Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рентгеноструктурные исследования флуоресцентных белков из ZOANTHUS

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Рентгеноструктурные исследования флуоресцентных белков из ZOANTHUS"

Российская академия наук Институт биоорганической химии им. академикоЁ М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи УДК 577112; 577,336

ПЛЕТНЁВА НАДЕЖДА ВЛАДИМИРОВНА

РЕНТТЕНОСТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ

белков из голтнт.

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

111111111111111111111

003164956

Москва - 2008 г.

Работа выполнена в группе химии хромопротеинов Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Научцьщ руководитель кандидат химических наук

В. И. Мартынов

Официальное оппоненты Доктор химических наук, профессор

Л. Д. Румш

Доктор физико-математических наук В. Р. Мелик-Адамян

Ведущая организация Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится « 5 » марта 2008 г. в 10 часов на заседании специализированного диссертационного совета при Институте биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан « февраля 2008 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета —

Доктор физ-мат. наук В. А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein - GFP), GFP-подобные флуоресцентные белки (ФБ) и их мутантные варианты стали популярными инструментами в клеточной биологии, биотехнологии и биомедицине для мечения белков, клеточных компартментов, клеток и тканей, в качестве маркеров, позволяющих следить за экспрессией белков, их локализацией, подвижностью и взаимодействиями. На основе ФБ созданы сенсоры на ионы Са2+, Cu2+, Zn2+, Cl", а также Н202, сАМР, активность клеточных киназ, протеаз, GTP-аз. Применение ФБ внесло огромный вклад в развитие методик, используемых в биомедицине для изучения молекулярных механизмов множества заболеваний, включая такие как рак, нарушения связанные с генными дефектами и т.д.

В большинстве случаев, практическое применение флуоресцентных белков требует разработки мономерных мутантных вариантов с эмиссией в дальне-красной области спектра, обладающих высоким квантовым выходом, высокой скоростью созревания хромофора и фотостабильностью. До. сих пор нет ясности относительно молекулярного механизма формирования хромофора и роли его аминокислотного окружения в проявлении спектральных свойств флуорофора. В этой связи, важно понять каким образом особенности стереохимии белка определяют его основные свойства, включая характеристики цветового спектра и установить ключевые остатки ответственные за формирование структуры мономера и олигомеризацию белка. Эти знания необходимы для разработки рационального подхода по созданию улучшенных вариантов белков, удовлетворяющих требуемым критериям. Фундаментальный и прикладной интерес для

1

i

дальнейшего развития этой области представляет детальное изучение пространственных структур новых флуорофоров и молекулярных процессов их посттрансляционной модификации с целью создания структурной основы для направленного воздействия на их фотофизические свойства.

Объекты настоящего исследования, зелёный (zGFP506), жёлтый (zYFP538) и красный (zRFP574) флуоресцентные белки (231 остаток; -2627 kDa) из морского бутончатого полипа рода Zoanthus характеризуются хромофоробразующими последовательностями Asn-Tyr-Gly, Lys-Tyr-Gly, Asp-Tyr-GIy и резко отличающимися спектральными характеристиками с максимумами возбуждения/эмиссии 492/506 нм, 528/538 нм, 553/574 нм соответственно (Рис. 1). При общей величине -78% идентичности аминокислотных последовательностей выбранные белки являются прекрасными моделями для выявления стереохимических факторов, ответственных за переход от "зелёного" к "жёлтому" и затем к "красному" излучающим состояниям. Они обладают уникальными фотофизическими свойствами и их мономерные варианты были бы широко востребованы для технологий многоцветного мечения и резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

Рис. 1 Кристаллы гИРР574 дикого типа (а), гСРР506 дикого типа (Ь) и

мутантного варианта 2СГР506 N660 в переходной "зеленой" (с) и зрелой "красной" (с!) формах и гУРР538 дикого типа (е)

Цели и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы являются создание структурной базы для исследования

взаимосвязи между структурами и свойствами у серии флуоресцентных белков из морского бутончатого полипа рода Zoanthus. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать условия получения монокристаллов серии флуоресцентных белков, пригодных для рентгеноструктурного анализа и получить экспериментальные наборы рентгеновских данных.

2. Установить на атомном уровне пространственные структуры красного (гКРР574), зелёного (гСРР506) и жёлтого (г¥РР538) флуоресцентных белков из 1оапЛт, а также генно-инженерного варианта гСРР506 с заменой АэпббАэр (гСРР506]Ч66В) в переходной "зелёной" и зрелой "красной" формах.

3. Провести детальный анализ структур хромофоров и хромофорсодержащих областей и установить стереохимические причины, ответственные за развитие посттрансляционной модификации за пределы "зеленой" формы у гЮ?Т574 и гУРР538.

4. На основе полученной структурной базы провести сравнительное исследование пространственной организации функциональных тетрамеров изучаемых объектов и составляющих их мономерных субъединиц. Исследовать структурные аспекты, ответственные за олигомеризацию и на этой основе внести предложения по генно-инженерному дизайну мономерных вариантов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые на атомном уровне установлены пространственные структуры красного гКЕР574 и зелёного гСРР506 флуоресцентных белков из Zoanthus, а также мутантного варианта 2СГР506_^60 в двух флуоресцентных формах.

Открыт новый процесс посттрансляционной модификации хромофора у zRFP574, который, в отличие от всех известных флуоресцентных белков, завершается декарбоксилированием боковой цепи первого остатка хромофоробразующей последовательности Asp66. На основе стереохимического анализа хромофорсодержащих областей в zRFP574 и целенаправленно выбранных ближайших гомологов, zGFP506 и zGFP506_N66D, выявлен стереохимический фактор, инициирующий дополнительную цепь реакций, приводящую к декарбоксилированию Asp66 хромофора.

Определена пространственная структура желтого флуоресцентного белка zYFP538 с высоким разрешением 1.8Â. На основе полученных структурных данных и спектральных характеристик целенаправленно сконструированной серии мутантов zYFP538 установлен инициирующий фактор дополнительной посттрансляционной стадии перехода от промежуточной "зелёной" к конечной "желтой" форме хромофора.

Изучены стереохимические факторы, ответственные за олигомеризацию исследуемых белков.

Полученные в настоящей работе результаты вносят вклад в создание общей структурной базы для изучения механизмов формирования хромофоров и разработки соответствующих мономерных вариантов флуоресцентных белков для технологий многоцветного мечения и резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

Апробация полученных данных и публикации. Результаты диссертационной работы были представлены на VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю. А. Овчинникова (г. Москва-Пущино, октябрь 2006г.), III Российском Симпозиуме "Белки и Пептиды" (г. Пущино, сентябрь 2007 г.), XVIII Менделеевском Съезде по

общей и прикладной химии (г. Москва, сентябрь 2007 г.), Конференции "Флуоресцентные белки и биологические сенсоры" (г. Ашбурн, октябрь 2007г). По материалам диссертации опубликованы 3 печатные работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России. Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (одна глава), изложения и обсуждения результатов (пять глав), экспериментальной части (одна глава), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 95 ссылок. Работа изложена на 96 страницах, содержит 29 рисунков и 8 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. КРАСНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, гКЕР574 (гоагакш эр2). 1.1. Пространственная структура. Пространственная организация мономера гКЕР574 представляет собой р-бочонок, образованный 11-ю антипараллельными Р-сегментами, с центральной а-спиралью проходящей вдоль его оси (Рис. 2).

Рис. 2 Моно- (а) и стерео- (б) изображения пространственная структуры Р-бочонка ZRFP574 с центральным хромофором

В центре а-спирали располагается хромофор. Петли на торцах бочонка образуют колпачки, защищающие внутреннюю область хромофора от воздействия внешней среды. В структуре обнаружены две цис-пептидные связи, предшествующие остаткам Pro53 and Рго88. Увеличение разрешения с 2.4 Ä до 1.5Ä, позволило выявить альтернативные конформации для серии боковых цепей. Аналогично ранее исследованному TurboGFP (Pontellinna plumata) в структуре ß-бочонка ZRFP574 обнаружена пора, образованная основными цепями остатков Trpl45, Glul46, Prol47, His202, Lys203, Leu 204 с цепочкой из молекул воды, ведущей из внешней среды к хромофору (Рис. 3). Пора предположительно обеспечивает поступление молекулярного кислорода необходимого для созревания хромофора.

1.2 Структура хромофора. Созревание хромофора завершается образованием копланарной бициклической структуры, состоящей из пятичленного имидазолинонового цикла и фенольного кольца Туг67 (Рис. 4). При этом, отличительная особенность зрелой структуры хромофора гЯГР574 от всех известных в настоящее время структур проявляется в декарбоксилировании боковой цепи первого остатка хромофора Аэрбб.

ХУв

РЬе65

АзпбЭ

РЬе65

АзпбЭ

ХУв

ХУО

Рис. 4 Стереоизображение хромофора гЯГР574 с предшествующим РЬе65 и последующим Авп69 остатками в 2Го-Рс электронной плотности (уровень р=\3а) (а). Химическая структура хромофора гКРР574 (б).

Посттрансляционная модификация гШ7Р574 предположительно проходит в две стадии (Рис. 5). Первая стадия, катализируемая неконсервативным остатком А1а63 и консервативными Аг§95 и С1и221 из окружения хромофора, по-видимому, проходит по механизму присущему всем флуоресцентным СРР-подобным белкам и приводит к образованию промежуточной СРР подобной бициклической формы с эмиссией в зелёной области спектра при 524 нм.

Туг67

С1у68

Туг67

С1у68

Аврбб

о

Туг67

™ < нА С1у68 ( II X

г° н > Г

ч

ч

Рис. 5 Две стадии посттрансляционной модификации

хромофоробразующей последовательности г11РР574.

У этой формы фенольное кольцо Туг67 принимает по отношению к связи С«-^ цис- ориентацию с торсионными углами и Х2=~3-2°,

определяющими планарность бициклической системы. Вторая стадия посттрансляционной модификации, в результате которой промежуточный продукт переходит из "зелёного" в конечное "красное" состояние, является уникальной особенностью только красного флуоресцентного белка гЫРР574. Подобно остальным белкам с эмиссией в красной области спектра эта стадия, наиболее вероятно, начинается с образования необычной цис- пептидной связи, непосредственно предшествующей хромофору (между остатками 65 и 66, «о = -8.2°)]. Этот начальный этап сопровождается окислительной реакцией, приводящей к образованию 1У-ацилиминной связи С1°МУ с переходом С1« (66) атома из $р3 в яр2 гибридизацию. Процесс завершается неожиданной реакцией декарбоксилирования боковой цени первого остатка хромофора Аврбб. Подобная реакция в других флуоресцентных белках не наблюдалась и впервые была обнаружена только у гКРР574 дикого типа. Расширение п электронной системы за счет расположенной в плоскости хромофора дополнительной ]Ч-ацилиминной связи С1°ИЧ приводит к батохромному ("красному") сдвигу флуоресценции в спектрах эмиссии белка.

Стереохимическое окружение хромофора (Рис. 6) включает каталитические остатки, участвующие в его образовании. Среди них неконсервативный остаток А1а63 и консервативные остатки Аг§95 и С1и221. Хромофор участвует в разветвлённой системе Н-связей со своим окружением как непосредственно, так и через воду.

Каталитическая трансформация хромофоробразующей триады в СГР подобную бициклическую структуру оставляет отрицательный заряд боковой цепи С1и221 в частично гидрофобном окружении,

предположительно сохраняя этот остаток потенциально реакционным

для дополнительных шагов посттрансляционной модификации.

Сделан вывод, что

электростатический конфликт

между пространственно

сближенными отрицательно

заряженными боковыми цепями

Asp66 хромофора и

каталитического остатка Glu221

является наиболее вероятной

причиной инициирующей цепь

реакций, приводящей к

Рис. 6 Аминокислотное декарбоксилированию Asp66.

окружение хромофора

bzRFP574

Доказательство выдвинутой гипотезы относительно роли остатка Asp66 в формировании хромофора было получено путем изучения целенаправленно выбранных ближайших аналогов zRFP574 из того же рода Zoanthus - зелёного флуоресцентного белка zGFP506 и его мутантного варианта zGFP506_N66D с заменой остатка Asn66 хромофоробразующей последовательности на Asp.

2. ЗЕЛЁНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, zGFP506 (Zoanthus sp.) 2.1 Структура мономера и хромофора. Топология пространственной укладки мономера zGFP506 практически идентична таковой у ZRFP574 и характеризуется средне квадратичным отклонением координат С« атомов пространственно совмещенных структур, RMSD = 0.52А.

Посттрансляционная модификация хромофоробразующей триады -Азп66-Туг67-С1у68- в гСРР506 заканчивается образованием стандартной бициклической структуры, содержащей имидазолиноновый цикл и фенольное кольцо Туг67 в цис- ориентации к €«-N(67) связи. В отличие от красного флуоресцентного белка /КРР574, у которого первый остаток Аврбб хромофора в процессе созревания претерпевает декарбоксилирование, боковая цепь остатка Аэпбб в этой же позиции в зрелом зелёном флуоресцентном белке /СРР506 остаётся интактной. При этом, у Авпбб сохраняется sp3 гибридизация Са атома, одинарный характер связи С®—N(66), а также стандартная транс- конфигурация предшествующей пептидной связи (Рис. 7).

>гге

а б

Рис. 7 Стереоизображение хромофора гСРР506 с предшествующим РИе65 и последующим Авп69 остатками в 2Ро-Рс электронной плотности (уровень р=1.0ег) (а). Химическая структура хромофора гСРР506 (б)

АвПбЭ

РИе65

РГ1е65

АзпбЭ

Из общего числа 37 точечных аминокислотных различий между гСГР506 и гКРР574, помимо отличия в первой позиции непосредственно хромофоробразующей последовательности, Авпбб/Азрбб, еще одно отличие располагается в относительной близости от хромофора -Туг16/РЬе16. Через посредничество молекулы воды боковая цепь остатка

10

Туг16 участвует в развитой системе Н-связей, образованной боковыми и основными цепями аминокислотных остатков и молекулами воды из ближайшего окружения хромофора (Рис. 8). Система непосредственно взаимодействует с хромофором и, по-видимому, обеспечивает необходимый транспорт протонов в процессе созревания хромофора.

а б

Рис. 8 (а). Ближайшее аминокислотное окружение хромофора яСЕР506.

(б) Стереоизображение системы Н-связей, образуемой аминокислотными остатками и молекулами воды в хромофорсодержащей полости гСГР506.

Полученные результаты указывают, что отличие природы остатка Аврбб хромофоробразующей триады в гЫЕР574 от Акпбб в 2СЕР506 является принципиально важным и, по всей вероятности, является определяющим в наблюдаемом резком различии процессов посттрансляционной модификации и спектральных характеристик зрелых хромофоров.

еы4б с,

гл

М • 2

И148

Алд95

\Л/ 2 73 МеИ67

«~2.88.LW 8ег148 ^

2.66

2.61

2.2 Мутантный вариант zGFP506 N66D. Для выявления роли природы остатка 66 в формировании хромофора изучена пространственная организация мутантного варианта zGFP506 с заменой первого остатка хромофоробразующей последовательности Asn66 на Asp66. Замена остатка Asn66 хромофора на Asp в зеленом флуоресцентном белке zGFP506 оказывает огромное влияние на процесс созревания соответствующего варианта zGFP506_N66D, инициируя продолжение посттрансляционной модификации за пределы "зелёной" формы. В отличие от ZRFP574, который полностью созревает в течение трех дней, процесс созревания zGFP506_N66D до "красной" формы длится несколько месяцев и полностью не завершается. Пространственная структура zGFP506_N66D была установлена в промежуточной "зелёной" и зрелой "красной" формах.

В каждой кристаллической структуре обнаружено присутствие обеих форм, доминантной и минорной. Доминантная (~80%) бициклическая структура хромофора "зелёного" состояния zGFP506_N66D аналогична структуре хромофора zGFP506 дикого типа и характеризуется интактной боковой цепью Asp66. Напротив, доминантная (~65%) форма "красного" состояния zGFP506_N66D аналогична структуре хромофора zRFP574 дикого типа с декарбоксилированной боковой цепью остатка Asp66. Резкое различие в кинетике созревания обоих белков является следствием 36 различий в их аминокислотных последовательностях. Из них, наиболее существенным, по-видимому, является замена единственного неконсервативного остатка из ближайшего окружения хромофора - Phel6 (zRFP574) на Туг16 (zGFP506_N66D). Вовлечение Туг16 в развитую сеть водородных связей, взаимодействующую с хромофором (Рис. 8), может оказать заметное влияние на кинетику созревания мутантного варианта.

Совокупность структурных данных полученных для /1*РР574, /СРР506 и хС РР 5 О 6 6 Э выявило критическую роль остатка 66 в созревании хромофора и подтверждают нашу гипотезу относительно основной причины декарбоксилирования Азрбб в хромофоре красного флуоресцентного белка гШ'Р574.

3. ЖЁЛТЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, гУРР538 (гоиШИи.ч эр.). 3.1 Структура мономера и хромофора. Как и в случае гИГР574 и 2СЕР506, структура мономера гУРР538 имеет форму вРР подобного р-бочонка. Хромофор жёлтого флуоресцентного белка гУРР538 образуется из аминокислотной триады -Ьу$66-Туг67-С1у68- и представляет собой планарную трициклическую систему сопряжённых двойных связей (Рис. 9). Уникальность структуры состоит в том, что помимо пятичленного имидазолинонового и фенольного (Туг67) циклов, характерных для стандартной бициклической "зелёной" формы, хромофор гУГР538 содержит дополнительный шестичленный тетрагидропиридиновый цикл.

Рис.9 Стереоизображение хромофора КУв гУРР538 с предшествующим РИе65 и последующим Авр69 остатками в 2Ро-Рс электронной плотности (уровень р=\Ла) (а). Химическая структура хромофора гУГР538 (б)

КУв

-ОМ

а

б

..2.90" \ Metí 67 2.75

Serl^iy»" I Leu204

Стереохимическое окружение хромофора показано на Рис. 10. Образование бициклического "зелёного" ядра, по-видимому, проходит по механизму присущему всем флуоресцентным GFP-подобным белкам. Третий шестичленный гетероцикл хромофора, согласно гипотезе Ремингтона (Университет Орегона, США) формируется автокаталитически в результате реакции трансиминирования атома

Glul46l w боковой цепи остатка Lys66 с

Ъ^е 27v f95 реакционноспособной ацилиминной

связью C«=N(66) переходного состояния. Эта реакция

сопровождается фрагментацией X ¿9\. основной цепи белка по связи С°МЧ

Phe65V

остатка Lys66 с образованием концевой карбоксамидной группы у Phe65.

Рис. 10 Аминокислотное окружение хромофора ZYFP538.

Связь тетрагидропиридинового цикла располагается в плоскости

хромофора (торсионный угол \|/[С-С«] -16°), что приводит к расширению тс-системы сопряженных двойных связей и, как следствие, к сдвигу спектральных характеристик флуорофора в длинноволновую область.

3.2 Мутантные варианты. Согласно литературным данным, в циановом флуоресцентном белке amFP486 (A,jm=486hm) из Anemonia majano с идентичной ZYFP538 хромофоробразующей последовательностью -Lys-Tyr-Gly-, хромофор имеет (в отличие от ZYFP538) характерную для

"зелёной" формы бициклическую структуру и боковая цепь остатка Lys не претерпевает никаких изменений при созревании хромофора. При идентичности аминокислотных последовательностей 49% отличие в ближайшем окружении хромофоров этих белков заключаются лишь в двух аминокислотных заменах. В циановом белке amFP486 вместо характерных для желтого белка ZYFP538 остатков 11е44 и Asp69 располагаются соответственно остатки Ser и Asn.

Сравнение структур amFP486 и ZYFP538 показали, что в незрелой форме zYFP538 положительно заряженная аминогруппа природной боковой цепи остатка Lys66 хромофоробразующей последовательности должна располагаться в гидрофобном кармане, сформированном боковыми цепями остатков Ile44, Leu46, Phe65, Leu204 и Leu219. Было предположено, что такое расположение заряда в гидрофобном окружении приводит к острому энергетическому конфликту (главным образом с 11е44) и является инициатором дополнительной посттрансляционной модификации, ведущей к образованию "желтого" хромофора. Для проверки была получена серия мутантов с заменами в двух неконсервативных позициях Ile44Ala, Ile44AIa_Asp69 и Ile44Ser. Спектры поглощения показали, что, если для полностью созревшего белка zYFP538 доминирует "жёлтая" форма ("зелёная" форма также всегда присутствует), то для мутантного варианта zYFP538_Ile44Ala с небольшим перевесом доминирует уже "зелёная" форма хромофора. Одновременная замена двух этих остатков в мутанте ZYFP538 Ile44Ala_Asp69Asn привела к полному нарушению формирования "жёлтого" хромофора, не затронув, в то же время, механизма формирования стандартного "зелёного" хромофора. И, наконец, у мутантного варианта zYFP538_Ile44Ser доминируют "зелёная" форма и, что особенно интересно, присутствует также "циановая" форма. Причем,

последняя, по-видимому, соответствует хромофору, у которого иитактная боковая цепь Ьувбб образует водородную связь с 8ег44, аналогично хромофору атЕР486.

4. СТУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ОЛИГОМЕРИЗАЦИИ.

Четвертичная структура подавляющего большинства СРР-подобных белков дикого типа имеет тетрамерную организацию. В большинстве случаев, практическое применение флуоресцентных белков требует разработки мономерных мутантных вариантов.

Кристаллы красного, зелёного и жёлтого флуоресцентных белков из Zoanthus содержат в асимметрической части кристаллической ячейки два независимых димера (гЫЕР574), два независимых мономера (/СГР506) и один тетрамер (гУЕР538). Операции кристаллографической симметрии дополняют каждый димер гКЕР574 и каждый мономер 2СЕР506 до соответствующего плотноупакованного тетрамера, являющегося биологической единицей флуоресцентных белков (Рис. 11).

Рис. 11. Стереоизображение структуры тетрамера /КРР574

Тетрамер построен из двух димеров расположенных под ~90° друг к другу и отвечает точечной симметрии 222. Каждый димер образован двумя аитипараллельными мономерами. В тетрамерной упаковке исследуемых флуоресцентных белков формируются два типа интерфейсов между контактирующими поверхностями мономерных субъединиц. Первый интерфейс (ИФ1) формируется внутри димера, между остатками двух антипараллельных мономеров, а второй (ИФ2) -между мономерами принадлежащим двум разным димерам.

Интерфейс ИФ1 характеризуется защищенной от внешней среды контактной площадью ~490 А2. Он стабилизируется, главным образом, центральным гидрофобным кластером, образованным плотно упакованными боковыми цепями двух групп консервативных остатков из 8-10 боковых цепей, L98, V104,1106, М129 и L98', V104', 1106', М129', примыкающих к оси симметрии 2-го порядка. Дополнительный вклад в стабилизацию вносит также соответствующий двойной набор водородных связей. Интерфейс ИФ2 имеет более развитую контактирующую поверхность -690 А2. Помимо нескольких одиночных гидрофобных контактов он стабилизируется сетью из шести водородных связей и десяти солевых мостиков, образованных остатками двух идентичных связанных осью симметрии 2-го порядка групп. Сюда входят высокоспецифичные связи, образованные заряженными боковыми цепями консервативных остатков Glul46, Lysl51, Aspl64, Argl78, Aspl82, and Lys203 . Кроме того, боковые цепи симметрично связанных и близко расположенных остатков Cysl49 обоих мономеров на интерфейсе ИФ2 в случае другой альтернативной ориентации сближаются до расстояния ~ЗА, что указывает на потенциальную возможность образования дисульфидных связей в процессе олигомеризации.

Отмеченные остатки на интерфейсах ИФ1 и ИФ2 представляют наиболее важную группу остатков, ответственных за олигомеризацию. Следует ожидать, что рационально выбранная частичная замена гидрофобных остатков центрального кластера на гидрофильные на ИФ1, совмещенная с мутациями Cysl49Ser и Lys/Arg на Glu/Asp (или Glu/Asp на Lys/Arg) на ИФ2 приведет к разрушению интерфейсов.

5 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 5.1. Кристаллизация. Кристаллы ZRFP574 дикого типа выращивались при 20°С методом диффузии через газообразное состояние в варианте висячей капли. Кристаллы кубической формы с интенсивно красной окраской появились через несколько дней из растворов 1.4 до 1.6 M (NH4)2S04, 0.2 M K/Na tartrate и 0.1 M Na citrate буферах pH = 5.9 (дифракционное поле разрешения 2.4Â) и 0.2 M K/Na tartrate и 0.1 M Tris-HC1 буферах pH =7.5 (разрешение 1.51 Â) и достигли окончательных размеров 0.15 х 0.15 х 0.15 мм3 через восемь недель.

Гексагональные бипирамвдальной формы кристаллы зелёного флуоресцентного белка zGFP506 дикого типа и "красной" формы соответствующего мутантного варианта zGFP506_N66D появились при 20°С через несколько дней из раствора 0.1 M bis-tris propane, 1.8 M tri-ammonium citrate pH 7.0 и достигли окончательных размеров -0.2 х 0.2 х 0.2 mm3 через две недели. При комнатной температуре в течении нескольких месяцев раствор zGFP506_N66D медленно менял исходную зелёную окраску на красную. С целью замедления скорости созревания кристаллы переходной "зелёной" формы zGFP506_N66D выращивались при 4°С из раствора 1.9 M Na malonate, pH 6.

Кристаллы жёлтого флуоресцентного белка дикого типа ZYFP538 были получены из раствора содержащего 0.085 M sodium Hepes рН=7.5,

17 % ПЭГ 4000, 8.5 % изопропанола, 15 % глицерина. Кристаллы достигли своего максимального размера 0.1 х 0.2 х 0.4 мм3 через три недели.

5.2 Определение структуры. Экспериментальные рентгеновские данные с кристаллов белка ZRFP574 при разрешении 2.4А были получены при Т=100К на комнатном дифрактометре MAR-345. Экспериментальные наборы интенсивностей дифракционных отражений с кристаллов остальных флуоресцентных белков были получены на синхротронном источнике (Advanced Photon Source, Аргонн, США). Кристаллографические параметры и статистические данные кристаллографического уточнения представлены в Табл. 1. Координаты атомов исследованных белков и соответствующие экспериментальные наборы структурных факторов депонированы в банк пространственных структур белков, PDB.

Таблица 1. Кристаллографические параметры и статистика кристаллографического уточнения

to о

Параметры ZRFP574 ZRFP574 zGFP506 zGFP506_N66D zGFP506_N66D ZYFP538

(дикий (дикий (дикий ("зелёный") ("красный") (дикий

тип) тип) тип) тип)

Разрешение 2.4Â 1.51Ä 2.2А 2.4Ä 2.2Â 1.8Ä

Простр. группа C222i C222i Р6г22 Р6г22 P6222 P212121

Парам, ячейки:

а (А) 114.9, 115.2, 102.5 102.2 101.5 87.4

Ь(А) 146.8, 146.7, 102.5 102.2 101.5 106.5

с (А) 122.9 122.9 270.9 269.4 271.2 115.7

г (г-) 32(4) 32(4) 24(2) 24(2) 24(2) 16(4)

Обработка HKL2000 HKL2000 HKL2000 HKL2000 HKL2000 HKL2000

Решение MOLREP MOLREP MOLREP MOLREP MOLREP MOLREP

Уточнение CNS SHELXL REFMAC5 REFMAC5 REFMAC5 REFMACS

Графика CHAIN COOT COOT COOT COOT COOT

Число атомов

Белок 7296 7296 3616 3616 3616 7171

Вода 412 428 254 293 238 497

804"2 45 20

Киогк (%) 0.203 0.178 0.182 0.167 0.177 0.184

Кггее (%) 0.249 0.225 0.232 0.201 0.214 0.240

РБВ ГО 2FL1 2ICR 20JK 2PXW 2PXS 20GR

выводы

1. Методом рентгеноструктурного анализа определена пространственная структура красного флуоресцентного белка г!*РР574 дикого типа при разрешении 2.4А и 1.51А. Показано, что пространственная организация мономера г1*РР574 представляет собой р-бочонок, образованный 11-ю р-сегментами, с центральной а-спиралью содержащий хромофор. Хромофор г1{РР574 представляет собой планарную бициклическую систему сопряженных двойных связей, сформированную из пятичленного имидазолинонового и фенольного циклов. Установлено, что продолжение посттрансляционной модификации хромофора за пределы стандартной "зеленой" формы завершается декарбоксилированием боковой цепи первого остатка хромофоробразующей последовательности Аврбб. Процесс сопровождается образованием цис- конфигурации пептидной связи предшествующей хромофору и переходом гибридизации Са(66) атома из эр3 в «/г2 с образованием ацилиминной Са(66) связи. Дополнительная посттрансляционная стадия приводит к расширению сопряженной я-электронной системы и, как следствие, к сдвигу максимумов длин волн возбуждения и эмиссии в красную область спектра. Сделан вывод, что причиной инициирующей соответствующую цепь реакций является электростатический конфликт между пространственно сближенными отрицательно заряженными боковыми цепями остатка Аврбб хромофора и каталитического остатка С1и221.

2. Для выявления роли остатка 66 в формировании хромофора установлена пространственная структура зеленого флуоресцентного белка гвРРбОб дикого типа (разрешение 2.2 А), а также его мутантного варианта гСРР506_Ш6В в переходной "зеленой" (разрешение 2.4 А) и

зрелой "красной" (разрешение 2.2 А) формах. В отличие от гЫРР574 боковая цепь первого остатка хромофора Аэпбб в гвРРбОб остается немодифицированной с сохранением гибридизации соответствующего Са(66) атома и транс- конфигурации пептидной связи предшествующей хромофору. Замена Авп 66 хромофора гвР Р506 на отрицательно заряженный Аэрбб инициирует в мутантном варианте zGFP506_N66D дополнительную цепь реакций, приводящих к декарбоксилированию боковой цепи Аэрбб, аналогично наблюдаемому у гКРР574. Полученные данные подтвердили сделанный вывод относительно инициирующей роли электростатических взаимодействий боковых цепей А8рбб—С1и221 в наблюдаемом эффекте.

3. Пространственная структура желтого флуоресцентного белка 2УРР538 установлена при разрешении 1.8А. Хромофор жУРР538 представляет собой планарную трициклическую систему сопряжённых двойных связей. Помимо пятичленного имидазолинонового и фенольного (Туг67) циклов, характерных для стандартной бициклической "зеленой" формы, хромофор гУРР538 содержит дополнительный шестичленный тетрагидропиридиновый цикл. Сделан вывод, что энергетический конфликт положительно заряженной аминогруппы природной боковой цепи остатка хромофоробразующего Ьувбб с окружением гидрофобного кармана (11е44, Ьеи46, Рйе65, Ьеи204 и Ъеи219) и является инициатором дополнительной посттрансляционной модификации, ведущей к фрагментации основной цепи с образованием третьего шестичленного гетероцикла. Следствием является формирование "желтого" хромофора с расширенной сопряженной л-электронной системой. Результаты спектральных исследований целенаправленно сконструированных мутантных вариантов

zYFP538_IIe44Ala, zYFP538 Ile44AlaAsp69Asn и zYFP538_Ile44Ser подтвердили сделанные выводы.

4. Изучена стереохимическая композиция контактирующих поверхностей между мономерными субъединицами на двух интерфейсах (ИФ1 и ИФ2) в тетрамерной упаковке исследуемых флуоресцентных белков. Интерфейс ИФ1 стабилизируется, главным образом, центральным гидрофобным кластером, образованным плотно упакованными боковыми цепями консервативных остатков из 8-10 боковых цепей. Интерфейс ИФ2 стабилизируется, в основном, сетью из шести консервативных водородных связей и десяти солевых мостиков. Предполагается, что рационально выбранная частичная замена гидрофобных остатков центрального кластера на гидрофильные на ИФ1, совмещенная с мутациями Cysl49Ser и Lys/Arg на GIu/Asp (или Glu/Asp на Lys/Arg) на ИФ2 приведет к разрушению интерфейсов.

Результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Pletneva NV, Pletnev SV, Tikhonova TV, Popov VO, Martynov VI. &

Pletnev VZ. (2006) "Crystal structure of a red fluorescent protein from Zoanthus, zRFP574, reveals a novel chromophore." Acta Cryst. D62:527-532.

2. Плетнёва HB, Плетнев CB, Чудаков ДМ, Тихонова ТВ, Попов ВО,

Мартынов ВИ, Влодавер А, Даутер 3 и Плетнев ВЗ (2007) "Пространственная структура желтого флуоресцентного белка zYFP538 {Zoanthus sp.) при разрешении 1. 8 À ." Биоорганическая химия, 33(4):421-430.

3. Pletneva NV, Pletnev VZ, Tikhonova TV, Pakhomov AA, Popov VO,

Martynov VI, Wlodawer A, Dauter Z & Pletnev SV. (2007) "Refined crystal structures of red and green fluorescent proteins from button polyp Zoanthus Г Acta Cryst D63:1082-1093.

4. Плетнёва HB, Тихонова ТВ, Мартынов ВИ, Плетнев ВЗ "Новая

посттрансляционная модификация хромофора белка GFP-семейства.

Рентгеноструктурные исследования белка Z2FP574 из Zoanthus sp. на атомном уровне" VIII чтения, посвященные памяти академика Ю. А. Овчинникова, г. Москва-Пущино, октябрь 2006г., сборник тезисов докладов, стр. 17.

5. Плетнёва НВ, Тихонова ТВ, Пахомов АА, Мартынов ВИ, Плетнев ВЗ

"Структуры хромофоров зелёного и красного флуоресцентных белков из морского полипа (Zoanthus)", III Российский Симпозиум "Белки и Пептиды", г. Пущино, сентябрь 2007г, сборник тезисов докладов, стр. 52.

6. Плетнёва НВ, Тихонова ТВ, Чудаков ДМ, Мартынов ВИ, Плетнев ВЗ

"Рентгеноструктурные исследования флуоресцентных белков семейства Zoanthus sp." XVIII Менделеевский Съезд по общей и прикладной химии, г. Москва, сентябрь 2007г, Т. 4, сборник тезисов докладов, стр. 567.

7. Pletneva NV, Pletnev VZ, Tikhonova TV, Pakhomov AA, Martynov VI,

Pletnev SV "3-D structures of fluorescent proteins from button polyp Zoanthus", Conference:"Fluorescent Proteins and Biological Sensors", Ashburn VA USA October 2007,28-31, abstracts collection, page 69.

Заказ № 41/01/08 Подписано в печать 31 01 2008 Тираж 80 экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 чтуу с/г ги, е-тай т/о@с/г ги

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Плетнева, Надежда Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Свойства, структура и применение флуоресцентных белков

1.2. Разнообразие структур хромофоров

1.2.1. Группа хромофоров I (диапазон эмиссии ~445-538 нм)

1.2.2. Группа хромофоров II (диапазон эмиссии ~ 570-655 нм)

1.2.3. Группа хромофоров П1 (посттрансляционная фрагментация основной цепи)

1.2.4. Группа хромофоров IV (посттрансляционная модификация первого остатка хромофора)

ГЛАВА 2. КРАСНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, zRFP574 (Zoanthus sp2).

2.1. Пространственная структура.

2.2. Структура хромофора

ГЛАВА 3. ЗЕЛЁНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, zGFP506 {Zoanthus sp.)

3.1. Пространственная структура.

3.2. Структура хромофора

ГЛАВА 4 МУТАНТНЫЙ ВАРИАНТ zGFP506N66D

ГЛАВА 5. ЖЁЛТЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, zYFP538 {Zoanthus sp.)

5.1. Пространственная структура.

5.2. Структура хромофора

5.3. Мутантные варианты

ГЛАВА 6. СТУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ОЛИГОМЕРИЗАЦИИ.

ГЛАВА 7 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

7.1. Выделение, очистка и кристаллизация белков.

7.2 Определение структуры, кристаллографическое уточнение.

7.3 Материалы, оборудование, программное обеспечение.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рентгеноструктурные исследования флуоресцентных белков из ZOANTHUS"

Клонирование в 1992г гена зелёного флуоресцентного белка (green fluorescent protein - GFP) и, позднее, других GFP подобных белков положило начало новой области исследований в клеточной биологии, биотехнологии и биомедицине, связанной с практическим использованием этих белков в качестве маркеров и генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоров (Глава 1. "Обзор литературы"). В большинстве случаев, практическое применение флуоресцентных белков требует разработки мономерных мутантных вариантов с эмиссией в дальне-красной области спектра, обладающих высоким квантовым выходом, высокой скоростью созревания хромофора и фотостабильностью. Молекулярный механизм формирования хромофора и роль его аминокислотного окружения, как ближайшего, так и дальнего, в проявлении спектральных свойств флуорофора полностью не ясны. В этой связи, важно понять каким образом особенности стереохимии белка определяют его основные свойства, включая характеристики цветового спектра и установить ключевые остатки ответственные за формирование структуры мономера и олигомеризацию белка. Эти знания необходимы для разработки рационального подхода по созданию улучшенных вариантов белков, удовлетворяющих требуемым критериям. Биологические функции и фотофизические свойства этих объектов строго взаимосвязаны с их структурами. Поэтому, важный фундамент для успешного решения этой задачи создают исследования пространственной организации GFP подобных белков. В этой связи, фундаментальный и прикладной интерес для дальнейшего развития этой области представляет детальное изучение пространственных структур флуорофоров и молекулярных процессов их посттрансляционной модификации с целью направленного воздействия на их фотофизические свойства.

Предметом настоящей диссертационной работы являются рентгеноструктурные исследования на атомном уровне пространственных структур красного (zRFP574), зелёного (zGFP506) и жёлтого (zYFP538) флуорецентных белков из морского бутончатого полипа рода Zoanthus (семейство Zoanthids, класс Anthozoa; Рис. &) (Matz et cit., 1999; Labas et al., 2002), a также генно-инженерного варианта zGFP506 с заменой Asn66Asp (zGFP506JN66D).

Рис. & Отдельные разновидности морских бутон чаты х полипов рода Zoanthus (район Карибского моря). Полипы имеют животное происхождение, развиваются в симбиозе с микроскопическими одноклеточными фитопланктонами (Zooxanthellae) и образуют плотно заселенные колонии, прикрепляющиеся на общем основании к твердой основе. Полипы перерабатывают органическую субстанцию из водной среды, а также питаются морскими организмами (мелкие черви, креветки, яйца морского ежа и т.д.) Симбиотические растительные фитопланктоны превращают энергию солнца в пищу путем фотосинтеза.

Объекты исследования (231 аминокислотный остаток) с хромофоробразующими последовательностями в позиции 66-68, Asp-Tyr-Gly (zRFP574), Asn-Tyr-Gly (zGFP506) и Lys-Tyr-Gly (zYFP538), характеризуются резко отличающимися спектральными характеристиками с максимумами возбуждения/эмиссии 553/574 нм, 492/506 им, 528/538 нм соответственно (Matz et а!., 1999; Gurskaya et al., 2001a; Labas et al., 2002; Yanushevich et al., 2003). При общей величине -78% идентичности аминокислотных последовательностей, выбранные белки являются прекрасными моделями для выявления стереохимических факторов, ответственных за переход от зелёного к жёлтому и затем к красному излучающим состояниям. Исследование этой проблемы явилось одной из задач диссертационной работы, решение которой базировалось на результатах начального этапа по установлению полной пространственной структуры объектов исследования, детального изучения структуры хромофора и хромофор содержащей области. При этом, изучение пространственной структуры зелёного флуоресцентного белка zGFP506 и его мутантного варианта zGFP506N66D с заменой первого остатка хромофора Asn66Asp было выполнено для доказательства сделанного вывода относительно фактора, инициирующего посттрансляционную модификацию хромофора за пределы стандартной "зелёной" формы у красного флуоресцентного белка zRFP574. Для аналогичной цели, было проведено спектральное изучение серии генно-инженерных мутантов zYFP538 по сайтам 44 и 69.

Олигомеризация природных флуоресцентных белков представляет собой серьёзную биотехнологическую проблему, существенно ограничивающую их применение. В этой связи, с целью выявления остатков ответственных за тетрамеризацию исследуемых объектов, в работе был сделан детальный анализ аминокислотной композиции на контактных поверхностях внутри белковых тетрамеров и на его основе предложены аминокислотные замены, приводящие к наиболее вероятному разрушению межмономерных интерфейсов.

Исследуемые белки обладают уникальными спектральными характеристиками и их мономерные варианты были бы широко востребованы для технологий многоцветного мечения и резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). Можно надеяться, что полученные результаты окажутся полезными для понимания молекулярного механизма формирования хромофоров данной группы белков и разработки их мономерных вариантов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Плетнева, Надежда Владимировна

выводы

1. Методом рентгенеструктурного анализа определена пространственная структура красного флуоресцентного белка гЛРР574 дикого типа при разрешениях 2.4А и 1.51 А. Показано, что пространственная организация мономера гКБР574 представляет собой р-бочонок, образованный 11-ю р-сегментами, с центральной а-спиралью содержащий хромофор. Хромофор гКРР574 представляет собой планарную бициклическую систему сопряжённых двойных связей, сформированную из пятичленного имидазолинонового и фенольного циклов. Установлено, что продолжение постгрансляционной модификации хромофора за пределы стандартной "зелёной" формы сопровождается декарбоксилированием боковой цепи первого остатка хромофоробразующей последовательности Аэрбб. Дополнительная постгрансляционная стадия приводит к расширению сопряженной тг-электронной системы и, как следствие, к сдвигу максимумов длин волн возбуждения и эмиссии в красную область спектра. Сделан вывод, что причиной инициирующей соответствующую цепь реакций является электростатический , конфликт между пространственно сближенными отрицательно заряженными боковыми цепями остатка Аэрбб хромофора и каталитического остатка С1и221.

2. Для выявления роли остатка 66 в формировании хромофора установлена пространственная структура зелёного флуоресцентного белка гСРР506 дикого типа разрешение 2.2А), а также его мутантного варианта гСРР506К66Б в переходной зелёной" (разрешение 2.4А) и зрелой "красной" (разрешение 2.2А) формах. В отличие от

2&РР574 боковая цепь первого остатка хромофора Авпбб в гОРР5С)6 остается модифицированной. Однако, замена Авпбб хромофора гОБР506 на отрицательно заряженный Аэрбб инициирует в мутантном варианте гСРР506К660 дополнительную цепь реакций, приводящих к декарбоксилированию боковой цепи Азрбб, аналогично

83 наблюдаемому у г11РР574. Полученные данные подтвердили сделанный вывод относительно инициирующей роли электростатических взаимодействий А5р66—01и221 в наблюдаемом эффекте.

3. Пространственная структура жёлтого флуоресцентного белка гУБР538 установлена при разрешении 1.8А. Хромофор гУРР538 представляет собой планарную трициклическую систему сопряжённых двойных связей. Помимо пятичленного имидазолинонового и фенольного (Туг67) циклов, характерных для стандартной бициклической "зелёной" формы, хромофор гУРР538 содержит дополнительный шестичленный тетрагидропиридиновый цикл. Сделан вывод, что энергетический конфликт положительно заряженной аминогруппы природной боковой цепи остатка хромофорного Ьувбб с окружением гидрофобного кармана (11е44, Ьеи46, РЬе65, Ьеи204 и Ьеи219) является инициатором дополнительной посттрансляционной модификации, ведущей к фрагментации основной цепи с образованием третьего шестичленного гетероцикла. Следствием является формирование "жёлтого" хромофора с расширенной сопряженной тг-электронной системой. Результаты спектральных исследований целенаправленно сконструированных мутантов гУРР53811е44А1а, 2УРР53811е44А1аА8р69Азп и гУРР538Ие448ег находятся в полном согласии с этим выводом.

4. Структуры и спектральные характеристики хромофоров исследованных объектов (общая аминокислотная идентичность 72%) определяются прежде всего хромофоробразующей аминокислотной последовательностью и стереохимией ближайшего аминокислотного окружения хромофоров.

NYG JCYG DYG a Ь С

Рис. S Химические формулы хромофоров зелёного, zGFP506 (а), жёлтого, zYFP538 (б) и красного, zRFP574 (с) флуоресцентных белков (Zoanthus) по данным рентгеноструктурного анализа (с указанием максимумов длин волн в спектрах возбуждения и эмиссии).

По данным рентгеноструктурного анализа структура хромофора zGFP506 (кодируемого последовательностью Asn66-Tyr67-Gly68) представляет собой планарную бициклическую систему сопряженных двойных связей, состоящую из пятичленного имидазолинонового цикла и фенольного (п-оксибензилиденового) кольца Туг67 (Рис. $а) Первый остаток Asn66 хромофора характеризуется интактной боковой цепью, sp3 гибридизацией Са атома и транс- конфигурацией предшествующей пептидной связи.

Хромофор zYFP538 (кодируемый последовательностью Lys66-Tyr67-Gly68) имеет планарную трициклическую структуру, состоящую из стандартного "зелёного" бициклического ядра и дополнительного шестичленного тетрагидропиридинового цикла, предположительно образованного (по механизму Remington et al. 2005) в результате реакции трансиминирования атома N^ боковой цепи остатка Lys66 с реакционноспособной ацилиминной связью Ca=N(66) переходного состояния (Рис.$Ь). Образование хромофора сопровождается фрагментацией основной цепи по связи Ca-N(66).

Структура хромофора zRFP574 (кодируемого последовательностью Asp66-Tyr67-Gly68) состоит из характерного для "зелёной" формы бициклического ядра с модифицированным первым остатком Asp66 (Рис.$с). Модифицированный Asp66 zRFP574, в резком отличии от соответствующего Asn66 в zGFP506, характеризуется декарбоксилированной боковой цепью, sp2 гибридизацией Са атома и цис- конфигурацией предшествующей пептидной связи.

5. Изучена стереохимическая композиция контактирующих поверхностей между мономерными субъединицами на двух интерфейсах (ИФ1 и ИФ2) в тетрамерной упаковке исследуемых флуоресцентных белков. Интерфейс ИФ1 стабилизируется, главным образом, центральным гидрофобным кластером, образованным плотно упакованными боковыми цепями консервативных остатков из 8-10 боковых цепей. Интерфейс ИФ2 стабилизируется, в основном, сетью из шести консервативных водородных связей и десяти солевых мостиков. Предполагается, что рационально выбранная частичная замена гидрофобных остатков центрального кластера на • гидрофильные на ИФ1, совмещенная с мутациями Cysl49Ser и Lys/Arg на Glu/Asp (или Glu/Asp на Lys/Arg) на ИФ2 приведет к разрушению интерфейсов.

6. Полученные в настоящей работе результаты вносят вклад в создание общей структурной базы для изучения механизмов формирования хромофоров и разработки соответствующих мономерных вариантов флуоресцентных белков для технологий многоцветного мечения и резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

7. Результаты диссертационной работы представлены в трех статьях и трёх тезисах на конференциях и симпозиумах:

Статьи:

1. Pletneva N, Pletnev S, Tikhonova T, Popov V, Martynov V. & Pletnev V. (2006) "Crystal structure of a red fluorescent protein from Zoanthus, zRFP574, reveals a novel chromophore." Acta Cryst. D62:527-532.

2. H. В. Плетнева, С. В. Плетнев, Д. M. Чудаков, Т. В.Тихонова В. О. Попов, В. И.

Мартынов, А. Влодавер, 3. Даутер и В. 3. Плетнев (2007) Пространственная структура жёлтого флуоресцентного белка zYFP538 (Zoanthus sp.) при разрешении 1.8 Â. Биоорганическая химия, 33(4) (принята к публикации).

3. Pletneva N, Pletnev V, Tikhonova T, Pakhomov A, Popov V, Martynov V, Wlodawer A,

Dauter Z & Pletnev S. (2007) Refined crystal structures of red and green fluorescent proteins from button polyp Zoanthus Acta Cryst. D63 (accepted).

Конференции/Симпозиумы:

1. Плетнева НВ, Тихонова ТВ, Мартынов ВИ, Плетнёв ВЗ "Новая постгрансляционная модификация хромофора белка GFP-семейства. Рентгеноструктурные исследования белка Z2FP574 из Zoanthus sp. на атомном уровне" VIII чтения, посвященные памяти академика Ю. А. Овчинникова, г. Москва-Пущино, 25-27 октября 2006г.,

2. Плетнева НВ, Тихонова ТВ, Пахомов АА, Мартынов ВИ, Плетнёв ВЗ "Структуры хромофоров зелёного и красного флуоресцентных белков из морского полипа {Zoanthus)", III Российский Симпозиум "Белки и Пептиды", г. Пущино, 16-21 сентября 2007г.

3. Плетнева НВ, Тихонова ТВ, Чудаков ДМ, Мартынов ВИ, Плетнев ВЗ

Рентгеноструктурные исследования флуоресцентных белков семейства Zoanthus sp." XVIII Менделеевский Съезд по общей и прикладной химии, г. Москва, 23-28 сентября 2007г.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Плетнева, Надежда Владимировна, Москва

1. Ando R, Mizuno H, & Miyawaki A. (2004) "Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting" Science, 306:1370-1373.

2. Andersen M, Wahl MC, Stiel AC, Grater F, Scafer LV, Trowitzsch S, Weber G, Eggeling C, Grubmuller H, Hell SW & Jakobs S. (2005) "Structure and mechanism of reversible photoswitch of a fluorescent protein". Proc. Natl. Acad. Sci. 120:13070-13074.

3. Barondeau DP, Putnam CD, Kassman CJ, Tainer JA & Getzoff E. (2003) " Mechanism and energetics of green fluorescent protein chromophore synthesis revealed by trapped intermediate structures". Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 12111-12116.

4. Barondeau DP, Kassmann CJ, Tainer JA & Getzoff ED (2006) "Understanding GFP posttranslational chemistry: structures of designed variants that achieve backbone fragmentation, hydrolysis, and decarboxylation." J. Am. Chem. Soc. 128:4685 4693.

5. Burmeister WP (2000) "Structural changes in a cryo-cooled protein crystal owing to radiation damage." Acta Cryst. D56:328-341.

6. Cambridge Soft Corporation. http://w\vw. camsoft. com.

7. Campbell RE, Tour O, Palmer AE, Stainbach, PA, Baird GS, Zacharias DA & Tsien RY. (2002) "A monomelic red fluorescent protein". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:7877-7882.

8. Chalfie M & Kain S. (1998) "Green Flourescent Protein: Properties, Applications, and Protocols". New York: Wiley-Liss, pp. 385.

9. Chiang CF, Okou DT, Griffin TB, Verret CR &Williams MN (2001) "Green fluorescent proteinrendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions" Arch Biochem1. Biophys. 394(2):229-235.

10. Chudakov DM, Feofanov AV, Mudrik NN, Lukyanov S & Lukyanov KA. (2003) "Chromophore environment provides clue to 'kindling fluorescent protein' riddle". J. Biol. Chem., 278:7215-7219.

11. Chudakov DM, Lukyanov S. and Lukyanov KA. (2005) "Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging". Trends in Biotechnology, 23:605-613.

12. Collaborative Computational Project Number 4 (1994). "The CCP4 suite: programs for protein crystallography." Acta. Cryst. D50(Pt5):760-763.

13. Cubbit AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gros LA & Tsien RY. (1995) "Understanding, improving and using green fluorescent proteins". Trends Biochem. Sci., 20:448-455.

14. DeLano WL (2002). http://www.pymol.org.

15. Ehrig T, O'Kane DJ & Prendergast FG. (1995) "Green-fluorescent protein mutants with altered fluorescence excitation spectra. " FEBS Let. 367:163-166.

16. Emsley P & Cowtan K (2004). "Coot: model-building tools for molecular graphics." Acta Cryst. D60:2126-2132.

17. Evans SV (1993) " SETOR: hardware-lighted three-dimensional solid model representations of macromolecules." J. Mol. Graphics, 11:134-138.

18. Evdokimov AG, Pokross ME, Egorov NS, Zaraisky AG, Yampolsky IV, Merzlyak EM,

19. Shkoporov AN, Sander I, Lukyanov KA & Chudakov DM (2006) "Structural basis for the fast maturation of Arthropoda green fluorescent protein." EMBO Rep. 7:1006-1012.

20. Fang Y, Dery O, Haugwitz M, Turpin P, Kain SR (2006) "Practical considerations for use of reef coral fluorescent proteins in mammalian cells: applications in fluorescence microscopy and flow cytometry." Methods Biochem. Anal. 47:339-359.

21. Gurskaya NG, Savitsky AP, Yanushevich YG, Lukyanov SA, & Lukyanov KA (2001a) "Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis." BMC Biochemistry, 2:6.

22. Gurskaya NG, Fradkov AF, Terskikh A, Matz MV, Labas YA. Martynov VI, Yanushevich YG, Lukyanov KA, & Lukyanov SA. (2001b) "GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins". FEBS Letters, 507:16-21.

23. Heim R, Prasher DC & Tsien RY. (1994) "Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein." Biochemistry, 91:12501-12504.

24. Heim R & Tsien RY "Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer." (1996) Curr. Biol. 6:178-182.

25. Jung G, Wiehler J & Zumbusch A (2005) "The photophysics of green fluorescent protein:influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222." Biophys. J. 88, 1932-1947.

26. Karasawa S, Araki T, Yamamoto-Hino M & Miyawaki A (2003) "A green-emitting fluorescent protein from Galaxeidae coral and its monomelic version for use in fluorescent labeling." J Biol Chem. 278:34167-34171.

27. Karasawa S, Araki T, Nagai T, Mizuno H & Miyawaki A (2004) "Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer." Biochem. J. 381:307-312.

28. Kuner T. & Augustine GJ. (2000) "A genetically encoded ratiometric indicator for chloride: capturing chloride transients in cultured hippocampal neurons." Neuron, 27:447-459.

29. Martynov VI, Maksimov B I, Martynova NY, Pakhomov AA, Gurskaya NG & Lukyanov SA (2003) "A purple-blue chromoprotein from Goniopora tenuidens belongs to the DsRed subfamily of GFP-like proteins." J. Biol. Chem. 278:46288-46292.

30. Matano, Y., Nomura, H. & Suzuki, H. (2000) "Stabilized bismuthonium ylides bearing a highly cross-conjugated ylidic carbon atom: synthesis, structures, and reactions" J. Organomet. Chem. 611, 89-99.

31. Matz MA, Fradkov Y, Labas A, Savitsky A, Zaraisky M. Markelov & Lukyanov S, 1999. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Biotechnology, 17:969-973.

32. McDonald IK, Thornton JM. (1994) "Satisfying hydrogen bonding potential." J. Mol. Biol. 238:777-793.

33. Mizuno H, Sawano A, Eli P, Hama H & Miyawaki A (2001) "Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer." Biochemistry 40:2502-2510.

34. Mizuno H, Mal TP, Tong Kl, Ando R, Furuta T, Ikura M & Miyawaki A (2003) "Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein." Mol. Cell 12:1051-1058.

35. Murshudov GN, Vagin AA & Dodson EJ (1997) "Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method." Acta Cryst. D53:240-255.

36. Nienhaus K, Nienhaus GU, Weidenmann J & Nar H. (2005) "Srtuctural basis for photo-induced protein cleavage and green-to-red conversion of fluorescent protein EosFP". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:9156-9159.

37. Oshimi K, Kubo K, Kawasaki A, Maekawa K, Igarashi T & Sakurai T (2002) "Oxidative cyclization of aryl-substituted (Z)-N-acetyl-a-dehydroalanines having a dialkylamino group, in the presence of dioxygen" Tetrahedron Letters, 43, 3291—3294.

38. Otwinowski Z & Minor W (1997) "Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.", Methods in Enzymology, Macromolecular Crystallography, part A (Carter CW, Jr. & Sweet RM, Eds.), Academic Press. V276:307-326.

39. Pakhomov AA, Martynova NY, Gurskaya NG, Balashova TA & Martynov VI (2004)

40. Photoconversion of the chromophore of a fluorescent protein from Dendronephthya sp." Biochemistry (Moscow) 69, 901-908.

41. Pakhomov AA, Pletneva NV, Balashova TA & Martynov VI. (2006) "Structure and reactivity of the chromophore of a GFP-like chromoprotein from Condylactis gigantea." Biochemistry 45, 7256-7264.

42. Pakhomov AA & Martynov VI. (2007) "Chromophore Aspartate Oxidation-Decarboxylation in' the Green-to-Red Conversion of a Fluorescent Protein from Zoanthns sp2" Biochemistry. 46 (accepted).

43. Palmer AE & Tsien RY. (2006) "Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators". Nature protocols, 1:1057-1065

44. Petersen J, Wilmann PG, Beddoe T, Oakley AJ, Devenish RJ, Prescott M & Rossjohn J.(2003) "The 2.0-Â Crysatl Structure of eqFP611, a Fea Red Fluorescent Protein from the Sea Anemone Entacmaea quadricolor". J. Biol. Chem., 278:44626-44631.

45. Perrakis A, Sixma TK, Wilson KS & Lamzin VS (1997) "wARP: improvement and extension of crystallographic phases by weighted averaging of multiple-refined dummy atomic models." Acta Cryst., D53:448—455.

46. Pilati T (1987) "Structure of (Z)-3-methoxycarbonylamino-N,N-dimethyl-2-phenylpropenamide" Acta Cryst. C43.-2432-2434.

47. Prescott M, Ling M, Beddoe T, Oakley AJ, Dove S, Hoegh-Guldberg O, Devenish RJ, Rossjohn J (2003) "The 2.2 a crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation." Structure 11:275-284.

48. Quillin ML, Anstrom DM, Shu X, O'Leary S, Kallio K, Chudakov DM & Remington SJ (2005) "Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution." Biochemistry, 44:5774 -5787.

49. Ravelli RB & Garman EF (2006) "Radiation damage in macromolecular cryocrystallography." Curr. Opin. Struct. Biol. 16:624-629.

50. Rekas A, Alattia JR, Nagai T, Miyawaki A. (2002) "Crystal structure of Venus, a Yellow Fluorescent Protein with Improved Maturation and Reduced Environmental Sensitivity". J. Biol. Chem., 277:50573-50578.

51. Remington S J, Wachter RM, Yarbrough DK, Branchaud B, Anderson DC, Kallio K & Lukyanov KA (2005) "zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore." Biochemistry, 44:202-212.

52. Remington SJ. (2006) "Fluorescent proteins: maturation, photochemistiy and photophysics", Curr. Opin. Struct. Biol. 16:1-8.

53. Rizzo MA., Springer GH., Granada B., Piston DW. (2004) "An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET", Nat Biotechnol., 22(4)-.445-449.

54. Sack JS (1988) "CHAIN a crystallographic modeling program." J. Mol. Graphics, 6, 224-225.

55. Salih A, Larkum A, Cox G, Kuhl M. & Hoegh-Guldberg O. (2000) "Fluorescent pigments in corals are photoprotective ". Nature, 408:850-853.

56. Sato M, Ozawa T, Inukai K, Asano T & Umezawa Y. (2002) "Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells" Nat. biotechnol. 20:287-294.

57. Schnell R, Sandalova T, Hellman U, Lindqvist Y & Schneider G (2005) "Siroheme- and Fe4-S4.-dependent NirA from Mycobacterium tuberculosis is a sulfite reductase with a covalent Cys-Tyrbond in the active site." J. Biol. Chem. 280(29):27319-27328.

58. Schwede TF, Retey J & Schulz GE. (1999) "Crystal structure of Histidine Ammonia-Liase revealing a novel polypeptide modification as the catalytic electrophile". Biochemistry, 38:5355-5361.

59. Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE & Tsien RY (2004) "Improved monomelic red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein." Nat Biotechnol. 22:1567-1572.

60. Shu X, Shaner NC, Yabrough CA, Tsien RY & Remington SJ. (2006) "Novel chromophores and buried charges control color in mFruits". Biochemistry, 45:9639-9647.

61. Sheldrick GM & Schneider TR (1997) "SHELXL:high resolution refinement. Methods in Enzymology (eds. by C. W. Carter, Jr. & R. M. Sweet) San Diego: Academic Press. V277:319-343.

62. Tsien RY (1998) "The green fluorescent protein:" Ann. Rev. Biochem. 67:509-544

63. Verkhusha W & Lukyanov KK (2004a) "The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins." Nat. Biotechnol. 22:289-296.

64. Verkhusha W, Chudakov DM, Gurskaya NG, Lukyanov S & Lukyanov K. (2004b) "Common pathway for the Red Formation in Fluorescent Proteins and Chromoproteins". Chemistry & Biology, 11:845-854.

65. Wachter RM, King BA, Heim R, Kallio, K, Tsein RY, Boxer SG & Remington SJ. (1997) "Crystal structure and photodynamic behavior of the blue emission variant Y66H/Y145F of green fluorescent protein". Biochemistry, 36:9759-9765.

66. Wachter RM, Esliger MA, Kallio K, Hanson GT & Remington SJ. (1998) " Structural basis of spectral shifts in yellow-emission variants of green fluorescent protein "Structure, 6:12671277.

67. Wall MA, Socolich M & Ranganathan R (2000) "The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed." Nat. Struct. Biol. 7:1133-1138.

68. Wang, S., Smith, S. C. (2007) " Mechanistic aspects of proton chain transfer in the green fluorescent protein. Part II. A comparison of minimal quantum chemical models" Phys. Chem. Chem. Phys., 9(4):452-458.

69. Wallace AC, Laskowski RA, Thornton JM. (1995) "LIGPLOT: A program to generate schematic diagrams of protein-ligand interactions." Protein Engin. 8:127-134.

70. Whittaker JW (2003) "Free radical catalysis by galactose oxidase." Chem. Rev. 103, 2347-2363.

71. Wiedenmann J, Ivanchenko S, Oswald F, Schmitt F, Rocker C, Salih A, Spindler KD &

72. Nienhaus GU (2004) "EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion." Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101:15905-15910.

73. Wood TI, Barondeau DP, Hitomi C, Kassmann CJ, Tainer JA & Getzoff ED (2005) "Defining the role of arginine 96 in green fluorescent protein fluorophore biosynthesis." Biochemistry 44:16211-16220.

74. Yanushevich YG, Gurskaya NG, Staroverov DB, Lukyanov SA & Lukyanov KA (2003) "A natural fluorescent protein that changes its fluorescence" Rus. Bioorg. Chem. 29, 325-329.

75. Yampolsky IV, Remington SJ, Martynov VI, Potapov VK, Lukyanov S. & Lukyanov K. A. (2005) "Synthesis and properties of the chromophore os asFP595 chromoprotein from Anemonia Sulcata " Biochemistry 44, 5788-5793

76. Yang F, Moss LG, & Phillips GN (1996) "The molecular structure of green fluorescent protein" Nature Biotechnol. 14, 1246-1251

77. Зубова НН, Булавина АЮ и Савицкий АП. (2003). «Спектральные и физико-химические свойства зелёного (ОРР) и красного (с1гКР583) флуоресцирующих белков", Успехи биол. хим. 43:163-224.

78. Зубова НН и Савицкий АП. (2005) «Молекулярные клеточные сенсоры на основе цветных флуоресцирующих белков». Успехи биол. хим., 45:1-66.98:462-467.4772.