем нами определена активность каждого фермента ^"фазы карбоксилирования" в отдельностиДтабл.2).

Суммарная активность ферментов "фазы карбоксилирования" волоснеца ситиякового несколько нижа активности РДОК, несмотря на то,: что для реакции фиксации fí^COg в присутствии-Р5Ф и ATí тщательно были - подобра ни ■ опта м аль нке'у словия. "

Цаксимальная фиксация исходными: экстрактами в присут-.

ствии Р5Ф и АТ5 достигается при содержании АТг-0,5,мккодь и P5Í -0,6 ынмоль на I мл ферментной смеси.. Линейность реакции сохраппет- ■ ■ ся до содержания белке 0,12 мг на I мл ферментной смеси в тече.чао 4 мин.

' : ' ■ РФ'Д волоснеца ск?никояого обладает наибодыаей активностью . 1Е70Э-ЗШО ед/мг белка) по сравнена» с другими исследованными <|ер-

иевгами "фазы карбоксидирования". Ливайность раакцииобразовения рибулозо-5-фосфата сохраняется до содержания бедка 0,5 иг в присутствия 10 икиоль Р50 на I ил ферментной смеси в тачевие-4 мин,

Активность ФРЙ - фермента, встречающегося лиаь.в ВПФЦ, .ниже активности РЭД, однако выше активности клвчевого ^ериента ВПФЦ-РДФК.

Таблица 2 ■' , ■ ' Влияние различных источников азота ва активность У ферментовл«Е/мг белка) в исходных экстрактах.во-лоснецв ситникового ."■:;■'

Ферменты

: Источники азотного питания

¡контроль ¡KJÍOj ] NH4ífOj j(HH4-)¿HPO^ J (Ш^ >¿co (fiaros) i___L_' ' } "• "

"рдфк u»i»i.s9) Суммарная активность. рфй, «pk» рдфк

рфи д5.эл.6) -

фрк u.7.i.i9í вдф-гафдл1.2.1.13) фепкч4.1л,а1>' • ш u.i.i.32) : фешс 14.i.i.33) над-юг u*i.i.s7) надо-ыдг

250 482 Í 670 . 612. 701

170 300 440 420 . 472

1840 2709. 2660 2660 ^ 3060

4(6 . 720 900 1035 1282

706 900 . 915 895 ' 966

; 114 140 204 194 ,236. ее обнаружено не обнаружено

924 1910 3015 : 8074 3050

• . не обнаружено ". :

Скорость реакции образования рибуло80-1,5-дифосфата (.РДО) при концентрации Р5Ф-20 мкмоль составляет (.720-1282 ед/мг белка) в постоянна в течение 5 мик. да содержания белка 0,5 мг на I мл ферментной ■ cueca.

Следует ответить, что РДФК в экстракте из листьев волоснеца ситникового обладает более значительной величиной удельной активности 1482-701 ед/мг белка), по сравнению,с РД5Х в. экстрактах из друлах "С-З" растиниа IАвдеева и др., 1974; Карпилов с сотр.,1976). лакзякость' ¡мэкцци образования Ч2)3-4ГК сохраняется в течение 4 мин до содержания белка 0,07 мг на I ил ферментной смеси.

Как еилча \таЗл,1) различные источники азота, присутствуовив з золосявца ситникового в очень "значительной степени увела-

чивавт как суикарну» активность 3-х ферментов "фазы щрбонсклирова-ния", так и активность каждого фермента в отдельности. При это«, как показано вьша,-резко увеличивается я общее количество этих ферментов за счет увеличения растворимого'белка в экстракте.

Наряду с ферментами "фазы карЗоксилировакка" нами, бил исследован фермент "фазы восстановления" - глицеральдегид^осфатдегядроге-наза 1ГА$Д). Определенная по прямолинейному участку кинетической криво* величина активности НАДФ-ГАФД - одного порядка с величиной активности РДФК и составляет 903-9G6 ад/мг белка. При этой следует откатить, что присутствие.различных источников азота в питании ио-.лоснаца ситникового незначительно влияет на активность этого ферме»-та. t ,■

. Следовательно,' :при азотном дефиците "фаза карбоксилярования". ВПФЦ испытывает большее угнетение, чек "фаза восстановления"..'

