Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рибосомная АТРаза высших еукариот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Рибосомная АТРаза высших еукариот"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОТ Б10Л0П1 ТА ГЕНЕТИКИ

Г Б 0.г!

_ __________На правах рукопису

СЕРЕБРЯНИК Олександр 1ллн

УДК 577.217.34 577.217.344 577.5.53 577.217.39

РИБОСОМНА АТРаза ВИЩИХ ЕУКАРЮТ

03.00.03 - молекулярна бюлопя

Автореферат дисертацм на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук

КиТв - 1998

HАЦ10НАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ М0ЛЕКУЛЯРН01' Б10Л0ГП ТА ГЕНЕТИКИ

На правах рукопису

СЕРЕБРЯНИК Олександр 1лл1ч

УДК 577.217.34 577.217.344 577.5.53 577.217.39

РИБОСОМНА АТРаза ВИЩИХ ЕУКАРЮТ

03.00.03 - молекулярна бюлопя

Автореферат дисертаци на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук

КиТв - 1998

Дисертац1ею е рукопис.

Робота виконана у в!ддт i мехажзмт трансляцй' генетичноТ Т'нформаци 1нституту молекулярноТ бюлогм та генетики HAH УкраТни (м. КиТв).

Науковий кер!вник:

доктор бюлопчних наук, професор академик HAH УкраТни Сльська Ганна Валентиншна,

1нститут молекулярноТ öionorn та генетики HAH УкраТни, зав. вщдшом механ1зм1в трансляцй генетичноТ ¡нформацм.

Оф1 ц1 йнi опоненти:

доктор б1олопчних наук, Козлов Едуард Андршович,

1нститут молекулярноТ бюлогй та генетики HAH УкраТни; провщний науковий сгнвробгсник вщд'ту ензимологи бшкового синтезу

доктор б!олопчних наук, професор Стародуб Микола Федорович

1нститут бюхшПм. O.B. ПалладЫа HAH УкраТни, зав. вщдшом 6ioxiMiT сенсорних i регуляторних систем.

Пров1дна установа:

КиТвський ушверситет ¡меж Тараса Шевченка, кафедра 6ioxiMiT

Захист дисертацм вщбудеться 23 червня 1998р. о 10-00 год. на заЫданж спецтл^ованоТ вченоТ ради Д 26.237.01 в 1нститут1 молекулярноТ бюлогй та генетики HAH УкраТни за адресою: 252143, м. КиТв-143, вул. Заболотного, 150.

3 дисертац'юо можна ознайомитись у бйл'ютец! 1нституту молекулярноТ бюлогм та генетики HAH УкраТни.

Автореферат роз1слано23 травня 1998 р.

Вчений секретар спец1ал"1зованоТ ВченоТ' Ради кандидат бюлопчних наук Л.Л. Лукаш

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальность проблема. Вщомо, що цикл елонгацм полтептидного ланцюгу на рибосомах в ycix живих орган1змах промотуеться двома бтковими факторами. Проте виявилося, що pi3Hi види rpn6iB мютять ще один додатковий розчинний фактор EF-3 (Skogerson, 1979), функцюнування якого е також суттевим для стадм елонгацм. На вщмшу вщ двох полередн1х факгорт EF-3 мае слабку АТРазну активнють, яка на деюлька порядюв збтьшуеться у присутност1 рибосом. Детальне вивчення участ1 EF-3 у бюсинтез1 бтка надало пщставу припустити, що вш промотуе лерехщ рибосоми з пост- у претранслокацмний стан (Nierhaus, 1993) та приймае участь у забезпечены точное™ вщбору амЫоацил-тРНК на А-сайт1 рибосоми.

Проте апарат бюсинтезу бтка з ¡нших еукарютичних оргатзмю функцюнуе у BiflcyTHOCTi др1жджового EF-3 або його розчинного аналогу. Особливий ¡нтерес у цьому план! становлять рибосоми з ¡нших нижчих еукарют, Tetrahymena pyriformis, яю волод1ють мщно зв'язаною ATP/GTP-азною активнютю, близькою за деякими параметрами до дрЬкджовоТ EF-3 АТРази (Miyazaki, 1990).

Що стосуеться АТРазноТ активное™ рибосом вищих еукарют, то в л1тератур1 з'явилися OKpeMi вказшки на м можливу наявнгсть, хоча до початку MieT роботи вони викликали великий сумнт i питания залишалося вщкритим.

Мета роботи та задач/ дослЮжень. Метою роботи е з'ясування питания, чи мають високо очищеж рибосоми вищих еукарют здатнють гщрол1зувати АТР, та пор^вняння властивостей рибосомноТ АТРази з дрЬкджовим EF-3 у pa3i и виявлення.

Для досягнення поставлено! мети слщ було виршити таю питания:

- дослщити здатысть високо очищених рибосом з ряду вищих еукарют гщрол1зувати АТР;

- за наявност!' рибосомноТ АТРази вивчити н властивосл, у тому числ1

субстратну специфмнють, юнетичж параметри реакцп пдролкзу АТР,

- вплив на функцюнування A-сайту рибосоми, чутливють до ¡нпбггсрв EF-3;

- визначити, чи здатн|' рибосоми вищих eyKapioT стимулювати ATP/GTP-азну активнють др1жджового EF-3.

Наукова новизна ооботи. Вперше доказано, що високо очищен1 рибосоми вищих еукарют мютять м'щно зв'язану АТРазу. Понад 50 % АТРазноТ активносп збер!гаеться у рибосомах навггь пюля вщмивання 1,5 М LiCI, ¡ ттьки 'fx обробка 4 М LiCI, яка сполучена з втратою частини рибосомних бшюв, призводить до майже повного зникнення здатност1 рибосом гщролЬувати АТР. Показано, що АТРазна активнють рибосом не е наслщком íx забруднення факторами елонгацм.

Вперше проведено поршняння рибосомноТ АТРази з дрюкджовим EF-3 i виявлено ряд загальних властивостей, у тому числ'| широку субстратну специфннють та приоичення специфнними ¡нпбяорами.

Вивчено K¡HeTH4H¡ параметри рибосомноТ АТРази печЫки кроля, показано наявнють двох активних центрш та виявлено стимулюючу д1ю амЫоацип-тРНК на каталп"ичну активнють одного з них.

Вперше отримано дан1, що свщчать про участь рибосомноТ АТРази у контрол1 над функцюнуванням A-сайта рибосоми, де вщбуваеться вщбф кодон-специф'шних тРНК. Встановлено, що рибосоми вищих еукарют, маючи власну АТРазну активнють, зберегли у процеа еволюцм пщсилюючий елемент(и), необх'щний для стимуляцп EF-3.

Теоретичне значения ооботи. Робота носить фундаментальний характер ¡ Tí цтн'ють полягае у новому зрозумтш детальних механ1зм1в циклу елонгацм полюептидного ланцюгу на 80S рибосом! та виявлент нових можливих точок прикладання факторщ, яга регулюють бюсинтез бшку у вищих еукарют.

Зв'язок робот и з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках плану науково-дослщних poöiT вщдту механкзмш трансляцм генетичноТ ¡нформацм 1нституту молекулярноТ бюлогм i генетики HAH Укра'ши за грантом № 5.3/16 Державного фонду фундаментальних дослщжень по тем1 "З'ясування рол! АТРазноУ активности рибосом у бюсинтез1 бшка в еукаргат" та за грантом UBA 200 Ммнародного CopociBCbKoro фонду.

Особистий внесок здобувача. Роботу виконано пщ кершництвом д.б.н., академжа Г.В. СльськоТ у ствробп"ництв1 з к.б.н. Г.В. Овчаренко та к.б.н. M.B. PoflHiHoT, з якими було опублжовано cnmbHi роботи. Особистим внеском автора дисертацм була участь у планувант роботи, виконаны експериментт та обговорены одержаних результат^. Експериментальж дан1, наведен! в дисертацм, отримано за безпосередньоТ учасп автора.

