Бесплатный автореферат и диссертация по географии на тему

Ресурсосберегающая технология выделения алкалоидов из растительного сырья

ВАК РФ 11.00.11, Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

Автореферат диссертации по теме "Ресурсосберегающая технология выделения алкалоидов из растительного сырья"

г4

со На правах рукописи

Станиповская Елена Владимировна

РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

11.00.11 - Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук. ¿У

Москва -1995

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Д.И.Менделеева на кафедре промышленной экологии.

Научный руководитель : доктор химических наук, старший научный сотрудник Ивахно С.Ю. ,

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Градова Н.Б.; доктор фармацевтических наук, профессор Самыпина И.А.

Ведущая организация: Тамбовское предприятие АООТ" Пигмент"

Защита состоится у О 1995г.

в у и час. в аудитории ТШ^ на заседании

диссертационного совета Д 053.34.11 в РХТУ им. Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, А- 47, Миусская пл., д. 9 .

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ им.Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан /г^?, ЬЛ/'гуА^ 1995г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Каменчук И.Н.

Общая характеристика работы.

Актуальность темы.

Работа посвящена проблеме сбережения и рационального использования растительного сырья и химических реагентов в процессах выделения алкалоидов из растений.

Многие лекарственные средства содержат в качестве основного компонента вещества, выделенные из растений - это гликозиды, флавоноиды, алкалоиды.

Содержание полезных компонентов в лекарственных растениях, в частности алкалоидах, невелико и колеблется от 0,1 до нескольких процентов.

Процессы переработки растительного сырья с целью выделения алкалоидов многостадийны и материалоёмки, что обуславливает низкий выход продукта и его высокую стоимость.

Повышение эффективности использования природных ресурсов может быть достигнуто за счет более полного извлечения полезных компонентов и замены одного вида сырья на другой - быстро возобновляемый.

Цель и задачи исследования.

1. Повышение степени извлечения целевого продукта (сангвиритрина) из маклейи сердцевидной; уменьшение количества используемого органического экстрагента и замена его на менее токсичный.; сокращение времени процесса.

2. Изучение растения чистотел большой в качестве альтернативного сырья для получения лекарственного препарата сангвиритрин; исследование состава входящих а него алкалоидов в зависимости от возраста и места произрастания; выделение алкалоидов из травы чистотела большого и разделение их на индивидуальные компоненты.

Научная новизна,

1. Для определения качественного и количественного состава растений маклейи сердцевидной и чистотела большого разработан новый аналитический метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием внутреннего стандарта.

2. Количественно определён и существенно уточнен алкалоидный состав травы чистотел большой. Доказано, что в растении преобладает алкалоид коптизин, а не хелидонин, как считалось ранее.

3. Впервые предложен способ выделения коптизина из чистотела, новизна которого подтверждена положительным решением о выдаче патента на изобретение по заявке №94-010426 от 25.03.94.

4. Установлено, что бисульфат коптизина, полученный из. чистотела, можно использовать как лекарственную форму с желчегонным и антисептическим эффектами, вместо бисульфата берберина. Это позволит- сохранить посадки невозобновляемого источника сырья-барбариса, которые вырубают один раз в 25 лет для" добычи корней растения (сырье для получения бисульфата берберина), и одновременно обеспечить регулярность поступления желчегонного препарата растительного происхождения на потребительский рынок, так как чистотел большой- многолетнее растение, ежегодный, доступный, возобновляемый источник сырья.

5. Впервые показано, что метод пертракции может использоваться для выделения алкалоидов непосредственно из растительного сырья. Предложена новая конструкция аппарата. Определены значения параметров проведения ■ процесса экстрагирования алкалоидов сангвиритрина из маклейи сердцевидной, при которых достигакж^ высокие степень извлечения целевых компонентов(93,7% в пересчете на 100% содержание бисульфатов сангвинарина и хелеритрина) и чистота продукта (95-97%) при соотношении концентраций алкалоидов сангвиритрина и хелеритрина 0,82-0,94.

Научная новизна разработанного способа получения сангвиритрина подтверждена положительным решением о выдаче патента на изобретение по заявке №93-057354 от 24.12.93.

Практическая значимость работы.

1. Разработан новый способ получения сангвиритрина из маклейи сердцевидной методом пертракции. Установлено, что при замене традиционной жидкостной экстракции на пертракцию при получении препарата сангвиритрин повышается степень извлечения целевого продукта и сокращается время процесса. Произведена замена органического экстрагента на менее токсичный при одновременном уменьшении количества экстрагента, объемов и состава образующихся отходов.

2. Внедрена в производство технологическая схема выделения алкалоидов сангвиритрина из маклейи сердцевидной на Тамбовском предприятии АООТ "Пигмент", что подтверждено актом о внедрении.

3. Показано, что разработанная технологическая схема и оборудование могут быть, использованны для получения коптизина из чистотела большого.

Апробация работы и публикации.

По материалам диссертационной работы опубликованы 2 статьи, 2 патента на изобретения, технологический регламент.

На защиту выносятся:

1. Результаты хроматографического анализа экстрактов растений маклейи сердцевидной и чистотела большого;

2. Результаты исследований по подбору условий выделения алкалоидов из растительного сырья;

3. Технологические схемы получения сангвиритрина из маклейи сердцевидной и коптизина из чистотела большого;

4. Эколого-экономические обоснования предлагаемых процессов выделения алкалоидов из растительного сырья.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 250 страницах машинописного текста, содержит 84 таблицы и 59 рисунков: состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 5 основных глав с описанием полученных результатов исследований и их обсуждением, эколого-экономических обоснований предлагаемых технологических процессов, общих выводов, списка использованной литературы, включающего 54 отечественных и 26 иностранных источников, и приложения.

Краткое содержание работы.

Обзор литературы- это первая глава в диссертации, посвященная исследованию и обобщению имеющихся сведений об источниках сырья алкалоидов сангвинарина и хелеритрина; условиях произрастания растений маклейи сердцевидной и чистотела большого; о факторах, влияющих на алкалоидный состав чистотела; о влиянии температуры сушки свежего растительного материала на алкалоидный состав воздушно-сухого сырья. Для некоторых прохинолиновых алкалоидов, встречающихся в растениях семейства Рарауегасеае, приведены фармакологические свойства. Подробно рассмотрены физические и химические свойства указанных прохинолиновых алкалоидов. Кратко охарактеризованы методы определения бензофенантридиновых и протобербериновых (изохинолиновых) алкалоидов в водных растворах и экстрактах из растений. Описаны существующие лекарственные средства на основе экстрактов травы чистотела и на основе алкалоидов

сангвинарина и хелеритрина с подробной характеристикой препарата "сангвиритрин". На основе химического строения алкалоидов коптизина и берберина (по аналогии между сангвинарином и хелеритрином) показанс на одинаковый характер их свойств, а, следовательно, фармакологической активности. Рассмотрены различные методы выделения алкалоидов из растительного сырья.

В экспериментальной части описаны объекты и методы исследования, приведены используемые в работе аналитические методики, методики проведения массообменных экспериментов на различных лабораторных установках, схемы лабораторных установок.

Раздел диссертации, посвященный результатам и обсуждениям проведенных исследований, состоит из 5 глав.

5 первой главе рассмотрены результаты экспериментов по выделению алкалоидов сангвиритрина из травы маклейи.

Основной стадией получения алкалоидов из растений является экстрагирование их из растительного сырья. Правильно подобранный экстрагент увеличивает полноту и скорость извлечения. В данной работе выбор органического растворителя осуществлен на основании анализа данных о коэффициентах распределения алкалоидов сангвиритрина при извлечении в органическую фазу( а2п ) и реэкстракции в 0,2М водный раствор серной кислоты( аг/з ), а также сведений о времени полного извлечения алкалоидов из растительного материала и степени их извлечения различными экстрагентами. При выборе также учтены конструкционные особенности используемой аппаратуры.

Выбор реэкстрагирующего раствора проведен на основании данных о растворимости бисульфатов сангвинарина и хелеритрина в растворах серной кислоты различной концентрации; о соотношениях концентраций алкалоидов в кристаллической фазе (следовательно, в готовом продукте - сангвиритрине); о степени извлечения целевых компонентов из травы маклейи.

В таблице 1 представлены обобщенные результаты по извлечению алкалоидов сангвиритрина из травы маклейи различными экстрагентами и последующей их реэкстракцией в 10% раствор серной кислоты при разном аппаратурном оформлении экспериментов.

Данные строки 1 отражают условия проведения процесса, описанного в регламенте Батумского Химико-Фармацевтического завода, и приведены для сравнения.

При использовании пертрактора и раствора октанола в керосине как органической фазы удалось сократить время процесса в 2 раза,

Таблица 1.

Извлечение алкалоидов сангвиртирина из травы маклейи в различных условиях.

Nа п/п Экстра-гент Полное время экстрагирования, час. Основная аппаратура Экстрагирование соотношение массы травы и объема эмггоагента Реэкст-ращ ия 10% ньэо* соотношение объемов водной И органической фаз Соотношение конц-ций алкалоидов сангвина-рина и хе-леритрина в препарате Степень извлечения алкалоидов из сырья, %(масс)

на ступеж общее

1 дихлорэтан 10,0 экстрактор и диф.ячейка 1:10 1:40 1:120 0,80-0,94 73,0

2 20% р-р октанола1 в керосине 5.0 пертрактор — 1:33 3:5 0,50-0,85 75,0

3 хлороформ 4,0 аппарат с аэрлифта-ми — 1:16 1:1,6 0,50-0,68 96,0

4 хлороформ 4,5 экстрактор и реэкст-рактор 1:7,5 1:10 4:3*на ступени р/э 1:3-к обще му объему орг.фазы 0,82-0,94 93,7

* реэкстрагирующий раствор серной кислоты используют в цикле 8 раз.

уменьшить расход экстрагента на 17,5%, использовать реэкстрагирующий раствор в цикле до 5 раз. Однако степень извлечения алкалоидов была повышена с 73 до 75%, т.е. только на 2%.

При выделении алкалоидов-из маклейи в аппарате с аэрлифтами и органической фазой хлороформом, достигли степени извлечения целевых компонентов более 90% при соотношении массы травы и объема экстрагента 1:16. Но при этом наблюдались значительные потери хлороформа (до 50%) за счет испарения. Для предотвращения потерь хлороформа и уменьшения объема органической фазы, участвующей в процессе, ■ разделили стадии' экстрагирования и реэкстракции, обеспечив периодическую циркуляцию части органической фазы. При таком способе организации процесса время экстрагирования составило 4,5 часа; объем экстрагента уменьшился в 4 раза по сравнению с базовой Батумской технологией. Реэкстрагирующий раствор использовали в цикле до 8 раз, а степень извлечения в пересчете на . 100% содержание бисульфатов сангвинарина и хелеритрина составила 93,7% ,

С целью более полного выделения алкалоидов сангвинарина и хелеритрина был проведен эксперимент по переработке сернокислых фильтратов. Приведенные в диссертации результаты хроматографического анализа показывают, что для увеличения выхода алкалоидов в кристаллическую фазу доизвлеченйе сангвиритрина из фильтратов возможно, но малоэффективно, так как при этом готовый продукт будет загрязнен сопутствующими примесями.

Во второй главе этой части описаны результаты по подбору экстрагента и других условий выделения алкалоидов из травы чистотела

большого.

В сводной таблице 2 приведены некоторые результаты исследований.

На рисунке 1 - представлены хроматограммы полученных кристаллов и сернокислого фильтрата после выделения алкалоидов из чистотела.

Из анализа полученных хроматографических данных методом ВЭЖХ с использованием внутренних стандартов хелидонина, сангвинарина, хелеритрина и берберина и литературных данных (Niu-C.-Q., Не Li-Yi, etc. Determination of isoquinoline alkaloids in Cleiidonium majus L. by ion-pair high-performance liquid chromatography // J. of Chromatography. - 1991,- Vol. 542. - p.193-199), соответствующих аналогичным условиям хроматографиро-вания, следует, что перед хелидонином выходит и протопин, и стилопин, а после хелидонина -коптизин. Сравнивая данные хроматограмм, можно предположить, что

I аолица

Извлечение коптизина из травы чистотела в различных условиях.

Экстрагент Полное время экстра-• гирова-ния, час. Основная аппаратура Экстраги Соотношен травы и ПКСТрЗ на спупени эование не массы объема гента общее Реэкстракция 10%Н?504: соотношение объемов водной и органической фаз Степень извлечения коптизина из сырья, %

0.05М водный раствор серной кислоты 1 диффузионная ячейка 1.20 1:20 — 83,8 (без крист. фазы)

Этанол 6 . сосклет 1:15 1:15 — 16,5

Смесь(уЛ/=1:1) хлороформ: .этанол 12 диффузионная ячейка 1:10 1:10 1:3 36,4

20% раствор октанола-1 в керосине 6 пертрактор — 1:36 1:1,8 31,4

Хлороформ 4 аппарат с аэрлифтами 1:13,5 1:4 98,5

Хлороформ 4 экстрактор и реэкстракгор 1:10 1:15 1:1,5*на ступ. 1:4,5 к оба;е-му объему экстрагента 95,5

* реэкстрагирующий раствор серной кислоты используют в цикле 8 раз.

Х-310нн 6-0,2 2с

з -1

УгМОт Х'ШИнм ¿,02

■За - .згт

Рис.1. Хроматограммы полученных кристаллов коптизина и сернокислого фильтрата после процесса выделения алкалоидов из чистотела большого. 1. Внутренний стандарт(сумма алкалоидов). 2-3. Сернокислый фильтрат после процесса выделения алкалоидов из чистотела большого: 2а- фильтрат плюс сумма алкалоидов при Х=280нм; 26- фильтрат плюс сумма алкалоидов при \=340нм; За- фильтрат при \=280нм; 36- фильтрат при Х=340нм. 4. Полученные кристаллы коптизина (4% примесей).

пик а принадлежит как протопину, так и стилопину, а пик N - коптизину, так как при длине волны X = 340 нм поглощают алкалоиды с четвертичным азотом (протопин, стилопин - третичные аммониевые основания), при этом пик р тоже исчезает, вероятно, что этот алкалоид с третичным азотом. То, что алкалоид N является коптизином, подтверждено данными ЯМР 1Н спектроскопии.

При экстрагировании алкалоида из чистотела большого 0,05М раствором серной кислоты степень извлечения коптизина составила 83,8%, но выделить из водно-кислого экстракта индивидуальный алкалоид или его концентрированный раствор не удалось из-за сопутствующих коптизину водорастворимых примесей, затрудняющих процесс экстракции. При использовании в качестве экстрагента хлороформа и аппарата с аэрлифтами достигли высокой степени извлечения коптизина - более 95% - с выделением алкалоида в кристаллическую фазу. Для. устранения потерь хлороформа за счет испарения при барботаже воздухом, применили описанную ранее аппаратуру. При таком аппаратурном оформлении процесса степень извлечения коптизина составила 95,5% .

Третья глава результатов и обсуждений посвящена описанию технологической схемы выделения алкалоидов сангвиритрина из травы маклейи.

Измельченную траву подают в экстрактор с рубашкой, где обрабатывают в течение 30 минут при перемешивании 10% водным раствором аммиака при соотношении массы травы и объема раствора равном 1 : 1. По истечении указанного времени в экстрактор заливают хлороформ до соотношения массы исходной травы и объема органической жидкости 1 : 7,5.

Экстрагирование проводят при умеренном перемешивании (100 сб/мин) в течение 30 минут. После остановки мешалки порцию ■ хпороформенного экстракта, объемом равным 1/3 от его исходного количества, под давлением (или вакуумом) отфильтровывают от растительного материала и подают на резкстракцию. Для соблюдения соотношения фаз трава : хлороформ (т : ж = 1 : 7,5) при последующем экстрагировании недостающую порцию органической жидкости добавляют в экстрактор и продолжают экстрагировать алкалоиды из сырья следующие 30 минут.

Органическая фаза периодически, каждые 30 минут, циркулирует между экстрактором и аппаратом для реэкстракции, причем насыщенный алкалоидами хлороформенный экстракт подают со стадии экстрагирования на реэкстракцию, а обедненный по целевым

, Блок- схема выделения сангвиритрина из травы маклвйи.

Трава макпейя

(содержание основного вещества не менее 0,6%; влажность не более 13%)

(содержание основного вещества не менее 90%)

компонентам экстракт (хлороформ) - со стадии реэкстракции на экстрагирование.•

В аппарат для реэкстракции, где уже находится хлороформенный экстракт, заливают реэкстрагирующий раствор - 10% водный раствор серной кислоты, до объемного соотношения водной и органической фаз 4 : 3. Реэкстракцию ведут при перемешивании турбинной мешалкой (500 об/мин) в течение 15 минут.

Полное время цикла экстрагирования алкалоидов из одной загрузки сырья 4,5 часа.

По окончании всего цикла реэкстракции (одна загрузка сырья) сернокислый раствор-суспензию выводят из аппарата для фильтрования кристаллов сангвиритрина. Сернокислый фильтрат возвращают в аппарат на следующий цикл реэкстракции. Один и тот же реэкстрагирующий раствор используют 8 раз, доукрепляя после четвертого цикла.

Кристаллы сангвиритрина (пасту) промывают ацетоном на вакуум-фильтре от избытка кислоты (до рН 6-7 ацетонового фильтрата). Последний отправляют на регенерацию, после которой 98% ацетона возвращается в технологический цикл.

Промытые кристаллы сушат при температуре 50-60° С и остаточном давлении 100 мм рт. ст. в вакуумной сушилке в течение 3 часов. Таким образом, получают технический сангвиритрин с содержанием основного вещества не менее 95-97%.

Отработанный хлороформ отправляют на регенерацию (99,2%возвращаются в технологический цикл).

Хлороформ с травы отгоняют "глухим" паром.

Шрот удаляют из экстрактора и отправляют на компостирование.

В диссертации приведен пример расчета количества отходов в процессе выделения сангвиритрина из маклейи.

В четвертой главе описана технологическая схема выделения коптизина из травы чистотела большого, отличающаяся от рассмотренной выше тем, что:

- экстрагирование алкалоида из сырья проводят при соотрошении массы исходной травы и объема органической фазы 1:10 в 12 ступеней по 20 минут каждая;

- на реэкстракцию выводят 1/2 реакционного объема хлороформенного экстракта каждой ступени, соотношение водной и органической фаз при реэкстракции 1:1,5.

Таким образом, способ получения коптизина можно охарактеризовать как,многоступенчатое экстрагирование хлороформом в щелочной среде, реэкстракцию 10% водным раствором серной кислоты с

последующей подачей водной фазы на фильтрацию, возврата фильтрата в технологический цикл, промывку и сушку продукта. •Экстрагирование ведут в 12 ступеней по 20 минут каждая при перемешивании и соотношении массы исходной травы и объема экстрагента 1:10. На реэкстракцию выводят 1/2 реакционного объема каждой ступени, реэкстракцию ведут в течение 15 минут при интенсивном перемешивании турбинной мешалкой и соотношении водной и органической фаз 1:1,5.

Соотношение фаз на стадии экстрагирования поддерживают путем возврата органической фазы со стадией реэкстракции.

Хлороформ с травы отгоняют "глухим" паром.

Шрот удаляют из экстрактора и отправляют на компостирование.

Отработанные хлороформ и ацетон отправляют на регенерацию, после которой 99,2% хлороформа и 98% ацетона возвращаются в технологический цикл.

В пятой главе сформулированы выводы по всему разделу результатов и обсуждений.

Эколого-экономические обоснования предлагаемых процессов приведены для сравнительной оценки технологий получения сангвиритрина из травы маклейи сердцевидной в базовом (Батумском) и предлагаемом вариантах (использование ограниченного сырьевого ресурса), а также технологий получения коптизина из травы чистотела большого и получения берберина из корней барбариса обыкновенного (получение одинакового результата у потребителя) по экономическим показателям и показателям ущерба от загрязнения окружающей среды в результате применения предлагаемых технологий в стоимостных величинах.

Таблица 3 содержит сводные данные.

, Таблица 3.

Эколого-экономическое обоснование предлагаемых технологий.

Сравниваемые расчетные величины Расходы по в а р и а н т а м , млн. руб.

выделение базовая технология (Батумский ХФЗ) лкалоидов предлагаемая технология (Тамбовское ¡ЮОТ'Пигмент" базовый вари-1 _ знт-технология получения бисульфата берберина редпагаемий вариант-технология получение бисульфата коптизина

. капитальные затраты 561,73 159,25 731,50 172,00

. себестоимость производства 2234,80 659,20 1525,40 1082,60

. себестоимость в расчете 5 1кг продуктов 29,60 5,11 10,93 7,76

. сопоставимая величина церба окружающей среде 426,00 0,91 0,10* 1,47

. приведенные затраты с ютом экологической зставляющей, З3 2745,00 684,00 1635,23* 1110,00

. народно-хозяйственный £фект (эколого-экономическая £>фективность) от внедрения эедлагаемых технологий 2061,00 525,23

. сопоставимая величина татежей за размещение гходоз в окружающей среде в эеделах лимита 150,20 0,38 0,24 0,60

. себестоимость производства учетом платежей по п.7 2385,00 659,53 1525,64 1083,20

себестримость получения 1кг эодукта с учетом платежей о п,7 31,60 5,11 10,94 7,77

). приведенные затраты с (етом платежей по п.7 2470,00 683,50 1635,40 1109,00

1. хозрасчетный эффект зедприятия от внедрения эедлагаемых технологий 1786,50 526,40

без учета стоимости стоимости сведения зеленых массивов и уничтожения эвоспроизеодимых источников сырья.

Выводы:

1. Показано, что метод пертракции может использоваться для выделения алкалоидов непосредственно из растительного сырья. Разработан новый пертракционный способ получения алкалоидов сангвиритрина из маклейи сердцевидной.

2. Внедрена в производство на Тамбовском предприятии АООТ "Пигмент" технология выделения алкалоидов сангвинарина и хелеритрина из маклейи сердцевидной, где по сравнению с описанной в литературе схемой:

повышена степень извлечения целевого продукта из растительного сырья с 73,0 до 93,7 % ;

- произведена замена экстрагента дихлорэтан на менее токсичный-хлороформ;

- уменьшен объем экстрагена, необходимого для выделения сангвиритрина из одной загрузки травы а 4 раза ;

- реэкстрагирующий раствор серной кислоты использован в цикле 8 раз; ,

- сокращено время процесса извлечения алкалоидов сангвиритрина из сырья с 10 до 4,5 часов.

Расчетная величина хозрасчетного эффекта предприятия с учетом платежей за размещение отходов в окружающей среде от внедрения предлагаемой технологии выделения алкалоидов сангвиритрина из травы маклейи хлороформом составила около 1,8 млрд. рублей в год.

3. Определено, что преобладающим алкалоидом растения чистотел большой является протобербериновый алкалоид коптизин, а не хелидонин, ка считалось ранее. Содержание коптизина в надземной части растения колеблется от 0,13 до 0,97 % , в зависимости от географии, места произрастания и возраста травы чистотел большой.

4. Предложена к внедрению на Тамбовском предприятии АООТ "Пигмент" схема выделения алкалоида коптизина из травы чистотела большого хлороформом со степенью извлечения коптизина из сырья 95,5 % и содержанием основного вещества не менее 95 %.

5. Получены опытные образцы алкалоида коптизина для проведения токсикологических, фармакологических, а затем и клинических испытаний на базе НИИ традиционных методов лечения с целью внедрения в медицинокую практику новой лекарственной формы бисульфата коптизина.

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в работах:

1. Ивахно С.Ю. , Голованова Л.В. , Станиловская Е.В. , Кулешова Л.Н. Выделение алкалоидов из чистотела большого // Современные аспекты изучения лекарственных растений. Научные труды НИИФ..- том XXXIV. - М., 1995,- С. 184-189.

2. Сорокина A.A. , Ленивова H.H. , Станиловская Е.В. Анализ водных извлечений из травы чистотела // Современные аспекты изучения лекарственных растений. Научные труды НИИФ. - том XXIV. -М., 1995. -с. 100-104.

3. Положительное решение о выдаче патента на изобретение. " Способ получения сангвиритрина" по заявке № 93-057354 от 24.12.93.

4. Положительное решение о выдаче патента на изобретение" Способ получения коптизина из чистотела большого " по заявке № 94010426 от 25.03.94.

У Г