V В экстрактах аз листьев волоснеца ситникового было обнарухево / вкличевие-*в присутствии $ЕП в продукт реакции, что свидетельству«»: о действии ФЕШС - плечевого фермента.при фотосинтезе у "C-t" растение. Постоянство реакции образования чавелевоуксусаой кислота 4EííCÍ,..продукта карбоксидировакия ФШ1,:сохраняется до содержания белка.0,15 мг на I мл ферме а та о а смесив течение 4иин. Активность ФЕП2Л140-236 ед/мг белка) волоснеца ситникового лишь в три раза ниже активности РДФК и близка к активности ФЕПК кукурузы - "С-4*" растения йарпялов я др.,/1976).

В связи-с высокое активность» ФЕШС, являющейся вторым по значение карбоксидируоцим фервентом-листьев" волоснеца ситникового, ' важное значение имеет дальнейшее превраяение БУК* Активность КАД-VSÍ"» фермента, метаболизирувцзго ЩУК, оказалось довольно высокой и примерно в з раза выва в.листьях.волоснеца ситникового, выращенного на мочевина по сравнения о контролем.

. Анализ полученных результатов Лгабл.2) укаэнваэт на весьма существенное увеличение биокаталической активности ферментов фотосин-хетяческого метаболизма углерода листьев волоснеца ситникового, выращенного в присутствии эквкмоляртяс количеств кно^, hh^no^, (кВ4.)йКро4 в, особенно мочевина, по.сравнении с контролем. Актив-'ностъ НАДФ-ГАФД в основном одинакова во'асах вариантах'опыта, т.е. практически-не зависит от источника азотного питания.

Азотное голоданивЧконтроль) в первую очередь отражается на работе ключевых ферментов ВЕЩ: РД5К и ФРК и особенно остро сказывается на работе НАД-МДГ.

Результаты энзимологических исследовзний^волосаеца ситяиково- . го свидетельствует о той,, что это растение обладает исключительно высокой активность» РДФК и ФЕШС в. необычном соотношении их активности.

Здесь уместно отметить," что характерным соотнооеняе*гактивности РДФК и СВПК-для типичных растений"С-З" и "С-4" типов считается например, 15:1 и 1:6*.'соответственно (.»llliaas et al.,1977) в то время,как для волоснеца.саткикового оно составляет 2-3:1.

Свойства и четвертичная-структура РЛФК-оксигзнвзы■-ключевого -тюраента Фотосинтеза водоснеца ситникового

Радиохроматографический анализ:продуктов.кратковременного фотосинтеза и энэимологические исследования волоснецагситникового показали, что основным механизмом. ассишляции.С02 у этого.растения -.является ВП$Ц-ключевоа:фврменг которого РДЯС.-РДФКЧКФ4.i;ii39)-. иа только самый: распространенный белок, в' природе, - нои-исклпчитель-но интересный бифункциональный фермент. РДФК -оксигеназа яатали-.лирует карбоксилирование и'его.окислеяиа ^ ЬоПшегес: al.,19751 Badges, Andrews,. 1976)."При 'проявлении:соответствующих;функцнвэто-го Фермента С02 и 02 взаимодействует:по принципу конкуренции^ субстрат реакции РДФ.

р СО- РДЬкарбоксилаэа: L Og РДЗоксигеназа ^ ♦ фосфогликолат

Иолекулярнаявструктура и^ свойства рдак^оксягена!эытВ-аначителв-

noit степени зависят:от объекта.;Молекулярный,вес,фермента* подучея-ного из различных источников, колеблется в пределах 580000-480000, ЗеОООО,-114ООО ^.tfci&dden, 197>: ( Романова,Л974). Уолзкула РДЗК-оксагеназы эукариот состоит из 8 больаихЧ L ): и. 8 малых Ч s ) субъе-дивиц,. а.у прокариот - из 8L . а 6-1 OS илигтолько из Ь субъеди-иац V Н„-«а *t al. , 197 V).

Учитывая важное значение РД?К- оксигеназы,/недостаточную -щу» изученность, ильную зависимой, актавности,:от Олрмы. азотного, питааан и значительное изменение свойств от объекта, мы исследовала1 свойства и структуру РДИС-вксагааоэв,.. ¿уделенного аз:листьев?во--досягца сатаккового.

IS

Прежде всего,-ваии'бал;разработан, способ;очистки;я;выявления гсшогенного ферментного препаратагвз;листьев/волоснеца ситникового,-

Процесс очисткя-РЛФК-оксишназы иэ листьов волоснеца ситникового: представлен в таблицв:З.Всв-процедурц очистки; проводились при 2°С.

