Влияние трансплантации мезенхимных стволовых клеток на течение экспериментального инфаркта миокарда

Кругляков, Петр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние трансплантации мезенхимных стволовых клеток на течение экспериментального инфаркта миокарда
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние трансплантации мезенхимных стволовых клеток на течение экспериментального инфаркта миокарда"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КРУГЛЯКОВ Петр Владимиров:

ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИНФАРКТА

МИОКАРДА

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена на кафедре цитологии и гистологии Санкт-Петербургского государственного университета и на базе ООО "Транс-Технологии"

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук

Харазова Алла Давыдовна

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук

Пинаев Георгий Петрович

профессор, доктор медицинских наук Климович Владимир Борисович

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Государственный

Медицинский университет им. И.П. Павлова МЗ и СР

Защита состоится " л*/ е 2006 г. в ^ часов на заседании

Диссертационного совета Д?212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан -уйсу^/У 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

S74&

-3-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение свойств мезенхимных стволовых клеток и их влияния на репаративные процессы в организме - одна из наиболее актуальных задач современной клеточной биологии. Особая значимость исследований в данной области связана с применением клеточных технологий для лечения человека.

Мезенхимные стволовые клетки (МСК) - резиденты стромы костного мозга. Они обладают всеми свойствами мультипотентных стволовых клеток - способностью к самовоспроизведению и дифференцировке в нескольких направлениях. МСК можно культивировать in vitro, многократно увеличивая биомассу, не теряя дифференцировочного потенциала (Hung et al., 2002). Так называемыми ортодоксальными направлениями их дифференцировки считаются остеогенное, адипогенное и хондрогенное. Известно, что МСК способны к дифференцировке и в неортодоксальных направлениях - нейрональном и глиальном, кардиомиоцитарном и миоцитарном (Ferrari et al., 1998; Sanchez-Ramos et al., 2000; Woodbury et al., 2000; Deng et al., 2001; Woodbury et al., 2002; Long et al., 2005).

Предполагается, что основная задача МСК в сформированном организме -репарация тканей мезодермального происхождения. Эксперименты по введению МСК в организм интактного животного показали, что донорский материал диффузно распределяется именно по тканям мезодермального происхождения, в том числе и по мышечной ткани (Anjos-Afonso et al., 2004). Более того, в исследованиях по трансплантации МСК в кровоток животным с повреждениями костной ткани было доказано что донорский материал мигрирует из кровотока в зону повреждения (Lu et al., 2001; Ji et al., 2004). Однако эта гипотеза не может считаться абсолютно доказанной на сегодняшний день.

На основании данных экспериментов многие исследователи предположили возможность применения МСК в качестве репаративного материала в области клеточной терапии. Во-первых, МСК мультипотентны. Второй важный фактор -наличие разработанных воспроизводимых методик наращивания в культуре чистых популяций МСК, выделенных из костного мозга. Кроме того, доступность костного мозга для пункции позволяет использовать для трансплантации аутологичные МСК и избежать, таким образом, проблем иммунологической совместимости. Наконец, несмотря на их высокий пролиферативный потенциал in vitro, в сотнях проведённых эктопических трансплантаций МСК ни разу не фиксировали развитие опухоли.

Клеточная терапия - новый метод лечения заболеваний связанных с необратимой гибелью клеточных элементов. Области применения клеточных технологий постоянно расширяются. Ещё в середине 90-х клеточные технологии использовались лишь при пересадках костного мозга (Silvestri et al., 1992). Сейчас они применяются для лечения сахарного диабета, печеночной недостаточности, лечения ожогов (Gohari et al., 2002). На экспериментальном уровне клеточные технологии активно используются в кардиологии, при инфаркте миокарда и кардиомиопатии (Smits et al., 2003; Hill et al., 2004; Kangetal., 2004).

ответ: вазодилятация артериол и капилляров, повышение проницаемости капилляров,

РОС НАЦИОНАЛ). • , » БИБЛИОТЕКА ; С.Овтср 08

J2L2

временная вазоконстрикция исходящих сосудов, экссудация, а как следствие - отек. В течение нескольких часов формируется острый клеточный ответ: инфильтрация клетками воспаления, среди которых преобладают нейтрофилы, ликвидация клеточного дсбриса, образование тромба. В последующие несколько дней развивается хронический клеточный ответ: инфильтрация макрофагами и лимфоцитами, образование грануляционной ткани и как следствие соединительно-тканного рубца. Повреждённый миокард никогда не восстанавливает своей первоначальной структуры. Это приводит к тяжёлым патологическим изменениям в функции сердца и развитию таких осложнений как сердечная недостаточность, аритмии, аневризмы, разрыв миокарда и т.д.

Однако проведенные исследования не охватывают весь спектр проблем, связанных с клеточной терапией инфаркта миокарда. В большинстве работ проводили интрамиокардиальное введение клеточного материала, что зачастую невозможно в клинической практике. Вопрос о миграции клеток при их трансплантации в кровоток животных с повреждением миокарда практически не исследован. Нам не удалось обнаружить данных о терапевтическом потенциале МСК трансплантированных в кровоток животных с экспериментальным повреждением миокарда.

Свидетельства того, что МСК могут дифференцироваться в кардиомиоциты как in vitro, так и in vivo, способны паракринно воздействовать на эпдогенные популяции стволовых клеток и мигрировать в зону повреждения, послужили основой для формулировки цели и задач нашего исследования.

Дели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение влияния трансплантации сингенных мезенхимных стволовых клеток на течение экспериментального инфаркта миокарда у крыс. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1) Выделить и охарактеризовать мезенхимные стволовые клетки крысы.

2) Адаптировать модель экспериментального инфаркта миокарда у крыс для животных породы Wistar-Kyoto.

3) Изучить общую картину течения экспериментального инфаркта миокарда у крыс линии Wistar-Kyoto.

4) Изучить распределение донорских МСК в организме интактных крыс.

5) Выявить МСК в миокарде экспериментальных животных.

6) Оценить влияние трансплантации МСК на гистологическую картину состояния ишемизированного миокарда.

7) Провести гистохимический анализ зоны ишемии экспериментальных животных.

8) Оценить гистологические, морфологические и морфометрические особенности в строении тканевой зоны инфаркта миокарда при профилактической и терапевтической трансплантации МСКна различных сроках.

Основные положения, выносимые иа защиту.

1. Дифференцировка мезенхимных стволовых клеток крысы in vitro в кардиомиоцитарном направлении сопровождается экспрессией эмбриональных и функциональных маркеров миокарда.

2. МСК крысы, введённые в кровоток, мигрируют в зону инфаркта миокарда.

3. Трансплантация сингенных МСК ускоряет течения процессов воспаления в ишемизированном миокарде.

4. Трансплантация сингенных МСК существенно влияет на гистологическое строение зоны ишемического повреждения, а именно: усиливается васкуляризация зоны повреждения, сохраняются переживающие кардиомиоциты периинфарктной зоны, зона рубца насыщена волокнами эластического типа.

5. Оптимальными сроками трансплантации МСК в кровоток для получения наилучшего профилактического и терапевтического эффекта при ЭИМ являются сроки за 2 суток, в день, через 2 и 7 суток после операции ЭИМ.

Научная новизна работы. Впервые экспериментально показана экспрессия эмбриональных и функциональных маркеров кардиомиоцитов в популяции дифференцированных в кардиомиоцитарном направлении МСК крысы. Впервые экспериментально доказана миграция МСК в зону повреждепия после инфаркта. Впервые экспериментально показано улучшение состояния тканей псриинфарктного миокарда после трансплантации МСК в кровоток животного. Впервые экспериментально зарегистрированы положительные изменения морфометрических параметров сердца после инфаркта миокарда при трансплантации МСК в кровоток животного. Впервые выявлена зависимость выраженности терапевтического эффекта лечения ЭИМ от сроков трансплантации МСК.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы могут быть использованы для дальнейшего углубленного изучения механизмов репаративных процессов в сформировавшемся организме млекопитающих, могут служить теоретической основой для разработки новых терапевтических подходов лечения дегенеративных заболеваний, основанных на запуске репаративных процессов с участием стволовых клеток взрослого организма. Кроме этого, результаты работы могут использоваться в учебном процессе (так они служат иллюстративпым материалом в спецкурсах по биологии стволовых клеток, читаемых на кафедрах цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета СПбГУ и факультетской терапии СПбГМУ).

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на международной конференции общества клеточных терапевтов "International Society for Cellular Therapy" (Phoenix, USA, 2003), на международной конференции общества клеточных терапевтов "International Society for Cellular Therapy" (Dublin, Ireland, 2004), на международном симпозиуме "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия" (Санкт-Петербург, 2004 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ. Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов, заключения и списка цитируемой литературы, состоящего из 374 источников. Работа изложена на 160 страницах, содержит 32 рисунка и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Выделение и культивирование МСК крысы. Для получения МСК крысы клетки эксплантировали из костного мозга. Животных умерщвляли избытком эфирного наркоза, отделяли у них заднюю часть тела и помещали её в стерилизующий раствор. Через 40-60 минут в стерильных условиях с помощью хирургических инструментов у животных выделяли бедренные кости, в стерильных условиях удаляли эпифизы, а диафизы промывали средой культивирования: аМЕМ (Hyclone, США), 20% сыворотки крови эмбрионов коров (Gibco, Англия) и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (Gibco, Англия). Полученный смыв высевали на пластиковые чашки Петри (Sarstedt, Германия). Через 48 часов после эксплантации костного мозга клетки двукратно отмывали с помощью раствора PBS (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4; 0,1 М NaCl), от форменных элементов крови, находящихся в суспензии, и снова заливали чашки средой культивирования. Для пересева МСК крысы использовали раствор трипсина и ЭДТА (Hyclone, США). Первый пересев МСК проводили через 6-7 дней после эксплантации. Далее культуру пересевали каждые 7 суток с исходной плотностью 1,27x103 клеток/см2. Замену питательной среды проводили каждые трое суток.

Фенотипирование МСК крысы. Фенотипирование МСК проводили методом проточной цитофлюориметрии на проточном цитофлюориметре EpicsXL (Beckman Coulter, США). МСК крысы окрашивали антителами против негативного маркера CD45 (Beckton Dickinson) и антителами против позитивного маркера CD90 (Beckton Dickinson). Фенотипирование проводили после первого, второго и третьего пересева культуры. Для окрашивания антителами против поверхностных маркеров клетки снимали с чашек раствором трипсина и ЭДТА, промывали два раза раствором PBS, затем па один час переносили в раствор моноклональных антител, коньюгированных с флюорохромом, в разведении 1:20. Далее клетки промывали два раза раствором PBS и анализировали на проточном цитофлюориметре. Распределение клеток по фазам клеточного цикла оценивали по методике Розанова (Розанов, 1988). Для этого клетки снимали с чашек раствором трипсина и ЭДГА, промывали 2 раза раствором PBS, фиксировали 70% метанолом 20 минут при температуре -20С° и снова дважды промывали раствором PBS. Далее инкубировали 15 мин при 37°С с РНКазой А (100 мкг/мл), и иодидом пропидия (10 мкг/мл), и анализировали на проточном цитофлуориметрс АТС300 (Brucker). Все эксперименты выполняли не менее чем в двух ттовторностях.

Дифференцировка МСК крысы в ортодоксальных направлениях. Для индукции дифференцировки в ортодоксальных направлениях МСК наращивали до плотного монослоя. Далее для дифференцировки в остеоцитарном направлении в среду культивирования добавляли 10"2М ß-глицерофосфата натрия, Ю* М дексаметазона и 2x10"4 М аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich). Для индукции дифференцировки в хондроцитарном направлении в стандартную среду культивирования добавляли 1 нг/мл трансформирующего ростового фактора-ЗР и 2x10^ М аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich). Для индукции дифференцировки в адипоцитарном направлении меняли среду культивирования на аМЕМ, 1% сыворотки крови эмбрионов коров и добавляли 10"9М инсулина и 10'7 М дексаметазона (Sigma-Aldrich). Обработка индукторами дифференцировки длилась 2 недели, половину среды культивирования меняли каждые три дня (Pittenger et al., 1999, Muraglia et al., 2000).

Дифференцировка МСК крысьи кардиомиоцитарном направлении. Для индукции дифференцировки в направлении кардиомиоцитов МСК наращивали до плотного

монослоя. Далее в стандартную среду культивирования добавляли 3 мкМ 5-азацитидина (Sigma-Aldrich) (Fukuda 2001). Обработка 5-азацитидином длилась 3 недели, половину среды культивирования меняли каждые три дня. Фенотипирование дифференцированных производных МСК. Фенотипирование полученных производных проводили с помощью анализа экспрессии маркерных генов методом обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Для этого из дифференцированных клеток выделяли тотальную РНК по стандартной методике с применением тризола (Sigma). Далее проводили реакцию обратной транскрипции с использованием полиА-праймера (Amersham). Полученную кДНК полимеризовали со специфическими праймерами и проводили ПЦР. Продукт реакции анализировали методом электрофореза в агарозном геле. Для анализа экспрессии маркерных генов методом ОТ-ПЦР использовали специфические праймеры маркерных генов. Для недифференцированных МСК анализировали экспрессию мРНК фибронектина (5'-ttacggtggcaactcaaacg-3', 5'-atcggcatcgtagttctggg-3') (Juneja et al., 1992). Для верификации остеогенной дифференцировки анализировали экспрессию мРНК остеопонтина(5'-acagtcaggcgagttccaaag-3', 5'-tcctgtaagtttgcctgcctc-3') и остеокальцина (5-agcagacaccatgaggaccc-3', 5'-tcgaggcagagagagggaac-3') (Zur Nieden et al., 2003). Для хондроцитарной дифференцировки анализировали экспрессию мРНК коллагена II (5'-ggtgaatctggtcgtgaggg-3', 5'-accagcaggaccactatcgc-3'). Для выявления адипоцитарной дифференцировки анализировали экспрессию мРНК лептина (5'-ttcacacacgcagtcggtatc-3', 5'-cttccctcaacatgatcctcg-3'), белка ALBP (adipocyte lipid-binding protein) (5'-atgaaagaagtgggagttggc-3', 5'-ccaccagcttgtcaccatct-3') и белка ACRP (adipocyte complement-related protein) (5'-gttgcaagcgctcctgttc-3', 5'-ttctccgggctctcctttc-3') (Li et al., 2002).

Для выявления кардиомиоцитарной дифференцировки анализировали экспрессию мРНК транскрипционных факторов GATA4 (5'-gacaagggtgatggatggaag-3', 5'-aatgttaacgggttgtggagg-З') и Nkx2.5 (5'-cagcgccaacagcaacttc-3', 5'-gcaagtgtgggtgtgaaatcc-3'), белков тропонина Т (5'-gagaaggaaaggcagaaccg-3', 5'-tgtcgttgatcctgtttcgc-3'), тропонина I (5'-cagcccttggtgttggat-3', 5'-tctttcggccttccattcc-3'), кардиотрофина 1 (5'-tgtgtgttcttgggctgtcc-3', 5'-cttcccttcccattgaccag-3'), коннексина 43 (5'-tcatgctggtggtgtccttg-3', 5'-ttggcattctggttgtcgtc-3'), кальциевой АТФазы 2a2 (5'-acaacccgctgaggagagag-3', 5'-ttgtggagaagttgtcgtcg-3') и белка Arp (ankyrin repeat protein) (5'-agttccttcctggcgagttc-3', 5'-tcagaaaccttggcacatcc-3').

Окрашивание МСК крысы флуорохромом РКН 26. Для окрашивания РКН 26 клетки снимали с чашек раствором трипсина и ЭДТА, промывали два раза раствором PBS, затем добавляли раствор дшпоента на 30 - 60 секунд. Непосредственно перед прокрашиванием готовили 4x10-6 М раствор РКН 26 и добавляли равный объём к клеточной суспензии. Суспензию клеток с РКН 26 инкубировали 5 минут на комнатной температуре. Далее ингибировали реакцию добавлением равного количества сыворотки. Дважды промывали клеточную суспензию 10 миллилитрами 20 % раствора фетальной сыворотки в оМЕМ. Окрашенные клетки высевали на 24 часа в среду без РКН 26. Затем клетки промывали раствором PBS. Окрашенные МСК снимали с чашек раствором трипсина и ЭДТА, центрифугировали при 450g в течение 10 мин. Полученный осадок дважды промывали PBS и суспендировали в питательной среде без сыворотки (аМЕМ +100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина) с финальной концентрацией 5х106 клеток в 100 мкл. Эффективность окрашивания МСК оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope (Zeiss).

Моделирование экспериментального инфаркта миокарда РИМ). Эксперименты проводили на инбредных крысах - самцах породы Wistar-Kyoto возраста - 3-4 мес., весом 90 - 130 г. Инфаркт миокарда у подопытных животных моделировали посредством перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка левого предсердия. Крыс наркотизировали пентобарбиталом натрия (40 мг/кг) интраперитонеально. На левой стороне груди крысы делали продольный надрез кожи, раздвигали грудные мышцы и с помощью ранорасширителей раздвигали 5 и 6 ребра. Затем извлекали сердце из грудной полости. Перевязывали левую коронарную артерию и возвращали сердце в грудную полость. Рану ушивали послойно. Перевязку коронарных артерий проводили без последующей рсперфузии (Rumyantsev, 1974). В ходе оперативного вмешательства погибало не более 30% животных. Менее 1% погибали в течение последующих шести недель. Перед проведением операции, через двое суток после ЭИМ и перед декапитацией у животных регистрировали электрокардиограммы (КФС - 01 "Кардиометр - МТ", Россия). По кардиограммам подтверждали наличие инфаркта у животных.

Введение МСК животным. Флуоресцентно меченые МСК (5 млн. клеток в 100 мкл питательной среды аМЕМ) вводили животным в хвостовую вену. Было выполнено две серии экспериментов. В первой серии клетки вводили через 2 суток после операции ЭИМ. Для данного эксперимента были сформированы 5 подопытных групп (со сроками наблюдения 4, 7, 21, 35 и 42 суток после ЭИМ). В каждую из перечисленных групп входило не менее 10 животных. Животным из контрольных групп (по 10 крыс на каждый срок наблюдения) вводили только питательную среду. Во второй серии экспериментов было сформировано семь подопытных групп животных (в каждой группе не менее 10 крыс), которым МСК вводили на разных сроках до и после экспериментального инфаркта миокарда (за 14, 7, 2 суток до ЭИМ, в день операции, через 2, 7, 14 суток после ЭИМ). Животным из контрольной группы (10 крыс) вводили только питательную среду. Срок наблюдения для всех животных составлял 42 сут после ЭИМ.

Фиксация материала, морфологический и гистологический анализ препаратов. У животных непосредственно после декапитации извлекали сердце. Желудочки разрезали перпендикулярно оси сердца на 4 параллельных сегмента толщиной 0,2-0,3 см каждый. Использовали два вида фиксации - криофиксацию и фиксацию 8% формалином. При разных фиксациях для получения срезов с одного и того же участка поврежденного миокарда выбирали для исследования сегмент 2 (криофиксация) и сегмент 3 (фиксация формалином), считая от основания сердца. Выделенные сегменты ориентировали так, чтобы срезы были изготовлены из максимально сближенных зон: с нижнего края сегмента 2 и с верхнего края сегмента 3. Фиксацию 8% формалином проводили не менее суток. После фиксации сегмент сердца заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 7 мкм по стандартной методике. Часть препаратов с одного блока окрашивали гематоксилином Майера и эозином, часть - гематоксилином Майера и красителем по Ван-Гизону. Для криофиксации сегмент 2 сердца охлаждали в парах жидкого азота в течение 10 сек, погружали в жидкий азот на 1 час, а затем помещали в морозильную камеру с температурой -70°С. Срезы толщиной 7 мкм изготавливали на криостатном микротоме Leica СМ 1900 Ciyostat (Leica). Срезы помещали на стекло, расправляли нагреванием, высушивали в течение 2 мин при комнатной температуре. Препараты заливали в пропилгаллат (5% в глицерине) и анализировали под

флуоресцентным микроскопом Leica DM LB HC (Leica). Морфологический анализ строения тканей сердца после ЭИМ проводили на парафиновых препаратах. На криопрепаратах сердца выявляли локализацию экзогенных МСК, окрашенных красителем РКН 26. Для выявления колокализации в миокарде зоны повреждения и распределения МСК проводили параллельный анализ крио- и парафиновых срезов. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда антителами против коннексина 43. Для иммуногистохимического окрашивания препаратов миокарда антителами против коннексина 43 (Chemicon) использовали криосрезы толщиной 7 мкм. Срезы помещали на стекло, расправляли нагреванием, высушивали в течение 2 мин при комнатной температуре. Далее промывали двукратно PBS, помещали в раствор первых антител (против коннексина 43). В качестве вторых антител использовали ослиные антитела против иммуноглобулинов мыши, коньюгированные с FITC (Chcmicon). Препараты заливали в пропилгаллат (5% в глицерине) и анализировали под флуоресцентным микроскопом Leica DM LB HC (Leica, Германия). Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда антителами против транскрипционного фактора GATA4 и тропонина I. Для иммуногистохимического окрашивания антителами против транскрипционного фактора GATA4 и тропонина I криосрезы толщиной 7 мкм. Срезы помещали на стекло, расправляли нагреванием, высушивали в течение 2 мин при комнатной температуре. Далее промывали двукратно PBS, инкубировали 25 минут в буфере TrisHCl (рН-2) на кипящей водяной бане. Затем срезы дважды промывали PBS. Далее срезы инкубировали в 10% растворе фетальной сыворотки, содержащей 0,03% азида натрия, 0,01% Triton-X-100. Затем срезы помещали в раствор первых поликлональных антител к GATA4 (Santa Cruz) или моноклональных антител к тропонину I (Chemicon). Далее срезы промывали PBS и помещали в раствор вторых антител. В качестве вторых антител использовали козлиные антитела против иммуноглобулинов кролика, коньюгированные с СуЗ или ослиные антитела против иммуноглобулинов мыши, коньюгированные с СуЗ. Препараты заливали в пропилгаллат (5% в глицерине) и анализировали под флуоресцентным микроскопом Leica DM LB HC (Leica, Германия).

Анализ распределения МСК в организме подопытных и интактных животных. Для анализа распределения МСК в организме животного в хвостовую вену вводили 5 миллионов флуоресцентно меченых клеток. Анализировали костный мозг, печень, мышцы, кишечник, лёгкие и селезёнку. Для этого проводили криофиксацию фрагментов указанных органов (кроме костного мозга). Фиксацию материала проводили на 7 и 21 сутки. Изготавливали криопрепараты и оценивали их под флуоресцентным микроскопом Leica DM LB HC (Leica). Для анализа костного мозга проводили его эксплантацию, клетки культивировали 3-7 суток, фиксировали параформальдегидом в монослое, заливали в пропилгаллат (5% в глицерине) и анализировали под флуоресцентным микроскопом Leica DM LB HC (Leica). Анализ распределения лизата МСК. окрашенных РКН26. в миокарде подопытных животных. Для получения лизата МСК клетки наращивали до плотного монослоя, снимали трипсином. Помещали в гипотоническую среду, стерильную деионизированную воду. Качество лизата контролировали под инвертированным микроскопом. Лизат 5 млн. флуоресцентно меченых МСК вводили животным в хвостовую вену в 100 мкл питательной среды аМЕМ. Клетки трансплантировали на 2 сутки после операции ЭИМ. Для данного эксперимента было сформировано 2

подопытных группы животных со сроками наблюдения 7 и 21 сутки после ЭИМ. В каждую группу входило не менее 5 животных. У животных непосредственно после декапитации извлекали сердце. Затем желудочки разрезали перпендикулярно оси сердца на 3 параллельных сегмента толщиной 0,3-0,4 см каждый. Из центрального сегмента изготавливали криопрепараты и анализировали их под флуоресцентным микроскопом Leica DM LB HC (Leica).

Количественная оценка васкуляризапии зоны повреждения и измерение дилатации полостей сердца. Подсчет сосудов регулируемого типа (артериол и венул) и сосудов синусоидного типа (сосудов с тонкой нерегулируемой стенкой) проводили в зоне повреждения миокарда на площади 30 мкм2 под световым микроскопом (Leica, Германия) через 35 суток после ЭИМ. Поля подсчета сосудов выбирались случайным образом. Все измерения повторяли 10-кратно. Полученные данные были обработаны с помощью программы Statistica (Stat Soft Inc). Дилатация полостей сердца (Д) рассчитывали как отношение средней площади просвета (Sn) к средней площади миокарда (Sm) желудочков у групп животных с введением МСК и у контрольных групп (Свищев, 1972). (Д= Sn/ Sm). Для морфометрических измерений выбирали животных только с трансмуральными инфарктами и постинфарктными аневризмами. Гистологические препараты были отсканированы. Площадь миокарда и площадь просвета желудочков были измерены с помощью программы PhotoM. Полученные данные были проанализированы с помощью программы Statistica (Stat Soft Inc).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В основе клеточной терапии любого заболевания, в том числе и инфаркта миокарда, лежит выделение, культивирование m vitro, дифференцировка и фснотипирование клеточного материала. Результаты лечения практически полностью зависят от того, какие именно клетки были использованы для трансплантации, а также от их качества.

В результате тщательного анализа литературных данных был сделан вывод, что наиболее перспективными для клеточной терапии инфаркта миокарда являются аутологичные МСК. Наличие отработанных и безвредных для человека процедур по получению первичного материала даёт возможность использовать для трансплантации только аутологичный клеточный материал, что позволяет полностью избежать реакции несовместимости в организме реципиента (Kuznetsov et al., 2001; Jiang et al., 2002; Zhang et al., 2003). К настоящему времени описан фенотип МСК и выявлены их ортодоксальные направления дифференцировки (Young et al., 1995 Johnstone et al., 1998; Pittenger et al., 1999; Martin et al., 2002; Zuk et al., 2002; Pittenger and Martin 2004). Характеристика культур МСК крыс породы Wistar-Kyoto. Количество СТ)45+-клеток (клеток гематопоэтического ряда) варьировало от донора к донору в пределах 3 - 5% общего числа клеток, количество СШ0+-клеток (МСК) составляло от 93 до 97%. Картина клеточного состава культуры существенно не менялась на протяжении первых четырёх пассажей после выделения. Для мезенхимных стволовых клеток фенотип определен как CD34-, CD45-, CD44+, CD90+, CD105+, CD106+. Такой клеточный фенотип используется для идентификации МСК человека и мыши (Guo et al., 2001). В настоящей работе МСК крысы фенотипировали с помощью антител против CD45 и CD90.

Дифференцировка МСК в ортодоксальные направления и_ фенотипирование полученных производных. О дифференцировке судили по изменению морфологии

клеток в культуре при визуальном наблюдении и по экспрессии ряда маркерных генов дифференцированных клеток. ' При добавлении в среду культивирования индукторов остеоцитарной

дифференцировки на поверхности клеточного монослоя образовывались поля минерализации, сформированные из гидроксиапатита кальция. Экспрессия генов остеопонтина и остеокальцина в дифференцированных МСК существенно усиливалась.

При добавлении к МСК индукторов адипоцитарной дифференцировки в культуре отмечали клеточные элементы, заполненные жировыми каплями. После процедуры адипогенной дифференцировки усиливалась экспрессия лепгина, ALBP и ACRP .

При воздействии на МСК индукторов хондроцитарной дифференцировки наблюдали скатывание клеточного монослоя в шарообразный клеточный конгломерат. Экспрессия гена коллагена П существенно усиливалась в клетках, дифференцированных в хрящевом направлении.

Т.о. клеточная популяция отвечала критериям, по которым идентифицируют

МСК.

ДиФФеренцировка МСК в кардиомиоцитарном направлении. Морфологическим критерием дифференцировки МСК служили присутствующие в культуре «валики» кардиомиоцитов. Мы выявили спонтанно сокращающиеся клеточные конгломераты. В настоящей работе в кардиомиоцитарном направлении дифференцировались около 15% МСК, что согласуется с ранее опубликованными данными (Fukuda, 2001).

Анализ экспрессии маркерных генов кардиомиоцитов показал, что в популяции дифференцированных МСК экспрессировались гены белков GATA4 и Nkx2.5, являющихся факторами детерминации миокардиальных предшественников в раннем эмбриогенезе позвоночных. В популяции дифференцированных МСК выявлялась экспрессия коннексина 43, основного белка щелевых контактов, необходимого для передачи сигнала сокращения, характерная для формирующегося миокарда (Ya et al., 1998). Также была выявлена экспрессия других использованных генов, в особенности тропонинов Т, I и кардиотрофина 1, являющихся маркерами дифференцированных кардиомиоцитов. Эти результаты свидетельствуют о том, что дифференцировка МСК под воздействием 5-азацитидина приводила к формированию функционально активных кардиомиоцитов. Следует отметить, что экспрессия транскрипционных факторов кардиомиоцитарной дифференцировки отмечалась и в недифференцированных МСК, Я что может косвенно свидетельствовать о дифференцировочном потенциале МСК.

Применение 5-азацитидина для направленной дифференцировки МСК не может • быть рекомендовано для работы с человеческим материалом, т. к. этот реагент является неспецифическим деметилирующим агентом.

МСК могут дифференцироваться в кардиомиоциты не только in vitro, но и непосредственно в миокарде, согласно теории органных ниш (Mackenzie and Flake, 2001) и современным экспериментальным данным (Tomita et al., 1999).

На основании вышеизложенных данных для дальнейших экспериментов мы использовали недифференцированные МСК и не применяли клетки, обработанные 5-азацитидином.

Перед нами стоял вопрос о способе введения МСК подопытным животным. В литературе упоминаются следующие пути трансплантации клеточного материала: непосредственно в зону повреждения, в коронарные сосуды или в системную венозную кровь. Введение МСК интрамиокардиально или интракоронарно требует тяжелой

повторной операции и может привести к нарушению работы сердца - аритмии. Предпринятая нами попытка вводить клеточную суспензию непосредственно в некротическую зону была безуспешной. Около 80% животных погибало через несколько минут после трансплантации. Избежать подобных осложнений удалось при введении МСК в кровоток. Анализ кардиограмм животных с ЭИМ после внутривенной инфузии показал, что трансплантация клеток не вызывала аритмий.

Трансплантация в кровоток предполагает диффузное распределение клеточного материала по капиллярному руслу всех органов. В связи с этим нам необходимо было определить, существует ли закономерность в локализации донорских клеток в органах интактных и подопытных крыс, и происходит ли специфическое накопление МСК в зоне экспериментального повреждения миокарда.

Распределение МСК в организме интактного животного. На криостатных срезах лёгких, печени, мышц и сердца как на 7, так и на 21 сутки после трансплантации меченых МСК обнаруживали единичные клеточные элементы с меткой донорских клеток. При анализе срезов кишечника наблюдали скопления меченых клеточных элементов в области крипт. Не было возможности провести анализ распределения клеток на срезах селезёнки, т. к. данный орган обладает сильной автофлуоресценцией. При эксплантации костного мозга реципиента среди клеток, способных к адгезии, выявляли значительное количество клеточных элементов с меткой донорских МСК. Причём интенсивность флуоресценции выделенных клеток варьировала.

Распределение МСК в организме животного, перенесшего ЭИМ. В перечисленных выше органах, кроме сердца, меченые клетки распределялись также как у интактных животных. В сердце они локализовались специфично в области формирующегося рубца. Такая картина распределения наблюдалась как на 7, так и 21 сутки.

Одной из причин локализации флуоресцентной метки в зоне инфаркта миокарда могла быть гибель трансплантированных МСК, последующая активация моноцитов -макрофагов и их миграция в область повреждения. Для верификации распределения донорского материала проводили трансплантацию гомогената окрашенных МСК животным с ЭИМ. Анализ распределения метки мы проводили на 21 сутки после операции и трансплантации гомогената. На криосрезах инфарктного сердца таких животных меченые клеточные элементы не выявили ни в зоне формирования рубцовой ткани, ни в зоне неповреждённого миокарда. Следовательно, в зоне инфаркта локализовались жизнеспособные донорские МСК. Поскольку картина распределения МСК на 7 и 21 сутки была одинакова, мы предполагаем, что направленная миграция МСК в организме интактного животного к 7 суткам уже завершается.

Миграция МСК в костный мозг, кишечник и зону повреждения определяется хемокинами, и главную роль играет SDF-1. Из литературы известно, что SDF-1 активно продуцируется в красном костном мозге и определяет homing (хоуминг-эффект) гемопоэтических стволовых клеток (Imai et al., 1999). Экспрессия SDF-1 показана и в криптах кишечника (Jordan et al., 1999; Dwinell et al., 2004). Повышенной продукцией SDF-1 характеризуются области тканевого повреждения, такие как инфаркт миокарда. На поверхности МСК недавно были обнаружены рецепторы различных хемоюгаов и в том числе SDF-1 (Wynn et al., 2004). При этом исследователи показали функциональную значимость этого рецептора в миграции МСК именно в область тканевого повреждения (Ji et al., 2004;_Togel et al., 2005i Tang et al., 2005). Таким

образом, мы можем утверждать, что МСК специфически мигрируют в область повреждения миокарда и закрепляются там.

Сравнение динамики ЭИМ у контрольных и подопытных животных. Результаты сравнения динамики ЗИМ представлены в таблице 1. Введение МСК, животным в день ЭИМ существенно ускоряло течение процессов воспаления и репарации сердечной мышцы. Причем менялась не только динамика инфаркта, но и структура рубца.

Известно, что мезенхимные стволовые клетки обладают сходным с макрофагами набором поверхностных рецепторов для интерлейкина (ИЛ) -1р, ИЛ-1а, ИЛ-6 и фактора некроза опухоли а (ФИО а) (Deans and Moseley, 2000). Показано, что in vitro МСК секретируют ИЛ 6, 7, 8, 11, 12, 14, 15, трансформирующий ростовой фактор-р , белковый фактор LIF (leukemia inhibitory factor), гранулоцитарно-макрафагальный колониу-стимулирующий фактор (ГМ-КСФ), фактор роста стволовой клетки, фактор BDNF (brain-derived neurotrophic factor) и фактор роста нервов (Majumdar et al., 1998, I Mareschi et al, 2001, Li et al., 2002). Продукция некоторых из этих факторов (ИЛ 6, 8,11, ГМ-КСФ, LIF) усиливается при добавлении в среду культивирования таких провоспалительных цитокинов, как ИЛ-1а (Majumdar et al., 1998). Мы предполагаем, что и in vivo, непосредственно в зоне тканевого воспаления, МСК могут секретировать подобный набор факторов: стимулирующих (ИЛ-1, ФИО), регулирующих (ИЛ-11) и ингибирующих (трансформирующий ростовой фактор-р) процессы воспаления и тем самым участвовать в регуляции воспалительных реакций.

Васкуляризация зоны ишемического повреждения. На 35 сутки, в зрелом рубце количество сосудов синусоидного типа в обеих группах достоверно не отличалось, а количество сосудов с регулируемой стенкой (артериол и венул) у животных опытной группы возросло более чем в 2 раза.

Помимо вышеназванных факторов МСК in vitro выделяют стимуляторы ангиогенеза - фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов (Li et al, 2002). В экспериментах на животных показано, что внутривенное введение МСК крысам стимулировало продукцию фактора роста эндотелия сосудов и основного фактора роста фибробластов в пограничной зоне при ишемическом поражении головного мозга (Chen et al., 2003). Мы полагаем, что подобная стимуляция серкреции этих факторов возможна и в зоне ишемического повреждения миокарда. Вероятно, МСК активировали ангиогенез в области инфаркта. Увеличение количества функционирующих сосудов значительно улучшало кислородное снабжение поврежденного участка и способствовало поддержанию метаболизма миокарда на физиологическом уровне.

Таким образом, в данной работе показано, что введение МСК существенно ускоряло процессы формирования рубца. Полное рубцевание поврежденной ткани у подопытных животных происходило на 2 недели раньше (через 21 сутки после ЭИМ), чем в контрольной группе (на 35 сутки после ЭИМ).

По литературным данным известно, что после трансмурального инфаркта миокарда развивается дилатация левого желудочка сердца, а при осложненных инфарктах дилатация обоих желудочков сердца, что свидетельствует о сильной функциональной перегрузке миокарда внеинфарктной зоны. Дилатация левого желудочка развивается в значительной степени на поздних постинфарктных сроках, что связано с профессией фиброзной ткани во внеинфарктные области. Трансплантация МСК приводила к существенному уменьшению дилатации правого желудочка.

Таблица 1. Морфологическая картина экспериментального инфаркта миокарда у контрольных и подопытных животных.

Группы\Сроки наблюдения 4 сутки после ЭИМ 7 сутки после ЭИМ | 21 сутки после ЭИМ 35 сутки после ЭИМ 42 сутки после ЭИМ

Контрольная Зона инфаркта: -инфильтрация гистиоцитами, лейкоцитами, лимфоцитами -образование грануляционной ткани, -коагуляционный некроз кэрдиомиоцнтов Пограничная зона: -периферический миоцитолнз Зона инфаркта: -финальные этапы коагуляционного некроза -начальные этапы формирования соединительной ткани -в сосудистом слое сосуды синусоидного типа Пограничная зона: -отек кардиомиоцитов Зона инфаркта: -формирование рубца -в толще рубца большое количество синусоидов -кардиомиоцитов нет Пограничная зона и внеинфарктная зона: -отек кардиомиоцитов -непроходимые капилляры. Зона инфаркта: -зрелый рубец -в толще рубца большое количество синусоидов Пограничная зона: -инфильтрация, - активация стромального компонента, -формирование грануляционной ткани. Внеинфарктная зона: -отек кардиомиоцитов. Зона инфаркта: -зрелый рубец -по периферии признаки роста рубцовой ткани -в соединительной ткани сосуды синусоидного типа Пограничная и внеинфарктная зона -отек кардиомиоцитов -непроходимые капилляры

Подопытная (введение ;МСК) Зона инфаркта: -образование грануляционной ткани -финальные этапы коагуляционного некроза -проходимые капилляры. -сохранившиеся кардиомиоциты Зона инфаркта: -формирование рубца -в толще рубца проходимые сосуды - периваскулярно сохраняются кардиомиоциты Пограничная зона: -миоцитолиз, -отека кардиомиоцитов нет. Зона инфаркта: -зрелый рубец -рубец насыщен эластическими волокнами. -сосудистый слой богат артериолами и венулами -субэпикардиальио лежат островки кардиомиоцитов. Пограничная зона: -отек кардиомиоцитов умеренный. Зона инфаркта: -зрелый рубец -субэпикардиальио островки, в некоторых случаях, слой кардиомиоцитов. -рубцовая ткань богата артериолами и венулами Пограничная зона: -отека кардиомиоцитов нет -признаков прогрессирующего повреждения нет Зона инфаркта: -зрелый рубец -рубцовая ткань богата .артериолами и венулами Пограничная зона: -отек кардиомиоцитов выражен слабо -признаков прогрессирующего повреждения нет

Дилатация левого желудочка на поздних сроках (42 сутки) после ЭИМ была существенно меньше выражена у подопытных животных.

Выявление кардиомиоцитов периинфарктной зоны окрашенных РКН26. На поздних сроках анализа (21, 35, 42 сутки) в периинфарктной зоне миокарда экспериментальных животных выявляли клетки, морфологически напоминающие кардиомиоциты, с меткой донорских МСК. Слой таких клеток прилегал непосредственно к зоне инфаркта.

Окрашивание криосрезов сердца антителами против коннексина 43 показало, что меченые клетки, содержали коннексин 43 и формировали щелевые контакты, как с окрашенными клетками, так и с кардиомиоцитами реципиента. Иммуноцитохимический анализ срезов сердца с использованием антител против других маркеров кардиомиоцитов, тропонина I и GATA4, выявил, что все клеточные элементы, прилегающие к зоне повреждения, прокрашивались как на GATA4, так и на тропонин I Таким образом, клеточные элементы миокарда, прилегающие к зоне повреждения и несущие донорскую метку, являлись кардиомиоцитами интегрированными в миокард. Однако на основании этих данных мы не можем с уверенностью утверждать, что донорские МСК именно дифференцировались в кардиомиоциты. В последние годы активно обсуждается феномен слияния клеточных элементов. Спонтанные слияния клеток выявлены для эмбриональных стволовых клеток, гемопоэтических стволовых клеток и моноцитов (Tada et al., 2003; Verfaillie et al., 2003; Balsam et al.,2004; Nygren et al., 2004). Слияние моноцитов и кардиомиоцитов пограничной зоны является своего рода защитной реакцией. Мы также не можем исключить такой механизм появления кардиомиоцитов с донорской меткой.

Влияние сроков внутривенного введения МСК при осложненном инфаркте. Животным с ЭИМ трансплантации клеток проводили за 14, 7, 2 суток до операции, в день операции, через 2, 7, 14 суток после операции. Сроки трансплантации клеток после ЭИМ определялись стадиями развития инфаркта миокарда: острое воспаление, завершение стадии коагуляционного некроза, активное формирование рубцовой ткапи соответственно. Гистологический анализ проводили на 42 сутки после экспериментального инфаркта.

Детекция флуоресцентно окрашенных МСК. Специфическую локализацию донорских МСК именно в зоне ишемического повреждения показали у всех подопытных животных независимо от срока трансплантации. Такое распределение МСК косвенно указывало на участие эндогенных стволовых клеток в процессах репарации миокарда. МСК, введенные на разных сроках относительно ЭИМ, мигрировали в сердце на разных этапах воспалительного процесса и формирования рубцовой ткани. На каждом отдельном этапе МСК испытывали воздействие определенных провоспалительных факторов. Вероятно, совокупность этих факторов и состояние микроокружения определяли степень воздействия МСК на поврежденный миокард. Особенности в строении рубцовой ткани при терапевтической трансплантации МСК. При трансплантации МСК в день ЭИМ. через 2 суток и 7 суток после ЭИМ. На 42 сутки после ЭИМ в зоне повреждения была выявлена рубцовая ткань с большим количеством эластических волокон. Количество сосудов с регулируемой стенкой было примерно в 1,5 раза выше, чем в контрольной группе. Субэпикардиально и субэндокардиально определялись слои кардиомиоцитов, между которыми находилась зрелая фиброзная ткань с большим количеством фибробластов. В пограничной зоне отек кардиомиоцитов выражен слабо, явления гибели кардиомиоцитов отмечали лишь в единичных случаях.

В интактной зоне миокарда отека не наблюдалось, в некоторых случаях - небольшие очаги межуточного фиброза. Рецидивов инфаркта практически не наблюдались. Показатели дшгатации левого желудочка были существенно меньше по сравнению с показателями дилатации животных контрольной группы.

При трансплантации МСК через 14 суток после ЭИМ. На 42 сутки после ЭИМ в поврежденной зоне определяли большое количество сосудов синусоидного типа, окруженных рыхлой соединительной тканью, инфильтрированной клетками воспаления. Количество артериол и венул было таким же, как в контрольной группе. Субэпикардиальный слой кардиомиоцитов отсутствовал. В пограничной зоне полоса кардиомиоцитов в состоянии интрацеллюлярного отека неширокая, но наблюдались признаки гибели кардиомиоцитов и прогрессии повреждения. В интактной зоне миокарда выражены признаки перегрузки кардиомиоцитов - интрацеллюлярный отек. Несмотря на признаки прогрессии повреждения, показатели дилатации левого желудочка были близки с показателями дилатации животных с трансплантацией в день операции, через 2, 7 суток после ЭИМ.

Комплексная оценка морфологических и морфометрических изменений в миокарде экспериментальных животных показала, что внутривенная трансплантация МСК в день операции, через 2, 7 суток после ЭИМ приводила к образованию рубца принципиально иной структуры, чем у контрольных животных. Появление в соединительной ткани рубца значительного количества эластических волокон делало его менее ригидным. Более эластичная, следовательно, более подвижная, способная к сокращению, структура рубца способствовала уменьшению функциональной перегрузки кардиомиоцитов пограничной области. В этих группах в зоне повреждения выявлялся субэпикардиальный слой кардиомиоцитов, нехарактерных для животных других экспериментальных групп и группы контроля.

Трансплантация МСК через 14 суток после ЭИМ также давала положительный результат, однако не столь яркий. При такой трансплантации предотвращалась патологическая дилатация левого желудочка сердца. Но таких результатов, как усиление васкуляризации поврежденной зоны и наличие субэпикардиальных слоев кардиомиоцитов выявлено не было. МСК, введенные через 14 суток после инфаркта миокарда, попадали в зону некроза на стадии хронического клеточного ответа инфильтрации макрофагов и лимфоцитов, образования грануляционной ткани. В зоне формирующейся рубцовой ткани уже присутствовали синтезирующие коллаген фибробласты и сформировались сосуды синусоидного типа. Поскольку новообразование сосудов к этому сроку началось, МСК, по-видимому, пе могли активировать ангиогенез в такой же степени, как у животных, которым трансплантация была проведена в день ЭИМ, через 2 и 7 сутки после ЭИМ. На данной стадии инфаркта миокарда МСК, вероятно, не были способны повысить выживаемость кардиомиоцитов в некротической зоне. Вполне вероятно, что на этом этапе постинфарктного воспаления, МСК могли секретировать факторы, например трансформирующий ростовой фактор-1, стимулирующие пролиферацию и активность клеток соединительной ткани, т. е. ускорять процесс формирования соединительнотканного рубца на месте повреждения сердечной мышцы (Chen et al., 2002). Особенности в строении рубцовой ткани при профилактической трансплантации МСК. При трансплантации МСК за 14 суток и за 7 суток ло ЭИМ. В данных группах на 42 сутки после ЭИМ выявляли рубец, состоящий из неоднородной фиброзной ткани с

толстыми коллагеновыми и единичными эластическими волокнами. Количество артериол и венул в фиброзной ткани было в 2 раза больше, чем в миокарде контрольных животных. Количество сосудов синусоидного типа, по сравнению с данными контрольной группы, уменьшилось достоверно, но незначительно. На протяженном участке пограничной области отмечали выраженный отек мышечных клеток миокарда. Во внеинфарктной зоне миокарда обнаруживали небольшие группы гибнущих кардиомиоцитов. Показатели дилатации левого желудочка были достоверно меньше по сравнению с показателями животных контрольной группы. При трансплантации МСК за 2 суток до ЭИМ. На 42 сутки после ЭИМ рубец состоял из зрелой фиброзной ткани с большим количеством активных фибробластов и значимым количеством эластических волокон. В соединительной ткани было больше сосудов с регулируемой стенкой (примерно в 2 раза), по сравнению с контролем. В зоне повреждения субэпикардиально и субэндокардиально определялись слои кардиомиоцитов. Признаков прогрессии зоны повреждения и рецидивов инфаркта не наблюдали. Отек кардиомиоцитов пограничной зоны был незначителен. Во внеинфарктной миокарде интрацеллюлярный отек встречался лишь в некоторых группах кардиомиоцитов. Показатели дилатации левого желудочка были достоверно меньше по сравнению с показателями животных контрольной группы.

Комплексная оценка морфологических и морфометрических изменений в миокарде экспериментальных животных показала, что внутривенная трансплантация МСК за 2 суток до ЭИМ приводила к эффектам схожим с терапевтической трансплантацией МСК на ранних сроках течения ЭИМ.

У животных, которым трансплантация МСК была проведена за 14 и 7 суток до инфаркта миокарда, мы выявили значительное повышение количества сосудов с регулируемой стенкой в зоне некроза. При этом дилатация желудочков у данных животных была такая же, как в контроле. У животных с трансплантацией за 14 суток отсутствовал субэпикардиальный слой кардиомиоцитов; с трансплантацией за 7 суток такие кардиомиоциты были обнаружены в незначительном количестве. МСК, введенные в кровеносное русло интактного животного, на первых же секундах оседают в капиллярах легких и печени. Через двое суток они были обнаружены в легких, селезенке, почках, печени (Gao et al. 2001) и костном мозге (Allers et al., 2004). Через семь суток они выявляются большей частью в костном мозге и кишечнике. Вероятно, МСК остаются в этих физиологических нишах до возникновения в организме какого-либо повреждения. В нашем случае - до проведения экспериментального инфаркта миокарда. Пока не известно, как влияет столь длительное пребывание в костном мозге (а большая часть МСК находилась именно там) на дифференцировочный потенциал донорских МСК и какова динамика мобилизации МСК в периферическую кровь.

Таким образом, мы показали, что максимальный эффект достигался при трансплантации МСК в наиболее близкие к моменту инфаркта миокарда сроки.

ВЫВОДЫ

1. Дифференцировка МСК крысы in vitro в кардиомиоцитарном направлении сопровождается экспрессией эмбриональных и функциональных маркеров миокарда.

2. МСК крысы, введённые в кровоток, мигрируют в зону инфаркта миокарда.

3. Трансплантация сингенных МСК ускоряет сроки течения процессов воспаления в ишемизированном миокарде.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в настоящей работе мы показали, что работали с чистыми популяциями МСК крысы. Мы проанализировали распределение сингенных МСК по организму интактных животных и животных, перенесших операцию экспериментального инфаркта миокарда. Донорские МСК мигрируют в красный костный мозг, кишечник и повреждённый миокард.

Мы выявили зависимость эффективности репарации миокарда от сроков трансплантации МСК. Значимые изменения морфологической структуры и морфометрических параметров повреждённого миокарда наблюдаются при трансплантации МСК в наиболее близкие к моменту инфаркта миокарда сроки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Кругляков П. В.. Соколова И. Б., Аминева X. К., Некрасова Н. Н., Вийде С. В., Чередниченко Н. Н., Зарицкиб А. Ю. Семернин Е. Н.Кислякова Т. В., Польпщев Д. Г. 2004. Терапия экспериментального инфаркта миокарда у крыс с помощью трансплангации сингенных мезенхимных стволовых клеток. Цитология, 46 (12): 1043-1054

Кругляков П. В.. Соколова И. Б., Аминева X. К., Некрасова Н. Н., Вийде С. В., Чередниченко Н. Н., Зарицкий А. Ю., Семерпин Е. Н., Кислякова Т.В., Полынцев Д. Г. 2005. Влияние сроков трансплантации мезенхимных стволовых клеток на репарацию сердечной мышцы крыс после инфаркта.

P. V. Krouelvakov. I. В. Sokolova, N. N. Nekrasova, Н. К. Amineva, D. G. Polyntsev, Т. V. Kislyakova. "Mesenchymal Stem Cells-Mediated Cell Therapy of Rat Infarcted Myocardium" 9th Annual Meeting of the International Society for Cellular Therapy (May 29-June 1, 2003) Phoenix, USA. p. 52.

P. V. Kruglvakov. D. G. Polyntsev, Т. V. Kislyakova. "Multiple Differentiation Potential Of Rat Bone Marrow-Derived Stromal Cells As Revealed By RT-PCR Approach" 9th Annual Meeting of the International Society for Cellular Therapy (May 29-June 1,2003) Phoenix, USA. p. 53. P. Krouelvakov. I. Sokolova, K. Amineva, N. Nekrasova, S. Viide, N. Cherednichenko, A. Zarytskii, E. Sememin, T. Kislyakova, D. G. Polyntsev. "Optimal Time Frames For Mesenchymal Stem Cells Transplantation In Myocardium Infarction Therapy" 10th Annual Meeting of the International Society For Cellular Therapy (May 7-10,2004) Dublin, Ireland, p. 66.

Кругляков П. В.. Соколова И. Б., Аминева X. К., Некрасова Н. Н., Вийде С. В., Чередниченко Н. Н., Зарицкий А. Ю., Семернин Е. Н., Кислякова Т. В., Полынцев Д. Г. " Влияние сроков трансплантации мезенхимных стволовых клеток на репарацию сердечной мышцы крыс после инфаркта". Тезисы докладов международного симпозиума «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» Цитология, 46(10): 920.

.2.006 fi 574£

Отпечатано в типографии СПб ТПП Заказ № 70-653/2006. Тираж 150 экз. Подписано в печать 02.03.2006

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кругляков, Петр Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования.

Основные положения, выносимые на защиту.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Стволовые клетки.

1.1.1. Эмбриональные стволовые клетки.

1.1.2. Стволовые клетки дифференцированных тканей взрослого организма.

1.1.3. Мезенхимные стволовые клетки.

1.2. Терапия инфаркта миокарда.

1.2.1. Инфаркт миокарда.

1.2.2. Терапевтические подходы к лечению инфаркта миокарда.

1.2.3. Стимуляция эндогенной регенерации миокарда.

1.2.4. Трансплантация фетальных и неонатальных кардиомиоцитов.

1.2.5. Реимплантация миобластов в область повреждения.

1.2.6. Мобилизация эндогенных стволовых клеток.

1.2.7. Клеточная терапия повреждений миокарда с применением моноиуклеарной фракции костного мозга.

1.2.8. Клеточная терапия повреждения миокарда с применением ГСК.

1.2.9. Клеточная терапия повреждений миокарда с применением МСК.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА.

2.1. Выделение и культивирование МСК крысы.

2.2. Фенотипирование МСК крысы.

2.3. Дифференцировка МСК крысы в ортодоксальных направлениях.

2.3.1. Дифференцировка МСК крысы в остеоцитарном направлении.

2.3.2. Дифференцировка МСК крысы в хондроцитарном направлении.

2.3.3. Дифференцировка МСК крысы в адипоцитарном направлении.

2.4. Дифференцировка МСК крысы в кардиомиоцитарном направлении.

2.5. Фенотипирование дифференцированных производных МСК.

2.6. Окрашивание мезенхимных стволовых клеток крысы флуорохромом РКН 26.

2.7. Моделирование экспериментального инфаркта миокарда (ЭИМ).

2.8. Введение МСК животным.

2.9. Фиксация материала, морфологический и гистологический анализ препаратов.

2.10. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда.

2.10.1. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда антителами против коннексина 43.

2.10.2. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда антителами против транскрипционного фактора GATA4 и тропонина I.

2.11. Анализ распределения МСК в организме подопытных и интактных животных.

2.12. Анализ распределения лизата МСК, окрашенных РКН26, в миокарде подопытных животных.

2.13. Количественная оценка васкуляризации зоны повреждения и измерение дилатации полостей сердца.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Мезенхимные стволовые клетки.

3.1.1. Характеристика культур МСК крыс.

3.1.2. Дифференцировка мезенхимных стволовых клеток в трёх ортодоксальных направлениях и фенотипирование полученных производных.

3.1.3. Дифференцировка МСК в кардиомиоцитарном направлении.

3.2. Динамика экспериментального инфаркта миокарда у крыс линии Wistar Kyoto.

3.2.1. Четвертые сутки после ЭИМ.

3.2.2. Седьмые сутки после операции ЭИМ.

3.2.3. Двадцать первые сутки после ЭИМ.

3.2.4. Тридцать пятые сутки после ЭИМ.

3.2.5. Сорок вторые сутки после операции ЭИМ.

3.3. Распределение МСК по организму интактных и подопытных животных.

3.3.1. Распределение МСК в организме интактного животного ЭИМ.

3.3.2. Распределение МСК в организме животного перенесшего ЭИМ.

3.3.3. Трансплантация лизата мезенхимных стволовых клеток животным с ЭИМ.

3.4. Динамика течения экспериментального инфаркта миокарда после трансплантации МСК.

3.4.1. Детекция донорских клеток в миокарде интактных и подопытных животных.

3.4.2. Морфологические особенности в строении ткани в зоне инфаркта миокарда у подопытных животных.

3.4.3. Выявление кардиомиоцитов периинфарктной зоны окрашенных РКН26.

3.5. Сравнение степени дилатации полостей сердца у контрольных и подопытных животных после ЭИМ.

3.6. Анализ васкуляризации зоны ишемического повреждения у контрольных и подопытных животных.

3.7. Регистрация изменений электрокардиограмм у контрольных и подопытных (с введенными МСК) животных после ЭИМ.

3.8. Влияние сроков внутривенного введения мезенхимных стволовых клеток при осложненном инфаркте.

3.8.1. Детекция флуоресцентно окрашенных мезенхимных стволовых клеток.

3.8.2. Особенности в строении рубцовой ткани при терапевтической трансплантации МСК.

3.8.3. Особенности в строении рубцовой ткани при профилактической трансплантации МСК.

3.9. Изменение морфометрических параметров миокарда у крыс с ЭИМ при разных сроках трансплантации МСК.

ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние трансплантации мезенхимных стволовых клеток на течение экспериментального инфаркта миокарда"

Изучение свойств мезенхимных стволовых клеток и их влияния на репаративные процессы в организме - одна из наиболее актуальных задач современной клеточной биологии. Особая значимость исследований в данной области связана с применением клеточных технологий для лечения человека. Мезенхимные стволовые клетки (МСК) - резиденты стромы костного мозга. Они обладают всеми свойствами мультипотентных стволовых клеток -способностью к самовоспроизведению и дифференцировке в нескольких направлениях. МСК можно культивировать in vitro, многократно увеличивая биомассу, не теряя дифференцировочного потенциала (Hung et al., 2002). Так называемыми ортодоксальными направлениями их дифференцировки считаются остеогенное, адипогенное и хондрогенное. Известно, что МСК способны к дифференцировке и в неортодоксальных направлениях -нейрональном и глиальном, кардиомиоцитарном и миоцитарном (Ferrari et al., 1998; Sanchez-Ramos et al., 2000; Woodbury et al., 2000; Deng et al., 2001; Woodbury et al., 2002; Long et al., 2005).

Предполагается, что основная задача МСК в сформированном организме - репарация тканей мезодермального происхождения. Эксперименты по введению МСК в организм интактного животного показали диффузное распределение донорского материала именно по тканям мезодермального происхождения, в том числе и по мышечной ткани (Anjos-Afonso et al., 2004). Более того, в исследованиях по трансплантации МСК в кровоток животным с повреждениями костной ткани было доказано что донорский материал мигрирует из кровотока в зону повреждения (Lu et al., 2001; Ji et al., 2004). Однако данная гипотеза не может считаться абсолютно доказанной на сегодняшний день.

Второй важный фактор - наличие разработанных воспроизводимых методик наращивания в культуре чистых популяций МСК, выделенных из костного мозга. Кроме того, доступность костного мозга для пункции позволяет использовать для трансплантации аутологичные МСК и избежать, таким образом, проблем иммунологической совместимости. Наконец, несмотря на их высокий пролиферативный потенциал in vitro, в сотнях проведённых эктопических трансплантаций МСК ни разу не фиксировали развитие опухоли.

Инфаркт миокарда - одна из основных причин, приводящих к стойкой инвалидизации или смертности во всём мире. Тромбоз или эмболия коронарных артерий способствуют образованию в сердце зоны ишемии и некрозу кардиомиоцитов. В области повреждения миокарда с первых минут развивается острый сосудистый ответ: вазодилатация артериол и капилляров, повышение проницаемости капилляров, временная вазоконстрикция исходящих сосудов, экссудация, а как следствие - отек. В течение нескольких часов формируется острый клеточный ответ: инфильтрация клетками воспаления, среди которых преобладают нейтрофилы, ликвидация клеточного дебриса, образование тромба. В последующие несколько дней развивается хронический клеточный ответ: миграция в зону повреждения макрофагов и лимфоцитов, образование грануляционной ткани и как следствие соединительно-тканного рубца. Повреждённый миокард никогда не восстанавливает своей первоначальной структуры. Это приводит к тяжёлым патологическим изменениям в функции сердца и развитию таких осложнений как сердечная недостаточность, аритмии, аневризмы, разрыв миокарда и т.д.

Применение клеточных технологий на экспериментальных моделях повреждения миокарда оказывало положительное влияние на репарацию ткани и восстановление сердечной деятельности. В качестве агентов клеточной терапии инфаркта миокарда использовали миобласты поперечнополосатой мускулатуры, фетальные кардиомиоциты, гемопоэтические стволовые клетки, стволовые клетки эндотелия сосудов и в том числе МСК (Atkins et al., 1999; Orlic et al., 2001; Kawamoto et al., 2003; Leobon et al.,2003; Skobel et al., 2004; Zhang et al., 2004; Katritsis et al., 2005; Xu et al.,2005). Однако проведенные исследования не охватывают весь спектр проблем, связанных с клеточной терапией инфаркта миокарда. В большинстве работ проводили интрамиокардиальное введение клеточного материала, что зачастую невозможно в клинической практике. Вопрос о миграции клеток при их трансплантации в кровоток животных с повреждением миокарда практически не исследован. Нам не удалось обнаружить данных о терапевтическом потенциале МСК трансплантированных в кровоток животных с экспериментальным повреждением миокарда.

Свидетельства того, что МСК могут дифференцироваться в кардиомиоциты как in vitro, так и in vivo, способны паракринно воздействовать на эндогенные популяции стволовых клеток и мигрировать в зону повреждения, послужили основой для формулировки цели и задач нашего исследования.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение влияния трансплантации сингенных мезенхимных стволовых клеток на течение экспериментального инфаркта миокарда у крыс.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. Выделить и охарактеризовать мезенхимные стволовые клетки крысы.

2. Адаптировать модель экспериментального инфаркта миокарда у крыс для животных породы Wistar-Kyoto.

3. Изучить общую картину течения экспериментального инфаркта миокарда у крыс линии Wistar-Kyoto.

4. Изучить распределение донорских МСК в организме интактных крыс.

5. Выявить МСК в миокарде экспериментальных животных.

6. Оценить влияние трансплантации МСК на гистологическую картину состояния ишемизированного миокарда.

7. Провести гистохимический анализ зоны ишемии экспериментальных животных.

8. Оценить гистологические, морфологические и морфометрические особенности в строении тканевой зоны инфаркта миокарда при профилактической и терапевтической трансплантации МСК.

Основные положения, выносимые на защиту.

2. МСК крысы, введённые в кровоток, мигрируют в зону инфаркта миокарда.

3. Трансплантация сингенных МСК ускоряет течение процессов воспаления в ишемизированном миокарде.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Кругляков, Петр Владимирович

выводы

2. МСК крысы, введённые в кровоток, мигрируют в зону инфаркта миокарда.

3. Трансплантация сингенных МСК ускоряет сроки течения процессов воспаления в ишемизированном миокарде.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в настоящей работе мы показали, что работали с чистыми популяциями МСК крысы. Проанализировав распределение сингенных МСК по организму интактных животных и животных, перенесших операцию экспериментального инфаркта миокарда, мы выяснили, что донорские МСК мигрируют в красный костный мозг, кишечник и повреждённый миокард.

Трансплантация МСК в кровоток экспериментальных животных приводит к значимым изменениям в динамике экспериментального инфаркта миокарда и в структуре формирующейся рубцовой ткани. По нашим данным МСК принимают непосредственное участие в репаративных процессах миокарда. Эффект МСК выявляется как при терапевтической, так и при профилактической трансплантации клеток. Максимальный эффект влияния МСК был достигнут при трансплантации клеток в наиболее близкие к моменту инфаркта миокарда сроки.

Механизм воздействия МСК на репарацию миокарда еще до конца не ясен. Мы экспериментально показали возможность дифференцировки МСК в кардиомиоциты в области инфаркта. Теоретически можно предположить, что часть введенных МСК, попав в поврежденный участок сердца, способны дифференцироваться в эндотелиоциты и клетки стромы миокарда, реконструируя тем самым поврежденную область сердца. Другая возможность - МСК остаются недифференцированными. Они выделяют определенные ростовые и антиапоптотические факторы и привлекают в зону некроза собственные стволовые клетки организма, значительно ускоряя и качественно изменяя процессы восстановления сердечной мышцы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Кругляков П. В., Соколова И. Б., Аминева X. К., Некрасова Н. Н., Вийде С. В., Чередниченко Н. Н., Зарицкий А. Ю. Семернин Е. Н.Кислякова Т. В., Полынцев Д. Г. 2004. Терапия экспериментального инфаркта миокарда у крыс с помощью трансплантации сингенных мезенхимных стволовых клеток. Цитология, 46 (12): 1043-1054

Кругляков П. В., Соколова И. Б., Аминева X. К., Некрасова Н. Н., Вийде С. В., Чередниченко Н. Н., Зарицкий А. Ю., Семернин Е. Н., Кислякова Т.В., Полынцев Д. Г. 2005. Влияние сроков трансплантации мезенхимных стволовых клеток на репарацию сердечной мышцы крыс после инфаркта. P. V. Krouglyakov, I. В. Sokolova, N. N. Nekrasova, Н. К. Amineva, D. G. Polyntsev, Т. V. Kislyakova. "Mesenchymal Stem Cells-Mediated Cell Therapy of Rat Infarcted Myocardium" 9th Annual Meeting of the International Society for Cellular Therapy (May 29-June 1, 2003) Phoenix, USA. p. 52. P. V. Kruglyakov, D. G. Polyntsev, Т. V. Kislyakova. "Multiple Differentiation Potential Of Rat Bone Marrow-Derived Stromal Cells As Revealed By RT-PCR Approach" 9th Annual Meeting of the International Society for Cellular Therapy (May 29-June 1, 2003) Phoenix, USA. p. 53.

P. Krouglyakov, I. Sokolova, K. Amineva, N. Nekrasova, S. Viide, N. Cherednichenko, A. Zarytskii, E. Semernin, T. Kislyakova, D. G. Polyntsev. "Optimal Time Frames For Mesenchymal Stem Cells Transplantation In Myocardium Infarction Therapy" 10th Annual Meeting of the International Society For Cellular Therapy (May 7-10, 2004) Dublin, Ireland, p. 66. Кругляков П. В., Соколова И. Б., Аминева X. К., Некрасова Н. Н., Вийде С. В., Чередниченко Н. Н., Зарицкий А. Ю., Семернин Е. Н., Кислякова Т. В., Полынцев Д. Г. 2004. Влияние сроков трансплантации мезенхимных стволовых клеток на репарацию сердечной мышцы крыс после инфаркта. Тезисы докладов международного симпозиума «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия». Цитология, 46(10): 920.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю глубокую благодарность и искреннюю признательность моему научному руководителю Харазовой Алле Давидовне, а также Татьяне Витальевне Кисляковой, Ирине Борисовне Соколовой и Дмитрию Генриховичу Полынцеву за огромную помощь, постоянное внимание к моей работе, поддержку и за всё, что было сделано ими для того, чтобы эта работа могла быть выполнена.

Я выражаю свою большую признательность Наталье Николаевне Зиньковой и Халиде Касимовне Аминевой за помощь в проведении анализа гистологических препаратов. Выражаю глубокую благодарность Елене Романовне Гагинской, Валерию Всеволодовичу Зенину, Тамаре Владимировне Бейр, за предоставленную возможность использования технической базы.

Благодарю коллектив кафедры и лаборатории за создание тёплой атмосферы и помощь в работе. Я благодарен также и всей своей большой семье, которая все эти годы оказывала мне всестороннюю помощь и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кругляков, Петр Владимирович, Санкт-Петербург

1. Андреев С.В., Докукин А.В., Чечулин Ю.С., Кобкова И.Д. 1968. Экспериментальная терапия сердечно-сосудистых заболеваний. Москва, 203с.

2. Ахабадзе JI.B. Восстановительные процессы в миокарде при дифтерийном миокардите и после введения некоторых биопрепаратов. 1971. Онтогенез, 2 (3), 252-261.

3. Беленький Е.Е., Рунихин Ю.А., Туницкая Т.А. Стимулирующее влияние метилурацила на репаративные процессы при экспериментальном инфаркте миокарда. В кн. Фармакологическая регуляция регенераторных процессов. Йошкар-Ола: 1979, 236-237.

4. Клиблей М.Х. Регенерация мышцы сердца у взрослых крыс по влиянием соединений кобальта. 1975. ДАН СССР, 223(1), 248-251.

5. Миракян В.О., Шперлинг И.Д., Мхитарян К.В., Петросян Д.Г. 1970. Влияние гидролизата миокарда и его комплекса с пирогеналом на ход регенерационного процесса сердечной мышцы у крыс. В кн. Симпозиум по регенерации миокарда. Ереван: 76-78.

6. Полежаев JI.B. 1970. Современное состояние проблемы регенерации миокарда В кн. Симпозиум по регенерации миокарда. Ереван: 5-9.

7. Полежаев JI.B. Ахабадзе Л.В., Захарова н.А., Мантьева B.JI. О регенерации миокарда у млекопитающих. 1958. ДАН СССР, 119 (5), 1039-1042

8. Полежаев JI.B. Ахабадзе Л.В., Музлаева Н.А., Явич М.П. 1965. Стимуляция регенерации мышцы сердца. Москва, 395с.

9. Полежаев JI.В. Состояние проблемы регенерации мышцы сердца 1975. Онтогенез, 6(2), 154-162.

10. Розанов Ю.М. 1988. Проточная цитометрия. в кн.: Методы культивирования клеток. Ленинград: С. 221-231.

11. Ромейс Б. 1954. Микроскопическая техника. Москва. 718с.

12. Саидрасулов С.С. Влияние комплекса, включающего нуклеиновые кислоты и витамины, на репаративную регенерацию колоторезаных проникающих ран миокарда. 1963. Изв. АН СССР, сер. биол., 1, 99-104.

13. Саркисов Д.С. 1977. Очерки по структурным основам гомеостаза. Москва, 349с.

14. Свищов А. В. 1972. Архивы патологии. 3:25-29.

15. Синицын Н.П. 1962. Фармакологические стимуляторы регенерационных процессов в сердечной мышце. В кн. Материалы 3-й конференции по вопросам регенерации и клеточного размножения. Москва: 151-155.

16. Abe S, Lauby G, Boyer С, Rennard SI, Sharp JG. Transplanted BM and BM side population cells contribute progeny to the lung and liver in irradiated mice. Cytotherapy. 2003;5(6):523-33.

17. Abrams RA, Deisseroth AB. Prospects for accelerating hematopoietic recovery following myelosuppressive therapy by using autologous, cryopreserved hematopoietic stem cells collected solely from the peripheral blood. Exp Hematol. 1979;7 Suppl 5:107-15.

18. Alison MR. Tissue-based stem cells: ABC transporter proteins take centre stage. J Pathol. 2003 Aug;200(5):547-50

19. Allers C, Sierralta WD, Neubauer S, Rivera F, Minguell JJ, Conget PA. Dynamic of distribution of human bone marrow-derived mesenchymal stemcells after transplantation into adult unconditioned mice. Transplantation. 2004 Aug 27;78(4):503-8.

20. Alonso L, Fuchs E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Sep 30;100 Suppl 1:11830-5.

21. Alvarez-Dolado M, Pardal R, Garcia-Verdugo JM, Fike JR, Lee HO, Pfeffer K, Lois C, Morrison SJ, Alvarez-Buylla A. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 2003 Oct 30;425(6961):968-73.

22. Amoh Y, Li L, Katsuoka K, Penman S, Hoffman RM. Multipotent nestin-positive, keratin-negative hair-follicle bulge stem cells can form neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Apr 12;102(15):5530-4.

23. Angelopoulou M, Novelli E, Grove JE, Rinder HM, Civin C, Cheng L, Krause DS. Cotransplantation of human mesenchymal stem cells enhances human myelopoiesis and megakaryocytopoiesis in NOD/SCID mice. Exp Hematol. 2003 May;31(5):413-20.

24. Anjos-Afonso F, Siapati EK, Bonnet D. In vivo contribution of murine mesenchymal stem cells into multiple cell-types under minimal damage conditions. J Cell Sci. 2004 Nov 1; 117(Pt 23):5655-64.

25. Asakura A, Seale P, Girgis-Gabardo A, Rudnicki MA. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 2002 Oct 14;159(l):123-34.

26. Atkins BZ, Hueman MT, Meuchel JM, Cottman MJ, Hutcheson KA, Taylor DA. Myogenic cell transplantation improves in vivo regional performance in infracted rabbit myocardium. J Heart Lung Transpl 1999; 18:1173-1180.

27. Auerbach R, Alby L, Morrissey LW, Tu M, Joseph J. Expression of organ-specific antigens on capillary endothelial cells. Microvasc Res. 1985 May;29(3):401-11.

28. Baran KW, Nguyen M, McKendall GR, Lambrew CT, Dykstra G, Palmeri ST, Gibbons RJ, Borzak S, Sobel BE, Gourlay SG, Rundle AC, Gibson CM, Barron HV; Limitation of Myocardial Infarction Following Thrombolysis in

29. Balsam LB, Wagers AJ, Christensen JL, Kofidis T, Weissman IL, Robbins RC. Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium. Nature. 2004 Apr 8;428(6983):668-73.

30. Bayat H, Swaney JS, Ander AN, Dalton N, Kennedy BP, Hammond HK, Roth DM. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Res Cardiol. 2002 May;97(3):206-13.

31. Bazan E, Alonso FJ, Redondo C, Lopez-Toledano MA, Alfaro JM, Reimers D, Herranz AS, Paino CL, Serrano AB, Cobacho N, Caso E, Lobo MV. In vitro and in vivo characterization of neural stem cells. Histol Histopathol. 2004 Oct;19(4):1261-75.

32. Bel A, Messas E, Agbulut O, Richard P, Samuel JL, Bruneval P, Hagege AA, Menasche P. Transplantation of autologous fresh bone marrow into infarcted myocardium: a word of caution. Circulation. 2003 Sep 9; 108 Suppl 1:1124752.

33. Belosjorow S, Schulz R, Dorge H, Schade FU, Heusch G. Endotoxin and ischemic preconditioning: TNF-alpha concentration and myocardial infarct development in rabbits. Am J Physiol. 1999 Dec;277(6 Pt 2):H2470-5.

34. Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D, Baker M, Limana F, Chimenti S, Kasahara H, Rota M, Musso E, Urbanek K, Leri A, Kajstura J, Nadal-Ginard

35. В, Anversa P. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 2003 Sep 19;114(6):763-76.

36. Bhagavati S, Xu W. Isolation and enrichment of skeletal muscle progenitor cells from mouse bone marrow. Biochem Biophys Res Commun. 2004 May 21;318(1):119-24.

37. Bielby RC, Boccaccini AR, Polak JM, Buttery LD. In vitro differentiation and in vivo mineralization of osteogenic cells derived from human embryonic stem cells. Tissue Eng. 2004 Sep-Oct; 10(9-10): 1518-25.

38. Bithell A, Williams BP. Neural stem cells and cell replacement therapy: making the right cells. Clin Sci (Lond). 2005 Jan; 108(1): 13-22.

39. Bjerknes M, Cheng H. Clonal analysis of mouse intestinal epithelial progenitors. Gastroenterology. 1999 Jan;116(l):7-14.

40. Breems DA, Blokland EA, Siebel KE, Mayen AE, Engels LJ, Ploemacher RE. Stroma-contact prevents loss of hematopoietic stem cell quality during ex vivo expansion of CD34+ mobilized peripheral blood stem cells. Blood. 1998 Jan 1;91(1):111-7.

41. Brinster RL. Stem cells and transgenic mice in the study of development. Int J Dev Biol. 1993 Mar;37(l):89-99.

42. Bruder SP, Kraus KH, Goldberg VM, Kadiyala S. The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. J Bone Joint Surg Am. 1998 Jul;80(7):985-96.

43. Burnstein RM, Foltynie T, He X, Menon DK, Svendsen CN, Caldwell MA. Differentiation and migration of long term expanded human neural progenitors in a partial lesion model of Parkinson's disease. Int J Biochem Cell Biol. 2004 Apr;36(4):702-13.

44. Camargo FD, Green R, Capetanaki Y, Jackson KA, Goodell MA. Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle through myeloid intermediates. Nat Med. 2003 Dec;9( 12): 1520-7.

45. Campagnoli C, Bellantuono I, Kumar S, Fairbairn LJ, Roberts I, Fisk NM. High transduction efficiency of circulating first trimester fetal mesenchymal stem cells: potential targets for in utero ex vivo gene therapy. BJOG. 2002 Aug; 109(8):952-4.

46. Campagnoli C, Roberts IA, Kumar S, Bennett PR, Bellantuono I, Fisk NM. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. Blood. 2001 Oct 15;98(8):2396-402.

47. Capela A, Temple S. LeX/ssea-1 is expressed by adult mouse CNS stem cells, identifying them as nonependymal. Neuron. 2002 Aug 29;35(5):865-75.

48. Chan J, O'Donoghue K, de la Fuente J, Roberts IA, Kumar S, Morgan JE, Fisk NM. Human fetal mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery. Stem Cells. 2005;23(1):93-102.

49. Chen F, Hui JH, Chan WK, Lee EH. Cultured mesenchymal stem cell transfers in the treatment of partial growth arrest. J Pediatr Orthop. 2003 Jul-Aug;23(4):425-9.

50. Chen J, Altman GH, Karageorgiou V, Horan R, Collette A, Volloch V, Colabro T, Kaplan DL. Human bone marrow stromal cell and ligament fibroblast responses on RGD-modified silk fibers. J Biomed Mater Res A. 2003 Nov l;67(2):559-70.

51. Chen JL, Guo ZK, Xu C, Li YH, Hou CM, Mao N, Chen H. Mesenchymal stem cells suppress allogeneic T cell responses by secretion of TGF-betal Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2002 Aug;10(4):285-8

52. Chen SS, Revoltella RP, Papini S, Michelini M, Fitzgerald W, Zimmerberg J, Margolis L. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three-dimensional culture systems. Stem Cells. 2003;21(3):281-95.

53. Chen J, Li Y, Katakowski M, Chen X, Wang L, Lu D, Lu M, Gautam SC, Chopp M. Intravenous bone marrow stromal cell therapy reduces apoptosis and promotes endogenous cell proliferation after stroke in female rat. J Neurosci Res. 2003 Sep 15;73(6):778-86.

54. Chen X, Li Y, Wang L, Katakowski M, Zhang L, Chen J, Xu Y, Gautam SC, Chopp M. Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production. Neuropathology. 2002 Dec;22(4):275-9.

55. Cheng L, Hammond H, Ye Z, Zhan X, Dravid G. Human adult marrow cells support prolonged expansion of human embryonic stem cells in culture. Stem Cells. 2003;21(2):131-42.

56. Chu JX, Zhao JM, Ding SL, Xu SC, Liu AR, Wang SP., Activation of auto-mesenchymal stem cells of skeletal muscle by bone morphogenetic protein for rescuing bone marrow failure Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2002 Jun;24(3):272-5.

57. Clarke DL, Johansson CB, Wilbertz J, Veress B, Nilsson E, Karlstrom H, Lendahl U, Frisen J. Generalized potential of adult neural stem cells. Science. 2000 Jun 2;288(5471): 1660-3.

58. Colter DC, Class R, DiGirolamo CM, Prockop DJ. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Mar 28;97(7):3213-8.

59. Colter DC, Sekiya I, Prockop DJ. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Jul 3;98(14):7841-5.

60. Deans RJ, Moseley AB. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Exp Hematol. 2000 Aug;28(8):875-84.

61. Deng W, Obrocka M, Fischer I, Prockop DJ. In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Mar 23;282(l):148-52.

62. Dexter TM, Garland J, Scott D, Scolnick E, Metcalf D. Growth of factor-dependent hemopoietic precursor cell lines. J Exp Med. 1980 Oct 1; 152(4): 1036-47.

63. Dicker A, Le Blanc K, Astrom G, van Harmelen V, Gotherstrom C, Blomqvist L, Arner P, Ryden M. Functional studies of mesenchymal stem cells derived from adult human adipose tissue. Exp Cell Res. 2005 May 27;

64. Ding S, Wu TY, Brinker A, Peters EC, Hur W, Gray NS, Schultz PG. Synthetic small molecules that control stem cell fate. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jun 24;100(13):7632-7.

65. Doetschman T, Williams P, Maeda N. Establishment of hamster blastocyst-derived embryonic stem (ES) cells. Dev Biol. 1988 May;127(l):224-7.

66. Dong J, Uemura T, Kikuchi M, Tanaka J, Tateishi T. Long-term durability of porous hydroxyapatite with low-pressure system to support osteogenesis of mesenchymal stem cells. Biomed Mater Eng. 2002;12(2):203-9.

67. Dooley DC, Oppenlander BK, Xiao M. Analysis of primitive CD34- and CD34+ hematopoietic cells from adults: gain and loss of CD34 antigen by undifferentiated cells are closely linked to proliferative status in culture. Stem Cells. 2004;22(4):556-69.

68. Dunnwald M, Tomanek-Chalkley A, Alexandrunas D, Fishbaugh J, Bickenbach JR. Isolating a pure population of epidermal stem cells for use in tissue engineering. Exp Dermatol. 2001 Feb;10(l):45-54.

69. Dwinell MB, Ogawa H, Barrett KE, Kagnoff MF. SDF-1/CXCL12 regulates cAMP production and ion transport in intestinal epithelial cells via CXCR4. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004 May;286(5):G844-50.

70. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981 Jul 9;292(5819): 154-6.

71. Fernandez M, Simon V, Herrera G, Cao C, Del Favero H, Minguell JJ. Detection of stromal cells in peripheral blood progenitor cell collections from breast cancer patients. Bone Marrow Transplant. 1997 Aug;20(4):265-71.

72. Ferrari G, Cusella-De Angelis G, Coletta M, Paolucci E, Stornaiuolo A, Cossu G, Mavilio F Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science. 1998 Mar 6;279(5356): 1528-30.

73. Field L. Future therapy for cardiovascular disease. NHLBI Workshop Cell Transplantation: Future Therapy for Cardiovascular Disease 1998. Columbia, MD.

74. Filip S, English D, Mokry J. Issues in stem cell plasticity. J Cell Mol Med. 2004 Oct-Dec;8(4):572-7.

75. Fink T, Abildtrup L, Fogd K, Abdallah BM, Kassem M, Ebbesen P, Zachar V. Induction of adipocyte-like phenotype in human mesenchymal stem cells by hypoxia. Stem Cells. 2004;22(7): 1346-55.

76. Frangogiannis NG, Smith CW, Entman ML. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 2002 Jan;53(l):31-47.

77. Frangogiannis NG, Youker KA, Rossen RD, Gwechenberger M, Lindsey MH, Mendoza LH, Michael LH, Ballantyne CM, Smith CW, Entman ML.

78. Cytokines and the microcirculation in ischemia and reperfusion. J Mol Cell Cardiol. 1998 Dec;30(12):2567-76.

79. Fridenshtein Ala, Chailakhin RK, Gerasimov IuV. Proliferative and differentiation potentials of skeletogenic bone marrow colony-forming cells Tsitologiia. 1986 Mar;28(3):341-9.

80. Fridenshtein Ala, Petrakova KV, Kuralesova Al, Frolova GI. Precursor cells for osteogenic and hemopoietic tissues. Analysis of heterotopic transplants of bone marrow Tsitologiia. 1968 May;10(5):557-67.

81. Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 1987 May;20(3):263-72.

82. Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol. 1976 Sep;4(5):267-74

83. Fukuda K, Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stem cells for cardiovascular tissue engineering. Artif Organs. 2001 Mar;25(3): 187-93

84. Gao J, Dennis JE, Muzic RF, Lundberg M, Caplan Al. 2001. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cell Tissues Organs. 169: 12-20.

85. Gojo S, Gojo N, Takeda Y, Mori T, Abe H, Kyo S, Hata J, Umezawa A. In vivo cardiovasculogenesis by direct injection of isolated adult mesenchymal stem cells. Exp Cell Res. 2003 Aug l;288(l):51-9.

86. Goodell MA, Brose K, Paradis G, Conner AS, Mulligan RC. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 1996 Apr 1;183(4): 1797-806.

87. Gothot A, van der Loo JC, Clapp DW, Srour EF. Cell cycle-related changes in repopulating capacity of human mobilized peripheral blood CD34(+) cells in non-obese diabetic/severe combined immune-deficient mice. Blood. 1998 Oct 15;92(8):2641-9.

88. Graves KH, Moreadith RW. Derivation and characterization of putative pluripotential embryonic stem cells from preimplantation rabbit embryos. Mol Reprod Dev. 1993 Dec;36(4):424-33.

89. Guan XQ, Yu JL, Li LQ, Liu GX. Study on mesenchymal stem cells entering the brain through the blood-brain barrier. Zhonghua Er Ke Za Zhi. 2004 Dec;42(12):920-3.

90. Guo Z, Yang J, Liu X, Li X, Hou C, Tang PH, Mao N. Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow.Chin Med J (Engl). 2001 Sep;114(9):950-3.

91. Gupta K, Kshirsagar S, Li W, Gui L, Ramakrishnan S, Gupta P, Law PY, Hebbel RP. 1999. VEGF prevents apoptosis of human microvascular endothelial cells via opposing effects on MAPK/ERK and SAPK/JNK signaling. Exp Cell Res. 247:495-504.

92. Hilbe W, Dirnhofer S, Oberwasserlechner F, Schmid T, Gunsilius E, Hilbe

93. G, Woll E, Kahler CM. CD133 positive endothelial progenitor cells contribute to the tumour vasculature in non-small cell lung cancer. J Clin Pathol. 2004 Sep;57(9):965-9.

94. Hill JM, Syed MA, Arai AE, Powell TM, Paul JD, Zalos G, Read EJ, Khuu

95. H, Leitman SF, Home MK, Csako G, Dunbar CE, Cannon RO. Outcomes of granulocyte colony-stimulating factor administration to patients with severe coronary artery disease. Circulation. 2004; 110(suppl III):352.

96. Honczarenko M, Le Y, Swierkowski M, Ghiran I, Glodek A, Silberstein LE. Human bone marrow stromal cells express a distinct set of biologically functional chemokine receptors. Stem Cells. 2005 Oct 27; Epub ahead of print.

97. Hong SH, Gang EJ, Jeong JA, Ahn C, Hwang SH, Yang IH, Park HK, Han H, Kim H. In vitro differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells. Biochem Biophys Res Commun. 2005 May 20;330(4):1153-61.

98. Hung SC, Chen NJ, Hsieh SL, Li H, Ma HL, Lo WH. Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow. Stem Cells. 2002;20(3):249-58.

99. Iannaccone PM, Taborn GU, Garton RL, Caplice MD, Brenin DR. Pluripotent embryonic stem cells from the rat are capable of producing chimeras. Dev Biol. 1994 May;163(l):288-92. Erratum in: Dev Biol 1997 May 1; 185(1): 124-5.

100. Im GI, Kim DY, Shin JH, Hyun CW, Cho WH. Repair of cartilage defect in the rabbit with cultured mesenchymal stem cells from bone marrow. J Bone Joint Surg Br. 2001 Mar;83(2):289-94.

101. Imai К, Kobayashi M, Wang J, Ohiro Y, Hamada J, Cho Y, Imamura M, Musashi M, Kondo T, Hosokawa M, Asaka M. Selective transendothelial migration of hematopoietic progenitor cells: a role in homing of progenitor cells. Blood. 1999 Jan l;93(l):149-56.

102. Iwai-Kanai E, Hasegawa K, Fujita M, Araki M, Yanazume T, Adachi S, Sasayama S. 2002. Basic fibroblast growth factor protects cardiac myocytes from iNOS-mediated apoptosis. J Cell Physiol. 190:54-62.

103. Iwatani H, Ito T, Imai E, Matsuzaki Y, Suzuki A, Yamato M, Okabe M, Hori M. Hematopoietic and nonhematopoietic potentials of Hoechst(low)/side population cells isolated from adult rat kidney. Kidney Int. 2004 May;65(5): 1604-14.

104. Jackson KA, Majka SM, Wang H, Pocius J, Hartley CJ, Majesky MW, Entman ML, Michael LH, Hirschi KK, Goodell MA. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest. 2001 Jun; 107(11): 1395-402.

105. Jacobs P, Wood L, Horak S. Collection and cryopreservation of human stem and progenitor cells for bone marrow transplantation. J Clin Apheresis. 1991;6(l):54-8.

106. Jaeschke H, Smith CW. Mechanisms of neutrophil-induced parenchymal cell injury. J Leukoc Biol. 1997 Jun;61(6):647-53.

107. Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan Al, Bruder SP. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 1997 Feb;64(2):295-312

108. Jankowski RJ, Deasy BM, Cao B, Gates C, Huard J. The role of CD34 expression and cellular fusion in the regeneration capacity of myogenic progenitor cells. J Cell Sci. 2002 Nov 15;115(Pt 22):4361-74.

109. Jansen J, Hanks S, Thompson JM, Dugan MJ, Akard LP. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. J Cell Mol Med. 2005 Jan-Mar;9(l):37-50.

110. Ji JF, He BP, Dheen ST, Tay SS. Interactions of chemokines and chemokine receptors mediate the migration of mesenchymal stem cells to the impaired site in the brain after hypoglossal nerve injury. Stem Cells. 2004;22(3):415-27.

111. Ji JF, He BP, Dheen ST, Tay SS. Interactions of chemokines and chemokine receptors mediate the migration of mesenchymal stem cells to the impaired site in the brain after hypoglossal nerve injury. Stem Cells. 2004;22(3):415-27.

112. Jiang Y, Vaessen B, Lenvik T, Blackstad M, Reyes M, Verfaillie CM. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. Exp Hematol. 2002 Aug;30(8):896-904.

113. Jo DY, Rafii S, Hamada T, Moore MA. Chemotaxis of primitive hematopoietic cells in response to stromal cell-derived factor-1. J Clin Invest. 2000 Jan; 105( 1): 101 -11.

114. Johnstone В, Hering TM, Caplan Al, Goldberg VM, Yoo JU. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp Cell Res. 1998 Jan 10;238(l):265-72.

115. Jordan NJ, Kolios G, Abbot SE, Sinai MA, Thompson DA, Petraki K, Westwick J. Expression of functional CXCR4 chemokine receptors on human colonic epithelial cells. J Clin Invest. 1999 Oct; 104(8): 1061-9.

116. Jorgensen C, Djouad F, Apparailly F, Noel D. Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy. Gene Ther. 2003 May;10(10):928-31.

117. Juncosa-Melvin N, Boivin GP, Galloway MT, Gooch C, West JR, Sklenka AM, Butler DL. Effects of cell-to-collagen ratio in mesenchymal stem cell-seeded implants on tendon repair biomechanics and histology. Tissue Eng. 2005 Mar-Apr; 11(3-4):448-57.

118. Kan I, Melamed E, Offen D. Integral therapeutic potential of bone marrow mesenchymal stem cells. Curr Drug Targets. 2005 Feb;6(l):31-41.

119. Kang SK, Lee DH, Bae YC, Kim HK, Baik SY, Jung JS. Improvement of neurological deficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromal cells after cerebral ischemia in rats. Exp Neurol. 2003 Oct;183(2):355-66.

120. Kao RL, Chin TK, Ganote CE et al. Satellite cell transplantation to repair injured myocardium. Cardiovasc Res 2000;1:31-42.

121. Katz AJ, Tholpady A, Tholpady SS, Shang H, Ogle RC. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 2005 Mar;23(3):412-23.

122. Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS, Shou M, Lee CW, Barr S, Fuchs S, Epstein SE. Local delivery of marrow-derived stromal cells augmentscollateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 2004 Mar 30; 109( 12): 1543-9.

123. Kogler G, Radke TF, Lefort A, Sensken S, Fischer J, Sorg RV, Wernet P. Cytokine production and hematopoiesis supporting activity of cord blood-derived unrestricted somatic stem cells. Exp Hematol. 2005 May;33(5):573-83.

124. Kruger GM, Mosher JT, Bixby S, Joseph N, Iwashita T, Morrison SJ. Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness. Neuron. 2002 Aug 15;35(4):657-69.

125. Kuwana M, Okazaki Y, Kodama H, Izumi K, Yasuoka H, Ogawa Y, Kawakami Y, Ikeda Y. Human circulating CD 14+ monocytes as a source of progenitors that exhibit mesenchymal cell differentiation. J Leukoc Biol. 2003 Nov;74(5):833-45.

126. Kuznetsov SA, Mankani MH, Gronthos S, Satomura K, Bianco P, Robey PG. Circulating skeletal stem cells. J Cell Biol. 2001 May 28;153(5):1133-40.

127. Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, Reitsma M, Dohse M, Osborne L, Wang X, Finegold M, Weissman IL, Grompe M. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med. 2000 Nov;6(l 1): 1229-34.

128. Lalykina KS, Latsinik NV, Epikhina SIu, Fridenshtein. Self-maintenance of induced bone tissue Biull Eksp Biol Med. 1976 Feb;81(2):239-42

129. Latif N, Khan MA, Birks E, OTarrell A, Westbrook J, Dunn MJ, Yacoub MH. Upregulation of the Bcl-2 family of proteins in end stage heart failure. J Am Coll Cardiol. 2000 Jun;35(7): 1769-77.

130. Laurson J, Selden C, Hodgson HJ. Hepatocyte progenitors in man and in rodents—multiple pathways, multiple candidates. Int J Exp Pathol. 2005 Feb;86(l):l-18.

131. Lazarus HM, Haynesworth SE, Gerson SL, Caplan AL Human bone marrow-derived mesenchymal (stromal) progenitor cells (MPCs) cannot be recovered from peripheral blood progenitor cell collections. J Hematother. 1997 Oct;6(5):447-55.

132. Le Blanc K, Ringden O. Use of mesenchymal stem cells for the prevention of immune complications of hematopoietic stem cell transplantation. Haematologica. 2005 Apr;90(4):438a.

133. Le Visage C, Dunham B, Flint P, Leong KW. Coculture of mesenchymal stem cells and respiratory epithelial cells to engineer a human composite respiratory mucosa. Tissue Eng. 2004 Sep-Oct; 10(9-10): 1426-35.

134. Lee MW, Yang MS, Park JS, Kim HC, Kim YJ, Choi J. Isolation of mesenchymal stem cells from cryopreserved human umbilical cord blood. Int J Hematol. 2005 Feb;81(2): 126-30.

135. Lee RJ, Springer ML, Blanco-Bose WE, Shaw R, Ursell PC, Blau HM. VEGF gene delivery to myocardium: deleterious effects of unregulated expression. Circulation. 2000 Aug 22;102(8):898-901

136. Lefer DJ, Granger DN. Oxidative stress and cardiac disease. Am J Med. 2000 Sep; 109(4):315-23.

137. Leobon B, Garcin I, Menasche P, Vilquin JT, Audinat E, Charpak S. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Jun 24;100(13):7808-11

138. Li J, Yu X, Pan W, Unger RH. 2002. Gene expression profile of rat adipose tissue at the onset of high-fat-diet obesity. Am. J Physiol Endocrinol Metab. 282:E1334-41.

139. Li M, Ma W, Hou Y, Sun XF, Sun QY, Wang WH. Improved isolation and culture of embryonic stem cells from Chinese miniature pig. J Reprod Dev. 2004 Apr;50(2):237-44.

140. Li M, Zhang D, Hou Y, Jiao L, Zheng X, Wang WH. Isolation and culture of embryonic stem cells from porcine blastocysts. Mol Reprod Dev. 2003 Aug;65(4):429-34.

141. Liechty KW, MacKenzie TC, Shaaban AF, Radu A, Moseley AM, Deans R, Marshak DR, Flake AW. Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep. Nat Med. 2000 Nov;6(l 1): 1282-6.

142. Lin GS, Lu JJ, Jiang XJ, Li XY, Li GS. Autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells improved heart function after myocardial infarction. Acta Pharmacol Sin. 2004 Jul;25(7):876-86.

143. Lints TJ, Parsons LM, Hartley L, Lyons I, Harvey RP. Nkx-2.5: a novel murine homeobox gene expressed in early heart progenitor cells and their myogenic descendants. Development. 1993 Oct; 119(2):419-31.

144. Liu J, Hu Q, Wang Z, Xu C, Wang X, Gong G, Mansoor A, Lee J, Hou M, Zeng L, Zhang JR, Jerosch-Herold M, Guo T, В ache RJ, Zhang J. Autologous stem cell transplantation for myocardial repair. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004 Aug;287(2):H501-l 1.

145. Long X, Olszewski M, Huang W, Kletzel M. Neural cell differentiation in vitro from adult human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2005 Feb;14(l):65-9.

146. Lu D, Li Y, Wang L, Chen J, Mahmood A, Chopp M. Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2001 Aug; 18(8):813-9.

147. Luriia EA, Chakhava OV, Fridenshtein Ala. The origin of fibroblast-like cells in bone marrowculture Tsitologiia. 1966 Jan-Feb;8(l):l 15-9. Russian.

148. Marshall CJ, Moore RL, Thorogood P, Brickell PM, Kinnon C, Thrasher AJ Detailed characterization of the human aorta-gonad-mesonephros region reveals morphological polarity resembling a hematopoietic stromal layer. DevDyn. 1999 Jun;215(2): 139-47.

149. Martin DR, Cox NR, Hathcock TL, Niemeyer GP, Baker HJ.; Isolation and characterization of multipotential mesenchymal stem cells from feline bone marrow. Exp Hematol. 2002 Aug;30(8):879-86.

150. Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1981 Dec;78(12):7634-8.

151. Mayhall EA, Paffett-Lugassy N, Zon LI. The clinical potential of stem cells. Curr Opin Cell Biol. 2004 Dec; 16(6):713-20.

152. McCloskey KE, Lyons I, Rao RR, Stice SL, Nerem RM. Purified and proliferating endothelial cells derived and expanded in vitro from embryonic stem cells. Endothelium. 2003;10(6):329-36.

153. McMillen MA, Simmons RL. Long-term bone marrow culture as a stem cell source for transplantation. J Surg Res. 1986 Mar;40(3): 193-7.

154. Meinel L, Hofmann S, Karageorgiou V, Zichner L, Langer R, Kaplan D, Vunjak-Novakovic G. Engineering cartilage-like tissue using human mesenchymal stem cells and silk protein scaffolds. Biotechnol Bioeng. 2004 Nov 5;88(3):379-91.

155. Menasche P. Skeletal muscle satellite cell transplantation.Cardiovasc Res. 2003 May l;58(2):351-7.

156. Michel M, L'Heureux N, Pouliot R, Xu W, Auger FA, Germain L. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1999 Jun;35(6):318-26.

157. Mohr H.J. Die pathologische Anatomie des Wirkungmechanismus embrionalen Herzextrates (Corhormon). 1952. Dtsch. Med. Wochenschr., 77(42), 1287-1290.

158. Mohr H.J., Helmreich,E. Ein morphologister Beitrag zum Wirkungmechanismus embrionalen Herzextrates (Corhormon). 1952. Arch.exper. Pathol. Pharmakol., 216, 327-330.

159. Moore MA. Cytokine and chemokine networks influencing stem cell proliferation, differentiation, and marrow homing. J Cell Biochem Suppl. 2002;38:29-38

160. Moritoh Y, Yamato E, Yasui Y, Miyazaki S, Miyazaki J. Analysis of insulin-producing cells during in vitro differentiation from feeder-free embryonic stem cells. Diabetes. 2003 May;52(5):l 163-8.

161. Moritoh Y, Yamato E, Yasui Y, Miyazaki S, Miyazaki J. Analysis of insulin-producing cells during in vitro differentiation from feeder-free embryonic stem cells. Diabetes. 2003 May;52(5):l 163-8.

162. Morrison SJ, Weissman IL. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1994 Nov; 1(8):661-73.

163. Morrison SJ, White PM, Zock C, Anderson DJ. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 1999 Mar 5;96(5):737-49.

164. Mothe AJ, Tator CH. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat Neuroscience. 2005;131(l):177-87.

165. Muraglia A, Cancedda R, Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 2000 Apr; 113 ( Pt 7): 1161-6.

166. Murry CE, Wiseman RW, Schwartz SM, Hauschka SD.Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest 1996;98:2512-23.

167. Neumann FJ, Ott I, Gawaz M, Richardt G, Holzapfel H, Jochum M, Schomig A. Cardiac release of cytokines and inflammatory responses in acute myocardial infarction. Circulation. 1995 Aug 15;92(4):748-55.

168. Ohneda O, Fennie C, Zheng Z, Donahue C, La H, Villacorta R, Cairns B, Lasky LA. Hematopoietic stem cell maintenance and differentiation are supported by embryonic aorta-gonad-mesonephros region-derived endothelium. Blood. 1998 Aug 1;92(3):908-19.

169. Ohtsuka M, Takano H, Zou Y, Toko H, Akazawa H, Qin Y, Suzuki M, Hasegawa H, Nakaya H, Komuro I. Cytokine therapy prevents left ventricular remodeling and dysfunction after myocardial infarction through neovascularization. FASEB J. 2004; 18:851- 853.

170. Okubo T, Matsui N, Yanai N, Obinata M. Stroma-dependent maintenance of cytokine responsive hematopoietic progenitor cells derived from long-term bone marrow culture. Cell Struct Funct. 2000 Apr;25(2): 133-9.

171. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Jakoniuk I, Anderson SM, Li B, Pickel J, McKay R, Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P. Bone marrowcells regenerate infarcted myocardium. Nature. 2001 Apr 5;410(6829):701-5.

172. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Limana F, Jakoniuk I, Quaini F, Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98:10344-10349.

173. Orschell-Traycoff CM, Hiatt K, Dagher RN, Rice S, Yoder MC, Srour EF. Homing and engraftment potential of Sca-l(+)lin(-) cells fractionated on the basis of adhesion molecule expression and position in cell cycle. Blood. 2000 Aug 15;96(4): 1380-7.

174. Osawa M, Nakamura K, Nishi N, Takahasi N, Tokuomoto Y, Inoue H, Nakauchi H. In vivo self-renewal of c-Kit+ Sca-1+ Lin(low/-) hemopoietic stem cells. J Immunol. 1996 May 1;156(9):3207-14.

175. Oskarsson HJ, Coppey L, Weiss RM, Li WG.; Antioxidants attenuate myocyte apoptosis in the remote non-infarcted myocardium following large myocardial infarction. Cardiovasc Res. 2000 Feb;45(3):679-87.

176. Oswald J, Boxberger S, Jorgensen B, Feldmann S, Ehninger G, Bornhauser M, Werner C. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells. 2004;22(3):377-84.

177. Palojoki E, Saraste A, Eriksson A, Pulkki K, Kallajoki M, Voipio-Pulkki LM, Tikkanen I. Cardiomyocyte apoptosis and ventricular remodeling after myocardial infarction in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001 Jun;280(6):H2726-31.

178. Pardanaud L, Yassine F, Dieterlen-Lievre F. Relationship between vasculogenesis, angiogenesis and haemopoiesis during avian ontogeny. Development. 1989 Mar;105(3):473-85.

179. Parker MH, Seale P, Rudnicki MA. Looking back to the embryo: defining transcriptional networks in adult myogenesis. Nat Rev Genet. 2003 Jul;4(7):497-507.

180. Passier R, Oostwaard DW, Snapper J, Kloots J, Hassink RJ, Kuijk E, Roelen B, de la Riviere AB, Mummery C. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells. 2005 Jun;23(6):772-80.

181. Pellegrini G, Bondanza S, Guerra L, De Luca M. Cultivation of human keratinocyte stem cells: current and future clinical applications. Med Biol Eng Comput. 1998 Nov;36(6):778-90.

182. Pera M.F., Reubinoff В., Trounson A. 2000. Human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 113(Pt 1): 5-10.

183. Pesce M, Anastassiadis K, Scholer HR. Oct-4: lessons of totipotency from embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 1999;165(3-4):144-52.

184. Phinney DG, Kopen G, Isaacson RL, Prockop DJ. Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice: variations in yield, growth, and differentiation. J Cell Biochem. 1999 Mar 15;72(4):570-85.

185. Pinckard RN, Olson MS, Giclas PC, Terry R, Boyer JT, O'Rourke RA. Consumption of classical complement components by heart subcellular membranes in vitro and in patients after acute myocardial infarction. J Clin Invest. 1975 Sep;56(3):740-50.

186. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999 Apr 2;284(5411):143-7.

187. Pittenger MF, Martin BJ. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res. 2004 Jul 9;95(l):9-20.

188. Pittenger MF, Mosca JD, Mcintosh KR. Human mesenchymal stem cells: progenitor cells for cartilage, bone, fat and stroma. Curr Top Microbiol Immunol. 2000;251:3-11.

189. Pochampally RR, Neville ВТ, Schwarz EJ, Li MM, Prockop DJ. Rat adult stem cells (marrow stromal cells) engraft and differentiate in chick embryos without evidence of cell fusion. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Jun 22;101(25):9282-5.

190. Polesskaya A, Seale P, Rudnicki MA., Wnt signaling induces the myogenic specification of resident CD45+ adult stem cells during muscle regeneration. Cell. 2003 Jun 27;113(7):841-52.

191. Polezhaev LV, Tinyakov YG. The use of electron microscopy in experiments on stimulation of cardiac muscle regeneration in rats. Folia Biol (Krakow). 1980;28(3):225-30.

192. Presnell SC, Petersen B, Heidaran M. Stem cells in adult tissues. Semin Cell Dev Biol. 2002 Oct;13(5):369-76.

193. Prockop DJ, Sekiya I, Colter DC. Isolation and characterization of rapidly self-renewing stem cells from cultures of human marrow stromal cells. Cytotherapy. 2001;3(5):393-6.

194. Prockop DJ, Sekiya I, Colter DC. Isolation and characterization of rapidly self-renewing stem cells from cultures of human marrow stromal cells. Cytotherapy. 2001;3(5):393-6.

195. Reinecke H, MacDonald GH, Hauschka SD, Murry CE. Electromechanical coupling between skeletal and cardiac muscle: implications for infarct repair. J Cell Biol 2000;149:731-740.

196. Reinecke H, Zhang M, Bartosek T, Murry CE. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 1999 Jul 13;100(2):193-202.

197. Reynolds BA, Rietze RL. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship .Nat Methods. 2005 May;2(5):333

198. Rieck PW, Gigon M, Jaroszewski J, Pleyer U, Hartmann C. Increased endothelial survival of organ-cultured corneas stored in FGF-2-supplemented serum-free medium. 2003. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44:3826-3832.

199. Riesenberg K, Levy R, Katz A, Galkop S, Schlaeffer F. Neutrophil superoxide release and interleukin 8 in acute myocardial infarction: distinction between complicated and uncomplicated states. Eur J Clin Invest. 1997 May;27(5):398-404.

200. Rietze RL, Valcanis H, Brooker GF, Thomas T, Voss AK, Bartlett PF. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 2001 Aug 16;412(6848):736-9.

201. Rietze RL, Valcanis H, Brooker GF, Thomas T, Voss AK, Bartlett PF. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 2001 Aug 16;412(6848):736-9.

202. Romanko MJ, Rothstein RP, Levison SW. Neural stem cells in the subventricular zone are resilient to hypoxia/ischemia whereas progenitors are vulnerable. J Cereb Blood Flow Metab. 2004 Jul;24(7):814-25

203. Romanov YA, Svintsitskaya VA, Smirnov VN. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from umbilical cord. Stem Cells. 2003;21(1):105-10.

204. Romson JL, Hook BG, Kunkel SL, Abrams GD, Schork MA, Lucchesi BR. Reduction of the extent of ischemic myocardial injury by neutrophil depletion in the dog. Circulation. 1983 May;67(5): 1016-23.

205. Rossen RD, Michael LH, Hawkins HK, Youker K, Dreyer WJ, Baughn RE, Entman ML. Cardiolipin-protein complexes and initiation of complement activation after coronary artery occlusion. Circ Res. 1994 Sep;75(3):546-55.

206. Rubio D, Garcia-Castro J, Martin MC, de la Fuente R, Cigudosa JC, Lloyd AC, Bernad A. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005 Apr 15;65(8):3035-9. Erratum in: Cancer Res. 2005 Jun 1;65(11):4969.

207. Rumyantsev P. P. 1974. Ultrastructural reorganization, DNA synthesis, and mitotic division of myocytes in atria of rats with left ventricle infarction. Virchows Arch. 15:357-378.

208. Rumyantsev PP. DNA synthesis in atrial myocytes of rats with aortic stenosis.Adv Myocardiol. 1983;4:147-62.

209. Rumyantsev PP. Post-injury DNA synthesis, mitosis and ultrastructural reorganization of adult frog cardiac myocytes. An electron microscopic-autoradiographic study. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 1973 May 23;139(3):431-50.

210. Sakai T, Li RK, Weisel RD, Mickle DA, Jia ZQ, Tomita S, Kim EJ, Yau TM. Fetal cell transplantation: a comparison of three cell types. J Thorac Cardiovasc Surg. 1999 Oct; 118(4):715-24.

211. Sanchez-Pernaute R, Studer L, Ferrari D, Perrier A, Lee H, Vinuela A, Isacson O. Long-term survival of dopamine neurons derived fromparthenogenetic primate embryonic stem cells (Cynol) after transplantation. Stem Cells. 2005 Jun 7

212. Sanchez-Ramos J, Song S, Cardozo-Pelaez F, Hazzi C, Stedeford T, Willing A, Freeman ТВ, Saporta S, Janssen W, Patel N, Cooper DR, Sanberg PR. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Exp Neurol. 2000 Aug;164(2):247-56.

213. Saraste A, Pulkki K, Kallajoki M, Heikkila P, Laine P, Mattila S, Nieminen MS, Parvinen M, Voipio-Pulkki LM. Cardiomyocyte apoptosis and progression of heart failure to transplantation. Eur J Clin Invest. 1999 May;29(5):380-6.

214. Saris DB, Sanyal A, An KN, Fitzsimmons JS, O'Driscoll SW. Periosteum responds to dynamic fluid pressure by proliferating in vitro. J Orthop Res. 1999 Sep;17(5):668-77.

215. Satake K, Lou J, Lenke LG. Migration of mesenchymal stem cells through cerebrospinal fluid into injured spinal cord tissue. Spine. 2004 Sep 15;29(18): 1971-9.

216. Scharenberg CW, Harkey MA, Torok-Storb B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 2002 Jan 15;99(2):507-12.

217. Sekiya I, Larson BL, Smith JR, Pochampally R, Cui JG, Prockop DJ. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality. Stem Cells. 2002;20(6):530-41.

218. Shake JG, Gruber PJ, Baumgartner WA, Senechal G, Meyers J, Redmond JM, Pittenger MF, Martin BJ. Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: engraftment and functional effects. Ann Thorac Surg. 2002 Jun;73(6):1919-25;

219. Shih DT, Lee DC, Chen SC, Tsai RY, Huang CT, Tsai CC, Shen EY, Chiu WT. Isolation and Characterization of Neurogenic Mesenchymal Stem Cells in Human Scalp Tissue. Stem Cells. 2005 Jun 7; Epub ahead of print.

220. Silvestri F, Banavali S, Baccarani M, Preisler HD. The CD34 hemopoietic progenitor cell associated antigen: biology and clinical applications. Haematologica. 1992 May-Jun;77(3):265-73

221. Simon TM, Van Sickle DC, Kunishima DH, Jackson DW. Cambium cell stimulation from surgical release of the periosteum. J Orthop Res. 2003 May;21(3):470-80.

222. Smith C, Gasparetto C, Collins N, Gillio A, Muench MO, O'Reilly RJ, Moore MA. Purification and partial characterization of a human hematopoietic precursor population. Blood. 1991 May 15;77(10):2122-8.

223. Sohn SK, Kim JG, Seo KW, Chae YS, Jung JT, Suh JS, Lee KB. GM-CSF-based mobilization effect in normal healthy donors for allogeneic peripheralblood stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant. 2002 Jul;30(2):81-6.

224. Spangrude GJ, Heimfeld S, Weissman IL. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 1988 Jul l;241(4861):58-62. Erratum in: Science 1989 Jun 2;244(4908):1030.

225. Spradling A, Drummond-Barbosa D, Kai T. Stem cells find their niche. Nature. 2001 Nov 1;414(6859):98-104

226. Stadtfeld M, Graf T. Assessing the role of hematopoietic plasticity for endothelial and hepatocyte development by non-invasive lineage tracing. Development. 2005 Jan;132(l):203-13.

227. Stemple DL, Anderson DJ. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 1992 Dec 11;71(6):973-85.

228. Studeny M, Marini FC, Champlin RE, Zompetta C, Fidler IJ, Andreeff M. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as vehicles for interferon-beta delivery into tumors. Cancer Res. 2002 Jul l;62(13):3603-8.

229. Subha VR, Cooke EG, Binkley PF, Dudley CS Jr, Narlow M, Ying Ming Zhang, Hartzell C. 2003. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential response. Circulation 107:195-200.

230. Sugi Y, Lough J. Anterior endoderm is a specific effector of terminal cardiac myocyte differentiation of cells from the embryonic heart forming region. DevDyn. 1994 Jun;200(2): 155-62.

231. Szilvassy SJ, Cory S. Phenotypic and functional characterization of competitive long-term repopulating hematopoietic stem cells enriched from 5-fluorouracil-treated murine marrow. Blood. 1993 May 1;81(9):2310-20.

232. Tada M, Morizane A, Kimura H, Kawasaki H, Ainscough JF, Sasai Y, Nakatsuji N, Tada T. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in embryonic stem hybrid cells. Dev Dyn. 2003 Aug;227(4):504-10.

233. Takemura G, Fujiwara H. Role of apoptosis in remodeling after myocardial infarction. Pharmacol Ther. 2004 Oct; 104(1): 1-16.

234. Tamaki T, Akatsuka A, Okada Y, Matsuzaki Y, Okano H, Kimura M. Growth and differentiation potential of main- and side-population cells derived from murine skeletal muscle. Exp Cell Res. 2003 Nov 15;291(1):83-90

235. Tang T, Hu JG, Yang JF, Zhou XM, Yang YF, Yin BL, Yu ВТ. Effect of mesenchymal stem cells transplantation on the apoptosis after rat myocardial infarction Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2004 Jun;29(3):274-8.

236. Tang YL, Qian K, Zhang YC, Shen L, Phillips MI. Mobilizing of haematopoietic stem cells to ischemic myocardium by plasmid mediated stromal-cell-derived factor-1 alpha (SDF-1 alpha) treatment. Regul Pept. 2005 Feb 15;125(l-3):l-8.

237. Tang YL, Zhao Q, Zhang YC, Cheng L, Liu M, Shi J, Yang YZ, Pan C, Ge J, Phillips MI. Autologous mesenchymal stem cell transplantation induce VEGF and neovascularization in ischemic myocardium. Regul Pept. 2004 Jan 15;117(1):3-10.

238. Tavian M, Cortes F, Charbord P, Labastie MC, Peault B. Emergence of the haematopoietic system in the human embryo and foetus. Haematologica. 1999 Jun;84 Suppl EHA-4:l-3.

239. Taylor DA. Cell-based myocardial repair: how should we proceed? Int J Cardiol. 2004 Jun;95 Suppl 1:S8-12

240. Thomas K.R., Capecchi M.R. 1987. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51(3): 503-512.

241. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998 Nov 6;282(5391):1145-7. Erratum in: Science 1998 Dec 4;282(5395):1827.

242. Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, Durning M, Harris CP, Becker RA, Hearn JP. Isolation of a primate embryonic stem cell line. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Aug 15;92(17):7844-8.

243. Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, Durning M, Harris CP, Hearn JP. Pluripotent cell lines derived from common marmoset (Callithrix jacchus) blastocysts. Biol Reprod. 1996 Aug;55(2):254-9.

244. Togel F, Isaac J, Hu Z, Weiss K, Westenfelder C. Renal SDF-1 signals mobilization and homing of CXCR4-positive cells to the kidney after ischemic injury. Kidney Int. 2005 May;67(5): 1772-84.

245. Toma JG, Akhavan M, Fernandes KJ, Barnabe-Heider F, Sadikot A, Kaplan DR, Miller FD. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 2001 Sep;3(9):778-84.

246. Tomita S, Li RK, Weisel RD, Mickle DA, Kim EJ, Sakai T, Jia ZQ. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 1999 Nov 9; 100(19 Suppl):II247-56.

247. Tsutsumi S, Shimazu A, Miyazaki K, Pan H, Koike C, Yoshida E, Takagishi K, Kato Y. Retention of multilineage differentiation potential of mesenchymal cells during proliferation in response to FGF. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Oct 26;288(2):413-9.

248. Uchida N, Buck DW, He D, Reitsma MJ, Masek M, Phan TV, Tsukamoto AS, Gage FH, Weissman IL. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Dec 19;97(26): 14720-5

249. Uchida N, Fujisaki T, Eaves AC, Eaves CJ. Transplantable hematopoietic stem cells in human fetal liver have a CD34(+) side population (SP)phenotype. J Clin Invest. 2001 Oct; 108(7): 1071-7.

250. Uchida N, Weissman IL. Searching for hematopoietic stem cells: evidence that Thy-l.llo Lin- Sca-1+ cells are the only stem cells in C57BL/Ka-Thy-1.1 bone marrow. J Exp Med. 1992 Jan 1; 175(1): 175-84.

251. Vassilopoulos G, Wang PR, Russell DW. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion Nature. 2003 Apr 24;422(6934):901-4.

252. Verfaillie CM, Schwartz R, Reyes M, Jiang Y. Unexpected potential of adult stem cells. Ann N Y Acad Sci. 2003 May;996:231-4.

253. Vulliet PR, Greeley M, Halloran SM, MacDonald KA, Kittleson MD. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs. Lancet. 2004 Mar 6;363(9411):783-4.

254. Wagers AJ, Sherwood RI, Christensen JL, Weissman IL. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 2002 Sep 27;297(5590):2256-9.

255. Wakitani S, Takaoka K, Hattori T, Miyazawa N, Iwanaga T, Takeda S, Watanabe TK, Tanigami A. Embryonic stem cells injected into the mouse knee joint form teratomas and subsequently destroy the joint. Rheumatology (Oxford). 2003 Jan;42(l):162-5.

256. Wang JF, Wu YF, Harrintong J, McNiece IK. Ex vivo expansions and transplantations of mouse bone marrow-derived hematopoietic stem/progenitor cells. J Zhejiang Univ Sci. 2004 Feb;5(2): 157-63.

257. Wang JS, Shum-Tim D, Galipeau J, Chedrawy E, Eliopoulos N, Chiu RC. Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: feasibility and potential clinical advantages. J Thorac Cardiovasc Surg. 2000 Nov;120(5):999-1005.

258. Wang L, Li Y, Chen J, Gautam SC, Zhang Z, Lu M, Chopp M. Ischemic cerebral tissue and MCP-1 enhance rat bone marrow stromal cell migration in interface culture. Exp Hematol. 2002 Jul;30(7):831-6.

259. Wang ML, Nesti LJ, Tuli R, Lazatin J, Danielson KG, Sharkey PF, Tuan RS. Titanium particles suppress expression of osteoblastic phenotype in human mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 2002 Nov;20(6):l 175-84.

260. Warejcka DJ, Harvey R, Taylor BJ, Young HE, Lucas PA. A population of cells isolated from rat heart capable of differentiating into several mesodermal phenotypes. J Surg Res. 1996 May;62(2):233-42.

261. Watanabe E, Smith DM Jr, Delcarpio JB, Sun J, Smart FW, Van Meter CH Jr, Claycomb WC. Cardiomyocyte transplantation in a porcine myocardial infarction model. Cell Transplant. 1998 May-Jun;7(3):239-46.

262. Wessels A, Anderson RH, Markwald RR, Webb S, Brown NA, Viragh S, Moorman AF, Lamers WH. Atrial development in the human heart: an immunohistochemical study with emphasis on the role of mesenchymal tissues. AnatRec. 2000 Jul l;259(3):288-300.

263. Wexler SA, Donaldson C, Denning-Kendall P, Rice C, Bradley B, Hows JM. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 2003 Apr;121(2):368-74.

264. Wlodarski КН. Orthotopic and ectopic chondrogenesis and osteogenesis mediated by neoplastic cells. Clin Orthop Relat Res. 1985 Nov;(200):248-65.

265. Woodbury D, Reynolds K, Black IB. Adult bone marrow stromal stem cells express germline, ectodermal, endodermal, and mesodermal genes prior to neurogenesis. J Neurosci Res. 2002 Sep 15;69(6):908-17.

266. Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, Black IB. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 2000 Aug 15;61(4):364-70.

267. Wu GD, Nolta JA, Jin YS, Barr ML, Yu H, Starnes VA, Cramer DV. Migration of mesenchymal stem cells to heart allografts during chronic rejection. Transplantation. 2003 Mar 15;75(5):679-85.

268. Xu X, Xu Z, Xu Y, Cui G. Effects of mesenchymal stem cell transplantation on extracellular matrix after myocardial infarction in rats. Coron Artery Dis. 2005 Jun;16(4):245-55.

269. Ya J, Erdtsieck-Ernste EB, de Boer PA, van Kempen MJ, Jongsma H, Gros D, Moorman AF, Lamers WH. Heart defects in connexin43-deficient mice. Circ Res. 1998 Feb 23;82(3):360-6.

270. Yamada Y, Boo JS, Ozawa R, Nagasaka T, Okazaki Y, Hata K, Ueda M. Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibringlue with a biodegradable scaffold. J Craniomaxillofac Surg. 2003 Feb;31(l):27-33.

271. Yasojima K, Kilgore KS, Washington RA, Lucchesi BR, McGeer PL. Complement gene expression by rabbit heart: upregulation by ischemia and reperfusion. Circ Res. 1998 Jun 15;82(11):1224-30.

272. Young HE, Mancini ML, Wright RP, Smith JC, Black AC Jr, Reagan CR, Lucas PA. Mesenchymal stem cells reside within the connective tissues of many organs. Dev Dyn. 1995 Feb;202(2):137-44.

273. Young RG, Butler DL, Weber W, Caplan Al, Gordon SL, Fink DJ. Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair. J OrthopRes. 1998 Jul;16(4):406-13.

274. Zardini P, Marino P, Golia G, Anselmi M, Castelli M. Ventricular remodeling and infarct expansion. Am J Cardiol. 1993 Dec 16;72(19):98G-106G.

275. Zhang B, Wang F, Deng L, Dun A, Dong L, Li J, Yang H. Isolating and culturing rat marrow mesenchymal stem cells and studying their phenotypical and functional properties Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2003 Oct;34(4):738-41.

276. Zhang MW, Guo ZK, Liu XD, Wu Y, Hou CM, Mao N. Development of methodology for isolation and culture of mesenchymal stem cells derived from mouse skeletal muscle. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2003 Oct; 11(5):53 8-41.

277. Zhang S, Zhang P, Guo J, Jia Z, Ma K, Liu Y,.Zhou C, Li L. Enhanced cytoprotection and angiogenesis by bone marrow cell transplantation maycontribute to improved ischemic myocardial function. Eur J Cardiothorac Surg. 2004 Feb;25(2): 188-95.

278. Zhang YG, Guo X, Xu P, Kang LL, Li J. Bone mesenchymal stem cells transplanted into rabbit intervertebral discs can increase proteoglycans. Clin Orthop Relat Res. 2005 Jan;(430):219-26.

279. Zhang YM, Hartzell C, Narlow M, Dudley CS Jr. 2002. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106:12941299.

280. Zhao LR, Duan WM, Reyes M, Keene CD, Verfaillie CM, Low WC. Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotypes and ameliorate neurological deficits after grafting into the ischemic brain of rats.Exp Neurol. 2002 Mar;174(l):l 1-20

281. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, Alfonso ZC, Fraser JK, Benhaim P, Hedrick MH. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002 Dec;13(12):4279-95.

282. Zur Nieden N1, Kempka G, Ahr HJ. 2003. In vitro differentiation of embryonic stem cells into mineralized osteoblasts. Differentiation. 71:18-27.

283. Zvaifler NJ, Marinova-Mutafchieva L, Adams G, Edwards CJ, Moss J, Burger JA, Maini RN. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. Arthritis Res. 2000;2(6):477-88.

Информация о работе

Кругляков, Петр Владимирович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.25

Диссертация

Влияние трансплантации мезенхимных стволовых клеток на течение экспериментального инфаркта миокарда - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы