Репарация и васкуляризация инфарктной зоны миокарда у крыс после трансплантации мононуклеаров красного костного мозга

Байкова, Юлия Павловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Репарация и васкуляризация инфарктной зоны миокарда у крыс после трансплантации мононуклеаров красного костного мозга
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Репарация и васкуляризация инфарктной зоны миокарда у крыс после трансплантации мононуклеаров красного костного мозга"

На правах рукописи

005002432

Байкова Юлия Павловна

Репарация и васкуляризация инфарктной зоны миокарда у крыс после трансплантации мононуклеаров красного костного мозга

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 НОЯ 2011

Москва 2011

005002432

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Большакова Галина Борисовна

Официальные доктор биологических наук

Егорова Ирина Федоровна

оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Болтовская Марина Николаевна

Ведущая организация:

Российский университет дружбы народов

Защита состоится 15 декабря 2011 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 1117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 1117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3

Автореферат разослан « » 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Михайлова Лилия Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Клеточная терапия - метод лечения заболеваний с помощью стволовых клеток - активно развивается в последние 10 лет. Трансплантация стволовых прогениторных клеток как одно из направлений клеточной терапии является одним из перспективных, так как позволяет стимулировать репаративные процессы поврежденной ткани (Anversa P. et al., 2004; Gersh В .J., Simari D.R., 2006).

На сегодняшний день существует несколько способов лечения таких распространенных заболеваний, сопровождающихся сердечной недостаточностью, как ишемическая болезнь сердца и инфаркт миокарда. Среди них выделяют хирургическое и медикаментозное лечение (Болл С. Дж. и др., 1995., Куртова А.В. и др., 2006), и трансплантацию прогениторных клеток костного мозга (Шахов В.П., Попов C.B., 2004; Li J. et al., 2010). Современная медикаментозная терапия и хирургическое лечение часто оказываются недостаточно эффективными, поэтому для лечения сердечно-сосудистых заболеваний все большее внимание уделяют клеточной трансплантации (Yacoub M. et al., 2006).

За последнее десятилетие было накоплено большое количество экспериментальных данных, свидетельствующих об эффективности и безопасности клеточных трансплантаций (Zhang С. et al., 2010). Было показано, что трансплантированные клетки могут выживать и участвовать в регенерации и реваскуляризации миокарда (Pangonyte D. et al., 2008). Однако до сих пор нет достоверных данных о том, что трансплантация клеток позволяет не просто восстановить функцию поврежденного миокарда, но в значительной мере устранить и само повреждение (Prockop D.J., 1997). Также остается неясным, какой именно клеточный трансплантат является наиболее безопасным и эффективным. Многие исследователи считают, что нефракционированные мононуклеары являются наиболее приемлемым клеточным трансплантатом (Zhang S. et al., 2010) по ряду причин. Во-первых, мононуклеары получают из красного костного мозга, который является наиболее доступным источником получения прогениторных клеток. Во-вторых, трансплантат мононуклеаров не требует культивирования и индукции дифференцировки, фенотипирования и отбора нужной фракции. Кроме того, в состав фракции мононуклеаров входят

мультипотентные стромальные клетки, гемопоэтические стволовые клетки, эритроидные клетки - предшественники, мегакариоцитарные клетки -предшественники и клетки-предшественники миелоидного ряда, что позволяет воспроизвести и оценить комплексное влияние клеток красного костного мозга на репарацию тканей (Iwase Т. et al., 2005).

Существуют три способа трансплантации прогениторных клеток: интравенозный, интракоронарный и интрамиокардиальный.

Интрамиокардиальная трансплантация наиболее инвазивна, но наиболее эффективна, так как клеточный трансплантат вводят непосредственно в область повреждения (Henning R.J., et al., 2007). Интравенозная и интракоронарная трансплантации менее инвазивны и травматичны, но менее эффективны, так как прогениторные клетки мигрируют в зону повреждения под действием хемоаттрактантов (Gragaard Н.К., et al., 2007). Именно поэтому на данный момент все еще стоит вопрос о выборе оптимальной техники введения клеток.

Среди возможных механизмов действия трансплантированных клеток на регенерацию миокарда выделяют заместительный (Orliö D. et al., 2001; Bell A. et al, 2010), индукционный (Sieveking P.D. et al, 2009; Wollert K.C. et al., 2010; Yoon C.H. et al., 2010) и механизм клеточного слияния (Balsam L.B. et al, 2001; Tada M. et al, 2003). Заместительный эффект реализуется благодаря высокому пролиферативному потенциалу стволовых/прогениторных клеток и возможности слияния и/или дифференцировки их в кардиомиоциты (Johnston P.V, et al, 2009). Индукция регенерации происходит за счет синтеза и выделения трансплантированными клетками различных сигнальных молекул, которые регулируют пролиферацию, миграцию и дифференцировку клеток в зоне повреждения (Burchfield J.S, Dimmeier S, 2008). Слияние прогениторных клеток с кардиомиоцитами предполагает восстановление пролиферативной активности последних, что и приводит к восстановлению поврежденной ткани (Matsuura К, et al, 2004). Тем не менее, точный механизм действия трансплантированных стволовых клеток не установлен, и его определение является одной из основных задач исследователей.

Таким образом, на данный момент остаются неизвестными механизм действия трансплантированных клеток, наиболее эффективный клеточный фенотип для трансплантации и способ доставки клеток в зону повреждения.

Однако, несмотря на недостаток данных и ряд спорных вопросов, то, что трансплантация мононуклеаров приводит к положительным результатам, свидетельствует о перспективности данного клеточного трансплантата и возможности его использования в клинической практике. Для этого необходима разработка эффективной методики трансплантации и точное знание механизмов действия трансплантированных мононуклеаров, обеспечивающих их терапевтический эффект.

Цель и задачи исследования. Изучить в эксперименте особенности репаративных процессов в инфарктной зоне миокарда после трансплантации аутологичных мононуклеаров красного костного мозга.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод интракоронарной трансплантации мононуклеаров костного мозга мелким лабораторным животным.

2. Исследовать топографию трансплантированных мононуклеаров в сердце и других органах через 14 и 30 сут после трансплантации с помощью витальной мембранной метки РкН26.

3. Определить фенотип клеток миокарда, образующихся из трансплантированных мононуклеаров через 14 и 30 суток после трансплантации с помощью морфологического анализа с применением иммуногистохимии.

4. Провести морфометрическое исследование особенностей васкуляризации постинфарктного рубца после трансплантации мононуклеаров.

5. Изучить влияние трансплантации мононуклеаров на постинфарктное ремоделирование левого желудочка с помощью морфометрического анализа серийных поперечных срезов сердца.

6. Оценить глобальную сократимость левого желудочка сердца после трансплантации мононуклеаров по показателям максимального давления и скорости повышения давления в левом желудочке.

7. Оценить уровень экспрессии генов ангиогенеза, ростовых факторов, цитокинов и хемоаттрактантов во фракции мононуклеаров красного костного мозга методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Научная новизна. Разработана модель интракоронарной трансвентрикулярной трансплантации мононуклеаров мелким лабораторным животным. Особенность разработанной модели состоит в том, что при

пережатии аорты большая часть трансплантированных клеток попадает из полости левого желудочка в коронарные артерии при сердечном выбросе. По эффективности доставки клеток в зону повреждения разработанный метод сравним с интрамиокардиальным (50,04% клеток через 14 сут в зоне повреждения после трансплантации, 40,07% клеток через 30 сут), но является менее инвазивным. Интракоронарная трансплантация мононуклеаров безопасна: она не вызывает развития воспалительной реакции.

Исследована локализация и выживаемость мононуклеарных клеток после трансплантации в условиях экспериментального инфаркта миокарда. Трансплантированные аутологичные мононуклеары выживали в течение месяца без изменения локализации. Большая часть клеток локализовалась в сердце и селезенке, единичные клетки были обнаружены в печени и легких.

В сердце клетки располагались только в рубцовой зоне, были окружены пучками коллагеновых волокон и имели фибробластоподобный фенотип через 14 и 30 сут после трансплантации. Часть трансплантированных клеток, помимо флуоресцентной метки трансплантированных мононуклеаров РкН26, экспрессировала маркеры фибробластов Рара и миофибробластов а-БМА, что доказывает их дифференцировку в фибробласты и миофибробласты как через 14, так и через 30 сут после трансплантации.

Мононуклеары не дифференцируются в клетки стенок кровеносных сосудов. Трансплантация мононуклеаров приводит к стабилизации процессов васкуляризации, поддерживая количество и объемную плотность сосудов на постоянном уровне, по сравнению с контрольной группой, где было выявлено уменьшение как количества, так и объемной плотности сосудов через 30 сут после трансплантации.

Показана стимуляция пролиферации клеток стромы после трансплантации. Через 14 и 30 сут после трансплантации в рубце опытной группы количество делящихся клеток значительно выше (/?<0,001), чем в контрольной. При сопоставлении метки было выявлено, что некоторые меченые РкН26 клетки окрашивались мАТ к Кл67, что свидетельствует о пролиферации самих трансплантированных мононуклеаров на протяжении всего срока исследования.

Изучена экспрессия 84 генов во фракции мононуклеаров. Установлена сверхэкспрессия факторов ангиогенеза, факторов роста и дифференцировки, цитокинов и хемоаттрактантов.

Трансплантация мононуклеаров ускоряла процесс созревания коллагена, что повышало механическую прочность стенки левого желудочка в области рубца и препятствовало ее разрыву. Однако дифференцировка мононуклеаров в фибробласты и миофибробласты, синтезирующие коллаген, приводила к разрастанию рубцовой ткани. Трансплантация мононуклеаров не влияла на индекс гипертрофии левого желудочка.

Показано улучшение глобальной сократимости сердца после трансплантации мононуклеаров. Трансплантация мононуклеаров приводила к повышению максимального давления в стенке левого желудочка и увеличению скорости повышения максимального давления в левом желудочке.

Практическая значимость. Разработанная модель интракоронарной клеточной трансплантации мелким лабораторным животным после экспериментального инфаркта миокарда по эффективности сравнима с интрамиокардиальной, но менее инвазивна.

Полученные экспериментальные данные о безопасности и эффективности трансплантации мононуклеаров послужат основой для усовершенствования методики предклинических испытаний.

Полученные данные следует учитывать не только при проведении исследований по клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний, но и в области клеточной ангиопластики и лечения ишемических заболеваний.

Степень личного вклада автора в результаты исследования. Автор принимал участие в хирургических операциях по моделированию инфаркта миокарда, взятии красного костного мозга и интракоронарной трансплантации. Все хирургические манипуляции проводили в Лаборатории биологических испытаний Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в г. Пущино в соответствии с СЬР-условиями.

Автор принимал участие в приготовлении клеточного трансплантата и витальном маркировании мононуклеаров. Автором было самостоятельно проведено гистологическое, иммуногистохимическое, морфометрическое исследование, полимеразная цепная реакция в реальном времени. Автор проводил статистический анализ полученных данных.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на:

Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 гг» (Москва, 2009, 2010, Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН); Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (25 - 28 октября 2010 года, Москва, факультет фундаментальной медицины МГУ имени М.ВЛомоносова); Научной конференции «Актуальные опросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2010, УРАМН НИИ морфологии человека РАМН); Всероссийской конференции «Фундаментальные и клинические аспекты изучения ангиогенеза. Подходы регенеративной медицины» (Москва, 2011, Московский физико-технический институт); Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011, УРАМН НИИ морфологии человека РАМН); межлабораторной конференции НИИ морфологии человека РАМН (2011).

Внедрение полученных результатов. На основании полученных данных разрабатываются протоколы клеточных трансплантаций для клинических исследований и протоколы клеточной терапии для лечения пациентов с диагностированной хронической сердечной недостаточностью. Проведенное исследование может служить доклиническим исследованием оценки безопасности и эффективности трансплантации мононуклеаров красного костного мозга.

Результаты диссертационного исследования используются в лекционных и практических занятиях на кафедре гистологии и эмбриологии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научные статьи в журналах, представленных в списках ВАК. Получен 1 патент.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 212 страницах машинописного текста и состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Литературный указатель включает 227 источников, из них 200 -

иностранных, 27 - отечественных. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 5 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальное исследование. Экспериментальное исследование проводили на самцах аутбредного стока линии Спрейг-Доули (НПП «Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН»), Всего использовали 56 животных в возрасте 8 недель массой тела 180-200 граммов. Животных содержали в соответствии с GLP-условиями. Работа с экспериментальными животными проводилась согласно приказу Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. На проведение исследования было получено разрешение биоэтической комиссии НИИ морфологии человека РАМН (протокол № 4 от 12.03.2008).