Очистзу проводилапутеиосвоСЕожденияакстрактаог патентов и клеточных структур» путем центрифугирования и гель-фильтрация;через Г-50,, осаждения нуклеиновых кислот:стрептомициасульфатом,. тщательного: фракционирования белков Ч в:дальнейшей гель-$идьтра-ции- ва Г-200.

.. Таблица 3

Очистка РД? К-оксигеназы■из листьев волоснеца сатвикового, диоходныа.ыатерааи -100 г листьев) '

. icOase ! Активность .Выход ¡Степень Стадии.очистки- /роли- ¡удельная,! иощая,. { по ¡очистки

/.■.» . вд* ¡белку,.]

I I

_ I_I__

Экстракт: после г £3000«; I2IO; 0,160 96,8 100 1,0

Сефадекс Г-50. 1164 0,174 97;в;

Осаждена».стрептомицин--- -. .-.

сульфатов 1005 0,177 97;г 83,09

(HH4)¿S04 35* S89 • ' 32,95

(N^so* 216 0,978 52,8-. 17,79 6,1.

Сефадекс Р-50' 200' I6¿59;

Свфадеко Г-ZOO : .168 2¿4S \ 100,45 13,89 15,3

; На рисунко1.пЬкаэаяа вослвдняя:стадия очистки фермвята.с по-«оцьо г9ль-фальтрацйЯ ! на Г-200. Белок выходит ' узкой^зоной¡с: однии сииметричныч>пиком во^фракциях; к 35-43. В: результате такой очистки из.1(Х)'грэич;листьев волоснеца ситникового удается выделить до 168 мг гомогенного ферментного препарата,, очищенного в 15 раз с ва-хэ дои.'белка 14%.

Гомогенность ферментного:препарата подтверждена сединентациоы-ным^аналнэок 1рис.2},-диск-электрофорезоив пола акрил омидн ом геле - I ри с. 3).. Кри те раем! чи стота РДОК-окса ге я азы служи т также отсутствие фиксации Н1'*СОд Фер«аатнш;препоратоа в присутствия PS5 к АТ5, так как известно, что особенность очистки-заключается в трудности отдо-

л

: Рие.1. Ляьфиьтрацня РДОК-оксигенаэанасэфадексв, Г-200; кривая - выход бедка; столбики - удельная актив- ■■ иость РД$К.,

I" ;

Рнс.2. СздаментационвыНаналиа - препарате РДФК-окситеназы, вэ листьев валоспеца ситникового. Зависимость ,

от х2 *,\гдв С - концентрация, х - расстояние от оси вращения» ■ ■*•■.'■■.''■'■:■

Рис.3* фск-злвнтрофорев РДН-оксяганаэы из листьвй воло-саеца ситкикового в 7,3 подиакрилаыиднои -геле.

лэаиа РдМС-окси гваазы от тесно сопутствующих ей ферментов РФИ в особенно ФРК исШго; ОЪ а1., 1968 I Романова о сотр.; 1973)

' ■:физико-химические свойства РДФК-онсигеназы ■ . из листьев волоснеца ситникового

Катадштические Функции Ферментного препарата.РДЬкарбоксадааа.

Максимальная карбоксилазная активность гоаотонкого фермента, определенная во фракциях К 35-48лрис.1), составляет 3.45 ыкиоль СОд» фиксированного за 1инн. на I иг белка при рН 8,0и 30°С 13*43 ед/мг белка и соответствует "числу оборотов" этого фермента, которое равно2,2 моль СО^, фиксированного каталитическим центром на моль субъединиц в сек. Эта величина близка для гомогенной РДФК тЫоЬ&сШиа (ригоЬ1Ъ «Ъ «1. ,1976) .'.'■ на сколько вше,

чем для РД$К шпинатаЛРв«18вп»1'ап«» ''9в6 ). Гомогенный фериент-нвЯ препарат (2,6 иг/ил) практически не теряет карбоксидаэнуо активность в течение 3-4 недель при 2°С и 5-в месяцев пряЛ-гсРО в 0,025 М грвс НИ буфере, рН 8,0, содержащей 0,01.11 МвС12» 0,01 Ы ДТТ.'ревулыаты-эмх исследований представлены в таблице 4. .'■•

/.,".'■,-; . Таблица 4

Влияние способа гравеняя ва активностъ РДФкарбоксиаази '■Л'"'" ■ . иг листьев волоснеца ситникового

■ фермент ■ ■ Т 1 1 Способ хранения ¡Удельная актив- . (Вость,ед/мг бел— |ка

рдфкарбоксидеэа * 1 сваяевыделенныЖ разнорешенный после храпения в течение 5 месяцев про (-200 лио$идизироэанный 2,45-2,50 ■ 2,20-2,30 ' 0,04-0,06

РЕФоксигеназа,- В определенных условиях фотосинтеза проявляется оксагенааная функция фермеита, в результате чего происходит необратимое окисление РД5 до ФПС и фосфогликолевоА кислоты воч»^ в* а1. "197а'( Дд4гв«в ей а!., 19?5)-

В основу определения активности рдаоксигенози положен метод Лоркаера и др. I х.ог1ювг еъ ах. ,1975 > в'некоторой кодификации (.Русинсво и др., 1978).

Иаксимальная удельная активность РД^оксагенааы из листьев ко-

ео сне да ситникового равна 0,05мкмоль.02,<{«ксироввшшгаза1 т. за I иг балка при-рН-9,4 я 25°С.~Есть данные,, что активность-РДФ-оксигеназы ИЗ листьев'шпината, - СЬгота*1ил <Та1саЪв, Дкагаяа, 19 ?6 ), И Н1ю(к13р1:г111ит гиЬгии. ( Еиап «1; ей. ,1974 ) составляет 0,03; 7 0,08; 0,01 икиолъ в I мин. на 1мг белке,г соответственно.

РДФОКсагеназа ^оодеркание белка - 2,5 аг/ыл) из листьев волоо-кеца ситникового.подобно РДФсксигеназе из- листьев; шпината, табака, и бактерии Шос1овр1гШ.1ж гиЬгит ( Вуад «« 197Н ТакаЬе , Акаа'а»«, 1976» ЬоПтег et в1. ,1975 ) ■ теряет 40-50£ исходной-окси-гиназной активности при 2°С по крайней пере через двое суток.после ее выделения. При храпении, фермента в течение 3 месяцев ^при.-20С) активность РДФоксигеназы уменьшается также на 40-50%. Оцнаконегра-вевка ферментного препарата в присутствии 0,01 М Не<яг и 0,01 и ДТТ восстанавливает активность фермента с лучшим-результатом при. 45°С в течение 10 кик.Чтабд.5).

■:'■■". ■ ' Таблица 5 .

Активность РДФоксигенвга (нмодь в I иин— на I мг белка) из листьев водоснеца ситникового яри различной концентрации Р1£ и.0,71 иг белка в реакцяовной скесиЛопределение активности РДФоксигенаэы проводили после нагревания,ферментного препарата в различных условиях)

---j----—--

Время нагрева-¡Температура, | ' Концентрация РДФЛикмоль)

«и« ЪШЧ. I - Л-. I------- ■ -_

вия, мин. i .V 1 | o.s i I ! •I v

10 '■■."■' 45 ' 8,6 "•. ' SI,I . 20,6 6,3

3. . . 50 . - '■ 23,3 16,0 ' 3,1

5 50 S,3 2I»0 16,2 -

■ s - 65 . 6,1. 12,0 13,0 -

- -•

',. Молекулярный рее рДФК-оксигзиазц из листьев волоснеца ситникового. Одноа из. вакаейвих характеристик ферментов является значение их молекулярных весов* Молекулярный вес РДФК-оксигеназы аз листьев водоснеца:ситникового был определен методой сехиментацнршюго равновесия:? аналитической ультрадентри-^ге. Данные седимевтациовного исследования,, представленшо на рас.2, свидетельствуют об одинаковой.величине молекулярного веса фермевтиого препарата по всей высо-

; ;,■'/ ■■ -у. ---V .. is .'' ■ .4.' 1 ■

те ячейки. Пра этом величине молекулярного веса рдок-оксигенази сот ставдяет 540000*23000^: что иоррвяируе* о величиной;коэффициента седиментации (s#2oV-), которая равна17,4+0,22. Как правило, величина молекулярного не са РДОК из высших растений составляет 500000 -580000 1 камоЫм, wiKtoon, .1970'), Среди'исследованных фото- и хеиосвктеаирувщих микроорганизмов самой низкой величиной молекулярного веса обладает РДФК микроорганизма R.rubw»' (Нуan ot el. ,197+), что до некоторой степени мохат сяужз&ть указанием на его древнее эволюционное происхождение.