Структура та обсяг роботи. Дисертацш складаеться з вступу, огляду лггератури, експериментальноТ частини, яка включав опис MaiepianiB та методю дослщження, виклад результата, Yx обговорення, висновюв та списку цитованоТ лп-ератури, який включае 191 найменування. Роботу викладено на 107 сторшках, включаючи 17 рисунюв та 2 таблиц.

Апробашя роботи. Матерели дисертацм доповщалися на мЬкнароджй конференци "Conference on the translational apparatus" (Berlin, Germany, 1992).

Публ'шацп. За матершлами дисертацм опублжовано 3 роботи у в1тчизняних та закордонних журналах.

МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ

Tpic, noni (U), NTP, GDP, ДТТ виробництва "Calbiochem", США. 2-меркаптоетанол, дезокахолат натрш, MgCI2 - "Merk", акриламщ, бюакриламщ, TEMED, пуромщин, кумаа синш R-250 - "Serva", ФРН. Сефадекси, сефарози - "Pharmacia", Швецт. Синтетичж hocíí: DEAE-, СМ-ToyoPerl, - "Тоуо-ТСМ", Японш. Гщрогаапатит - "Bio-Rad", США. Фтьтри "Whatman", Великобритажя, "Millipore", США, "Sartorius-GmbH", ФРН.

Основним об'ектом дослщжень була печжка кроля.

Отримання рибосомних субчасток проводили з акгивних полюом за методом (Falvey, 1970) у модиф^ацм (Потапов, 1986). Тх концентрац!ю визначали, припускаючи, що 1 од. А260/мл вщповщае 28 пмоль/мл для 40S субчасток та 55 пмоль/мл для 60S субчасток. 80S рибосоми отримували реасо^ацюю 40S та 60S субчасток. "Run-off' рибосоми з кролячоТ та бичачоТ' ne4¡HKH, а також ретикулоцитш кроля, отримували з полюом ультрацентрифугуванням у присутнос™ 10 мМ MgCL2M.

Препарат сумарних АРСаз (КФ 6.1.1) отримували вщповщно (Von der Haar, 1974). BmKOBi фактори елонгаци (EF-1H та EF-1a) отримували ступЫчастим осадженням постполюомального супернатанту сульфатом амонно з послщуючою гель-фтьтрацюю та cepieio хроматографа на юнообмЫниках та гщрока-апатитк Отримання та очищения EF-3 з дрЬкджш проводили як описано в (Skogerson, 1979).

Сумарну тРНК отримували за методом фенольноТ екстракцм з послщуючою хроматографгёю на ОЕАЕ-целюлоз1, очищену тРНКРЬе -хроматографюю на ВО-целюлозк Для отримання [14C]Phe-TPHKpne здмснювали препаративне амжоацилювання тРНКРЬе з подальшою хроматографию на БД-целюлозК СтупЫь збагачення отриманих препарат|'в складала 1600 пмоль/од. А260. Ы-ацетил-[иС]РЬе-тРНКР|1е (AcPhe-TPHKPhe - аналог пептидт-тРНК) отримували за методикою (Rappoport, 1974). Зв'язування Ac[14C]Phe-TPHKPhe з 80S рибосомами вимфювали за допомогою методу фтьтраци через нггроцелюлозж мембрани. Заповнення Р-сайту контролювали за допомогою

мембрани. Заповнення Р-сайту контролювали за допомогою пуромщиновоТ реакци (Rodn¡na1 1989). Факторзалежне зв'язування тРНК з рибосомою проводили як описано в робоп' (Иобгта, 1995).

Визначення АТРЯЗРТазно'Т активносп проводили за методом (Рагтедд1ат, 1981). Радюактивн1сть проб визначапи у сцинтиляцмному поильнику.

Електрофорез бтюв проводили за (1_аеттИ, 1970) у присутност1 0,1 % додецилсульфату натр1ю в 12,5% ПААГ.

Для описания нелМйних графпив (та дтянок графжш) у координатах 1дьХофст1 використовували емпфичний пщхщ Хтла (Курганов, 1978).

ГрафКжий анал1з, ¡нтерполяцш та розрахунок юнетичних параметра проводили за допомогою статистичноТ програми "АзЕаэу" та спец1ал1зованого пакету програм аналЬу бюх1м1чних процеав "ЕпгеАИег".

Здатн/сть 80S рибосом вищих еукарют aidponteyeamu АТР

Основним завданням цього роздту роботи було з'ясування питания, чи е у склад1 80S рибосом можливий аналог фактору EF-3. Для цього було вивчено здатнють 80S рибосом p¡3Horo походження пдролюувати АТР та GTP (рис. 1).

РЕЗУЛЬТАТИ

Рис. 1. К/'нетика гЮрол'пу АТР "run- off" рибосомами вищих еукарют:

¡з печ'тки бика (■) ¡з печшки mypie (•) ¡з ретикулоцит!в кроля (□)

О 5 10 15 20 25 30

Час, хвл.

Реагауя прошае досить ефективно у присутносп Bcix препаралв рибосом-10-20 молекул АТР/ рибосома,хв. На рис. 2 показано, що 80S рибосоми, реконструйован! з 40S та 60S субодиниць, також здатн1 гщролюувати АТР без будь-якого додаткового розчинного бокового фактору.

Виявилося, що GTP також пдролшуеться як "run-off', так i реконструйованими 80S рибосомами, хоча й менш ефективно, нЬк АТР.

Рис. 2. Шнетика zidpontey ATP/GTP реасоцшованими 80S рибосомами /з печшки кроля: АТР (В, □); GTP (•, О); з додаванням Phe-mPHKPtie (■, •); без Phe-mPHKPhe (D.O)

Промивання рибосом 0,66 М (КС1 + ЫН4С1), обробка низькими концентрации Мд2+, центрифугування у градютч сахарози, дисоц!ац1я рибосом та реасоц^фя Тх з субодиниць не призводять до зникнення АТРазноТ активностК Крм того, рибосомна АТРЛЗТРазна активнють не пригнмуеться фусидовою кислотою та антиттами проти ЕР-1 ,що свщчить проти пов'язання цюТ активност'| з домшками фактор1в елонгаци у рибосомних препаратах.

Щоб дослщити, як мщно пов'язана АТРазна активнють з рибосомою, останню промивали зростаючими концентрации Як видно з рис. 3, рибосоми з бичачоТ печжки та ретикулоцитш кроля, промил 1 М та 1,5 М иС1, збер1гають 80% та 50% початковоТ АТРазноТ активное^ вщповщно, хоча втрачають при цьому 55% та 78% активное^ у синтез! пол1фенталан1ну. Ттьки обробка 4 М УС1 пригнмуе АТРазну активнють практично повнютю.

15 20 Час, хв

I4¡ результати ще раз пщтверджують, що АТРаза е невщ'емною частиною саме 80S рибосом.

Час, хв

А Б

Рис. 3. Кшетика zidponhy A TP "run-off" рибосомами з печшки бика (А) та ретикулоцитт кроля (Б), вЮмитих 0.35 М KCI (О) та, додатково, 0.6 М (ш), 1 М (Ф), 1.5 (О) або 4 М (A) Lid.

Bnacmueocmi АТРази 80S рибосом печшки кроля

В перших експериментах було вивчено вплив одно - та двохвалентних катюнш на рибосомну АТРазу. Активнють ферменту залежить вщ обох видю катюыв, причому Ух оптимальы концентрацм корелюють з такими для пол'шептидного синтезу.

Юнетичы параметри рибосомноУ АТРази було вивчено у вщповщносл з ртнянням Mixaenica-MeHTeH. Граф1чний аналю у координатах 1д1-Хофсп показав наявнють двох юнетично рЬних компонент, що свщчить про наявнють двох р1зних сайтш. Комп'ютерний анал1з дозволив роздтити складов! та розрахувати юнетичж параметри для кожного сайту (табл. 1).

KaTan¡TH4H¡ властивосл двох сайпв рибосомноТ АТРази суттево вщр1зняються. Важливо вщзначити, що додавання Phe-TPHK сильно

стимулюе активнють лише одного сайту.

Таблиця1

Шнетичш параметра АТРази 80S рибосом з печшки кроля

Аа-тРНК Км Kcat

мкмоль хв.-1

-Phe-TPHKPhe

1 87 11,5

II 1010 33,4

+Phe-TPHKPhe

1 83 10,8

II 1610 98,7

Суттевою подЮнютю рибосомноТ АТРази з EF-3 виявилось ¡нпбування Т7 активное™ ванадатом аможю, який належить до класичних iHr¡6¡Top¡B АТРаз протонних насоав (рис. 4А).1ншим ефективним ¡Hr¡6iTopoM виявився алкалоТд ем1тин (рис. 4Б).

Рис. 4. Вплив ванадата амошя (А) та ем'нпина (Б) на АТРазну актившсть 80S рибосом ¡з печшки кроля.

!нпбггорний аналю показав ,що подано EF-3 АТРаза 80S рибосом мае широку субстратну специфнысть ( рис. 5).

Аналоги АТР та GTP, що не гщрол1зуються, виявилися найбтьш сильними ¡нпбторами, ефективнють NTP ¡Hri6iTop¡b зменшуеться в ряду UP, GTP, CTP/UTP; ADP та GDP мають суттево бтьш низьку афжнють до активних центрю АТРази.

Рис. 5. 1нг!бування ри-босомноТ АТРази у npueym-Hoemi NDP, NTP, ma ix аналог'ш. AdoPP[NH]P(D), GuoPP[NH]P(e), GTP(*), 1TP(+), ADP(A), GDP(+), СТР(Ф), UTP(O) додавались у p¡3Hiü концентрацн до стандартноТ сумШ, яка мютила Юпмоль 80S рибосом. Час ¡нкубаци Юхв.

Низька афшнють АТРази до NDP вказуе на те, що дисоцшфя продукту реакцм не е швидюсть-лштуючою стад1ею. Той факт, що аналоги АТР та GTP, що не гщролЬуються, мають бтьший ¡нпбуючий вплив, h¡>k можна було чекати на пщстав1 екв1молярного сптвщношення, дозволяе припустити, що зв'язаний аналог дисощюе дуже повтьно ¡ що рибосома може бути ним блокована у певному стаы.

2 4 6 8 10 В!дношення аналог/АТР

Можлива участь рибосомно)'АТРази у зв'язуванш тРНКз А-сайтом рибосоми

Щоб наблизитися до розумЫня функцюнальноТ poni рибосомноУ АТРази, було вивчено вплив рших форм тРНК на Т7 активнють ( табл. 2). Додавання "rioncognate" тРНК або noni(U) не впливае на р'шень гщрол'1зу АТР, в той час як кодон-специфнна тРНКРЬе посилюе АТРазну активнють. Ще бтьш виразний стимулюючий ефект знайдено для Phe-tRNAPhe та AcPhe-tRNAPhe.

Таблиця 2

Вплив функцюнальних форм тРНК на АТРазну активнють 80 S рибосом / рибосомних субчастиц /з печшки кроля.

Контроль 100

TpHK-Phe 1,2 MKM 100

TPHKPhe 0,6 MKM 112

TPHKPhe 1,2 MKM 141

Phe-TPHKPhe 0,6 MKM 154

AcPhe-TPHKPhe 0,6 mkM 160

Важливо шдкреслити, що афшжсть цих форм тРНК до А-сайту рибосоми на порядок вища у портняны з тРНК, в той час як вщносна спорщненють до Р-сайту ркзних функцюнальних форм тРНК мае зворотнш характер. Отже, велика ефективнють заряджених форм тРНК у посиленн1 пдролкзу АТР порюняно з деацильованою тРНК може бути пов'язана з тим, що стимулюючий ефект залежить вщ зв'язування тРНК з А-сайтом рибосоми.

Це припущення було nepeeipeHO в експериментах, типовий приклад яких наведено на рис. 6.

Рис. 6. Ефект зв'язування AcPhe-mPHKphB з А / Р сайтами на АТРазну активтсть:

pieeHb г/'дрол/'зуАТР (Ф)

зв'язування з Р-сайтом (V; Ш)

зв'язування з А-сайтом (V4; О)

Як видно, заповнення Р-сайту AcPhe-tRNAPhe не впливае на р1вень пдролЬу АТР, в той час як крив1, що вщповщають збтьшенню АТРазноТ активное^ та зв'язуванню субстрату з А-сайтом, майже сгпвпадають. Отже, зв'язування тРНК саме з А-сайтом рибосоми е суттевим для м стимулюючого ефекту.

Виникае питания, чи суттева активнють АТРази для заповнення А-сайта рибосоми, як у випадку з EF-3. Вивчення впливу аналога АТР, що не пдролюуеться, виявило майже повну пригнненють EF-1 залежного зв'язування Phe-tRNAPhe з А-сайтом рибосоми (рис. 7), тобто при практично повному пригнненн1 рибосомноТ АТРази А-сайт е блокованим.

Рис. 7. Вплив AdoPP[NH]P на pieeHb EF-1-залежного

зв'язування Phe-mPHKPt"> з А-сайтом: зв'язування у npucymHocmi AdoPP[NH]P (И), АТР (О) або без нуклеотида (О).

5 10 15

' Час ¡нкубацм, хв

Таким чином, наведеж у даному роздМ результата дають пщставу вважати, що рибосомна АТРаза бере участь у контрол1 функцюнування А-сайта подано дрЬкджовому EF-3.

Стимуляцш активност'1 др'жджового EF-3 рибосомами печ'шки

кроля

У подальших експериментах вивчалась можливють стимуляцм др'|жджового EF-3 рибосомами з вищих еукар'ют. Встановлено, що при певних умовах загальна АТРазна активжсть значно перебтьшуе суму активностей рибосом та EF-3, хоча юнетика АТР гщролюу значно повтьнше у гетеролопчжй систем^рис. 8 А).

А Б

Рис. 8. Залежшсть ATP aidponhy aid часу (А) та концентрацп АТР

(Б) у npueymHoemi ттьки рибосом /з печ'шки кроля (Я), рибосом ¡з печши кроля та др'жджового EF-3 (Л), др'жджових рибосом та др'жджового EF-3 (О).

Цкаво, що крива залежносп швидкост1 пдрол1зу вщ концентрацп АТР у присутнооп EF-3 та 80S рибосом не мае форми пперболи, як це характерно для рибосомноТ АТРази (рис. 8Б). Рис. 9 демонструе p¡3Hy залежжсть р1вня стимуляци вщ концентрацм EF-3 та рибосом ¡з лечЫки кроля або др1жджових.

Рис. 9. Залежн/сшь р/вню ATP zidpontey eid концентраци др'жджового EF-3 або рибосом. Стимуляцт

активност'1 EF-3 (0,1-20 пмоль) рибосомами (4 пмоль) з др/ждж/в (О) та печ/нки кроля (Ф); EF-3 (5 пмоль) рибосомами (0-20 пмоль) з Tetrohymena (ф) та печтки кроля (О).

Наведенн данл вказують на те, що ефект стимуляцм обумовлений збтьшенням активное™ EF-3, а не рибосомноТ АТРази. Цей висновок було пщтверджено в експериментах з EF-3, прежкубованим ¡з антиттами проти нього для ¡нпбування йога АТРазноТ активное™. Таким чином, рибосомний пщеилюючий (регуляторний?) елемент для АТРази дрЬкджового EF-3 збер1гся у npoueci еволюци, i йога участь у функцюнуванж власне рибосомноТ АТРази вищих еукар1от являе собою особливий ¡нтерес для подал ыиих дослщжень.

О 5 10 15 20 25 Концштра ц! я EF-3 а бо рибосом, пмоль

ЗАКЛЮЧЕННЯ

Вщкриття рибосомноТ' АТРази Tetrahymena поставило питания про принципову унжальнють дрЬкджового EF-3 та про наявнють рибосомноТ АТРази у вищих еукарют. Результати, що ми отримали, однозначно свщчать про те, що рибосоми з ряду вищих еукарют мютять мщно зв'язану ATP/GTPa3Hy активнють. Як вщомо, еукарютична рибосома не мае бтку, який вщповщае за розмфами EF-3 (115 kDa). Проте не виключено, що рибосомний аналог EF-3 складаеться з двох полтептидних ланцюпв або що АТРазну активнють мають бтки, cnmbHi для двох рибосомних субодиниць i розм1щен1 м'|ж ними.

Встановлено принайми три властивосл, сптьы для АТРази рибосом ne4¡HKH кроля та дрЬкджового EF-3, як1 мають принципово важливий характер: 1) широка субстратна специфЫнють, 2) ¡нпбування ванадатом амон!ю, який е класичним ¡нпб'ггором АТРаз протонних насос'ш, 3) два активн! центри рибосомноТ АТРази вщповщають наявност1 двох АТР зв'язуючих дтянок у структур! др1жджового EF-3.

Отриман1 даж дозволяють припустити, що рибосомна АТРаза вищих еукарют бере участь у контрол1 функцюнування A-сайту, де вщбуваеться B¡fl6ip кодон-специфЫних тРИК. В той же час вщомо, що юнуе певна координац1я м1ж А- та Е-сайтами 80 S рибосом.

Важливою с також визначена в po6oT¡ здатнють 80S рибосом, що мають власну АТРазну активнють, стимулювати дрЬкджовий EF-3, тобто збереження в процеа еволюцм регуляторного елементу(1в).

висновки

1. Встановлено, що як "run-off" рибосоми, так ¡ реконструйованм з субодиниць 80S рибосоми тваринного походження мають АТРЯЗТРазну активнють, яка зникае ттьки теля промивання рибосом 4 М LiCI, що сполучено з втратою значноТ частини рибосомних бшюв.

2. Показано, що под1бно АТРаз'| др1жджового EF-3 рибосомна АТРаза печжки кроля характеризуеться широкою субстратною специфннютю, причому ефективнють NTP ¡Hr¡6¡TopÍB гщролюу АТР зменшуеться в ряду ITP, GTP, CTP/UTP.

3. Юнетичний анал1з показав, що АТРаза 80S рибосом мае два актива центри, яю вщрюняються за значениями Км та Kcat. Катал1тична активнють одного з центрю суттево пщвищуеться у присутносп кодон-специфЫноТ амжоацил-тРНК, у той час як ¡нший центр не регулюсться тРНК.

4. Показана участь рибосомноТ АТРази вищих еукаргат у контрол1 над функцюнуванням A-сайту рибосоми, де вщбуваеться вщб!р кодон-специф1чних тРНК пщ час пол'тептидного синтезу. Про це свщчить стимуляцт активное^ рибосомноТ АТРази при зв'язуванж аммоацил-чи пептидт-тРНК з A-сайтом рибосоми та блокування A-сайта для EF-1-залежного зв'язування амЫоацил-тРНК при пригнгненн! АТРазноТ активное^ аналогом АТР, що не пдролЬуеться.

5. Встановлено, що 80S рибосоми печЫки кроля здаты суттево стимулювати АТРазну активнють др1жджового EF-3, що свщчить про збереження на рибосом! в процес! еволюцм як дтянки зв'язування EF-3, так ¡ пщсилюючого елементу.

СПИСОК ПРАЦЬ ОПУБЛ1КОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦИ

1. Marina V. Rodnina, Alexander I. Serebryanik, Galina V. Ovcharenko and Anna V. El'skaya. ATPase strongly bound to higher eukaryotic ribosomes. // Eur. J. Biochem. - 1994.-225,-P.305-310.

2. A.V. El'skaya, A.I. Serebryanik, G.V. Ovcharenko. Stimulation of yeast EF-3 factor by mammalian ribosomes. // Укр. биохим. журн. - 1995, т.67, №6. -С.28-32.

3. А.И. Серебряник, С.С. Пальчевский, А.В Ельская. Рибосомная АТРаза высших эукариот. И HAH Украины. Институт молекулярной биологии и генетики. Препринт. Киев 1997.

АНОТАЦ1Я

СЕРЕБРЯНИК О. I. Рибосомна АТРаза вищих еукарют. - Рукопис.

Дисертацю на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук за спещальнютю 03.00.03 - молекулярна бюлогж. - 1нститут молекулярноТ бюлоги та генетики HAH УкраТни, КиТв, 1998.

Вперше доказано, що високо очищеж рибосоми вищих еукарют мютять мщно зв'язану АТРазу та вивчено íí властивостг Показано наявнють двох активних центрю та виявлено стимулюючу a¡k> амшоацил-тРНК на каталп-ичну активнють одного з них. Отримано дан1 про участь рибосомноТ АТРази у KOHTponi над функц1онуванням A-сайта рибосоми, де вщбуваеться вщб1р кодон-специф'мних тРНК. Проведено пор'юняння рибосомноТ АТРази з др1жджовим EF-3 i виявлено ряд загальних властивостей. Встановлено, що рибосоми вищих еукарют, маючи власну АТРазну активнють, зберегли у процеа еволюци пщсилюючий елемент(и), необхщний для стимуляцм EF-3. Теоретичне значения роботи полягае у новому розумжж детальних механЬмю циклу елонгацм пол1пептидного ланцюгу на 80S рибосом! та виявленн1 нових можливих точок прикладання фактор1в, яю регулюють 61осинтез бтку у вищих eyKapioT.

ключ0в1 слова: субчастинки рибосом, АТРазна активысть, цикл елонгац11, EF-3 др1ждж1в.

АННОТАЦИЯ

СЕРЕБРЯНИК О. И. Рибосомная АТРаза высших еукариот. -

Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1998.

Впервые доказано, что высоко очищенные рибосомы высших еукариот содержат прочно связанную АТРазу и изучены ее свойства. Показано наличие двух активных центров и виявлено стимулирующее действие аминоацил-тРНК на каталитическую активность одного из них. Получены данные, об участии рибосомной АТРазы в контроле над функционированием A-сайта рибосомы, где происходит отбор кодон-специфических тРНК. Проведено сравнение рибосомной АТРазы с дрожжевым EF-3 и выявлен ряд общих свойств. Установлено, что рибосомы высших еукариот, имея собственную АТРазну активность, сохранили в процессе эволюции усилительный элемент(и), необходимый для стимуляции EF-3. Теоретическое значение роботы состоит в новом понимании детальных механизмов цикла елонгации полипептидной цепи на 80S рибосоме и выявлении новых возможных точек приложения факторов, которые регулируют биосинтез белка у высших еукариот. Ключевые слова: субчастицы рибосом, АТРазная активность, цикл элонгации, ef-3 дрожжей.

SUMMARY

A.I. SEREBRYANIK. The ribosomal ATPase from higher eukaryotes.

- Manuscript

Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Biology, Special Option - Molecular Biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.

It has been first shown that highly purified ribosomes from higher eukaryotes are strongly associated with ATPase activity, and its properties have been studied. Two active sites have been revealed, one of them may be stimulated by aminoacyl-tRNA. The data obtained show participation of the ATPase in the regulation of the ribosomal A-site responsible for the selection of cognate tRNA. A comparative analysis of the ribosomal ATPase and yeast EF-3 has elucidated some common properties. Higher eukaryotic ribosomes, even though possessing intrinsic ATPase, are found to preserve in the course of evolution an enhancing element for the yeast EF-3 ATPase stimulation. The thesis contributes to a new understanding of detailed mechanisms of the elongation cycle on 80S ribosome, including the elucidation of novel points of protein biosynthesis regulation in mammals.

Key words: ribosomal subunits, ATPase activity, the elongation cycle, yeast EF-3.