Острый инфаркт миокарда моделировали лигированием левой нисходящей коронарной артерии с последующей реперфузией через 20 мин. Наркотизацию крыс проводили внутримышечной инъекцией смеси кетамин/ксилазин (90-120 мг/кг + 10 мг/кг). Проводили трахеальную интубацию, подсоединяли к аппарату искусственной вентиляции легких (UGO BASILE, Rodent Ventilator). После интубации к животному подключали электроды для регистрации ЭКГ. Проводили торакотомию и накладывали лигатуру на левую коронарную артерию. Наличие инфаркта определяли по изменению комплекса PQRST. Визуально окклюзию устанавливали по появлению цианоза передней стенки левого желудочка. Через 20 мин после начала окклюзии лигатуру снимали, возвращали сердце в грудную клетку и зашивали рану. Животное находилось при включенном ИВ Л в течение 10 мин после окончания всех хирургических манипуляций. После операции всем животным однократно давали противовоспалительный препарат «Дексафорт» (100 мкл/500 г) и в течение 5 дней - антибиотик «Линкомицин» (2 раза в день в дозировке 0,6 мл/100 г веса).

Получение клеточного трансплантата. Клеточный трансплантат получали из красного костного мозга бедренных и большеберцовых костей обеих конечностей. Взятие костного мозга проводили перед моделированием острого инфаркта миокарда многократным пунктированием большеберцовых и бедренных костей через полость коленного сустава. Полученный пунктат помещали в среду с гепарином и DMEM/F12 с антибиотиком «Амикацин».

Выделение мононуклеаров. Для выделения мононуклеаров использовали метод разделения клеточных элементов при центрифугировании в градиенте плотности фиколла-урографина (плотность 1,089 г/мл). Фракцию мононуклеаров отбирали и центрифугировали повторно, получая мононуклеары в осадке.

Приготовление клеточного трансплантата. Полученную фракцию мононуклеаров разводили в 1 мл физиологического раствора, брали аликвоту и подсчитывали количество клеток в камере Горяева. Готовили клеточный трансплантат так, чтобы получить 5 млн. кл./мл физиологического раствора. Клеточный трансплантат 6 животных опытной группы маркировали витальной мембранной флуоресцентной меткой РКН26 (Sigma). Животным контрольной группы вводили 1 мл физиологического раствора.

Имплантация катетеров. Катетеризация левой сонной артерии была необходима для регистрации системного артериального давления. Катетеризация правой сонной артерии была необходима для регистрации давления в левом желудочке и введения клеточного трансплантата. Над артериями делали разрез и отсепарировали левую, а затем правую наружные сонные артерии по стандартной методике. Катетер подсоединяли к электроманометрическому датчику DTX™ Plus TNF-R (Becton Dickinson). После введения трансплантата оба катетера вынимали. Повторную катетеризацию проводили перед эвтаназией.

Интракоронарная трансвентрикулярная трансплантация. Животных делили случайным образом на 2 группы - опытную (п = 29) и контрольную (« = 27). Животным опытной группы вводили клеточный трансплантат, животным контрольной группы - физиологический раствор. Введение клеточного трансплантата осуществляли однократно через 30 сут после острого инфаркта миокарда. Клеточный трансплантат водили в полость левого желудочка через катетер, внедренный в правую наружную сонную артерию. Одновременно пережимали аорту ниже места ее отхождения от правой и левой коронарных артерий, что обеспечивало поступление прогениторных клеток в коронарные сосуды. Клеточный трансплантат вводили в полость левого желудочка сначала в объеме 0,2 мл. После восстановления нормального давления в левом желудочке процедуру повторяли для введения всего объема трансплантата.

Функциональный тест. В исследовании использовали тест «Плавание» для оценки физической динамической нагрузки. Уровень воды был подобран таким образом, чтобы крыса, плавая, не касалась дна кончиком хвоста. Регистрировали продолжительность плавания от момента погружения крысы в воду до того момента, как ее хвост касался дна.

Регистрация давления. Регистрировали артериальное давление и давление в левом желудочке сердца до операции трансплантации и перед выведением животных из эксперимента. Рассчитывали скорость повышения давления в левом желудочке (+dp/dt) как показатель инотропной функции сердца.

Гистологические методы исследования. Каждую группу животных делили на две подгруппы в зависимости от сроков выведения из эксперимента (14 и 30 сут после трансплантации клеток). Выведение животных из эксперимента проводили в С02-камере. Для гистологического исследования брали сердце, печень, селезенку и легкие, которые фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 2-х дней. Органы животных, которым вводили клетки, меченные флуоресцентной меткой, после изъятия помещали в жидкий азот и в дальнейшем до приготовления криосрезов хранили при -70°С. Для дальнейшей обработки и приготовления парафиновых срезов использовали ксилол-спиртовую гистологическую проводку. Срезы селезенки, печени и легких делали на 3 разных уровнях, выбранных случайным образом. Срезы сердца делали на 10 разных уровнях на протяжении от верхушки сердца до предсердий. Из органов животных, которым вводили меченные РКН26 клетки, после криофиксации делали криосрезы с помощью криостата НМ525 MICROM и проводили анализ миграции клеток в органах с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 (Carl Zeiss, Германия), подсчитывая количество меченых клеток в 50 полях зрения.

Гистологические срезы сердца окрашивали пикросириусом красным для выявления зоны рубца и оценки в поляризованном свете доли зрелого и незрелого коллагена. Срезы печени, легких и селезенки окрашивали гематоксилином и эозином. Для исследования васкуляризации и подсчета клеток в рубце серийные поперечные срезы окрашивали по Маллори.

Морфометрическое исследование. При морфометрическом исследовании серийных поперечных срезов сердца измеряли следующие

показатели: толщину стенки левого желудочка в области рубца, толщину стенки левого желудочка в перифокальной области, площадь рубцовой зоны, площадь полости левого желудочка, площадь стенки левого желудочка, общую площадь левого желудочка.

На основании первичных данных измерений рассчитывали следующие индексы, выраженные в процентах:

1. Объемная доля рубцовой ткани - отношение площади рубцовой ткани к площади стенки левого желудочка.

2. Индекс дилатации левого желудочка - отношение площади полости левого желудочка к общей площади левого желудочка.

3. Относительная толщина рубца - отношение толщины стенки левого желудочка в области рубца к толщине стенки левого желудочка в перифокальной области.

4. Индекс гипертрофии левого желудочка - отношение толщины стенки левого желудочка в перифокальной области к толщине межжелудочковой перегородки.

При исследовании срезов сердца, окрашенных по Маллори, определяли общее количество сосудов на квадратный миллиметр и объемную плотность кровеносных сосудов в области рубца на 14-е и 30-е сут после трансплантации:

1. Общее количество сосудов на мм2 определяли как отношение количества сосудов в поле зрения к площади поля зрения (в мм2), умноженное на 100.

2. Объемную плотность кровеносных сосудов в области рубца определяли как отношение площади кровеносных сосудов в поле зрения к площади поля зрения, умноженное на 100.

Отдельно подсчитывали количество артериол, венул и капилляров, измеряли их площадь, обводя их контур по внешнему диаметру. Вычисляли процентные доли капилляров, артериол и венул, количество артериол, капилляров и венул на квадратный миллиметр. Кроме того, на окрашенных по Маллори срезах подсчитывали количество клеток в рубце.

Иммунногистохимическое исследование. Для проведения иммуногистохимического исследования использовали как парафиновые срезы, так и криосрезы. Парафиновые срезы перед иммуногистохимическим окрашиванием депарафинировали, криосрезы сразу помещали в фосфатно-

солевой буфер. Для проведения исследования были выбраны следующие антитела фирмы Abeam: CD68 (мембранный маркер макрофагов), KÍ67 (ядерный маркер пролиферации), Fapa (мембранный маркер реактивных фибробластов), a-SMA (a-гладкомышечный актин). В качестве системы визуализации использовали биотин-стрептавидин-пероксидазный комплекс (Dako), в качестве блокатора пептидов - 10% раствор БСА.

Для определения дифференцировки трансплантированных мононуклеаров сопоставляли две метки: одновременное наличие флуоресцентной мембранной метки РкН26 и иммуногистохимического маркера свидетельствовало о том, что дифференцировалась именно трансплантированная клетка.

RT-PCR. Полимеразную цепную реакцию в реальном времени (RT-PCR) проводили согласно рекомендованной производителем реактивов (QIAGEN) схеме. РНК выделяли из образцов фракции мононуклеаров (стандартным фенольным способом и с использованием набора RNeasy Mini Kit). Проверяли чистоту выделенной РНК электрофоретически и с помощью спектрофотометра. На ее матрице синтезировали кДНК (с использованием набора RT2 First Strand Kit фирмы SABioscience) и ставили RT-PCR (с использованием набора The Rat Angiogenesis RT2 Profiler™ PCR Array). Все этапы проводили согласно протоколам фирм-производителей. Данный набор был выбран для комплексной количественной оценки рецепторов ангиогенеза и экспрессии генов факторов роста. Помимо этого, с помощью данного набора можно оценить экспрессию молекул адгезии и матричных белков, а также протеиназ и их ингибиторов, цитокинов и хемокинов, принимающих участие в процессе ангиогенеза (Табл.1).

Сравнение уровня экспрессии вышеуказанных генов проводили с генами «домашнего хозяйства» («house-keeping» genes).

Статистический анализ. Для абсолютных и процентных показателей определяли средние значения, медианы и стандартные ошибки среднего. Абсолютные показатели при условии нормального распределения сравнивали с помощью критерия Стьюдента. При распределении, отличном от нормального, использовали /¿-тест, z-тест и тест Манна-Уитни. Сравнения процентных показателей проводили с помощью рангового однофакторного дисперсионного анализа Краскала-Уоллиса. Статистический анализ проводили с помощью

программы SigmaStat 3.5. Различия считали значимыми при достигнутом 95% уровне достоверности.

Статистический анализ данных ПЦР проводили с помощью RT2 Profiler PCR Array Data Analysis Template v3.3.

Таблица 1. Обозначение генов ангиогенеза на плашке в исследовании RT-PCR.

А В С D E F G H

01 Angpt2 Cxcl9 Fgfl 6 Ifnal Lectl Pdgfb Tgfbl Rplpl

02 Aktl Tymp Fgß Ifnbl Lep Pecaml Tgfb2 Hprtl

03 Angptl Slprl Fgf6 Ifng Марк 14 Pgf Tgfb3 Rpll3a

04 Anpep Efnal Fgfr3 Igfl Mdk Plau Tgfbrl Ldha

05 Bail Efna2 Figf Illb Mmpl9 Plg Thbs4 Actb

06 Ccl2 Efna5 Fltl 116 Mmp2 Ptgsl Timpl RGDC

07 Cdh5 Egf Fnl Itga5 Mmp3 Serpinb5 Timp2 RTC

08 Coll8al Eng Fzd5 Itgav Mmp9 Serpinfl Timp3 RTC

09 Col4a3 Epasl Hgf ltgb3 Nprl Sphkl Tnf RTC

10 Ctgf Ereg Hifl а Jagl Nrpl Tbx4 Vegfa PPC

11 Cxcll F2 Idl Kdr Nф2 Тек Vegfb PPC

12 Cxcl2 Fgfl Id3 Lama5 Pdgfa Tgfa Vegfc PPC

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка модели интракороиарной траисвентрикулярной трансплантации. Разработана модель интракороиарной траисвентрикулярной трансплантации клеток мелким лабораторным животным, особенность которой состоит в том, что вследствие пережатия аорты большая часть клеток попадает в зону повреждения. Ранее хирургические операции подобной сложности выполняли на крупных животных - кроликах и свиньях. Подобная модель позволяет осуществлять интракоронарные трансплантации мелким лабораторным животным без рентгенографического контроля локализации

катетера, что позволяет проводить эксперименты с меньшими затратами на содержание животных и, таким образом, увеличивать выборки.

По эффективности разработанная модель сравнима с интрамиокардиальной и обеспечивает доставку большого количества трансплантированных клеток в зону повреждения (50,04% клеток через 14 сут, 40,07% клеток через 30 сут). По сравнению с интрамиокардиальной, разработанная модель менее инвазивна и не требует операции на открытом сердце. Тем не менее, из-за тяжести процедуры пережатия аорты, погибло 5 животных контрольной и 4 животных опытной группы (27,7% и 17,4% соответственно). Смерть наступала либо во время хирургических операций, либо в течение двух суток после операций, и не зависела от состава введенного трансплантата (мононуклеары или физиологический раствор).

Второе преимущество разработанной модели состоит в том, что в отличие от других способов трансплантации она позволяет использовать клеточные трансплантаты с разными потенциями к направленной миграции, так как при пережатии аорты клетки попадают в полость левого желудочка в область максимальной концентрации хемоаттрактантов, а не в сосуды большого круга кровообращения.

Выживаемость трансплантированных клеток. Было установлено, что трансплантированные клетки не элиминировались и сохраняли жизнеспособность в течение как минимум 30-и сут после трансплантации. На гистологических срезах клетки имели вид неповрежденных, по фенотипу не отличались от клеток стромы, вокруг них не было обнаружено выраженной лимфо-макрофагальной инфильтрации. Иммуногистохимический анализ с использованием мАТ к маркеру макрофагов CD68 показал присутствие макрофагов как в контрольной, так и в опытных группах, при этом их количество достоверно не различалось (р=1,000).