Аминокислотный состав гомогенной РДФК-оксигвнвзы из листьев волоснеца ситникового представлен в таблице 6-в виде молярного отношения аминокислотных.остатков к остаткуфовилавевава.

- результаты: анализа аминокислотного со став а РДФК-ок си ген еэн из лйстаав волоснеца ситникового показали близкое'сходство о аминокислотным составов РДФК из. листьев шпината Ututeer, Lane,19671 SJgi-jaffla,AkazaFa-,i97o :).'Некоторыми особенности«» является более высокое «олярноа отношение алакина и сирина к фенилаланнну и болеа низкое иолнрное отновеиие к фенилвлвнииувспарагиновой кислоты, гди-' цина, продана в молекуле РДФЯ^ксагеназы из листьев волоснеца ситникового по сравнении с молекулой РДФК на листьев шпината. ..,' / Основное отличие аминокислотного состава РДОК-окси re назы из листьев волоснеца . ситниковом и шпината по сравнена» с РДФК R. rub-rum. И Thiobacillus intermedins, СОСТОЯЩИХ ЛИШЬ ИЗ бОЛЫЕИХ субь-' единиц, а также по сравнению о Buslena e^acilis й chrooatiua D., состоящих из больших и малых, субъединиц, заключается в молярном отношении 1/2 цистзина .к. фенилаленину и составляет для иинроорганиз-мов , 0,18-0,25, тохда как.для растительного фермента это отношение ; 0,4-0,5 (Rutner,I.ane,i9ti7i Wcpadden et al. ,1975tPurohjLt-et al.,

1976). Эти данные, возможно, отражает различные скорости окисления ■ ' РДФК в'процессе выделения, фермента, зашеящие'шга от содержания сульфгидрильных груш*- в молекуле фермента, или от их стабилизаторов в среде iTabita, ucVadden, 1974).

Четвертичная стдукт^ра. РДФК^оксигенаэы из листьев волоснеца ситникового

"Гомогенный ферментный препарат РДФК-оксигеназы 155 мг) инкубированный в течение 3-х часов при gcP в 0,05 М-фосфзтном 6jfeF9 рН 11,5 < Kawa&hlma,irUtoaa,i97l), был нанесен яа колодку с сефздек-сом Г-200..В результате гель-фильтрации (.данные представлены на

рисуике 4)"были получек два хороио разделившихся балка; : <

.!..'■."■■:■; ' . ':: * ' Таблица 6 ' :

Аминокислотный состм РДфк-оксигвнаэы из листьев^ .волоснваасахниковоговсравнбвии.с.аиинокислотныи, ! составом из листьев .шпината, а,бЧ8 ииЬавг ап4 Ьт»,19671 аш1 А*аха*а,-)970) ■

Аминокислота- / Молярное отношанив аиинокислотных остатков' к остатку ." | ,. фенилаланина ..

¡волоснвц ситниковые| Е1шнат. а. { шпинат 0

■ Асп. ' 1,71 2,01 2,20

Тре • ,/ ' 1,24 1,37 1,63 . .'

- Сер , : ■■■* <1,04- 0,68 ; 0,69

; Гиу 2,31 2;18 л. 2,36 ; ■

■ Про 1,24 . 1,20

Гдв . 1,69 2,05 ~ г,оэч

■ Ала . - 2,42.: . ' : \ - 1,89 " V 1,92*.

1/2 дяст 0,46 : • 0,46 . . 0,50

■ вел ; ■ . 1,49- .... 1 ■- 1,60 1,57

- . ИвТ Л 0,55 . - .0,45 . 0,40

.Иле ■ 1,15 . " 0,84 : 0,87.

Де8• . • 2,08 2,00 2,09

. 'ТИР V 1,06 . 1,07 1,09

■ Фев. - ";. ■ а.оо) а.оо) . а,оо>

- ■ " £из '■■■ у. ; ■ 1,02: 1,15 . 1,12

Ню о,ео : 1,67 0,73

. Три ■ 0,64 0,58 '

АрР. ■ 1,зо ■. 1,34 1,14

Разделение ферментного препарата на дев белковые фракция про- . исходит и в присутствии 6М мочевины Лянкубация 12-15 часов, при 2°С). Таким образом»* при щелочном рН происходит разделение наивного ферментного,препарата ив две белковые фракции соответствующие двум,типам субъвдикиц. '.г.- .".■■■ .. V '

Кроме различного поведения при гель-фильтрации ^рас.4),эти два бедка отличаются меаду собой и по скорости седиментации (.рис.5),

21 S5

■Д.

Рис.4. Профиль элюцимс колонка^ Г-200 препарата РДОН-оксягеаазы, обработанного -0,05 II фосфатный; буфарок, рН 11,5, А и Б

- белклраздодившеИся РДМ-оксигенагы соответствую в :двум•типеи;субъ--единиц*- •

Рас.З.СедииентбционвнЯ внализпрепаратаРДОК-окси-геназыиз листьев волоснеца ситникового после обработка его 6 Миочевннэв в течение 15 чае. при 0-4°. Заваси-кость. Le <dc/d* > от 'х2, где.х - расстояние от оси вращения, С - концентрация.

^■Hi^ ti UU П'П ГITii-il i~i • ■ «I «. . . _ »

Иолекулярвый вес больвойЧ1,. ) .в малоа S ) субъединац, определенный иетодои^сеДинёахационного равновесия,; равен 55000+2000 и 12900+650, соответственно. Таким образои показано, что молекула РДФК-оксигеяазы из листьев волоснеца.ситникового состоит аз двоякого рода еубъединиц; на основании весового соотношения бохытх а мэ-лах субъединиц в молзкуле ферианта, котороесоставдяет1:4,2» получено представление о'том, что молекула РДФК-оксигеяази из листьев волоснеца ситникового состоит из 8L и es субьединиц. СО этой же свидетельствуют и результаты эдектронноиах,*роскопкчо>схого.исследования ферментного препарата, которое показало, что/молекула Р££К-оксигенаэы состоит из восьми субъедаяац сложной формы, представляя-адх собоа дииеры ьз. ■, '.■

Эта честь работы выполнена совместно с Институтов кристаллографии им. А. В. Шубки ков а АН СССР г секторе электронной микроскопии

под руководство!} доктора биологических наук, профессора H.A.Îtaceae-ваЛСаисоиадэв и др. ¿ -1978). > :../ ■ ■ ; ,

Г На микрофото гранях негативно ко мраст иро ва н ных у ре ни даце татом препаратов-РДОК-оксмгэиаэи наблюдалось несколько характерных типов ■ частиц. Одни из ниг (.рис.ба) представляют собой частицы приблизительно округлой формы с диаметром IOO-IIS X и небольшим \10-15 % У темним;пятном в центре. При этом удается наблюдать, что.на периферии частиц располагаются до восьми небольвих выступов, котогые,как; правило, сбдихвны:попарно;;Уг()д между, парнымм'выступами. около 40?. Такая величина угла принципиально отличает структуру; РДФК-охсигзна- : зыиз ли стье вв о ло сне цасит ни ко во го*, тшгка кпрэ кти че с кинев стра- -чается у. других исследованных РДФК. Угол между каждое из четырех пар ЭС^^Такии обраэом^ эти изображения: частиц характеризуются сим-■■ метрией ' 4«й ;; '../.."V w^:

Три следующие- типа изображения 1рис.6б,в,г) имеют прямоугольные очертания.Все ошгхарактеризуются двумя продольными полосками ! - ."с гудения "белков ой материи.Ширинавсех типов одинакова, 65-70 но они отличаются:по длине и деталями изображения. Прямоугольныед частицы на рис.66 имеют длину I00-II5 Й; Продольные полосы на них ;'■■■ , обычно образованы из трёх "субъедиаиц" каждая. При этом средние . . субъединицы выражены более отчетливо. Изображения характеризуются ' симметрией, 2т. Частицы на рис.бв, отдичаютсп тем, что продольные полосы.выгдядят неодинаково: в одной из них три "субъединицы" ила она представляется спдосугов),в то время как другая полоса состоит ■ ■ из двух "субъединиц*. Частицы бг формируются из четырех."субъединац? расположенных по вершинам прямоугольника длиной около 85 Я и шириной 65-70 Î; Изображение характеризуется, симметрией 2т. этот тип изображений встречается.реже других.

Логично предположить,,что первый тип изображений соответствует : фронтальной проекции молекул, в то время как остальные ее боковым, проекциям, перпендикулярные оси 4-го порядка. Характер боковых иэо-: бражений подсказывает, что структура молекулы двухсловна. Наиболее вероятно,<что каждый,олой состоит из четырех ьз пар, расположенных относительно оси 4-го порядка.

Цетодои проб и ошибок построена модель РДФК-оксигеназы.волоснеца ситникового, которая.показана на рис.6а,б,в,г справа от микрофотографии; " •

Восемь LS димеров расположены с симметрией 48 по вереинам двух квадратов,- повернутых друг относительно друга ка 4СР вокруг

Рис.б. Молекула РДОК-оксягевазы вэ раствора, контрасткровь нныа уранмдацетатсц. Увел.: а, нижний ряд, 1,5-1,8 10° остальное, «рои» ,80333*, а - изобразения первого типе, б -.изображения второго типа, в - изображения третьего .типа (.часть коле кул представлена дя-мерами) г - изображения четвертого типа. В правой части (.а-г) поха-заиа модель РДФК-оксагенезы в соответствующей ориентации, д - модель, подученная методом трехмерно!) реконструкции. Модель показана в ориентация!, соответствующих проекциям частиц а,б,в и г - типов, соответственно. ' •

общей оси 4-го порядка. В результата, во фроятальнойпроэкциг центры "субъединиц" весовпадщотчрис.ба). Это позволяет объяснить происхождение-попарно Сближенных выступов в частицах первого тепа.

В модели рдФК-оксягенаэы,: полученной в результате трехмерной . реконструкции Чрвс.бд), можно выделить восемь "субгвдиниц" сложной формы. Логично предположить,.что они представляет собой дямеры.ьа. . Но при данном разрешении невозможно установить, где находится большая субъединица, а где малая.

Модель РДФЯ-оксигеназы волоснецв ситникового существенно отличается От модвля РДФК Nicotian a taoacumсимметрия молекулы ко-' торой 422. Согласно этой подели, Ь. субъединица расположены по вор-шинам кубе; а зоубмданицы по две располагаятся на четырех его грааяхД Baiter et si*, 1975»197? ).

Модель РДФК-оксягенаэы аз листьев волоснеца ситникового в отличие от модели;РДФК Kicotiana tabacua больоо удовлетворяет экспериментальные данные и объясняет всевозможные ориентации белковых макромолекул РДОК-оксиганазы в растворе.

4 вывода

1. Состав и динамика продуктов кратковременного фотосинтеза, активность ферментов фотосантетического метаболизма углерода позволя-вт отнести водосяец ситниковый к растениям с "С-З" путей фотосинтеза, основный механизмом ассииляции углекислоты которых является восстановительно певтозофосфатный цикл. Вмеоте с тем фотосинтети-* чески и метаболизм углерода этого растения отличается характерными

особенностями. та

2. Изучение зависимости фотосинтетической ассимиляции С&, листьями волосвеца ситникового и активности ряда ферментов в экстракте из.листьев волоскеца ситникового, выраженного на различных источниках азота (.эквикодяряыо количества) показало, что аммонийные соли и, особенно, мочевина по сравнении с.нитратами й контролем вызывает ускорение и увеличение вклочевия С в органические кислоты

и аминокислоты. '

3. Показано, что при азотаои голодания волоснеца ситникового "фаза нарбоксилврованиа" ВП&Ц испытывает значительно больнее угнетение, чем "фазе восстановления*. .....

4. Результаты анзииологических исследований свидетельству»! о том, что волоснец ситниковый обладает исключительно высокой удэль-

■ 25 - ■ ;

„ \ , . •V*

ной' активность» основных кврбонсиаируовд« ферментов ЛРДЭК н ФЕПК) в необычайном: соотн ошв ни и хв к тиваости »;£озиож но, - э та и и объясняется ряд.уникальных,физиологических особенностей этого растения ^высокая отавность1 быстрое отрастание после скашивания или стравливания)..., .V■... ...;.; _.

5.;. Показано, что присутствие различных источников азота в питании волоснецз ситникового увеличивает содержание растворимого белка в листьях этого растения,"что согласуется с имеющимися в литературе данными о влиянии азота на синтез,белка/

6. разработан способ препаративного получения РДФК-оясигенэзы из листьев волосвеца ситникового, обладающего наряду с карбоксалазной активностью оксигеназноа активность». Выход белка составляет 14%. На способ очистки РДФК-оксигеназы из листьев волоснеца ситникового получено авторское.свидетельство. '.

7. разработан подярографческий метод определения оксигекззной активности' ферментного препарата, основанный на измерении поглощения кислорода. -. . ",. ■ ■-.

• 8. Определен аминокислотный состав РДФК-оксягеназы, показывающий близкое сходство с аминокислотным составом РДФК из других растения, д. Оаредеден,молекулярный вес РДФК-оксигеназы Iметод сединеатаци-

ониого равновесия)». который равен 540000 и' коррелирует о-величиной-_

коэффициента седиментации-1 £>в2р,»}, которая составляет 17,4 а.

10.Показано,.что тодекуло фермента состоит из двух видов субьеди-ниц: большойч ь ) и малой Ч э ) с молекулярным весом 55000 к 12900,. соответственно.'

11. Злектронномикроскофнеское.исследование ферментного препарате показало, что структура молекулы двухслойна, каждый-слой состоит из четырех Ьб. 'дамеров, расположенныхс симметрией 42 по вершинам двух квадратов, повернутых друг относительно друге иа 40° вокруг общей оса четвертого поредка.:

. 12. На основании данных электронной.микроскопии■РдОК-оксигенозы предложена оригинальная модель четвертичной структуры, в наибодызей степени удовлетворявшая экспериментальным данным и оаъяснкюцея всевозможные ориентации белковых макромолекул а растворе.

Материала:диссертации опубликованы.в работах;;

1. Н.Г.Доиак, ЪА.Сеитова, 1976. Изучена« влияния различных

форм азотного удобрения, на фотосинтетичесадя матаболизи углерода.

Тезисы доклада иа 12 Научно-координационном совещании и симпозиуме: разрабатываемой СЭВ : по теме I-I6.I: "Изучение первичных и вторичных, продуктов фотосинтеза и их метаболизм в растениях". Прага.

2. Н.Г.Русинова, Т.А.Сеитова, н;Г;Доман,;с.Г.38клинова;. 1977. Сотосинтегический метаболизм углерода листьев волоснеца ситникового в зависимости от источников азотного питания. Докз; БАН, 30, 12, I76I-I764. .. „Л

8. Н.Г.Русиновв, Т.А.Свмтова,. Н.Г.Доиая, С.Г.Вакдияовэ,°1978. Активность ферментов восстановительного пентоэофосфатного цикла и . фосфопирулаткарбоксидазы 4.1.1*31'листьев волоснеца ситникового в зависямоста от источников азотного питания. Докл. БАН,. 31, I.

4* Г.Г.Самсонидзе, Н.АуКисадев, Т.А.Сеитова^ Н.Г.Русинова, ! Н.Г.Доман,.1978. Электронная микроскопия.рмбудоэоди$ос$аткарбоксн-жааы. Докл. АН СССР, 240, 1,932-986. . .

5. К. Г. Русинов а,, Т.А.Свитова, Н.Г.Доман, 1978;. рнбулозод&;ос- ' фаткарбоксилаза-окскгенааа из листьев.волоснеца ситникового. Докл. АН СССР, 242, 3,. 719-722. i ' ' '

6. Т.А.Сеитова, Н.Г.Русанов в, Н.Г.Доман, 1978 (.в печати). Свойства в четвертичная структура рябулозодифосфаткарбоксилазы из * листьев волоснеца ситникового. Биохимия. , ;

7* Т.А.Сеитова, Н.Г.Русинова, Н.Г.Доман, 1978 U печати). Влияние источников азота на активность ферментов углеродного метаболизма волоснеца ситникового. Физиодогив растении.

8. Т.А.Сеитова, Н.Г.Русинова, Н.Г.Доман, 1978 \ъ печати). Выделение ребудозодифосфаткарбоксалазы-оксигеназы из листьев волосне-ца ситникового. Сб. Современные методы биохимических исследований.

9. Н.Г.Русинова, Т.А.Сеитова, Н.Г.Д°ман, 1978 U печати). Полярографическое определение активности рибулозоди^сфатоксигеназы. Сб. Современные методы биохимических исследований.

10/ Н.Г.Д0118Н, .Т.А.Сеитова, Н.Г.Русинова, 1978. Способ получения рибулозодафосфаткарбоксилазы-оксигеназы. Заявка на изобретение 253S758/C4 от 9.08.77, решение о выдаче авторского свидетельства от 24*02.78.

ПОД. К ПЕЧАТИ 21.07. 197 Э, Т- 05707 ЗАК. 1290 ТКР. 200 »кэ. ВЦ ВШИЖСа.