Окрашенные CD68 единичные трансплантированные клетки, несшие РкН26 метку, вероятно, элиминировались макрофагами, но при этом морфологические признаки острой воспалительной реакции отсутствовали. Не исключено, что единичные трансплантированные клетки дифференцировались в макрофаги, так как известно, что во фракции мононуклеаров присутствуют предшественники клеток миелоидного ряда (Ярилин A.A., 1999).

Топография трансплантированных мононуклеаров. Было показано, что при неселективном интракоронарном введении меченые мононуклеары локализуются в основном в сердце и селезенке (Рис.1).

Наличие меченых клеток в селезенке связано с тем, что данный орган является естественной нишей введенного клеточного трансплантата. В сердце клетки располагались только в рубцовой зоне сердца, что свидетельствует о направленной миграции трансплантированных мононуклеаров. Ни одной меченой клетки не было обнаружено в перифокальной области, в неповрежденном миокарде и стенках кровеносных сосудов. Отсутствие РкН26 метки в кардиомиоцитах, клетках эндотелия и гладкомышечных клетках кровеносных сосудов свидетельствует о том, что трансплантированные мононуклеары не дифференцируются в кардиомиоциты, клетки кровеносных сосудов и не сливаются с ними в синцитий. Подобная локализация была отмечена и другими исследователями, особенно при интракоронарных инъекциях (МакеШ I. е! а!., 2009).

Рис. 1. Распределение трансплантированных мононуклеаров по органам через 14 (А) и 30 сут (Б) после трансплантации.

Иммунофенотип трансплантированных клеток. Вопрос о дифференцировке мононуклеаров до сих пор остается открытым. Зачастую в экспериментах in vivo одного наличия маркеров недостаточно для заключений о дифференцировке клеток. О ней можно косвенно судить по морфологии и

локализации клеток, а также по наличию различных типов контактов с окружающими клетками. Поэтому в данном исследовании, помимо реакции с мАТ, рассматривали и локализацию, и морфологию трансплантированных мононуклеаров.

Трансплантированные мононуклеары располагались в сердце только в области рубца в толще соединительной ткани как через 14, так и через 30 сут после трансплантации, были окружены коллагеновыми волокнами. Некоторые мононуклеары окрашивались мАТ к маркеру реактивных фибробластов Рара и мАТ к маркеру миофибробластов а-АБМА. Таким образом, учитывая особенности локализации, фенотип и экспрессию Рара и а-А8МА, можно сделать вывод, что, по крайней мере, часть трансплантированных мононуклеаров дифференцируется в фибробласты и миофибробласты (Табл.2).

Таблица 2. Клеточный состав рубцовой зоны через 14 и 30 сут после трансплантации мононуклеаров.

Показатель Контрольная группа Опытная группа

14 сут 30 сут 14 сут 30 сут

Количество клеточных элементов в рубце 51, 3±1,4 49, 0±1 80,8±2,5 * 76,7±1,0 *

Количество пролиферирующих клеток в рубце 17,3±0,6 16,8±0,7 27,4±0,7 * 24,2±0,9 *

Количество фибробластов в рубце 12,8±0,6 14,6±0,5 16,3±0,5 * 16,6±0,3 *

Количество миофибробластов в рубце 2,6±0,2 3,4±0,2 6,4±0,6 * 8,8±0,6 *

Примечание: * - р<0,05 при сравнении с контрольной группой

Не было обнаружено ни одного мононуклеара, дифференцировавшегося в кардиомиоцитарном направлении. Даже если бы единичные клетки дифференцировались в кардиомиоциты, установка щелевых контактов с функционально активными неповрежденными кардиомиоцитами была бы невозможна из-за особенности их локализации, так как клетки были окружены пучками коллагеновых волокон. Следовательно, говорить о существовании функционально активных кардиомиоцитов, возникших вследствие дифференцировки мононуклеаров, невозможно. В проведенных экспериментах

не подтвердились данные о том, что трансплантированные мононуклеары способны дифференцироваться в гладкомышечные и эндотелиальные клетки стенки сосудов, приводимые рядом исследователей (Prockop D.J., 1997; Wang T. et al., 2009; Li C.J. et al., 2010; Hosoda T. et al., 2010). В опытной группе не было обнаружено ни одной РкН26-меченной клетки, входящей в состав внутренней и

средней стенки сосудов.

Полученные данные совпадают с данными Orlic D. и его коллег (2001), а также Yang S.E. (2004), которые свидетельствуют о возможности дифференцировки мононуклеаров в фибробласты и миофибробласты под воздействием факторов роста и дифференцировки.

Данные результаты противоречат утверждениям некоторых исследователей (Bell A. et al., 2010) о том, что мононуклеары способны дифференцироваться в гладкую и поперечно-полосатую мышечную ткань, кардиомиоциты и клетки эндотелия сосудов. Авторами показана подобная дифференцировка in vitro, но данных о возможности дифференцировки мононуклеаров в кардиомиоциты in vivo недостаточно (Gnecchi M. et al., 2008;

Brunner S. et al., 2008).

Васкуляризация миокарда после трансплантации мононуклеаров.

Трансплантированные мононуклеары не дифференцировались в клетки стенок кровеносных сосудов, но, несмотря на это, трансплантация приводила к стимуляции ангиогенеза. Через 14 сут после трансплантации количество кровеносных сосудов на мм2 в опытной группе было меньше, чем в контрольной, но объемная плотность кровеносных сосудов у животных опытной группы была достоверно больше (р<0,001), что свидетельствует о большем калибре новообразованных сосудов при трансплантации мононуклеарных клеток. На 30-е сут уже и количество (р<0,001), и объемная плотность (р=0,004) сосудов в опытной группе была больше, чем в контрольной (Рис.2). При этом следует отметить, что по сравнению с контрольной группой, где наблюдалось уменьшение количества сосудов, в опытной группе показатели количества и объемной плотности сосудов были стабильными.

Рис. 2. Количество сосудов (А) на квадратный мм2 и объемная плотность сосудов (Б) через 14 и 30 сут после трансплантации. Примечание: * - р<0,05 при сравнении с контрольной группой, # - р<0,05 при сравнении с исходным значением.

Подобная динамика наблюдалась и при подсчете количества капилляров на мм2 среза рубцовой ткани. На 14-е и 30-е сут количество капилляров в опытной группе было достоверно меньше, чем в контрольной (р<0,001) (Рис.3). Но к 30-м сут количество капилляров в рубце животных контрольной группы достоверно снижалось, тогда как у животных опытной группы наблюдалась стабильность данного показателя (р = 0,267). Количество артериол на мм2 в обеих группах было стабильно (Рис.3). Однако в рубце опытной группы количество артериол было меньше, чем в контрольной (р = 0,901). Доля венул в рубце контрольной группы к 30-м сут увеличивалась (р <0,001), когда как в рубце опытной группы на 14 и 30 сутки количество венул оставалось стабильным и на обоих сроках превышало контрольные значения (Рис. 3).

Таким образом, согласно полученным данным, трансплантация мононуклеаров стабилизировала и стимулировала ангиогенез, что соотносится с уже известными данными о процессах ангиогенеза в поврежденном миокарде ^БИаП К.Ь. ег а1, 2003; Рикис1а Б, 2004). По данным литературы, при трансплантации стволовых клеток увеличивалось количество и капилляров, и венул, и артериол за счет дифференцировки трансплантированных клеток в гладкомышечные и эндотелиальные (БЫШаш Б. еЬ а1, 2001; Та§исЫ А. е1 а1,2004). Возможно, снижение активности артериогенеза после трансплантации мононуклеаров в проделанном исследовании связано с тем, что трансплантированные клетки не дифференцировались в гладкомышечные

стенки сосудов, а деление гладкомышечных клеток предсуществующих артериол и миграция гладкомышечных клеток не обеспечивали образования новых артериол.

Цкапилляры |артсриолы

0,9% У

В Я^

43,5%

' : 85,3%

55,8%

о;

Рис. 3. Доля капилляров, артериол и венул через 14 и 30 сут после трансплантации. А - опытная группа, 14 сут, Б - опытная группа, 30 сут, В -контрольная группа, 14 сут, Г - контрольная группа, 30 сут.

Экспрессия генов во фракции мононуклеаров. Во всех образцах фракций мононуклеаров была установлена сверхэкспрессия таких факторов, как генов семейства Тп/ и Angpt, а также генов семейства Вероятно, сверхэкспрессия после трансплантации приводила к стабилизации

ангиогенеза, а сверхэкспрессия - к увеличению количества капилляров за счет пролиферации клеток эндотелия. Так как дифференцировавшиеся в фибробласты и миофибробласты мононуклеары не способны к секреции

факторов роста и дифференцировки, то, вероятно, к секреции паракринных факторов после трансплантации способны не дифференцировавшиеся мононуклеары, сохранившиеся в зоне рубца.

Повышенный уровень экспрессии Pecaml, гена молекул адгезии эндотелиальных клеток, вероятнее всего, связан с тем, что во фракцию мононуклеаров входят эндотелиальные клетки-предшественники, способные паракринным способом регулировать рост эндотелия сосудов (Yoon С.Н. et al., 2005). Повышенный уровень экспрессии гена Pecaml в мононуклеарах после трансплантации, вероятно, приводит к стимуляции формирования капилляров.

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что во фракции мононуклеаров экспрессия генов ангиогенеза, факторов роста и дифференцировки повышена. Терапевтический эффект после трансплантации мононуклеаров, по-видимому, и реализуется за счет сверхэкспрессии данных генов, а не за счет их дифференцировки в кардиомиоцитарном направлении, как считают некоторые исследователи (Johnston P.V. et al., 2009; Bell A. et al., 2010; ZakharovaL. etal.,2010).

Морфология рубцовой ткани постинфарктного сердца. К моменту выведения животных из эксперимента (44-е и 60-е сут после инфаркта миокарда) у животных обеих групп в миокарде были выявлены очаги рубцовой ткани. Рубец представлял собой плотно-волокнистую соединительную ткань, богатую коллагеновыми волокнами, среди которых были как толстые пучки коллагена I типа, так и тонкие пучки коллагена III типа. Между коллагеновыми волокнами располагались клетки полигональной и/или веретеновидной формы, количество которых снижалось по мере приближения к перифокапьной зоне. В рубцовой ткани опытной группы была выявлена достоверно большая (с><0,001) плотность клеточных элементов как на 14-е, так и на 30-е сут после трансплантации, чем в контрольной (Табл.2). На 14-е сут большая часть клеток была представлена мечеными трансплантированными клетками, а на 30-е сут доля меченых клеток уменьшалась.

В рубце у крыс опытной группы было выявлено достоверно большее количество как фибробластов, так и миофибробластов (р<0,001) по сравнению с контролем, количество которых незначительно увеличивалось в обеих группах к 8 неделе после острого инфаркта миокарда (Табл.2). Так как Fapa окрашивает только реактивные фибробласты, можно заключить, что фибробласты рубцовой

зоны активно синтезировали коллаген, укрепляя тем самым стенку левого желудочка.

Окрашивание с мАТ к маркеру пролиферации Кл67 выявило три зоны пролиферации - эпикард, стенки кровеносных сосудов и постинфарктный рубец. При этом пролиферация клеток рубца активно шла в обеих группах (Табл.2). Ни в опытной, ни в контрольной группе не было обнаружено ни одного Кл67+ кардиомиоцита. Пролиферировапи только клетки стромы, эндотелиальные клетки сосудов и клетки эпикарда. Единичные пролиферирующие клетки были обнаружены в адвентиции сосудов перифокальной зоны. Количество пролиферирующих клеток в зоне рубца на всех сроках наблюдения было выше в опытной группе по сравнению с контролем. Пролиферация, по-видимому, была индуцирована паракринными факторами роста, синтезируемыми трансплантированными мононуклеарами.

Трансплантация клеток приводила к утолщению стенки сердца в области рубца (Табл.3).

Таблица 3. Морфометрические показатели левого желудочка через 14 и 30 сут после трансплантации мононуклеаров _____

Показатель Контрольная группа Опытная группа

14 сут 30 сут 14 сут 30 сут

Толщина стенки в области рубца 33,1±1,0 33,1±1,4 40,3±1,8 * 43,1±1,3 *

Размер рубца 7,6±1,3 7,4±0,7 5,1±0,8 * 10,0±1,0 *#

Объемная доля коллагена I типа в рубце 77,9±3,3 87,2±1,7 # 92,0±0,9 * 87,5±1,9 #

Индекс дилатации левого желудочка 24,2±1,4 27,6±1,0 19,7±1,1 32,6±1,7 #

Индекс гипертрофии перифокальной области левого желудочка 73,1 ±2,5 67,5±2,1 72,2±2,6 69,8±1,6

Примечание: # - р<0,05 при сравнении с исходным значением

* - р<0,05 при сравнении с контрольной группой

Утолщение стенки связано с выработкой коллагена фибробластами сердца и мононуклеарами, дифференцировавшимися в фибробласты и миофибробласты. Было выявлено, что после трансплантации происходит

ускорение созревания рубцовой ткани, состоящее в перестройке коллагена III типа в коллаген I типа. Доля зрелого коллагена была достоверно выше в опытной группе по сравнению с контрольной уже на 14-е сут после трансплантации (Табл.3). Вероятно, ускорение созревания коллагена связано с повышенной экспрессией генов семейства Мтр. Согласно данным RT-PCR, во фракции мононуклеаров повышен уровень экспрессии Мтр9. Так как не все трансплантированные мононуклеары дифференцировались в фибробласты, то, возможно, экспрессия Мтр9 не дифференцировавшимися мононуклеарами привела к ускорению созревания коллагена. Полученные данные не согласуются с утверждениями некоторых ученых о том, что для мононуклеаров характерна пониженная экспрессия генов семейства Мтр (Hirohata S. et а!., 1997; Vu Т.Н. et al., 2000).

Хотя существуют данные о том, что трансплантация мононуклеаров приводит к уменьшению рубца (Orlic D. et al., 2001; Henning RJ. et al., 2007) за счет дифференцировки трансплантированных клеток в кардиомиоциты, в данном исследовании активный синтез коллагена клетками, дифференцированными из трансплантированных мононуклеаров, и собственными фибробластами сердца привел к увеличению размера рубца через 30 сут после трансплантации (Табл.3).

Функциональные показатели работы сердца. Важными показателями функциональной активности сердца являются систолическое давление и скорость повышения давления в левом желудочке. Данные показатели отражают изменение систолической функции и глобальной сократимости левого желудочка.

Согласно полученным результатам, систолическое давление в левом желудочке через 30 сут после трансплантации было выше в опытной группе по сравнению с контролем (136±7 мм.рт.ст. по сравнению с 116±3 мм.рт.ст., /7<0,01).

Подобную картину наблюдали и при сравнении показателя скорости повышения давления в левом желудочке, которая увеличивалась через 30 сут после трансплантации в опытной группе (9320±655 мм.рт.ст./с по сравнению с 7781±364 мм.рт.ст./с в контрольной группе, р<0,01).

Ремоделирование левого желудочка. Установлено, что после трансплантации мононуклеаров индекс гипертрофии достоверно не различался

между опытом и контролем, а индекс дилатации левого желудочка возрастал к 30-м суткам после трансплантации (Табл.3). Таким образом, улучшение функциональных показателей, скорее всего, обусловлено не структурной перестройкой миокарда, а увеличением механической прочности рубцовой ткани вследствие более активной пролиферации фибробластов.

Таким образом, можно заключить, что интракоронарная трансплантация мононуклеаров безопасна и эффективна. Мононуклеары как клеточный трансплантат оказывают стабилизирующее и стимулирующее влияние на ангиогенез в области постинфарктного рубца в миокарде, вероятно, за счет паракринных механизмов. Трансплантированные мононуклеары дифференцируются не в кардиомиоциты и клетки стенки кровеносных сосудов, а в фибробласты и миофибробласты, за счет чего происходит укрепление стенки левого желудочка в области рубца. Мононуклеары стимулируют увеличение площади рубца, но не влияют на процессы постинфарктного ремоделирования. Трансплантация нефракционированных мононуклеаров может быть использована в качестве вспомогательного метода при медикаментозном и хирургическом лечении больных инфарктом миокарда. По-видимому, в дальнейших исследованиях следует использовать отдельные фракции мононуклеаров, такие, как мультипотентные стромальные клетки, или проводить их преддифференцировку с целью повышения эффективности трансплантации.

Выводы

1. Разработана эффективная методика интракоронарного трансвентрикулярного введения аутологичных мононуклеаров мелким лабораторным животным после индуцированного инфаркта миокарда с реперфузией.

2. При интракоронарном введении меченые клетки выживают как минимум в течение месяца после трансплантации. Трансплантированные клетки локализуются преимущественно в сердце, причем только в рубцовой зоне, и селезенке Через 14 сут после трансплантации количество меченых клеток в сердце составило 1996,6±65,8 клеток на мм2, через 30 сут -1336,7±29,7 клеток.

3. Трансплантированные мононуклеары дифференцируются в фибробласты и миофибробласты рубцовой ткани, обладающие характерной морфологией и специфическими маркерами a-SMA и Fapa. Трансплантированные мононуклеары не сливаются с кардиомиоцитами, не дифференцируются в кардиомиоциты и клетки кровеносных сосудов.

4. Трансплантация клеток стабилизирует ангиогенез, поддерживая количество артериол и капилляров на постоянном уровне, и способствует увеличению количества венул. Это может быть обусловлено сверхэкспрессией ангиогенных факторов (генов семейства Vegf), факторов роста (генов семейства Tg/}, хемоаттрактантов и молекул адгезии (Ресат!) во фракции мононуклеаров.

5. Трансплантация мононуклеаров стимулирует пролиферативную активность клеток стромы. Пролиферация клеток соединительной ткани и самих трансплантированных мононуклеаров увеличивает количество клеточных элементов в рубце.

6. Трансплантация мононуклеаров не увеличивает степень гипертрофии левого желудочка.

7. Трансплантация ускоряет процесс созревания коллагена в рубце, изменяя активность генов семейства Мтр и Akt, влияющих на процессы синтеза, созревания и деградации коллагена. Синтез коллагена фибробластами сердца и мононуклеарами, дифференцировавшимися в миофибробласты и фибробласты, приводит к утолщению стенки левого желудочка в области

рубца, препятствуя ее разрыву и увеличивая размер рубца у животных опытной группы по сравнению контрольной.

8. Трансплантация мононуклеаров улучшает функциональное состояние левого желудочка. После трансплантации мононуклеаров увеличивается максимальное давление в левом желудочке и скорость его повышения. Это способствует увеличению глобальной сократимости сердца и систолической функции левого желудочка.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Байкова Ю.П., Фатхудинов Т.Х., Большакова Г.Б., Бухарова Т.Б., Слащёва Г.А., Хохлова О.В., Мурашев А.Н., Гольдштейн Д.В. Репарация миокарда при трансплантации мононуклеарных клеток костного мозга // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2010. - №4. - С. 203 -211.

2. Фатхудинов Т.Х., Байкова Ю.П., Большакова Г.Б., Бухарова Т.Б., Дубовая Т.К., Кактурский Л.В., Гольдштейн Д.В. Влияние трансплантации мононуклеаров красного костного мозга на ангиогенез у крыс // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2011. - №. 3-С. 132- 136.

3. Байкова Ю.П., Фатхудинов Т.Х., Большакова Г.Б., Бухарова Т.Б., Дубовая Т.К., Кактурский Л.В., Гольдштейн Д.В. Пути дифференцировки мононуклеарных клеток костного мозга при трансплантации в постинфарктное сердце// Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2011. - №. 3- С. 140 -146.

Соискатель /С./?Ю.П. Байкова

Заказ № Об-а/11/2011 Подписано в печать 01.11.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Байкова, Юлия Павловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. КАРТИНА ИНФАРКТА МИОКАРДА.

1.2. РЕПАРАЦИЯ МИОКАРДА ПОСЛЕ ОСТРОГО ИНФАРКТА.

1.2.1. Формирование рубца.

1.2.2. Гипертрофия и пролиферация кардиомиоцитов после инфаркта.

1.2.3. Ангиогенез.

1.2.4. Резидентные прогениторные клетки.

1.2.5. Экзогенные клетки-предшественники.

1.3. КЛЕТКИ КРАСНОГО КОСТНОГО МОЗГА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ПРИ ИНФАРКТАХ.

1.3.1. Мононуклеары.

1.3.2. Мультипотентные стромальные клетки.

1.3.3. Гемопоэтические стволовые клетки.

1.3.4. Эндотелиальные клетки.

1.4. МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ТРАНСПЛАНТИРОВАННЫХ КЛЕТОК

1.4.1. Заместительный механизм.

1.4.2. Слияние клеток.

1.4.3. Индукционный механизм.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.1. Содержание животных.

2.1.2. Группы исследования и схема эксперимента.

2.1.3. Получение клеточного трансплантата.

2.1.4. Экспериментальный инфаркт миокарда и интракоронарная трансплантация мононуклеаров.

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.2.1. Прижизненные методы исследования.

2.2.2. Методы исследования, используемые после выведения животных из эксперимента.

2.2.3. Статистический анализ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Разработка модели интракоронарной трансплантации мононуклеаров крысам.

3.2. Изменение физического состояния крыс в ходе эксперимента.

3.3. Топография меченых мононуклеаров через 14 и ЗОсуток после их интракоронарной трансвентрикулярной трансплантации.

3.4. Оценка интенсивности макрофагальной реакции в миокарде в ответ на трансплантацию МН.

3.5. Иммунофенотип трансплантированных клеток.

3.6. Васкуляризация рубцовой зоны миокарда после трансплантации мононуклеаров.

3.7. Экспрессия генов во фракции мононуклеаров красного костного мозга

3.8. Морфология рубцовой ткани постинфарктного сердца.

3.9. Ремоделирование левого желудочка.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Разработка модели интракоронарной трансвентрикулярной трансплантации.

4.2. Изменение функциональных показателей работы сердца после трансплантации МН у крыс в постинфарктном периоде.

4.3. Локализация и выживаемость клеток, трансплантированных крысам в постинфарктном периоде.

4.4. Иммунофенотип трансплантированных клеток в миокарде крыс в постинфарктном периоде.

4.5. Влияние трансплантации МН на васкуляризацию миокарда крыс в постинфарктном периоде.

4.6. Влияние трансплантации мононуклеаров на гены ангиогенеза.

4.7. Морфология рубцовой ткани постинфарктного сердца.

4.8. Постинфарктное ремоделирование ЛЖ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Репарация и васкуляризация инфарктной зоны миокарда у крыс после трансплантации мононуклеаров красного костного мозга"

Актуальность проблемы. Клеточная терапия — трансплантация стволовых прогениторных клеток, позволяющая стимулировать репарацию поврежденных тканей, — на сегодняшний день уже стала реальностью (Anversa» Р: et al., 2004; Gersh В. J., Simari D.R., 2006). Лечение таких заболеваний, как инфаркт миокарда (ИМ), ишемическая болезнь сердца и вызванного ими состояния хронической сердечной недостаточности (ХСН) на данныйг момент осуществляется с помощью хирургического вмешательствами медикаментозной терапии (Болл и др., 1995; Куртова А.В. и др., 2006). Однако в последнее время ведется разработка нового способа терапишс использованием, стволовых/прогениторных клеток (Шахов В.П., Попов C.B., 2004; Dai W., Kloner R.A., 2010; Li J. et al., 2010). Современная медикаментозная терапия и хирургическое лечение дают положительные клинические результаты, но не могут решить основную проблему — восстановление поврежденной инфарктом ткани^ миокарда (Потапов И.В. и др., 2001; Leri A. et al., 2005; Yacoub M. et al., 2006).

За последнее десятилетие было накоплено» большое количество экспериментальных данных, свидетельствующих об эффективности и безопасности трансплантации клеток в сердце (Joggerst S J., Hatzopoulos A.K.,

2009; Zhang С. et al:, 2010). Было выявлено, что трансплантированные клетки могут выживать и участвовать в регенерации и реваскуляризации миокарда

Cleland J.F.G. et al., 1999; Pangonyte D. et al., 2008). Однако до сих пор нет достоверных данных о том, что трансплантация клеток позволяет не просто восстановить функцию поврежденного миокарда, но в значительной* мере устранить и само повреждение (Prockop D.J., 1997; Wang T. et al., 2008).

Также остается неясным, какой именно клеточный трансплантат (КТ) 8 является наиболее безопасным и эффективным. Многие исследователи считают, что нефракцированные мононуклеары (МН) являются наиболее удобным клеточным трансплантатом (Zhang S. et al., 2010) по ряду причин. Во-первых, МН получают из красного костного мозга, который является наиболее доступным источником получения прогениторных клеток. Во-вторых, трансплантат МН не требует культивирования и преддифференцировки, фенотипирования и отбора нужной фракции, что значительно сокращает время приготовления трансплантата и снижает финансовые затраты. Кроме того, в состав фракции МН входят и мультипотентные стромальные клетки (МСК), и гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), и предшественники миелоидного ряда, что позволяет воспроизвести и оценить комплексное влияние клеток красного костного мозга на репарацию, так как в естественных условиях в область повреждения 1 мигрируют все типы прогениторных клеток костного мозга (Iwase Т. et al., 2005).

Экспериментальные данные, полученные после трансплантации МН, несмотря на их противоречивость, послужили основой для проведения ряда клинических испытаний. Но результаты клинических исследований не могут дать столь же подробную информацию о процессе регенерации после трансплантации клеток, как результаты экспериментальных, из-за их специфики: малых выборок, невозможности проведения многих гистологических методов анализа и др.

Однако, несмотря на недостаток данных и некоторое количество спорных вопросов, клеточная терапия приводит к положительным результатам, что свидетельствует о перспективах данного метода и целесообразности его внедрения в широкую практику. Для дальнейшего развития и совершенствования данного метода необходимо знание точных механизмов действия трансплантированных клеток и разработка эффективной методики и знание.

Цель исследования - изучить особенности ангиогенеза и репаративной регенерации инфарктной зоны миокарда крыс после трансплантации аутологичных мононуклеаров красного костного мозга.

Задачи:

1. Разработать метод интракоронарной трансвентрикулярной трансплантации мононуклеаров костного мозга при экспериментальном инфаркте миокарда.

2. Исследовать распределение трансплантированных мононуклеаров в сердце и других органах через 2 и 4 недели после трансплантации.

3. Определить иммунофенотип трансплантированных мононуклеаров через 2 и 4 недели после трансплантации.

4. Изучить особенности васкуляризации рубца после трансплантации мононуклеаров.

5. Оценить влияние трансплантации мононуклеаров на ремоделирование левого желудочка.

6. Оценить глобальную сократимость левого желудочка сердца после трансплантации мононуклеаров.

7. Оценить влияние трансплантации мононуклеаров на активность генов ангиогенеза.

Научная новизна. Разработана модель интракоронарной трансплантации мононуклеаров мелким лабораторным животным, обеспечивающая эффективную доставку клеток в место повреждения.

Модифицированы протоколы иммуногистохимического и генетического исследования для крыс.

Исследована локализация и выживаемость мононуклеарных клеток после трансплантации в условиях экспериментального инфаркта миокарда. Произведена количественная оценка эффективности разработанного метода.

Определен иммунофенотип трансплантированных клеток. Показано участие траснплантированных мононуклеаров в процессе репарации. Установлено отсутствие заместительного эффекта и клеточного слияния. Подробно изучено влияние мононуклеаров на процессы ангиогенеза как на клеточном, так и на генетическом уровне.

Показана стимуляция клеточной пролиферации после трансплантации, приводящая к укреплению рубцовой зоны.

Изучено влияние трансплантации мононуклеаров на экспрессию генов ангиогенеза. Показана оверэкпрессия факторов ангиогенеза, факторов роста и дифференцировки, цитокинов и хемоаттрактантов после трансплантации мононуклеаров. Показано индуцирующее действие трансплантированных мононуклеаров на васкуляризацию миокарда. Выявлено стабилизирующее действие мононуклеаров на процессы реорганизации внеклеточного матрикса.

Проведена комплексная оценка влияния трансплантации на процесс ремоделирования левого желудочка. Показано отсутствие патологических изменений при ремоделировании после трансплантации.

Выявлена динамика процесса рубцевания после трансплантации. Дана оценка безопасности и эффективности мононуклеаров как клеточного трансплантата.

Научно-практическая значимость. Разработана модель интракоронарной клеточной трансплантации мелким лабораторным животным после экспериментального инфаркта миокарда, по эффективности сравнимая с интрамиокардиальной, но менее инвазивная. Полученные экспериментальные данные о безопасности и эффективности трансплантации мононуклеаров послужат основой для усовершенствования методики предклинических испытаний.

Разработанные для крыс протоколы иммуногистохимического и генетичекого исследования позволяют сократить время проведения эксперимента и финансовые затраты на необходимые реактивы.

Проведенное исследование позволяет использовать полученные данные не только в сфере лечения хронической сердечной недостаточности, но и в клеточной ангиопластике.

Проведенное исследование может служить основной для проведения дальнейших клинических испытаний.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Трансплантированные мононуклеары выживают и не элиминируются имунной системой в течение всего срока наблюдения. Они мигрирут в область повреждения миокарда, где локализуются только в толще коллагеновых волокон рубцовой зоны.

2. Трансплантированные мононуклеары частично дифференцируются в реактивные фибробласты и миофибробласты, синтезируя коллаген и укрепляя ткань рубца. Мононуклеары не дифференцируются в кардиомиоциты и клетки стенки кровеносных сосудов, а также не сливаются с ними.

3. Трансплантация монуклеаров оказывает стабилизирующее действие на ангиогенез, приводит к увеличению количества капилляров и калибра новообразованных сосудов.

4. Трансплантированные мононуклеары индуцируют пролиферацию клеток стромы в зоне рубца за счет выделения факторов роста.

5. Мононуклеары оказывают паракринный эффект на поврежденный миокард. Их трансплантация приводит к оверэкспрессии факторов роста и дифференцировки, факторов ангиогенеза, цитокинов и хемоаттрактантов. Оверэкспрессия данных факторов положительно влияет на процесс репарации. 6. Трансплантация мононуклеаров не вызывает патологических изменении при ремоделировании и улучшает функцию левого желудочка.

Внедрение. Результаты диссертационного исследования используются для составления лекионных и практических занятий на кафедре гистологии и эмбриологии лечебного факультета Российского гоударственного медицинского университета. На основании полученных данных могут быть разработаны протоколы клеточных трансплантаций для клинических исследований. Проведенное исследование может служить доклиническим исследованием оценки безопасности и эффективности трансплантации мононуклеаров красного костного мозга.

Степень личного вклада автора в результаты исследования. Автор принимал участие в хирургических операциях по моделированию инфаркта миокарда и хронической сердечно недостаточности, взятии красного костного мозга и интракоронарной трансплантации. Автор принимал участие в приготовлении клеточного трансплантата и витальном маркировании мононуклеаров. Автором было самостоятельно проведено гистологическое, иммуногистохимическое, морфометрическое исследование, полимеразная цепная реакция в реальном времени. Автор принимал участие в статистическом анализе полученных данных. Апробация работы. Основные положения работы доложены на: Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий в рамках приорететного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса Росии на 2007-2012 годы» (2009 и 2010 год, Москва, Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН); Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (25 - 28 октября 2010 года, Москва, факультет фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова); Научной конференции «Актуальные опросы морфогенеза в норме и патологии» (20 Юг, Москва, ГУ НИИ морфологии человека РАМН). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы, все в журналах, представленных в списках ВАК. Получен 1 патент. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 213 страницах машинописного текста и состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Литературный указатель включает 227 источников, из них 206 -иностранных, 21- отечественный. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 5 таблицами.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

На сегодняшний день существует необходимость в разработке принципиально новых, доступных и эффективных методов коррекции поврежденного миокарда (Потапов И.В. и др., 2001). Самая частая причина возникновения сердечной недостаточности - острый инфаркт миокарда (Болл С.Дж. и др., 1995).

В связи с развитием клеточной биологии в последние годы появился вспомогательный метод лечения заболеваний сердца, связанный с трансплантацией стволовых/прогениторных клеток (Reubinoff В.Е. et al., 2000; Dai W., Kloner R.A., 2010; Li J. et al., 2010). В настоящее время исследователи используют различные КТ, как-то: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (Orlic D. et al.,2001), гемопоэтические стволовые клетки (Hale L.S. et al., 2008), CD 133(+) клетки (Anversa P. et al., 2004), предшественники эндотелиальных клеток (Badorff С. et al., 2003), скелетные миобласты (Menasche P. et al., 2001), фетальные кардиомиоциты (Muller - Ehmsen J. et al., 2002), гладкомышечные клетки (ГМК) (Li R.K.et al.,1999). Положительные результаты предклинических и клинических испытаний позволяют использовать этот метод как вспомогательный метод при медикаментозном и хирургическом лечении ИМ и ХСН, а также перед трансплантацией сердца у больных, находящихся на листе ожидания (Шумаков В.И. и др., 2003).

Кардиомиоциты (КМЦ) являются высокодифференцированными клетками, поэтому их потенции к пролиферации и дифференцировке значительно снижены (Румянцев П.П., 1982; Anversa Р. et al., 2004). Поэтому основной вклад в регенерацию миокарда после повреждения вносит гипертрофия КМЦ (Qin D. et al., 1996). По данным последних исследований, после ИМ протекают также такие репаративные процессы, как пролиферация экзогенных клеток-предшественников кардиомиоцитов, гладкомышечных клеток сосудов и стромальных клеток (Tsiavou А. et al., 2010), мигрирующих под действием хемоаттрактантов из красного костного мозга (Anversa Р. et al., 2006; Dorreil С. et al., 2006; Bergmann О. et al., 2009).

На основании данных, полученных в экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo, исследователи обсуждают предполагаемые механизмы влияния клеточных трансплантатов на глобальную и региональную сократимость и перфузию миокарда. Среди возможных механизмов действия трансплантированных клеток на регенерацию миокарда первоначально выделяли заместительный (Orlic D. et al., 2001; Bell A. et al., 2010), индукционный (Wollert K.C. et al., 2010; Yoon C.H. et al., 2010) и ангиогенный эффекты (Sieveking P.D. et al., 2009). Заместительный эффект реализуется благодаря высокой пролиферативной активности стволовых/прогениторных клеток и возможности слияния и/или дифференцировки их в КМЦ (Johnston P.V. et al., 2009; Zakharova L. et al., 2010). Индукция регенерации происходит за счет синтеза и выделения трансплантированными клетками различных сигнальных молекул (Sadek H. et al., 2008), которые регулируют пролиферацию, миграцию и дифференцировку клеток в зоне повреждения (Burchfield J.S., Dimmeler S., 2008; Lee W.H. et al., 2009). Ангиогенный эффект, ранее выделяемый как отдельный механизм действия трансплантированных клеток, на данный момент считается одной из составляющих индукционного эффекта (Fukuda S., 2004).

Таким образом, на данный момент существует несколько теорий касательно механизмов действия трансплантированных клеток, объясняющий терапевтическую эффективность клеточных трансплантаций. Исследователи до сих пор не могут прийти к единому мнению, поэтому вопрос о механизме действия клеточных трансплантатов остается открытым и требует дальнейшего изучения.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Байкова, Юлия Павловна

выводы

2. При интракоронарном введении меченые клетки выживают как минимум в течение месяца после трансплантации. Трансплантированные клетки локализуются преимущественно в сердце, причем только в рубцовой зоне, и селезенке. Через 14 сут после трансплантации количество меченых клеток в сердце составило 1996,6±65,8 клеток на мм2, через 30 сут -1336,7±29,7 клеток.

3. Трансплантированные мононуклеары дифференцируются в фибробласты и миофибробласты рубцовой ткани, обладающие характерной морфологией и специфическими маркерами а-8МА и Бара. Трансплантированные мононуклеары не сливаются с кардиомиоцитами, не дифференцируются в кардиомиоциты и клетки кровеносных сосудов.

4. Трансплантация клеток стабилизирует ангиогенез, поддерживая количество артериол и капилляров на постоянном уровне, и способствует увеличению количества венул. Это может быть обусловлено сверхэкспрессией ангиогенных факторов (генов семейства факторов роста (генов семейства Tgf), хемоаттрактантов и молекул адгезии (PecamJ) во фракции мононуклеаров.

6. Трансплантация мононуклеаров не увеличивает степень гипертрофии левого желудочка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ко времени начала нашего исследования клеточная трансплантология уже стала вспомогательным методом лечения ряда сердечно-сосудистых заболеваний. Проведенные предклинические исследования позволили определить клеточные фенотипы, подходящие для трансплантации, разработать способы трансплантации и оценить влияние того или иного клеточного трансплантата на поврежденную сердечную ткань. Тем не менее, до сих пор ведутся споры о том, какую методику введения клеток считать оптимальным, какой клеточный трансплантат более безопасен и эффективен, каким образом реализуется терапевтический посттрансплантационный эффект.

В данном исследовании были изучены миграция, направления дифференцировки трансплантированных мононуклеарных клеток красного костного мозга, их роль в стимуляции ангиогенеза и репаративных процессов миокарда.

Разработана модель интракоронарной трансвентрикулярной трансплантации клеток мелким лабораторным животным. На сегодняшний день существует три способа трансплантации клеток — интрамиокардиальный, интракоронарный и интравенозный. На практике чаще всего используют интравенозную трансплантацию прогениторных клеток так как она наименее инвазивна. Интрамиокардиальная трансплантация наиболее инвазивна, но наиболее эффективна. Однако

169 интрамиокардиальную трансплантацию не всегда возможно применить в клинических условиях. Особенность модели состоит в том, что вследствие пережатия аорты большая часть клеток попадает в зону повреждения. Подобная модель позволяет осуществлять интракоронарные трансплантации мелким лабораторным животным, что позволяет проводить эксперименты с меньшими затратами на содержание животных и увеличить выборку.

Второе преимущество разработанной модели состоит в том, что она позволяет использовать клеточные трансплантаты с разными потенциями к направленной миграции, в том числе и преддиференцированные клетки, чьи потенции значительно снижены.

Трансплантированные клетки не элиминировались иммунной системой и сохраняли жизнеспособность в течение как минимум 4 недель после трансплантации. На гистологических срезах клетки имели вид неповрежденных, по фенотипу не отличались от клеток стромы, вокруг них не было выявлено выраженной лимфо-макрофагальной инфильтрации. Иммуногистохимический анализ мАТ к маркеру макрофагов (СБ68) показал присутствие макрофагов как в контрольной, так и в опытных группах. Окрашенные мАТ единичные флуоресцентные клетки, вероятно, элиминировались макрофагами, но при этом морфологические признаки реакции отторжения трансплантата отсутствовали. Не исключено, что единичные клетки дифференцировались в макрофаги, так как во фракции мононуклеаров присутствуют предшественники клеток миелоидного ряда.

Было показано, что при неселективном интракоронарном введении меченые МНК мигрируют в основном в сердце и селезенку. В сердце клетки располагались только в рубцовой зоне сердца. Ни одной меченой клетки не было обнаружено в перифокальной области,в неповрежденном миокарде и стенках кровеносных сосудов. Отсутствие РкН26 метки в КМЦ, клетках эндотелия и гладкомышечных клетках кровеносных сосудов свидетельствует о том, что трансплантированные мононуклеары не дифференцируются в КМЦ, клетки кровеносных сосудов и не сливаются с ними в синцитий.

Трансплантированные были окружены коллагеновыми волокнами, часть их окрашивалась АТ к маркеру реактивных фибробластов (Бара). Часть мононуклеаров также окрашивалась АТ к маркеру а-А8МА. Таким образом, учитывая особенности локализации, фенотипа и экспрессию Бара и а-АЭМА, можно сделать вывод, что по крайней мере часть трансплантированных мононуклеаров дифференцируется в фибробласты и миофибробласты.

Было обнаружено, что трансплантированные мононуклеары стабилизируют процессы ангиогенеза, поддерживая количество капилляров, артериол и венул на постоянном уровне. Стимуляцию ангиогенеза наблюдали только в увеличении калибра новообразованных сосудов. Через 30 суток после трансплантации помимо увеличения площади сосудистого поля наблюдали и увеличение количества сосудов.

Согласно результатам ЯТ-РСЯ, мононуклеары оверхэкспрессировали целый ряда ангиогенных факторов, в частности факторы семейства УЕОР.

Трансплантированные мононуклеары могли оказывать противовоспалительное действие, стимулируя экспрессию II1Ь. Кроме того, в МН повышена экспрессия хемоаттрактантов, таких, как Ресат1, необходимых для васкуляризации, и ростовых факторов и цитокинов (Т§£ Тп:Г), ускоряющих репарацию.

Мононуклеары участвуют в процессах обратного ремоделирования левого желудочка посредством регуляции активности генов семейства ММР и АкП, стабилизируя внеклеточный матрикс и регулируя процессы деградации и синтеза коллагена.

Одним из аспектов морфологии регенерирующей ткани является количество делящихся клеток. В исследовании было выявлено три зоны пролиферации - эпикард, стенки кровеносных сосудов и рубец. При этом пролиферация активно шла в обеих группах. Ни в опытной, ни в контрольной группе не было обнаружено ни одного К167+ КМЦ. Пролиферировали только клетки стромы, эндотелиальные клетки сосудов и клетки эпикарда. Количество пролиферирующих клеток на всех сроках наблюдения было выше в опытной группе. Пролиферация, вероятно, индуцирована паракринными факторами роста, синтезируемыми трансплантированными мононуклеарами.

Трансплантация клеток приводила к утолщению стенки сердца в области рубца. Утолщение стенки связано с выработкой коллагена фибробластами сердца и мононуклеарами, дифференцировавшимися в фибробласты и миофибробласты. После трансплантации происходит ускорение созревания рубцовой ткани, состоящее в перестройке коллагена III типа в коллаген I типа. Доля зрелого коллагена достоверно выше в опытной группе по сравнению с контрольной уже на 14 сутки после трансплантации. Тем не менее, активный синтез коллагена трансплантированными клетками и фибробластами сердца привел, к увеличению размера рубца через 30 суток после трансплантации.

Согласно полученным данным, траснплантация мононуклеаров не оказывает влияния на индекс гипертрофии левого желудочка и на 30 сутки увеличивает индекс дилатации. Вероятно, выделяемых мононуклеарами паракринных факторов не достаточно для полноценного ремоделирования левого желудочка. Это связано с тем, что мононуклеары в своем составе содержат разные клеточные популяции, из которых ГСК и ЭКП практически не оказывают паракринного влияния. Мононуклеры дифференцируются в фибробласты уже через 2 недели после трансплантации, а этого времени недостаточно, чтобы осуществилось ремоделирование. Несмотря на то, что мононуклеары не стимулируют ремоделирование левого желудочка, трансплантация улучшает функцию сердца. .

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что интракоронарная траснплантация мононуклеаров безопасна и эффективна. Мононуклеары как клеточный трансплантат оказывают стабилизирующее и стимулирующее влияние на ангиогенез, выделяя паракринные фаткоры роста и дифференцировки. Мононуклеары не дифференцируются в КМЦ и клетки стенки кровеносных сосудов, а дифференцируются в фибробласты и миофибробласты, за счет чего происходит укрепление стенки левого желудочка в области рубца. Тем не менее, мононуклеары приводят к увеличению площади рубца и не влияют на индекс гипетрофии. Этот факт позволяет сделать предположение, что в дальнейших исследованиях следует использовать отдельные фракции мононуклеаров, такие, как МСК, или проводить их преддифференцировку с целью повышения эффективности трансплантации. Трансплантация нефракционированных мононуклеаров может быть использована в качестве дополнительного метода при медикаментозном и хирургическом лечении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Байкова, Юлия Павловна, Москва

1. Амосова E.H. Кардиомиопатии. Киев:»Книга плюс», 1999.

2. Болл С.Дж, Кемпбелл Р.В.Ф, Френсис Г.С. Международное руководство по сердечной недостаточности. М., 1995.

3. Калитеевская В.Ф. Морфологические изменения при инфаркте миокарда // Архив патологии. -1957. № 5. - С. 20.

4. Коваленко В.Н. Руководство по кардиологии. Морион, 2008.

5. Куртова A.B., Зуева Е.Е., Немков A.C. Постинфарктная клеточная регенерационная терапия сердечной мышцы // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006. - № 2. - С. 34-43.

6. Маркс В. О. Ортопедическая диагностика (руководство-справочник). Мн.: "Наука и техника", 1978.

7. Маслов JI.H., Рябов В.В., Сазанова С.И. Регенерация миокарда // Успехи физиологических наук — 2004. — № 3. — С. 50-60.

8. Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Перспективы генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний // Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ РФ. 2000. - №3.

9. Полежаев ЛВ. Факторы регенерации нерегенерирющих органов и тканей // Вестню РАН. 2000. - № 70. - С. 597-603.

10. Попов C.B., Рябов В.В., Суслова Т.Е., Штатолкина М.А., Веснина Ж.В., Крылов А.Л., Афанасьев С.А., Марков В.А., Карпов B.C. Фундаментальные и прикладные аспекты клеточных технологий в кардиологии и хирургии // Бюллетень СО РАМН 2008. - № 4. - С. 5-15.

11. Потапов И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко H.A. Клеточная кардиомиопластика // Вестник трансплантологии и искусственных органов -2001.-№2.-С. 46-53.

12. Путинцева О.В., Артюхов В.Г., Колтаков И.А. Иммунология. Практикум. Часть II. Воронеж: ВГУ, 2008.

13. Репин B.C., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. М.: РАМН Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1998.

14. Рубина К.А., Мелихова B.C., Парфенова Е.В. Резидентные клетки-предшественники в сердце и регенерация миокарда // Клет. Транспл. -2007. -№2. -С. 29-35.

15. Румянцев П.П. Processes of the differentiation and reproduction of different types of muscle cells // Tsitologiia 1986. - V. 28. - P. 285-294.

16. Румянцев П.П. Кардиомиоциты в процессах репродукции, дифференцировки и регенерации. JL: Наука, 1982.

17. Саркисов Д.С. Регенерация и ее клиническое значение. М.: Медицина, 1979.

18. Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии. М.: МГУ,1989.

19. Селиванов Е.В. Красители в биологии и медицине. Барнаул: Азбука, 2003.

20. Смирнов В.Н., Романов Ю.А. Стволовые клетки и регенерация сердца // Кардиологический вестник. 2007. - № 2. - С.61-63.

21. Шахов В.П., Попов C.B. Стволовые клетки и кардиомиогенез в норме и патологии. Томск: STT, 2004.

22. Ярилин А. А. Основы иммунологии. Медицина, 1999.

23. Abbott J.D., Giordano F.J. Stem cells and cardiovascular disease // J. Nucl. Cardiol. -2003. Vol.10, № 4. - P. 403^12.

24. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. D. Molecular Biology of the Cell, 3rd edition. N.Y.: Garland Science, 1994.

25. Alvarez-Dolado M., Pardal R., Garcia-Verdugo J.M. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes // Nature 2003. - Vol.425. - P. 968-973.

26. Anversa P., Kajstura J., Leri A. Circulating Progenitor Cells Search for an Identity // Circulation - 2004. - Vol. 110. - P. 315 8-3160.

27. Anversa P., Kajstura J., Leri A., Bolli R. Life and death of cardiac stem cells: a paradigm shift in cardiac biology // Circulation 2006. - Vol.113, №11.-P. 1451-1463.

28. Anversa P., Leri A., Kajstura J. Cardiac regeneration // J. Am. Coll. Cardiol. 2006. - Vol.47, № 9. - P. 1769-1776.

29. Anversa P., Rota M., Urbanek K., Hosoda Т., Sonnenblick E.H., Leri A., Kajstura J., Bolli R. Myocardial aging—a stem cell problem // Basic Res. Cardiol. 2005. - Vol.100, № 6. - 482-493.

30. Anversa P., Sussman M.A., Bolli R. Molecular Genetic Advances in Cardiovascular Medicine: Focus on the Myocyte // Circulation 2004. - Vol.109. -P. 2832-2838.

31. Aviles R.J., Annex B.H., Lederman R.J. Testing clinical therapeutic angiogenesis using basic fibroblast growth factor (FGF-2) // Br. J. Pharmacol. — 2003. Vol.140, № 4. - P. 637-646.

32. Balsam L.B., Wagers A.J., Christensen J.L., Kofidis T., Weissman I.L., Robbins R.C. Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium // Nature 2004. - Vol.428, № 6983. - 668-673.

33. Bassett E.G., Wakefield J.S. Elastic fibers in myocardial scars in rats: development teraction with other components // Connect. Tissue Res. — 2008. -Vol.49.-P. 321-327.

34. Belema-Bedada F., Uchida S., Martire A., Kostin S., Braun T. Efficient homing of multipotent adult mesenchymal stem cells depends on FROUNT-mediated clustering of CCR2 // Cell Stem Cell 2008. - Vol.2. - P. 566575.

35. Bergmann O., Bhardwaj R.D., Bernard S., Zdunek S., Barnabe-Heider F., Walsh S., Zupicich J., Alkass K., Buchholz B.A., Druid H., Jovinge S., Frisen J. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans // Science -2009 -Vol.324, № 5923.-P. 98-102.

36. Bhati R., Patterson C., Livasy C.A., Fan C., Ketelsen D., Hu Z., Reynolds E., Tanner C., Moore D.T., Gabrielli F., Perou C.M., Klauber-DeMore N.

37. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells // Am J Pathol. -2008.-V. 172.-P. 1381-1390.

38. Bollano E., Tian F., Shao R. Hypoxia — induced myocardial angiogenesis preserves myocardial function after infarction in mouse // Eur. J. Echocardiography -2005. Vol.6. - P.34.

39. Brunner S., Engelmann M.G., Franz W.M. Stem cell mobilisation for myocardial repair // Expert Opin. Biol. Ther 2008. Vol.8. - P. 1675-1690.

40. Burchfield J.S., Dimmeler S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis // Fibrogenesis Tissue Repair 2008. -Vol.1, № 1. - P. 4.

41. Campbell S.E, Katwa L.C. Angiotensin II stimulated expression of transforming growth factor-(31 in cardiac fibroblasts and myofibroblasts // J. Mol. Cell Cardiol. 1997. - Vol.29. -P. 1947-1958.

42. Ceradini D.J, Gurtner G.C. Homing to hypoxia: HIF-1 as a mediator of progenitor cell recruitment to injured tissue // Trends Cardiovasc. Med. — 2005. -Vol.15, №2.-P. 57-63.

43. Chen M.M, Lam A, Abraham J.A, Schreiner G.F, Joly A.H. CTGF expression is induced by TGF- beta in cardiac fibroblasts and cardiac myocytes: a potential role in heart fibrosis // J. Mol. Cell Cardiol. 2000. - Vol. 32, № 10. -P.1805-1819.

44. Cho J, Zhai P, Maejima Y, Sadoshima J. Myocardial injection with GSK-3p-overexpressing bone marrow-derived mesenchymal stem cells attenuates cardiac dysfunction after myocardial infarction// Circ. Res. -2011. Vol.108, №4. - P. 478-489.

45. Chung C.Y, Bien H., Sobie E.A, Dasari V, McKinnon D, Rosati B, Entcheva E. Hypertrophic phenotype in cardiac cell assemblies solely by structural cues and ensuing self-organization // FASEB J. 2010. - Vol.25, № 3. - P. 851862.

46. Ciulla M.M., Paliotti R., Ferrero S., Braidotti P., Esposito A., Gianelli U., Busca G., Cioffi U., Bulfamante G., Magrini F. Left ventricular remodeling after experimental myocardial cryoinjury in rats // J. Surg. Res. 2004. -Vol.116, №1. - P. 91-97.

47. Cleland J. F. G., Puri S. How do ACE inhibitors reduce mortality in patients with left ventricular dysfunction with and without heart failure: remodelling, resetting, or sudden death? // Br. Heart J. 1994. - Vol. 72, №3. - P. S81-S86.

48. Cleland J.F.G., McGowan J. Heart Failure due to Ischaemic Heart Disease: Epidemiology, Pathophysiology and Progression // J. Cardiovasc. Pharmacol. 1999. - Vol.33. - P. S17-S29.

49. Cleutjens J. P., Blankesteijn, W. M., Daemen, M. J. & Smits, J. F. The infracted myocardium: simply dead tissue, or a lively target for therapeutic interventions // Cardiovasc. Res. -1999. Vol.44. - P. 232-241.

50. Conway E.M., Carmeliet P. The diversity of endothelial cells: a challenge for therapeutic angiogenesis // Genome Biology 2004. -Vol.5. - P. 207.

51. Dai W., Kloner R.A. Experimental cell transplantation therapy in rat myocardial infarction model including nude rat preparation // Methods Mol. Biol. -2010.-Vol.660.-P. 99-109.

52. Dayan D., Hiss Y., Hirshberg A., Bubis J.J., Wolman M. Are the polarization colors of picrosirius red-stained collagen determined only by the diameter of the fibers? // Histochemistry 1989. - Vol.93, №1. -P. 27-29.

53. Dishart K.L., Work L.M., Denby L., Baker A.H. Gene Therapy for Cardiovascular Disease // J. Biomed. Biotechnol. 2003. -Vol.2. - P. 138-148.

54. Donnelly D.S. and Krause D.S. Hematopoietic stem cells can be CD34+ or CD34- // Leuk. Lymphoma 2001. - Vol. 40. - P. 221-234.

55. Dorrell C., Grompe M. Adult liver stem cells // Essentials of stem cell biology. Boston: Elsevier Academic Press, 2006.

56. Eisenberg L.M., Eisenberg C.A. An in vitro analysis of myocardial potential indicates that phenotypic plasticity is an innate property of early embryonic tissue // Stem Cells Dev. 2004. - Vol.13. - P. 614-624.

57. Fukuda S. Angiogenic signal triggered by ischemic stress induced myocardial repair in rat during chronic infarction // J. Mol. Cell Cardiology.2004. Vol.36, № 4. - P. 547-559.

58. Garbade J., Schubert A., Rastan A.J., Lenz D., Walther T., Gummert J.F., Dhein S., Mohr F.W. Fusion of bone marrow-derived stem cells with cardiomyocytes in a heterologous in vitro model // Eur. J. Cardiothorac. Surg.2005.-Vol.28, №5.-P. 685-91.

59. Gaskill L. PKH Linker Kits for Fluorescent Cell Labeling. Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA, 2006.

60. Gersh B.J., Simari R.D. Cardiac cell-repair therapy: clinical issues // Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 2006. - Vol.3. - P. 105. - 109.

61. Gilbert S. F. Developmental Biology, 6th edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates, 2000.

62. Gnecchi M., Zhang Z., Ni A., Dzau V.J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy // Circ. Res. 2008. - Vol.103. - P. 12041219.

63. Guo J., Lin G.S., Bao C.Y., Hu Z.M., Hu M.Y. Anti-inflammation role for mesenchymal stem cells transplantation in myocardial infarction // Inflammation 2007. - Vol.30. - P. 97-104.

64. Guo Z., Li H., Li X., Yu X., Wang H., Tang P. and Mao N. In Vitro Characteristics and In Vivo Immunosuppressive Activity of Compact Bone-Derived Murine Mesenchymal Progenitor Cells // Stem Cells 2006. - Vol.24. - P. 992-1000.

65. Haissaguerre M., Shan P. Role of catheter ablation for atrial fibrillation // Curr. Opin. Cardiol. 1997. - Vol.12. - P. 18-23.

66. Hale L.S., Daia W., Dowa S.J., Klonera A.R. Mesenchymal stem cell administration at coronary artery reperfusion in the rat by two delivery routes: A quantitative assessment // Life Sciences 2008. - Vol. 83. - P. 511-515.

67. Henning R.J., Burgos J.D., Vasko M, Alvarado F., Sanberg C.D., Sanberg P.R., Morgan M.B. Human cord blood cells and myocardial infarction: effect of dose and route of administration on infarct size // Cell Transplant. 2007. -Vol.16.-P. 907-917.

68. Horan P.K., Melnicoff M.J., Jensen B.D., Slezak S.E. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking // Methods Cell Biol. — 1990. Vol. 33.-P. 469-490.

69. Hosoda Т., Kajstura J., Leri A., Anversa P. Mechanisms of myocardial regeneration // Circ. J. 2010. - Vol.74, №1. - P. 13-17.

70. Hoyer J., Distler A., Haase W., Gogelein H. Ca2+ influx through stretch-activated cation channels activated maxi K+ channels in porcine endocardial endotelium // PNAS 1994. - Vol.91. - P. 2367-2371.

71. IHC-parafin protocol (IHC-P). URL: http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/ihcp.pdf (дата обращения: 26.11.2010).

72. Ishikawa H. Evolution of ribosomal RNA // Сотр. Biochem. Physiol. 1977.-Vol. 58.-P. 1-7.

73. Jin H., Aiyer A., Su J., Borgstrom R, Stupack D., Friedlander M., Varner J. A homing mechanism for bone marrow-derived progenitor cell recruitment to the neovasculature // J. Clin. Invest. 2006. - Vol. 116, № 3. - R 652-662.

74. Joggerst S.J., Hatzopoulos A.K. Stem cell therapy for cardiac repair:benefits and barriers // Expert Rev. Mol Med. 2009. - Vol. 11. - R 20.

75. Kajstura J., Leri A., Finato N., Di Loreto C., Beltrami C.A., Anversa P. Myocyte proliferation in end-stage cardiac failure in humans // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. P. -8801-8805.

76. Karamysheva A.F. Mechanisms of angiogenesis. M: Biochemistry, 2008.-P. 751-762.

77. Kim W.H, Joo C.U, Ku J.H. et al. Cell cycle regulators during human atrial development // Korean J. Intern. Med. 1998. - Vol.13. - P. 77-82.

78. Klotz S, Burkhoff D. Vetricular remodeling in ischemic cardiomyopathy // Springer Sience+Business Media, Inc.: Stem cell therapy and tissue engineering for cardiovascular repair, 2006. P. 3-24.

79. Kraitchman D.L, Tatsumi M, Gilson W.D, Ishimori T, Kedziorek D, Walczak P, Segars W.P, Chen H.H, Fritzges D, Izbudak I, Young R.G,

80. Marcelino M., Pittenger M.F., Solaiyappan M., Boston R.C., Tsui B.M., Wahl R.L., Bulte J.W. Dynamic imaging of allogeneic mesenchymal stem cells trafficking to myocardial infarction // Circulation -2005. Vol. 112, № 10. - P. 1451-61.

81. Kumar A.H., Caplice N.M. Clinical potential of adult vascular progenitor cells // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2010. - Vol.30, № 6. - P. 1080-1087.

82. Laeremans H., Rensen S.S., Ottenheijm H.C., Smits J.F., Blankesteijn W.M. Wnt/frizzled signalling modulates the migration and differentiation of immortalized cardiac fibroblasts // Cardiovasc. Res. 2010. - Vol.87, № 3. - P. 514-523.

83. Leask A., Abraham D. J. TGFbeta signaling and the fibrotic response // FASEB J. -2004. Vol.18. - P. 816-827.

84. Lee W.H., Kang S., Vlachos P.P., Lee Y.W. A novel in vitro ischemia/reperfusion injury model. Arch Pharm Res. 2009. — Vol.32, № 3. - P. 421-429.

85. Leor J., Patterson M., Qumones M.J., Kedes L.H., Kloner R.A. Transplantation of Fetal Myocardial Tissue Into the Infarcted Myocardium of Rat A Potential Method for Repair of Infarcted Myocardium? // Circulation. -1996. -Vol. 94.-P. 332-336.

86. Leri A., Kajstura J., and Anversa P. Cardiac Stem Cells and Mechanisms of Myocardial Regeneration // Physiol Rev. 2005. - Vol.85. - P. 1373-1416.

87. Lesman A., Gepstein L., Levenberg S. Vascularization shaping the heart//Ann. N. Y.Acad. Sci. -2010. Vol.1188. -P.46-51.

88. Li H., Zuo S., He Z., Yang Y., Pasha Z., Wang Y., Xu M. Paracrine factors released by GATA-4 overexpressed mesenchymal stem cells increase angiogenesis and cell survival // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2010. -Vol.299, № 6. - P. 1772-1781.

89. Li M., Yu J., Li Y., Li D., Yan D., Rúan Q. CXCR4+ progenitors derived from bone mesenchymal stem cells differentiate into endothelial cells capable of vascular repair after arterial injury // Cell Reprogram. 2010. - Vol.12, №4.-P. 405-415.

90. Li R.K., Jia Z.Q., Weisel R.D., Merante F., Mickle D.A. Smooth muscle cell transplantation into myocardial scar tissue improves heart function // J. Mol. Cell Cardiol. 1999. - Vol.31. - P. 513-522.

91. Linke A., Millier P., Nurzynska D., Casarsa C., Torella D., Nascimbene A., Castaldo C., Cascapera S., Bôhm M., Quaini F., Urbanek K., Leri

92. A., Hintze T.H., Kajstura J., Anversa P. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005. - Vol. 102, № 25. -P. 8966-8971.

93. Logemann J., Schell J., Willmitzer L. Improved Method for the Isolation of RNA from Plant Tissues //Anal. Biochem. 1987. - Vol. 163. - P. 1620.

94. Mackenzie T.C., Flake A.W. Multilineage differentiation of human MSC after in utero transplantation // Cytotherapy. 2001. - Vol.3. - P. 403-405.

95. Madeddu P. Stem cell therapy for cardiovascular regeneration: the beginning or the end of all hearts' hopes // Pharmacol. Ther. 2010. - Vol.129, № l.-P. 1-2.

96. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D., Moorman M., Gerson S.L. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells // J. Cell Physiol. 1998. -Vol.176.-P. 57-66.

97. Martin-Puig S., Wang Z., Chien K.R. Lives of a heart cell: tracing the origins of cardiac progenitors // Cell Stem Cell 2008. - Vol.2, № 4. - P. 320-331.

98. Matsuura K., Wada H., Nagai T. et al. Cardiomyocytes fuse with surrounding noncardiomyocytes and reenter the cell cycle // J. Cell Biol. 2004. -Vol.167.-P.3 51-363.

99. Medugorac I. Characterization of intramuscular collagen in mammalian left ventricle // Basic Res. Cardiol. -1982. Vol. 77. - P. 589-598.

100. Menasche P., Hagege A., Scorsin M., Pouzet B., Desnos M., Duboc D., Schwartz K., Vilquin J.T., Marolleau J.P. Myoblast transplantation for heart failure // Lancet. 2001. - Vol.357. - P. 279-280.

101. Moebius-Winkler S., Schuler G., Adams V. Endothelial progenitor cells and exercise-induced redox-regulation // Antioxid. Redox. Signal. 2010 Nov 21. doi:10.1089/ars.2010.3734.

102. Molkentin J.D., Lu J.R., Antos C.L., Markham B., Richardson J., Robbins J., Grant S.R., Olson E.N. A calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy // Cell 1998. - Vol.93, № 2. - P. 215-228.

103. Muller Ehmsen J., Whittaker P., Kloner R. A. et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium // J. Mol. Cell Cardiol. - 2002. - Vol. 34. - P. 107-116.

104. Nadal-Ginard B., Mendez-Ferrer S. Cardiac stem cells for myocardial regeneration. Springer Sience+Business Media, Inc, 2006. P.39-57.

105. Nervi B., Link D.C., DiPersio J.F. Cytokines and hematopoietic stem cell mobilization // J. Cell. Biochem. 2006. - Vol.99. - P. 690-705.

106. Nishida M., Saiki S., Kitajima N., Nakaya M., Sato Y., Kurose H. Regulation of cardiovascular functions by the phosphorylation of TRPC channels // Yakugaku Zasshi. -2010. -Vol.130, № 11.-P. 1427-1433.

107. Nishida S., Nagamine H., Tanaka Y., Watanabe G. Protective effect of basic fibroblast growth factor against myocyte death and arrhythmias in acute myocardial infarction in rats // Circ. J. 2003. - Vol.67. - P. 334-339.

108. O'Kane S. Wound remodeling and scarring // J. Wound. Care. Vol. 11.-P. 296, 2002.

109. Oh H., Bradfute S.B., Gallardo T.D. et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA- 2003.-Vol.100.-P. 12313-12318.

110. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Jakoniuk I., Anderson M.S., Li B., Pickel J., McKay R., Nadal-Ginard B., Bodine M.D., Leri A., Anversa P. Bonemarrow cells regenerate infracted myocardium // Nature 2001. — Vol. 410. — P. 701-705.

111. Pangonyte D., Stalioraityte E., Ziuraitiene R., Kazlauskaite D., Palubinskiene J., Balnyte I. Cardiomyocyte remodeling in ischemic heart disease // Medicina. 2008. - Vol.44. - P. 848-854.

112. Porter K, Turner N. A. Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling // Pharmacol. Ther. 2009. - Vol.123. - P. 255-278.

113. Porter K.E, Turner N.A. Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling // Pharmacol. Ther. 2009. - Vol.123, № 2. - P. 255 -278.

114. Povsic T.J, O'Connor C.M. Cell therapy for heart failure: the need for a new therapeutic strategy // Expert. Rev. Cardiovasc. Ther. 2010. - Vol.8, № 8. -P. 1107-1126.

115. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues// Science. -1997. -Vol.276. P. 71-74.

116. Puchtler H, Waldrop F.S, Valentine L.S. Polarization microscopic studies of connective tissue stained with picro-sirius red FBA // Beitr. Pathol. -1973.-Vol. 150, №2.-P. 174-187.

117. Qian L, Srivastava D. Monkeying around with cardiac progenitors: hope for the future // J. Clin. Invest. 2010. - Vol.120, № 4. - P.1034-1036.

118. Qin D, Zhang Z.H, Caref E.B, Boutjdir M, Jain P, el-Sherif N. Cellular and ionic basis of arrhythmias in postinfarction remodeled ventricular myocardium // Circ. Res. 1996. -Vol. 79. -P.461-473.

119. Quaini F, Urbanek K, Beltrami A.P, Finato N, Beltrami C.A, Nadal-Ginard B, et al. Chimerism of the transplanted heart // N. Engl. J. Med. -2002. Vol.346. - P. 5-15.

120. Reeve J.L., Duffy A.M., O'Brien T., Samali A. Don't lose heart-therapeutic value of apoptosis prevention in the treatment of cardiovascular disease //J. Cell Mol. Med. 2005. -Vol. 9, № 3. - P. 609-622.

121. Reubinoff B.E., Pera M., Fong C.Y., Trounson A., and Bongso A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro //Nat. Biotech. -2000. -Vol.18. P. 399-404.

122. Riches K., Hettiarachchi N.T., Porter K.E., Peers C. Hypoxic remodelling of ca(2+) stores does not alter human cardiac myofibroblast invasion // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010. - Vol.403, № 3-4. - P. 468-472.

123. Ruvinov E., Leor J., Cohen S. The promotion of myocardial repair by the sequential delivery of IGF-1 and HGF from an injectable alginate biomaterial in a model of acute myocardial infarction // Biomaterials 2011. - Vol.32, № 2. -P. 565-578.

124. Schlag G., Redi H. Pathophysiology of shock, sepsis, and organ failure. Berlin: Springer-Verlag, 1993.

125. Schnaper H.W., Hayashida T., Hubchak S.C., Poncelet A.C. TGF-p signal transduction and mesangial cell fibrogenesis // Am. J. Physiol. Renal Physiol 2003.-Vol.284.-P. 243.

126. Shintani S., Murohara T., Ikeda H., Ueno T., Sasaki K., Duan J., Imaizumi T. Augmentation of postnatal neovascularization with autologous bone marrow transplantation// Circulation. 2001. - Vol.103, № 6. - P. 897-903.

127. Siepe M., Heilmann C., von Samson P., Menasché P., Beyersdorf F. Stem cell research and cell transplantation for myocardial regeneration // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2005. - Vol.28, № 2. - P. 318-324.

128. Siepe M., Heilmann C., von Samson P., Menasché P., Beyersdorf F. Stem cell research and cell transplantation for myocardial regeneration // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2005. - Vol. 28, № 2. - P. 318-324.

129. Sieveking D.P., Ng M.K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench // Vase. Med. 2009. -Vol.14, № 2. - P. 153-166.

130. Smart N., Risebro C.A., Clark J.E., Ehler E., Miquerol L., Rossdeutsch A., Marber M.S., Riley P.R. Thymosin beta4 facilitates epicardial neovascularization of the injured adult heart // Ann. N. Y. Acad. Sei. — 2010 . -Vol.1194.-P. 97-104.

131. Spradling A., Drummond-Barbosa D., Kai T. Stem cells find their niche // Nature 2001. - Vol.414. - P. 98-104.

132. Springer M.L., Hortelano G., Bouley D.M., Wong J., Kraft P.E., Blau H.M. Induction of angiogenesis by implantation of encapsulated primary myoblasts expressing vascular endothelial growth factor // J. Gene Med. — 2000. — Vol.2.-P. 279-288.

133. Squires C.E., Escobar G.P., Payne J.F., Leonardi R.A., Goshorn D.K., Sheats N.J., Mains I.M., Mingoia J.T., Flack E.C., Lindsey M.L. Altered fibroblast function following myocardial infarction // J. Mol. Cell Cardiol. -2005. Vol.39. -P. 699-707.

134. Sun Y., Kiani M.F., Postlethwaite A.E., Weber K.T. Infarct scar as living tissue // Basic Res. Cardiol. 2002. - Vol.97, № 5. - P. 343-347.

135. Sun Y., Weber K.T. Infarct scar: a dynamic tissue // Cardiovasc. Res. — 2000. Vol.46, № 2. - P. 250-256.

136. Symes J.F., Losordo D.W., Vale P.R. Gene therapy with VEGF for inoperable coronary artery disease // Ann. Thorac. Surg. 1999. - Vol.68. — P. 830-836.

137. Tada M., Morizane A., Kimura H., Kawasaki H., Ainscough J.F., Sasai Y., Nakatsuji N., Tada T. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in embryonic stem hybrid cells // Dev. Dyn. 2003. - Vol.227, № 4. - P. 504-510.

138. Tang Y.L., Zhao Q., Qin X., Shen L., Cheng L., Ge J., Phillips M.I. «

139. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction // Ann. Thorac. Surg. 2005. - Vol.80. - P. 229-236.

140. Tendera M., Wojakowski W. Clinical trials using autologous bone marrow and peripheral blood-derived progenitor cells in patients with acute myocardial infarction // Folia Histochem Cytobiol. 2005. - Vol.43. - P. 233-235.

141. Tomasek J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C. & Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodeling // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002. - Vol.3. - P. 349-363.

142. Tsiavou A., Manginas A. Dynamics of progenitor cells and ventricular assist device intervention // J. Cardiovasc. Transí. Res. 2010. - Vol.3, № 2. - P. 147-152.

143. Tzahor E., Lassar A. B. Wnt signals from the neural tube block ectopic cardiogenesis // Genes Dev. 2001. - Vol.15. - P. 255-260.

144. Urbanek K., Cesselli D., Rota M., Nascimbene A., Angelis A., HosodaT., Bearzi C, Boni A, Bolli R., Kajstura J., Anversa P., Leri A. Stem cell niches in the adult mouse heart // PNAS 2006. - Vol. 103, № 24. - P. 9226-9231.

145. Voisine P., Bianchi C., Ruel M. Inhibition of tha cardiac angiogenic response to exogeneos vascular endothelial growth factor // Surgery. 2004. -Vol.136, №2.-P. 407-415.

146. Volders P.G., Willems I.E., Cleutjens J.P., Arends J.W., Havenith M.G., Daemen M.J. Interstitial collagen is increased in the non-infarcted human myocardium after myocardial infarction // J. Mol. Cell Cardiol. 1993. - Vol.25, № 11.-P. 1317-1323.

147. Vu Т.Н., Werb Z. Matrix metalloproteinases: effectors of development and normal physiology // Genes Dev. 2000. - Vol. 14. - P. 2123.

148. Wallace P.K., Tario J.D., Fisher J.L., Wallace S.S., Ernstoff M.S., Muirhead K.A. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution // Cytometry 2008. - Vol. 73, № 11. - P. 1019-1034.

149. Wang Т., Tang W., Sun S., Wan Z., Xu Т., Huang Z., Weil M.H. Mesenchymal stem cells improve outcomes of cardiopulmonary resuscitation in myocardial infarcted rats // J. Mol. Cell Cardiol. 2009. - Vol.46. - P. 378-384.

150. Wang W., Jiang Q., Zhang H., Jin P., Yuan X., Wei Y., Hu S. Intravenous administration of bone marrow mesenchymal stromal cells is safe forthe lung in a chronic myocardial infarction model I I Regen. Med. -2011.- Vol. 6, №2.-P. 179-190.

151. Wang, J, Chen, H, Seth, A. & McCulloch, C. A. Mechanical force regulation of myofibroblast differentiation in cardiac fibroblasts // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2003. - Vol.285. - P. 1871-1881.

152. Wollert K.C, Drexler H. Cell therapy for the treatment of coronary heart disease: a critical appraisal // Nat. Rev. Cardiol. 2010. - Vol.7, № 4. - P. 204-15.

153. Wu K, Mo X, Lu S, Han Z. Retrograde delivery of stem cells: promising delivery strategy for myocardial regenerative therapy // Clin. Transplant. 2011. - doi: 10.1111/j.1399-0012.2011.01508.x.

154. Wu R.X, Laser M, Han H, Varadarajulu J, Schuh K, Hallhuber M, Hu K, Ertl G, Hauck C.R, Ritter O. Fibroblast migration after myocardialinfarction is regulated by transient SPARC expression // J. Mol. Med. 2006. -Vol.84, №3.-P. 241-252.

155. Xu M., Uemura R., Dai Y., Wang Y., Pasha Z., Ashraf M. In vitro and in vivo effects of bone marrow stem cells on cardiac structure and function // J. Mo.l Cell Cardiol. 2007. - Vol.42. - P. 441-448.

156. Yacoub M., Suzuki K. and Rosenthal N. The future of regenerative therapy in patients with chronic heart failure // Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. -2006. Vol.3, № 1.- P. 133-135.

157. Yamagari I. Electronmicroscopic study on the cornea. 1 .Mechanism of experimental new vessel formation // Jap. J. Ophthalmol. 1970. - Vol. 14. - P. 41.-58.

158. Yang S.E., Ha C.W., Jung M., Jin H.J., Lee M., Song H., Choi S., Oh W., Yang Y.S. Mesenchymal stem/progenitor cells developed in cultures from UC blood // Cytotherapy. 2004. - Vol.6, № 5. - P. 476-86.

159. Yin R., Feng J. Dynamic changes of serum VEGF levels in a rat myocardial infarction model // Chin. Med. Sci. 2000. -Vol.15, № 3. - P. 154156.

160. Zeng B., Lin .G, Ren X., Zhang .Y, Chen H. Over-expression of HO-1 on mesenchymal stem cells promotes angiogenesis and improves myocardial function in infarcted myocardium // J. Biomed. Sei. 2010. - Vol.7. - P. 80.

161. Zeng T., Bett G.C.L., Sachs F. Stretch-activated whole cell currents in cardiac myocytes //Amer. J. Physiol. 2000. - Vol.278. - P. 548-557.

162. Zhang Y., Li T.S., Lee S.T., Wawrowsky K.A., Cheng K., Galang G., Malliaras K., Abraham M.R., Wang C., Marbän' E. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes // PLoS One 2010. - Vol.5, № 9. -P.

163. Zhou L., Ma W., Yang Z., Zhang F., Lu L., Ding Z., Ding B., Ha T., Gao X., Li C. VEGF165 and angiopoietin-1 decreased myocardium infarct size through phosphatidylinositol-3 kinase and Bcl-2 pathways // Gene Ther. 2005. -Vol.12.-P. 196-202.12559.

Информация о работе

Байкова, Юлия Павловна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.03.04

Диссертация

Репарация и васкуляризация инфарктной зоны миокарда у крыс после трансплантации мононуклеаров красного костного мозга - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы