Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция транспорта митохондрий в клетках млекопитающих

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Регуляция транспорта митохондрий в клетках млекопитающих"

11а правах рукописи УДК 577.3

Кулик Александр Валентинович

Регуляция транспорта миюхондрнй в клетках млекопитающих 03 00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2006

Работа выполнена на кафедре молекулярной биофизики Московского физико-технического института (| осударственного университета) и в группе клеточной биологин Института белка РАН.

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Минин Александр Александрович.

Официальные оппоненты: Доктор фичико-матсма гических наук Лившиц Михаил Аронович, Институт молекулярной биологии РАН (г. Москва)

Доктор биологических наук Ширинский Владимир Павлович, Российский кардиологический научно-производственный комплекс (г. Москва)

Ведущая организация: Институт биохимии им А.Н. Баха РАМ

Защита диссертации состоится 22 мартг^ ^ 2006 года, в Лрчасов на заседании диссертационного совета К 212 156.03 при МФТИ по адресу: 141700 Московская обл, г.Долгопрудный, Институтский переулок, д.9, МТФИ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан: /Г 2006 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, __

кандидат физико-математических наук

Брагин В Е

lOOCfi,

j Актуальность проблемы.

Митохондрии играют важную роль в физиологии клетки. Они обеспечивают клетку энергией в форме молекул ЛТФ, участвуют в регуляции концентрации ионов кальция в цитоплазме, а также являются важнейшим звеном в процессе программируемой клеточной смерти. Распределение митохондрий в клетке тесно связано с жизненной активностью различных ее участков. К примеру, ко-локапизация некоторых доменов эндоплазматического ретикулума (ЭР) и митохондрий необходима для передачи ионов кальция от ЭР к митохондриям (Rizzuto et al., 1993; 1998; Csordáset al., 1999); расположение митохондрий вблизи плазматической мембраны позволяет контролировать уровень поступления кальция внутрь клетки (Lawrie et al., 1996; Hoth et al., 1997; Montero et al., 2000), а локальные взаимодействия между соседними митохондриями способствуют распространению сигналов между митохондриями в некоторых моделях апоптоза (Pacher and Hajnóczky, 2001). Кроме того, почти во всех клетках митохондрии локализуются вблизи мест высокого потребления энергии (Zielinski et al., 1988; van Blerkom., 1991; Morris and Möllenbeck 1993; Chada and Möllenbeck, 2003; Li et al., 2004). Нарушения транспорта и правильного распределения митохондрий могут приводить к ряду нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера и Хантингтона (Gunawardena and Goldstein, 2001; Gunawardena et al., 2003; Hurd and Saxton, 1996), a также латеральный амиотрофический склероз (Collard et. al, 1995). Таким образом, координированный транспорт и распределение митохондрий являются неотъемлемой частью нормального функционирования клетки в целом. Поэтому изучение процессов, лежащих в основе регуляции распределения митохондрий, является важным шагом на пути к пониманию причин нарушения внутриклеточного транспорта этих органелл.

По современным представлениям транспорт митохондрий осуществляется моторными белками, которые используют энергию гидролиза АТФ для движения вдоль филаментов цитоскелета. Было показано, что митохондрии способны перемещаться как вдоль микротрубочек, так и вдоль актиновых микрофиламентов (Morris and Hollenbeck, 1995 Ligón and Steward, 2000), и осуществляется этот процесс при участии таких моторных белков, связанных с микротрубочками, как кинезины и динеины (Tanaka et al., 1998; Nángakli et al., 1994), и актин-зависимых -миозинов. За последнее время накопилось много данных о функциях отдельных моторов. Однако, сведений о молекулярных механизмах их рефляции пока недостаточно. ■■■" —

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

I

1J 01ЛИЧПС or друшх органелл, большинство ми юхондрии и клетке неподвижны или малоподвижны, и лишь небольших их часть двигается относительно быстро (Trinczek et al., 1999; De Vos et ai, 2003). Наличие малоподвижных митохондрий принято связывать с их иммобилизацией вблизи мест активного потребления АТФ или участков, с повышенным содержанием ионов кальция. Вопрос о том, какие именно белки участвуют в непосредственном связывании митохондрий и удерживании их в местах специфической локализации, в настоящее время остается открытым. Тем не менее, в нескольких работах высказывается предположение, что в основе ингибирования движения митохондрий лежит взаимодействие этих оргаиелл с такими элементами цитоскелета, как промежуточные филаменты и актиновые микрофиламенты (Krendel et al, 1998, Wagner et al., 2003, Letemer et al. 1994, Trinczek et al., 1999). Таким образом, подвижность митохондрий может регулироваться как со стороны моторных белков, участвующих в их транспорте, так и при помощи их взаимодействий с неподвижными структурами цитоскелета. Однако, сигнальные пути, лежащие в основе такой регуляции, в настоящее время остаются малоизученными

Мы обнаружили, что в клетках CV-1 митохондрии переходят из подвижного состояния в стационарное в ответ на добавление к клеткам одного из основных ростовых факторов, содержащихся в сыворотке, лизофоефатилной кислоты (LPA), которая, как было показано ранее, вызывает такие изменения в клетках, как образование актиповых стресс-фибрилл, созревание фокальных кош актов и стабилизацию микротрубочек в направлении движения клетки.

Цель работы и основные задачи исследования

Целью работы было установить механизмы передачи сигнала LPA, контролирующего подвижность митохондрий, и определить участников этой передачи.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Среди известных регуляторных белков, осуществляющих передачу сигнала LPA, выявить те из них, которые участвуют в ингибировании движения митохондрий.

2. Выяснить, какие из изменения в структуре цитоскелета, вызываемые LPA, отвечают за ингибирование движения митохондрий.

Научная новизна

В pciyjiьгаI е настоящей работы найден новый механизм регуляции подвижности митохондрий одним из ростовых факторов, лизофосфатидной кислотой (1-РА), который заключается в регулируемом переходе их из подвижною состояния в стационарное. Впервые установлено участие малой ГТФазы RhoA и ее белка-мишени mDial, в передаче сигнала LPA, который приводит к подавлению движения митохондрий.

Продемонстрировано также, что ингибиторное действие белка mDial на движение митохондрий строго зависит от его способности стимулировать полимеризацию актина, связывающего митохондрии. Индукция полимеризации актина, другими, не зависимыми от mDial способами, включая обработку клеток известным стабилизатором полимерного актина, джасплакинолидом или активацию Агр2/3 комплекса, не влияет на подвижность митохондрий.

Теоретическая и практическая ценность

Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию фундаментальных процессов, лежащих в основе внутриклеточной локализации и транспорта митохондрий. Полученные результаты могут быть использованы для разработки методик лечения нсйро-дсгснсративных заболеваний, связанных с нарушением транспорта и правильного распределения митохондрий Разработанные методические подходы к наблюдению и анализу движения митохондрий могут быть использованы для изучения внутриклеточного транспорта других органелл.

Апробация работы.

Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на XLIV научной конференции Московского физико-технического института (Долгопрудный, 2001); на международной конференции «2001 ННМ1 Meeting of International Research Scholars» (Ванкувер, Канада, 2001); на международной школе «FEBS practica! course on «Visualising Cytoskeleton Dynamics» (Дрезден, Германия, 2004); и на межлабораторном семинаре Института белка РАН (Москва, 2005).

Структура и объем работы.

Диссертация содержит следующие основные разделы введение, обзор литературы, описание материалов и методов, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы.

Диссертация изложена на 82 страницах машинописного текста и содержит 4 тблнцы и 15 рисунков.

Методы исследования.

Для экспериментов по изучению движения митохондрий использовались культивируемые клетки линии CV-1-Mito. Линия была получена в ходе селективной трансфекции клеток CV-1 (клетки эпителия почки зеленой мартышки) плазмидой pEYFP-Mito (Clontech), кодирующей восьмую субьединицу человеческой цитохром С оксилазы с присоединенным к ней желтым флуоресцентным белком (EYFP, флуоресценция на длине волны 527 нм). Клетки выращивали на покровных стеклах до плотности 50-70% суб-конфлуентного монослоя.

Грансфекцию культивируемых клеток CV-1 Mito необходимыми плазмндами проводили с помощью липосомного реагента Unifectin М, полученного от А. Сурового (Институт биоорганической химии, Москва) В опытах для ко-экспрессии в клетке нескольких ДНК-конструкций применяли методику внутриядерных микроинъекций раствора ДНК в культивируемые клетки, которые предварительно рассаживали на разграфленные стекла.

Для микроскопии живых клеток, покровные стекла с клетками монтировали на предметных стеклах, в результате чего получалась герметичная камера, заполненная культуральной средой Наблюдения проводили при помощи микроскопа Axiophot (Zeiss). Температуру поддерживали постоянной 37°С +/-2°С с помощью регулируемого воздушного потока (Zeiss Air Stream Incubator).

С помощью 12-битной цифровой CCD камеры 1 MIU MicroMax (Roper Scientific) и программного обеспечения WinView 32 (Princeton Instruments) изображение записывалось, передавалось на компьютер и запоминалось в виде 8-битных файлов с размером картинки 782x582 пикселя. Время экспозиции было равно 1 секунде, пауза между последовательными кадрами - 3 секунды, количество кадров в каждом фильме - от 20 до 50.

Обработка данных. Для определения средней скорости отдельных митохондрий использовали программу ImagcJ (Scion). С ее помощью в каждом кадре записанной последовательности определялись координаты каждой митохондрий: геометрического центра (для митохондрий малого размера) или координаты одного из концов митохондрии (для длинных органелл). Затем при помощи программы Excel (Microsoft), определяли расстояния между положениями органелл в соседних кадрах и среднюю скорость движения каждой митохондрии за промежуток времени между кадрами Таким образом, определяли, как меняется

средняя скорость каждой миюхонлрии в данной клетке от кадра к кадру. В каждом опыте анализировали митохондрии в 5-10 клетках, в каждой клетке 10-40 митохондрий.

Для анализа подвижности митохондрий и доли неподвижных митохондрий, учитывали движения всех митохондрий в плоской части клеток, которые были видны в поле микроскопа в течение съемки. Значение относительной подвижности митохондрий в клетке, определяли как отношение числа перемещений митохондрий со скоростью больше 0.2 мкм/с к общему числу всех зарегистрированных перемещений митохондрий в данной клетке. Долю неподвижных митохондрий определяли как отношение числа митохондрий, которые в течение всего времени наблюдения не меняли своего положения или двигались со скоростью меньше 0.2 мкм/с, к общему числу митохондрий в данной клетке. Долю времени в движении определяли как отношение числа кадров, в которых митохондрия двигалась со скоростью больше 0 2 мкм/с, к общему числу кадров, в которых наблюдали данную митохондрию. Для подсчета среднего значения данного параметра учитывались данные только для подвижных митохондрий Для определения средней скорости движения подвижных митохондрий, учитывали только тс кадры, в которых митохондрия двигалась со скоростью больше 0.2 мкм/с.

Для каждого опыта получали распределение соответствующих характеристик движения митохондрий (относительной подвижности митохондрий; доли подвижных митохондрий; доли времени в движении; средней скорости), полученных в разных клетках. С помощью программы «Statistica for Windows» (StatSoft) распределения проверяли на нормальность по тесту Колмогорова-Смирнова и вычисляли среднее значение и стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий использовали t-тест для независимых величин.

Результаты исследования и их обсуждение.

Наблюдение митохондрий в живых клетках и определение их подвижности.

Поведение митохондрий на периферии клеток характеризуется двумя различными состояниями: стационарным и подвижным Стационарные митохондрии закреплены на элементах цитоскелета, а подвижные - перемещаются вдоль микротрубочек с помощью моторных белков. Чтобы исследовать механизмы переключения между двумя состояниями митохондрий, мы использовали систему наблюдения за индивидуальными митохондриями в живых клетках. Для этого была получена клеточная линия, в которой все митохондрии были помечены желтым флуоресцентным белком (EYFP). На рис 1 представлена типичная картина

распределения митохондрий в клетках CV-1 Mito, полученная при помощи цифровой камеры.

Рис. /. Движение митохондрий в клетках CV-1 Mito. (Л) Первый из пос ¡едочатечыюсти кадров по ¡ученных при помощи флуоресцентной микроскопии (Б) Движения митохондрий в участке выдечениом « рис 1А (В) Траектории перемещений митохондрий ш рис 1S за 3 мин Масштаб 10

Видно, чю митохондрии в лих клегкач имеюг удлиненную форму и располагаются радиально. На рис.1 Б показано, как меняется положение митохондрий в выделенном на рис. 1 А участке в серии кадров. На рис.1 В представлены траектории их движения за 3 минуты с разрешением 4 секунды Видно, что движение митохондрий представляло собой перемещения в направлении края клетки или к центру, которые прерывались частыми остановками. Многие органеллы не перемещались иа значительные расстояния, а находились в относительном покое на протяжении всего времени наблюдения

Чтобы выяснить, какой вклад в транспорт митохондрий в нашей системе вносят микротрубочки, мы проанализировали движение митохондрий в клетках, обработанных нокодазолом и не содержащих микротрубочек. Движение митохондрий в отсутствие микротрубочек представляло собой случайные хаотические перемещения на небольшие расстояния. Все перемещения происходили со скоростями меньше 0 2 мкм/с Из чего следует, что 6ucipoc движение митохондрий возможно только в присутствии микрогрубочек, и -jro движение характеризуется скоростями 0.2 мкм/с и выше

Для удобства анализа движения митохондрий мы в дальнейшем считали митохондрии подвижными, если скорость их движения превышала 0.2 мкм/с, мнточондрии, которые двигались с меньшими скоростями или были неподвижными в течение времени съемки, мы считали стационарными. В качестве основного параметра была выбрана относительная подвижность митохондрий, которая представляет собой долю перемещений митохондрий со скоростью больше 0 2 мкм/с среди всех зарегистрированных перемещений. Этот параметр показывает, какая часть наблюдаемых митохондрий (в среднем) в каждый момент времени находится в подвижном состоянии. Анализ движения митохондрий в 50 клетках линии CV-1 Mito показал, что среднее значение относительной подвижности митохондрий составляет 7% (таблица 1)

Подвижность митохондрий находится под контролем внешних факторов

Чтобы выяснить, как подвижность митохондрий зависит от условий культивирования клеток, мы поместили клетки в бессыворогочную сред\ Оказалось, что подвижность митохондрий значительно снижается, если клетки инкубировать в отсутствие сыворотки (таблица 1). Такой эффект был обратимым-подвижность митохондрий восстанавливалась при добавлении в среду сыворотки. Этот результат свидетельствует о наличии в сыворотке веществ, способных регулировать внутриклеточную подвижность митохондрий.

Таблица 1.

Относительная подвижность митохондрий, % *

Контроль 7+/-3

Клетки с разобранными микротрубочками 0

В безсывороточной среде 1.6+/- 0.4

* Данные представлены в виде М ± SD

Для того чтобы определить, какой из сывороточных факторов отвечает за регуляцию подвижности митохондрий, мы измеряли относительную подвижность митохондрий в клетках при добавлении в среду различных факторов, содержащихся в сыворотке Несмотря на то, что ни одно из проверенных нами веществ не повышало подвижности митохондрий в такой же степени, как сыворотка, мы

обнаружили, что лизофосфатидная кислота (!.РА), один из основных компонентов сыворотки, оказывает противоположный эффект' добавление ЬРА приводило к значительному снижению подвижности митохондрий. Митохондрии переставали двигаться уже через несколько минут после добавления в среду 1-РА. Спустя 40-60

минут подвижность митохондрий восстанавливалась до контрольною значения Анализ движения митохондрии в таких клетках показал, чю ниш. очень не большая их часть перемешается на значительные расстояния

На рис 2 Г показаны траектории митохондрий в присутствии LPA Видно, что они очень короткие, и большинство органелл практически не изменяли своего положения за время съемки Результаты количественного анализа, приведенные на рис 3, показывают, что I.PA подавляет движение митохондрий, уменьшая среднее значение относительной подвижности митохондрий более чем в пять раз (Р < 0.05)

Лизофосфатидная кислота ингибирует подвижность митохондрий через белок RhoA.

Лизофосфатидная кислота представляет собой фосфолипид, обладающий активностью ростовых факторов в нормальных и опухолевых клеточных культурах. Связываясь с LPA-рецепторами на поверхности клетки, LPA запускает несколько сигнальных каскадов, вызывающих различные клеточные изменения. Один из наиболее изученных каскадов, активируемых LPA, включает активацию малой ГТФ-азы RhoA (Ridley and Hall, 1992; Cook et al., 1998). Мы предположили, что этот белок может быть также вовлечен и в регуляцию подвижности митохондрий. Чтобы

Рис. 2. ЬРА ингибирует подвижность митохондрии. (А В) Первый кадр и? пос ¡едоватепьности микрофотографии ф луоресцентно меченых митохондрий в клетках пинии СУ-1 Мча, (Б, Г) представчены траектории движения за 3 минуты всех митохондрий в тех же самых клетках (Л. Б) -контрочьная клетка, (В, Г) - клетка, обработанная 5 мкМ И'А в течение 5 минут Масштаб 10 икм

проверить данное предположение, мы экспрессировали в клетках конститутивно активный мутант белка RhoA, EGFP-RhoA-(Q63L) (плазмида любезно предоставлена Др. Клаусом Ханом (Scripps Research Institute, Сан Диего, США). Анализ движения митохондрий в таких клетках показал, что, как и при добавлении LPA, относительная подвижность митохондрий i данных клетках сильно уменьшается (рис. 3).

Контроль Т.РЛ UhoA-QL

Рис, 3 Количественный анализ подвижности митохондрий в клетках, обработанных LPA, и в клетках, репрессирующих ECFP-RltoA-(Q63L). п- чисю клеток, в которых была посчитана относитепьная подвижность митохондрий в скобках указано суммарное чиао проанализированных митохондрий, в каждой опыте посчитаны клетки из J независимых экспериментов Данные представлены в виде М ± SD

Чтобы выяснить, какую роль играет эндогенный белок RhoA в регуляции распределения и подвижности митохондрий, мы инъецировали в клетки СЗ трансферазу, бактериальный фермент, который АДФ-рибозилирует и тем самым инактивирует белок RhoA (Paterson et al., 1990; Ridley and Hall, 1992). Такое воздействие приводило к тому, что закрепленное состояние митохондрий на периферии клетки нарушалось, и почти все они оказывались в околоядерной области. Таким образом, наши результаты показывают, чго беток RhoA участвует в регуляции подвижности и распределения митохондрий.

Белок ЮюА регулирует распределение митохондрий, действуя через свои белки-мишени.

Поскольку активация ШюА оказалась необходимым и достаточным условием для заякоривания митохондрий на периферии, мы решили проверить, участвуют ли, активируемые им белки, тП1а1 и Шю киназа, в регуляции подвижности митохондрий.

Рис. 4 Экспрессия мутантных конструкций Rho киназы изменяет актиновый цитоскелет Микрофотографии клеток CV-1, экспрессирующих конститутивно активный (А, Б, В) или доминантно негативный (Г, Д Е) мутанты Rho киназы Клетки зафиксированы 4% параформальдегидом Трансфецированные клетки отмечены на рисунке стрелками (А, Г) - фазовый контраст; (Б, Д) -уровень экспрессии мутантных конструкций, выявлянный антителами против с-Мус и FITC-мечеными вторыми антителами; (В, Е) - полимерный актин, выявленный TRITC - фаллоидином Масштаб Юмкм.

Чтобы изменить активность Rho киназы мы экспрессировали в клетках ее

конститутивно активный (ROCK-CAT) и доминантно негативный (ROCK-RB/PH) мутанты (плазмиды любезно предоставлены Др Кото Каибучи (Nagoya University, Нагоя, Япония) Как и следовало ожидать, экспрессия ROCK-CAT индуцировала в клетках образование развитых стресс-фибрилл (рис 4 В), а экспрессия ROCK-RB/PH - приводила к их полному исчезновению (рис 4 Е) При этом картина распределения и подвижность митохондрий в клетках, экспрессирующих данные мутанты, не отличались от таковых в контрольных клетках (таблица 2) То есть ингибирование движения митохондрий, вызываемое LPA через белок RhoA, происходит без участия Rho киназы.

Таблица 2.

Опыт Относительная подвижность митохондрий,% Число клеток (митохондрий)

Контроль 7+/-3 11 (340)

LPA 1.2+/-0.5 9(310)

RhoA-QL 2.1 +/- 1.1 5(100)

ROCK-CAT 6+/-4 6(185)

ROCK-RB/PH 6+/-4 7 (207)

mDial (ДЮ) 0 5 +/- 0 3 10 (303)

mDial (AN3) + СЗ 0 6 +/- 0 4 10(290)

ROCK-RB/PH + mDial(AN3) 0 5 +/- 0 4 8(212)

Данные представлены в виде M±SD

Поскольку оказалось, что Rho кимаза непосредственно не участвует в регу 1Я1ши движения митохондрий, мы решили изучить роль в этом процессе другого возможного участника - белка mDial Для этого мы трансфецировали клегки плазмилой, кодирующей конститутивно активный мутант белка mDial, содержащий домены, отвечающие за полимеризацию актина, но с удаленным RhoA-ГТФ-связывающим регуляторным доменом (плазмида любезно предоставлена др Шу Нарумией (Kyoto University, Киото, Япония). Оказалось, что при экспрессии F.GFP-mDial (AN3) быстрое движение митохондрий полностью подавлялось Относительная подвижность митохондрий была почти в десять раз меньше, чем в контроле, и составляла менее 1% (таблица 2).

Рис. 5 Экспрессия конститутивно активного мутанта белка mDial изменяет картину распределения митохондрий в клетках CV-I Mita. Микрофотография клеток линии СУ-I Mita, трансфицироваиных конструкцией EGFP-mDial(áN)) и зафиксированных 4% параформалъдегидом. А - фазовый контраст Б -флуоресценция на длине волны 510 - 560 нм Масштаб 10 мкм.

Помимо roi о, что в клетках, .жспрессирующих конститутивно активный муганг белка mDial, все митохондрии были неподвижными, сами клетки изменяли свою форму, становились сильно вытянутыми (рис. 5 А). Митохондрии в таких клетках выстраивались вдоль длинной оси клетки (рис. 5 Б).

Поскольку инактивация белка RhoA СЗ-трансферазой приводила к нарушению закрепления митохондрий на периферии клетки, важно было выяснить, будет ли она изменять локализацию и подвижность митохондрий в клетках, экспрессирующих активный мутант белка mDial. Анализ движения митохондрий показал, что инъекция СЗ-трансферазы в клекти, экспрессирующие mDial(AN3), не вызывала увеличения подвижности митохондрий (таблица 2).

А: „ V.

.•Л VvV ' 4

4 л-""

Рис. 6 Инактивация белка RhoA не нарушает заякоривания митохондрий, индуцированного экспрессией конститутивно активного мутанта белка mDial. Микрофотографии клеток CV-1 Mito, экспрессирующих конститутивно активный мутант белка mDial. и инъецированных раствором СЗ трансферты Фотография сделана спустя 2 часа после инъекции А - фазовый контраст. Б - флуоресценция на длине волны 510 - 560 нм Масштаб 10 мкм

Кроме того, в таких клетках не изменялось характерное распределение и форма митохондрий (рис. 6), свидетельствуя о том, что роль белка ЮюА в регуляции этих процессов сводится к активации белка т01а1.

Цитоскелегные структуры, участвующие в заякоривании митохондрий.

Изменение формы клеток, в результате экспрессии активного мутанта белка mDial, было описано ранее в работе из лаборатории Ш. Нарумии на клетках другого типа (Ishizaki et al., 2001). Экспрессия EGFP-mDial(AN3) в клетках Hela также вызывала их удлинение. Такая вытянутая форма клеток была следствием перестроек цитоскелета: актиновые филаменты в них имели вид параллельных пучков и вместе с системой микротрубочек располагались вдоль главной оси

клсгки Мы исследовали циюскслстные стр>к"гуры в трансфицнрованнмх клетках нашей линии CV-I Mito На рис. 7 видно, что подобная реорганизация микротрубочек и актииовых филаментов происходила и в них.

Б

Рис. 7 Экспрессия конститутивно активного мутанта белка mDial изменяет организацию микротрубочек и актиновых филаментов в клетках CV-1 Mita.

Микрофотографии клеток линии CV-1 Mita, трансфицированиых конструкцией EGFP-mDial(AN3) и зафиксированных 4% парафорчачьдегидои Микротрубочки выявлены антителами против С1и-тубучина и FITC-мечеными вторыми антитечами (Л), а полимерный актин ТШТС-фалюидином (Б) Масштаб 10 \ik\i

Поскольку неподвижные митохондрии в клетках, экспрессирующих активный мутант белка mDial, располагались вдоль параллельных пучков актиновых филаментов и микротрубочек, мы предположили, что ингибирование движения митохондрий возникает из-за их взаимодействия с актиновыми филаментами, которое препятствует быстрому движению этих органелл вдоль микротрубочек.

Чтобы выяснить, участвует ли полимерный актин (F- актин) в ингибировании движения митохондрий, мы обрабатывали клетки веществами, которые его разрушают (латранкулин В и цитохапазин D), и анализировали в них движение митохондрий. На рис.8 представлены результаты анализа подвижности митохондрий в клетках, обработанных латранкулином Б Видно, что относительная подвижность митохондрий в отсутствие полимерного актина значительно выше (Р < 0 01) Разборка актина цитохалазином D, также приводила к увеличению подвижности митохондрий в клетках, экспрессирующих mDial (AN3) (данные не приведены).

55

« 16-а

Контроль ЛАтранкч.шнВ mDmlAN mD¡nlAN +

ла1ранк->.1ннВ

Рис. 8. Деполимеризация F-актина латраикулином В приводит к увеличению подвижности митохондрий. Количественный акатз движения митохондрий в контрольных тетках и клетках, жспрессирующих конститутивно активный мутант белка mDial (EGFP-mDial (AN3). обработанных 0 2 - 0 4 мкМ чатранкучина Б в течение 20 мин Дчя опреде ¡ения относите чыюй подвижности митохондрий в каждом опыте было проанализировано минимум 10 клеток (3 независимых эксперимента). Данные представ 1ены в виде М ± SD

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что активация белка mDial ингибирует движение митохондрий за счет увеличения содержания F-актипа в клетках. Чтобы узнать, происходит ли ингибирование подвижности митохондрий актиновыми филаментами в контрольных клетках, мы проанализировали движение митохондрий в клетках CV 1 Mito при разборке в них F-актина. Как и в опытах с клетками, экспрессирующими mDia!(AN3), деполимеризацию актиновых филаментов в контрольных клетках осуществляли латраикулином В. Оказалось, что в этом случае относительная подвижность митохондрий возрастает вдвое (рис. 8). То есть, F-актин в клетках препятствует движению митохондрий.

Полимеризация актина, сгпмутрм-мая независимыми от шРш! способами, не приводит к заякориваиию митохондрий.

Увеличение содержания Р-актина в клетках могло препятствовать движению митохондрий, во-первых, в результате простого увеличения вязкости цитоплазмы, во-вторых, причиной такою замедления мо! ти быть специфические взаимодействия митохондрий и микрофиламентов, например, при участии моторных белков, связанных с актиновыми микрофиламентами, или других белков на поверхности митохондрий, способных связываться с Р-актином Чтобы проверить предположение, о том, что митохондрии тормозятся вследствие увеличения плотности актинового геля, мы исг.очьзовали несколько способов повышения содержания полимерного актина в клетках.

Рис. 9. Экспрессия WA и джасплакинолид увеличивают содержание F-актина в клетках. Микрофотографии клеток линии CV-1 Mita, жспрессирующих конститутивно активный мутант белка N-WASP (А), или обработанных 0.2 мкМ джасплакино.чида в течение 30 мин Клетки зафиксированы 4% параформальдегидом Полимерный актин выявлен TRITC-фаллоидином Клетка, экспрессирующая EGFP-WA, отмечена на рисунке стрелкой Масштаб 10;,ik.ii

Во-первых, мы увеличивали уроь нь содержания F-актина, добавляя в среду к клеткам джасплакинолид, пептид, чы-. .енный m морской губки Jaspis johnstoni, который стабилизирует фибриллярный ..ктин и стимулирует его полимеризацию (Bubb et al , 1994) Во-вторых, мы i.!« ,v 'чровали полимеризацию актина, путем активации эндогенного Агр2/3 комплекса, который, как было показано ранее, стимулирует полимеризацию новых актиновых филаментов (Pollard et al., 2000; Evangelista et al., 2003). Для этого мы эк'пресгиповали С-концевой домен WA белка N-WASP (Wiskott -Aldrich Syndrome Protein) (плашида любезно предоставлена Др Михаэлем Уэем (Cáncer Research UK., JIiwoii, Великобритания), который дейчвуег как конститутивно активный стимулятор Агр?/3 комплекса (Yamaguchi et al, 2000; Moreau et al., 2000; Harlander et al., 2003)

В обоих слччаях уровень полимерною актина в клетках существенно возрастал (рис 9) Олнако. ни обработка клеток лжасмлакинолидом, ни экспрессия в них и'А не уменьшали относительную подвижность митохондрий (рис 10).

Контроль m Dial AN Джасп.щкиио.шл WA Cdc42-QL Racl-QL

Рис. 10 Индукция F-актина, вызываемая только конститутивно активным мутантом белка mDial, приводит к снижению подвижности митохондрий. Количественный анализ движения митохондрий в клетках экспрессирующих конститутивно активный мутант белка mDiaJ (EGFP-mDial, (ЛИЗ), конститутивно активный мутант белка Cdc42 (F.GFP-Cdc42 (Q61L), конститутивно активный мутант белка Racl (EGFP-Racl (Q61L); конститутивно активный мутант белка N-WASP (EGFP-WA) и в клетках, обработанных джаепчакинопидом В каждом опыте было проанализировано по 10 клеток (3 независимых эксперимента) Данные представлены в виде М ± SD. Различие в относительной подвижности митохондрий в клетках, экспрессирующих EGFP-mDial(¿¡N3), со всеми остальными представленными опытами достоверно с Р<001.

Мы также проверили, как влияет на подвижность митохондрий экспрессия двух других белков, участвующих в регуляции актинового цитоскелета, малых ГТФаз Racl и Cdc42. Конститутивно активные мутанты этих белков активировали полимеризацию актина и образование ламеллиподий и филоподий, соответственно, как было показано ранее (Ridley et al., 1992). Однако, митохондрии в клетках, экспрессируюших Racl-(Q61L) и Cdc42-(Q61L), были даже более подвижны, чем в контроле (рис. 10).

Таблиц» 3.

Контроль Латранкулнн В тОЫДМ пШ|а1ДК + Латранкулин В

Доля неподвижных мнтохондрий* 67% ± 20%" 45% ± 27%" 99% ± 1%*" 45% ± 21%*" 65% ± 14%

Доля времени в движении отдельных митохондрий* 10%* 4% 16% ±7% — 12% ±2% 8%±3%

Средняя скорость во время движения, мкм/с* 0 29 ±0 01 0 32 ± 0 01 — 033 ±001 0 28 ± 001

Число клеток (митохондрий) 15(410) 13 (388) 10(250) 9(303) 10(280)

* Определение этих характеристик движения митохондрий приведено в

части «Методы исследования» данного реферата Данные представлены в виде М

** Различие достоверно с Р < О ЭЬ.

*** Различие достоверно с Р < 0 01.

Таким образом, наши данные свидетельствуют в пользу того, что активация ш01а1, а не других стимулирующих полимеризацию актина белков, способствует закреплению митохондрий на периферии клеток. Поэтому, предположение о том, что причиной снижения подвижности митохондрий является увеличение вязкости цитоплазмы вследствие повышенного содержания Р-актина, скорее всего не верно. В пользу специфических взаимодействий между митохондриями и Р-актиноч, говорит тот факт, что при разборке Р-актина средняя скорость движения митохондрий практически не меняется (таблица 3). В то же время значительно уменьшается доля стационарных митохондрий, то есть тех митохондрий, которые бьши неподвижными в течение всего времени наблюдения (таблица 3).

Заключение.

Имеющиеся к настоящему времени данные указывают на то, что распределение митохондрий может контролироваться на уровне регуляции активности моторных белков (Morris and Hollenbeck, 1995; De Vos et al., 2000; De Vos et al, 2003), а также на уровне регуляции переключения между подвижным состоянием и стационарным состоянием (Morris and Hollenbeck, 1993; Leterrier et al., 1994; Wagner et al., 2003; Chada and Hollenbeck, 2003; Chada and Hollenbeck, 2004). В настоящей работе мы показали, что переход митохондрий из подвижного состояния в стационарное регулируется ростовым фактором LPA. Было показано, что за передачу сигнала от рецептора LPA отвечает регуляторный каскад, включающий малую ГТФ-азу RhoA и активируемый ею белок mDial. Последний относится к семейству формииов и в активированном состоянии стимулирует образование F-актина, который специфически взаимодействует с митохондриями и ингибирует их движение по микротрубочкам.

LPA, связываясь с рецепторами на поверхности клеток запускает ряд сигнальных каскадов, вызывающих, в том числе, образование актиновых стресс-фибрилл и их сокращение (Ridley and Hall, 1992; Hall, 1994) В наших опытах неподвижные, вследствие действия LPA, митохондрии локализовались в области новообразованных стрссс-фнбрллл Можно предположив, чго близость митохондрий к сократительным пучкам выгодна клетке, поскольку образование пучков F-актина и миозин-зависимое сокращение требуют интенсивного расхода энергии в виде АТФ. Таким образом, перераспределение митохондрий может объясняться локальным изменением в потребности АТФ, что было показано ранее в работах из лаборатории П. Холленбека (Moms and Hollenbeck, 1993). Известно, что в клетках разных типов митохондрии, находящиеся на периферии и взаимодействующие с цитоскелетом, имеют более высокий трансмембранный потенциал, чем те, которые локализуются в околоядерной области (Collins et al., 2002). А в культивируемых нейронах митохондрии с высоким трансмембранным потенциалом (высокоэнергизованные митохондрии) локализуются в основном в дендритах, а не в аксоне, и подвижность их в дендритах также существенно меньше (Overly et al 1996) Можно предположить, что существует связь между подвижным состоянием митохондрий и их трансмембранным потенциалом.

Наши результаты отчетливо свидетельствуют в пользу того, что основную роль в удерживании митохондрий в неподвижном состоянии играют актиновые чикрофиламенты. Разборка F-актина при добавлении латранкулина H приводила к повышению подвижности митохондрий в клетках. Интересно, что митохондрии

переходили в стационарное состояние только при увеличении содержания F-актина, образующегося вследствие активации белка mDial Подавление подвижности митохондрий не наблюдалось при активации других белков, стимулирующих полимеризацию актина (N-WASP, Cdc42, Racl), а также при стабилизации полимерного актина джасплакинолидом Эти результаты исключают предположение о том, что ингибирование подвижности митохондрий является следствием возросшей вязкости цитоплазмы, вызванной избыточным содержанием актиновых филаментов.

В пользу специфических взаимодействий между митохондриями и F-актином, говорит тот факт, что при разборке F-актина средняя скорость движения митохондрий практически не меняется (таблица 3). В то же время значительно уменьшается доля стационарных митохондрий, то есть тех митохондрий, которые остаются неподвижными в течение всего времени наблюдения.

Регуляция распределения митохондрий другим ростовым фактором была показана ранее (Chada and Hollenbeck, 2003). Локальная стимуляция аксона NGF (нервным ростовым фактором) приводила к тому, что митохондрии скапливались в местах стимуляции и переставали двигаться Этот процесс зависел от активносга фосфоинозитол- 3-киназы (PI-3-киназы), одного из компонентов сигнальной цепи, запускаемой ак1ивацисй NOF ренеторов Ишибирование PI -3-киназы полностью подавляло эффект иммобилизации митохондрий, вызванный NGF. Неподвижное состояние большинства митохондрий также нарушалось после деполимеризации F-актина латранкулином В, свидетельствуя о том, что, как и в нашем случае с LP А, полимерный актин необходим для удерживания митохондрий в стационарном состоянии. Поскольку PI-3-киназа способна активировать малые ГТФазы Racl и RhoA (Arrieumerlou et al., 1998; Reifet al., 1996), можно предположить, что NGF активирует PI-3-киназу, которая затем актиьирует малую ГТФазу RhoA, а белок RhoA, в свою очередь, стимулирует mDial-зависимую полимеризацию актиновых микрофиламентов, препятствующих транспорту митохондрий.

Выводы

1. Найден новый регулятор подвижности митохондрий - лизофосфатидиая кислота (LPA), который ингибирует их движение по микротрубочкам.

2. Выявлено участие регуляторных белков, малой ГТФазы RhoA и ее белка-мишени mDial, в передаче сигнала LPA, который приводит к подавлению движения митохондрий.

3. Показано, что ингибиторное действие белка mDial на движение митохондрий строго зависит от его способности стимулировать полимеризацию актина, связывающего митохондрии.

4. Движение митохондрий ингибируется при их взаимодействии с полимерным актином, который образуется только под действием mDial, а не других индукторов.

Список опубликованных статей по теме диссертации

1. A.B. Кулик, Ф.К. Гиоева, А.А Минин. Видеомикроскопичсское исследование движения митохондрий //Онтогенез. 2002. Т. 33. №5. С. 366-373.

2. A.A. Минин и A.B. Кулик. Внутриклеточный транспорт. Принципы регуляции // Успехи биологической химии. 2004. Т. 44. С. 171-208.

3. O.E. Некрасова, Ан.А. Минин, A.B. Кулик, A.A. Минин Регуляция фибронекгином формы и внутриклеточного распределения митохондрий // Биологические мембраны. 2005. Т. 22. № 1. С. 58-65

4. A.B. Кулик, O.E. Некрасова, A.A. Минин. Фибриллярный актин регулирует подвижность митохондрий. // Биологические мембраны. 2006. Т. 23. № 1. С. 52-59.

Работа выполнена при поддержке Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF, грант RBI-2506-PU-03 А А М) и программой Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология"

Кулик А чексамдр Валентинович

РЕФЛЯЦИЯТРАНСПОРТА МИЮХОНДРИИ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Подписано в печать 01 02 06 Формат 60 х 84 '/,* Печать офсстна* Уем ис< п 10 Уч-тд л 1.0 I ирзж 70 ук I Зака» N° ф-016

1 ос\дарствен!»ос образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский физико-тсчнкчсский ИНСТИ1УТ (государственный университет) Отдел автоматизированных систем "ФИ31КХ-ПОЛИ1 1'ДФ' 141700, Моек обл. г ДоичшрулмыЙ, Инстит)тскиЙ пер. 9

1006А

з^аь

• - 34 8 3

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Кулик, Александр Валентинович

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Распределение и функции митохондрий в клетке.

1.2. Цитоскелет, как средство внутриклеточного транспорта.

1.2.1. Особенности системы микротрубочек.

1.2.2. Особенности актинового цитоскелета.

1.2.2.1. Полимеризация новых актиновых микрофиламентов. Агр2/3-комплекс.

1.2.2.2. Роль белков форминового семейства в организации актинового цитоскелета.

1.2.3. Регуляция внутриклеточной организации микротрубочек и актинового цитоскелета.

1.2.4. Участие двух цитоскелетных систем в транспорте митохондрий.

1.3. Молекулярные моторы, участвующие в движении митохондрий.

1.4. Регуляция распределения митохондрий как процесс переключения между стационарным и подвижным состояниями.

1.5. Видеомикроскопические подходы к наблюдению митохондрий в живых клетках.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Культивирование клеток.

2.2. Флуоресцентная микроскопия.

2.2.1. Фиксация клеток.

2.2.2. Процедура иммунофлуоресцентного окрашивания.

2.2.3. Антитела, используемые в работе.

2.2.4. Окрашивание актина.

2.3. ДНК конструкции.

2.4. Трансфекция клеток.

2.5. Микроинъекция.

2.5.1. Микроинъекция кДНК.

2.5.2. Микроинъекция белка.

2.6. Получение видеомикроскопических данных.

2.7. Обработка данных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Наблюдение митохондрий в живых клетках.

3.2. Определение подвижности митохондрий клетках.

3.3. Подвижность митохондрий находится под контролем внешних факторов.

3.4. Лизофосфатидная кислота ингибирует подвижность митохондрий через белок RhoA.

3.5. Белок RhoA регулирует распределение митохондрий, действуя через свои белки-мишени.

3.5.1. Изменение активности Rho киназы не влияет на подвижность митохондрий.

3.5.2. Белок mDial играет ключевую роль в регуляции транспорта митохондрий.

3.6. Роль F-актина в ингибировании движения митохондрий

3.7. Полимеризация актина, стимулируемая независимыми от mDial способами, не снижает подвижность митохондрий.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция транспорта митохондрий в клетках млекопитающих"

Митохондрии играют важнейшую роль в физиологии клетки. Они обеспечивают клетку энергией в форме молекул АТФ, участвуют в регуляции концентрации ионов кальция в цитоплазме, а также являются важнейшим звеном в процессе программируемой клеточной гибели. Для нормального функционирования митохондрий важное значение имеет их внутриклеточное распределение: во многих клетках митохондрии локализуются вблизи мест высокого потребления энергии или повышенной концентрации кальция. Локализация митохондрий находится под контролем внешних и внутренних факторов и достигается при помощи транспорта этих органелл вдоль микротрубочек и актиновых филаментов моторными белками. Чтобы работа различных моторных белков в клетках была скоординирована, необходимо наличие четкой системы их регуляции. Регуляция распределения митохондрий может происходить как на стадии собственно транспорта, в результате изменения активности моторных белков и организации микротрубочек и актиновых филаментов, так и при посредством регуляции взаимодействий митохондрий с неподвижными цитоскелетными структурами.

В отличие от других органелл, митохондрии большую часть времени проводят в неподвижном состоянии. Вопрос о том, какие именно белки участвуют в непосредственном удерживании митохондрий в неподвижном состоянии, в настоящее время остается открытым. Накапливается все больше данных, свидетельствующих о наличии стационарных взаимодействий между митохондриями и элементами цитоскелета. Тем не менее, сигнальные пути, лежащие в основе регуляции переключения между стационарным и подвижным состоянием митохондрий, еще не определены.

Мы обнаружили, что в клетках CV-1 митохондрии переходят из подвижного состояния в стационарное в ответ на добавление одного из основных факторов роста, лизофосфатидной кислоты (LPА). Связываясь с рецепторами на поверхности клеток, LPA вызывает такие изменения в клетках, как образование актиновых стресс-фибрилл, созревание фокальных контактов и стабилизацию микротрубочек в направлении движения клетки.

Целью настоящей работы было установить механизмы передачи сигнала LPA, контролирующего подвижность митохондрий, и определить участников этой передачи.

Мы показали, что за подвижность митохондрий отвечает регуляторный сигнальный каскад, включающий белок RhoA и активируемый им белок mDial. LPA, связываясь с клеточными рецепторами, стимулирует активацию малой ГТФ-азы RhoA, которая затем активирует белок mDial, относящийся к семейству форминов. Активный белок mDial стимулирует полимеризацию актина, и образующиеся структуры актинового цитоскелета взаимодействуют с митохондриями, которые в результате переходят в стационарное состояние.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Кулик, Александр Валентинович

ВЫВОДЫ.

1. Найден новый регулятор подвижности митохондрий лизофосфатидная кислота (LPА), который ингибирует их движение по микротрубочкам.

2. Выявлено участие регуляторных белков, малой ГТФазы RhoA и ее белка-мишени mDial, в передаче сигнала LPA, который приводит к подавлению движения митохондрий.

3. Показано, что ингибиторное действие белка mDial на движение митохондрий строго зависит от его способности стимулировать полимеризацию актина, связывающего митохондрии.

4. Движение митохондрий ингибируется при их взаимодействии с полимерным актином, который образуется только под действием mDial, а не других индукторов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Кулик, Александр Валентинович, Москва

1. Alberts A.S. (2001). Identification of a carboxyl-terminal diaphanous-related formin homology protein autoregulatory domain. J Biol Chem 276, 2824-2830.

2. Allen R.D., Metuzals J., Tasaki I., Brady S.T., Gilbert S.P. (1982). Fast axonal transport in squid giant axon. Science 218, 1127-1129

3. Amano M., Chihara K., Kimura K., Fukata Y., Nakamura N., Matsuura Y., Kaibuchi K. (1997). Formation of actin stress fibers and focal adhesions enhanced by Rho-kinase. Science 75, 1308-1311.

4. Andersen S.S. (2000). Spindle assembly and the art of regulating microtubule dynamics by MAPs and stathmin/Opl8. Trends Cell Biol. 10, 261-267.

5. Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. (1993). Cytoplasmic dynein-dependent vesicular transport from early to late endosomes. J. Cell Biol., 123, 1373-1387.

6. Arrieumerlou C., Donnadieu E., Brennan P., Keryer G., Bismuth G., Cantrell D., Trautmann A. (1998). Involvement of phosphoinositide 3-kinase and Rac in membrane ruffling induced by IL-2 in T cells. Eur J Immunol 28, 1877-1885.

7. Barkalow K., Hamasaki Т., Satir P. (1994). Regulation of 22S dynein by a 29kD light chain. J Cell Biol 126, 727-735

8. Baumann O, Murphy D.B. (1995). Microtubule-associated movement of mitochondria and small particles in Acanthamoeba castellanii. Cell Motil Cytoskeleton. 32 (4): 305-17.

9. Bereiter-Hahn J. (1976 ). Dimethylaminostyrylmethylpyridiniumiodine (daspmi) as a fluorescent probe for mitochondria in situ. Biochim Biophys Acta. Jan 15; 423(1): 1-14.

10. Berg J.S., Powell B.C., Cheney R.E. (2001). A millennial myosin census. Mol Biol Cell Apr 12:4 780-94

11. Bradley T.J., Satir P. (1979). Evidence of microfilament-associated mitochondrial movement. J Supramol Struct. 12(2): 165-75.

12. Brady S.T., Lasek R.J., Allen R.D. (1982). Fast axonal transport in extruded axoplasm from squid giant axon. Science 218, 1129-1131

13. Brenner C, Kroemer G. (2000). Apoptosis. Mitochondria—the death signal integrators. Science. Aug 18; 289(5482): 1150-1.

14. Bubb M.R., Senderowicz A.M.J., Sausville E.A., Duncan K.L.K., Korn E.D. (1994). Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. J. Biol. Chem. 269, 14869-14871

15. Cambray-Deakin M.A., Robson S.J., Burgoyne R.D. (1988). Colocalisation of acetylated microtubules, glial filaments, and mitochondria in astrocytes in vitro. Cell Motil Cytoskeleton. 10(3): 438-49.

16. Carlier M.F. and Pantaloni D. (1997). Control of actin dynamics in cell motility. J. Mol. Biol. 269, 459-467.

17. Castrillon D.H. and Wasserman S.A. (1994). Diaphanous is required for cytokinesis in Drosophila and shares domains of similarity with the productsof the limb deformity gene. Development 120, 3367-3377.

18. Chada S.R. and Hollenbeck P.J. (2003). Mitochondrial movement and positioning in axons: the role of growth factor signaling. J Exp Biol 206, 19851992.

19. Chada S.R. and Hollenbeck P.J. (2004). Nerve Growth Factor Signaling Regulates Motility and Docking of Axonal Mitochondria. Current Biol. 14, 1272-1276.

20. Chang F., Drubin D., Nurse P. (1997). cdcl2p, a protein required for cytokinesis in fission yeast, is a component of the cell division ring and interacts with profilin. J. Cell Biol. 137, 169-182.

21. Chilcote T.J. and Johnson K.A. (1990). Phosphorylation of Tetrahymena 22 S dynein. J Biol Chem 265, 17257-17266

22. Collins T.J., Berridge M.J., Lipp P., Bootman M.D. (2002). Mitochondria are morphologically and functionally heterogenous within cells. EMBO J., 21, 16161627.

23. Cook T.A., Nagasaki Т., Gundersen G.G. (1998). Rho guanosine triphosphatase mediated the selective stabilization of microtubules induced by lysophosphatidic acid. J Cell Biol, 141:175-185.

24. Copeland J.W. and Treisman R. (2002). The Diaphanous-related formin mDial controls serum response factor activity through its effects on actin polymerization. Mol. Biol. Cell 13, 4088-4099.

25. Corthesy-Theulaz I., Pauloin A., Pfeffer S.R. (1992). Cytoplasmicdynein participates in the centrosomal localization of the Golgi complex. J. Cell Biol., 118, 1333-1345.

26. Cossarizza A., Salvioli S. (2001). Analysis of mitochondria during cell death. Methods Cell Biol. 63: 467-86

27. Csordas G., Thomas A.P., Hajnoczky G. (1999). Quasi-synaptic calcium signal transmission between endoplasmic reticulum and mitochondria. EMBOJ. 18:96-108.

28. De Vos K.J., Sable J., Miller K.E., Sheetz M.P. (2003). Expression of phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate-specific pleckstrin homology domains alters direction but not the level of axonal transport of mitochondria. Mol. Biol. Cell 14, 3636-3649.

29. De Vos K., Severin F., Van Herreweghe F., Vancompernolle K., Goossens V., Hyman A., Grooten J. (2000). Tumor necrosis factor receptor induces hyperphosphorylation of kinesin light chain and inhibits transport of mitochondria. J.Cell.Biol. 149:1207-1214.

30. De Zwaan T.M., Ellingson E., Pellman D., Roof D.M. (1997). Kinesin-related KIP3 of Saccharomyces cerevisiae is required for a distinct step in nuclear migration. J Cell Biol. Sep 8;138(5):1023-40.

31. Del Pozo M.A., Alderson N.B., Kiosses W.B., Chiang H.H., Anderson R.G., Schwartz M.A. (2004). Integrins regulate rac targeting by internalization of membrane domains. Science 303, 839-842.

32. Desagher S., Martinou J.C. (2000). Mitochondria as the central control point of apoptosis. Trends Cell Biol. Sep;10(9):369-77. Review.

33. Dillman J.F. and Pfister K.K. (1994). Differential phosphorylation in vivo of cytoplasmic dynein associated with anterogradely moving organelles. J Cell Biol 127, 1671-1681.

34. Elluru R.G., Bloom G.S., Brady S.T. (1995). Fast axonal transport of kinesin in the rat visual system: functionality of kinesin heavy chain isoforms. Mol Biol Cell. 1995 Jan;6(l):21-40. Erratum in: Mol Biol Cell Sep; 6(9): 1261.

35. Etienne-Manneville S. and Hall A. (2001). Integrin-mediated activation of Cdc42 controls cell polarity in migrating astrocytes through PKCzeta. Cell 106, 489-498.

36. Etienne-Manneville S. and Hall A. (2002 ) Rho GTPases in cell biology. Nature. Dec 12;420(6916):629-35. Review.

37. Evangelista M., Blundell K., Longtine M.S., Chow C.J., Adames N.,

38. Pringle J.R., Peter M., Boone C. (1997). Bnilp, a yeast forminlinking cdc42p and the actin cytoskeleton during polarized morphogenesis.1. Science 276, 118-122.

39. Evangelista M., Pruyne D., Amberg D.C., Boone C., Bretscher A. (2002). Formins direct Arp2/3-independent actin filament assembly to polarize cell growth in yeast. Nat. Cell Biol. 4, 32-41.

40. Evangelista M., Zigmond S., Boone C. (2003). Formins: signaling effectors for assembly and polarization of actin filaments. J Cell Sci. Jul 1; 116(Pt 13): 260311. Review.

41. Evans L.L. and Bridgman P.C. (1995). Particles move along actin filament bundles in nerve growth cones. Proc Natl Acad Sci USA 92, 10954-10958.

42. Fath K.R., Trimbur G.M., Burgess D.R. (1994). Molecularmotors are differentially distributed on Golgi membranes from polarizedepithelial cells. J. Cell Biol., 126, 661-675.

43. Fernandez-Borja M., Janssen L., Verwoerd D., Hordijk P., Neefjes J. (2005) RhoB regulates endosome transport by promoting actin assembly on endosomal membranes through Dial. J Cell Sci. Jun 15; 118(Pt 12):2661-70.

44. Forman D.S., Lynch K.J., Smith R.S. (1987). Organelle dynamics in lobster axons: anterograde, retrograde and stationary mitochondria. Brain Res 412, 96106.

45. Gasman S., Kalaidzidis Y., Zerial M. (2003). RhoD regulates endosome dynamics through Diaphanous-related Formin and Src tyrosine kinase. Nat Cell Biol. Mar; 5(3): 195-204. Erratum in: Nat Cell Biol. Jul; 5(7): 680.

46. Goldstein L.S. (2001). Kinesin molecular motors: transport pathways, receptors, and human disease. Proc Natl Acad Sci USA. Jun 19; 98(13): 6999-7003. Review.

47. Goldstein L.S. and Gunawardena S. (2000). Flying through the drosophila cytoskeletal genome. J. Cell Biol. 150, F63-68.

48. Hall A. (1998). Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science. 279:509-514.

49. Harlander R.S., Way M., Ren Q., Howe D., Grieshaber S.S., Heinzen R.A. (2003). Effects of ectopically expressed neuronal Wiskott-Aldrich syndrome protein domains on Rickettsia rickettsii actin-based motility. Infect Immun. V. 71(3). P. 1551-6.

50. Higgs H.N. and Pollard T.D. (2001). Regulation of actin filament network formation through Arp2/3 complex: activation by a diverse array of proteins. Annu. Rev. Biochem. 70, 649-676

51. Hirokawa N., Sato-Yoshitake R., Yoshida Т., Kawashima T. (1990). Brain dynein (MAP 1С) localizes on both anterogradely and retrogradely transported membranous organelles in vivo. J Cell Biol. Sep; 111(3): 1027-37.

52. Hirokawa N. (1998). Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science 279, 519-526.

53. Holleran E.A., Tokito M.K., Karki S., Holzbaur E.L.F. (1996). Centractin (ARP1) associates with spectrin revealing a potential mechanism to link dynactin to intracellular organelles. J. Cell Biol., 135, 1815-1829.

54. Holzbaur E.L., Vallee RB. (1994). DYNEINS: molecular structure and cellular function. Annu Rev Cell Biol. 10: 339-72. Review.

55. Hotani H., Horio T. (1988). Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: treadmilling and dynamic instability. Cell Motil Cytoskeleton 10:12 229-36.

56. Johnson L.V., Walsh M.L., Chen L.B. (1980) "Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123." Proc Natl Acad Sci USA 77, 990-994 PN774.

57. Kelleher J.F., Atkinson S.J., Pollard T.D. (1995). Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. J Cell Biol, 131: 385-397.

58. Kimura K., Ito M., Amano M., Chihara K., Fukata Y., Nakafuku M., Yamamori В., Feng J., Nakano Т., Okawa K., Iwamatsu A., Kaibuchi K. (1996). Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science 273,245-248.

59. Z., Okamoto K., Hayashi Y., Sheng M. (2004). The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. Dec 17;119(6):873-87.

60. Matthies H.J.G., Miller R.J., Palfrey H.C. (1993). Calmodulin binding to and cAMPdependent phosphorylation of kinesin light chains modulate kinesin ATPase activity. J Biol Chem 268, 11176-11187.

61. Mcllvain J.M., Burkhardt J.K., HammAlvarez S., Argon Y., Sheetz M.P. (1994). Regulation of kinesin activity by phosphorylation of kinesinassociated proteins. J Biol Chem 269, 19176-19182.

62. Miki H., Miura K., Takenawa T. (1996). N-WASP, a novel actindepolymerizing protein, regulates the cortical cytoskeletal rearrangementin a PIP2-dependent manner downstream of tyrosine kinases. EMBO J. 15, 5326-5335.

63. Miki H., Sasaki Т., Takai Y., Takenawa T. (1998). Induction of filopodium formation by a WASP-related actin-depolymerizing protein N-WASP. Nature 391,93-96.

64. Miller K.E., Sheetz M.P. (2004). Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. Jun 1; 117(Pt 13):2791-804. Epub 2004 May 18.

65. Moreau V., Frischknecht F., Reckmann I., Vincentelli R., Rabut G., Stewart D., Way M. (2000). A complex of N-WASP and WIP integrates signalling cascades that lead to actin polymerization. Nature Cell Biol. 2, 441-448.

66. Morris R.L. and Hollenbeck P.J. (1993). The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J Cell Sci 104, 917-927.

67. Morris R.L. and Hollenbeck P.J. (1995). Axonal transport of mitochondria along microtubules and Factin in living vertebrate neurons. J Cell Biol 131, 13151326.

68. Mull ins R.D., Heuser J. A., Pollard T.D. (1998). The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation high affinity pointed end capping and formation of branching networks of filaments. Proc Natl Acad Sci USA, 95:6181-6186.

69. Nangaku M., Sato-Yoshitake R., Okada Y., Noda Y., Takemura R., Yamazaki H., Hirokawa N. (1994). KIF1B, a novel microtubule plus end-directed monomeric motor protein for transport of mitochondria. Cell. 79: 1209-1220.

70. Narumiya S. (1996). The small GTPase Rho: cellular functions and signal transduction. J Biochem (Tokyo). Aug 120:2 215-28.

71. Nobes C.D., Hall A. (1995). Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia. Cell 81, 53.

72. Oda H., Stockert R.J., Collins C., Wang H., Novikoff P.M., Satir P., Wolkoff A.W. (1995). Interaction of the microtubule cytoskeleton with endocytic vesicles and cytoplasmic dynein in cultured rat hepatocytes. J. Biol. Chem., 270, 1524215249.

73. Overly C.C., Rieff H.I., Hollenbeck P.J. (1996). Organelle motility and metabolism in axons vs dendrites of cultured hippocampal neurons. J Cell Sci 109: 971-980.

74. Pacher P. and Hajnoczky G. (2001). Propagation of the apoptotic signal by mitochondrial waves. EMBO J. 20:4107-4121.

75. Palazzo A.F., Cook T.A., Alberts A.S., Gundersen G.G. (2001). mDia mediates Rho-regulated formation and orientation of stable microtubules. Nat Cell Biol 3, 723-729.

76. Palazzo A.F., Eng C.H., Schlaepfer D.D., Marcantonio E.E., Gundersen G.G. (2004). Localized Stabilization of Microtubules by Integrin- and FAK-Facilitated Rho Signaling. Science 303, 836-839.

77. Paterson H.F., Self A. J., Garrett M. D., Just I., Aktories K., Hall, A. (1990). Microinjection of recombinant p21rho induces rapid changes in cell morphology. J. Cell Biol. 111, 1001-1007.

78. Pollard T.D. and Beltzner C.C. (2002). Structure and function of the Arp2/3 complex. Curr. Opin. Struct. Biol. 12, 768-774.

79. Pollard T.D. Blanchoin L., Mullins R.D. (2000). Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29, 545-576.

80. Poot M., Zhang Y.Z., Kramer J.A., Wells K.S., Jones L.J., Hanzel D.K., Lugade A.G., Singer V.L., Haugland R.P. (1996). Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem. Dec;44(12): 1363-72.

81. Provance D.W. Jr., Wei M., Ipe V., Mercer J.A. (1996). Cultured melanocytes from dilute mutant mice exhibit dendritic morphology and altered melanosome distribution. Proc Natl Acad Sci USA. Dec 10; 93(25): 14554-8.

82. Pruyne D., Evangelista M., Yang C., Bi E., Zigmond S., Bretscher A., Boone C. (2002). Role of formins in actin assembly: nucleation and barbed-end association. Science 297, 612-615.

83. Reif K., Nobes C.D., Thomas G., Hall A., Cantrell D.A. (1996). Phosphatidylinositol 3-kinase signals activate a selective subset of Rac/Rho-dependent effector pathways. Curr Biol 6, 1445-1455.

84. Reilein A.R., Rogers S.L., Tuma M.C., Gelfand V.I. (2001). Regulation of molecular motor proteins. Int Rev Cytol. 204: 179-238. Review.

85. Ridley A.J. (1996). Rho: theme and variations. Curr. Biol. 10:1256-1264.

86. Ridley A.J. (1999). Stress fibres take shape. Nat. Cell Biol. 1, E64-E66.

87. Ridley A.J. and Hall A. (1992). The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibres in response to growth factors. Cell 70, 389-399.

88. Ridley A.J., Paterson H.F., Johnston C.L., Diekmann D., Hall A. (1992). The small GTP-binding protein Rac regulates growth factor-induced membrane ruffling. Cell. 70: 401-410.

89. Rizzuto R., Brini M., Murgia M., Pozzan T. (1993). Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. Oct 29; 262 (5134): 744-7.

90. Rizzuto R., Brini M., Pizzo P., Murgia M., Pozzan T. (1995). Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr. Biol. 5, 635-642.

91. Rizzuto R., Pinton P., Carrington W., Fay F.S., Fogarty K.E., Lifshitz L.M., Tuft R.A., Pozzan T. (1998). Close contacts with the endoplasmic1. J ireticulum as determinants of mitochondrial Ca responses. Science. 280: 1763-1766.

92. Rogers S.L, Gelfand V.I. (1998). Myosin cooperates with microtubule motors during organelle transport in melanophores. Curr. Biol. 8:161-64

93. Rogers S.L., Karcher R.L., Roland J.T., Minin A.A., Steffen W., Gelfand V.I. (1999). Regulation of melanosome movement in the cell cycle by reversible association with myosin V. J Cell Biol. Sep 20; 146(6): 1265-76.

94. Rohatgi R., Ma L., Miki H., Lopez M., Kirchhausen Т., Takenawa Т., Kirschner M.W. (1999). The interaction between N-WASP and the Arp2/3 complex links Cdc42-dependent signals to actin assembly. Cell. Apr 16;97(2):221-31

95. Sagot I., Klee S.K., Pellman D. (2002). Yeast formins regulate cell polarity by controlling the assembly of actin cables. Nat. Cell Biol. 4, 42

96. SatoYoshitake R., Yorifuji H., Inagaki M., Hirokawa N. (1992). The phosphorylation of kinesin regulates its binding to synaptic vesicles. J Biol Chem 267, 23930-23936.

97. Schmidt A., Hall A. (2002). Guanine nucleotide exchange factors for Rho GTPases: turning on the switch. Genes Dev. Jul 1; 16(13): 1587-609. Review.

98. Schroer T.A. (1994). Structure, function and regulation of cytoplasmic dynein. Curr Opin Cell Biol. Feb; 6(1): 69-73. Review.

99. Schulze E. and Kirschner M. (1988). New features of microtubule behavior observed in vivo. Nature 334: 356-359.

100. Sheetz M.P. and Spudich J.A. (1983). Movement of myosin-coated fluorescent beads on actin cables in vitro. Nature. May 5-11; 303 (5912): 31-5.

101. Small J.V. (1988). The actin cytoskeleton. Electron Microsc. Rev. 1: 155-174.

102. Small, J.V., Rottner, K., Kaverina, I. 1999. Functional design in the actin cytoskeleton. Curr. Opin. Cell Biol. 11: 54-60.

103. Stebbings H., Hunt C. (1987). The translocation of mitochondria along insect ovarian microtubules from isolated nutritive tubes: a simple reactivated model. J Cell Sci. Dec; 88 (Pt 5): 641-8.

104. Stowers R.S., Megeath L.J., Gorska-Andrzejak J., Meinertzhagen I.A., Schwarz T.L. (2002). Axonal transport of mitochondria to synapses depends on milton, a novel Drosophila protein. Neuron. Dec 19; 36 (6): 1063-77.

105. Svitkina T.M., Verkhovsky A.B., Borisy G.G. (1995). Improved procedures for electron microscopic visualization of the cytoskeleton of cultured cells. J Struct Biol. 115:290-303.

106. Takenaka Т., Kawakami Т., Hikawa N., Gotoh H. ((1990). "Axoplasmic transport of mitochondria in cultured dorsal root ganglion cells." Brain Res 528, 285-290 PN11071.

107. Tanaka Y., Kanai Y., Okada Y., Nonaka S., Takeda S., Harada A., Hirokawa N. (1998). Targeted disruption of mouse conventional kinesin heavy chain, kif5B, results in abnormal perinuclear clustering of mitochondria. Cell 93: 1147-1158.

108. Trinczek В., Ebneth A., Mandelkow E.M., Mandelkow E. (1999). Tau regulates the attachment/detachment but not the speed of motors in microtubule-dependent transport of single vesicles and organelles. J Cell Sci. Jul 112 (Pt 14): 2355-67.

109. Vale R.D., Reese T.S., Sheetz M.P. (1985). Identification of a novel force-generating protein, kinesin, involved in microtubule-based motility. Cell. Aug; 42(1): 39-50.

110. Van Blerkom J. (1991). Microtubule mediation of cytoplasmic and nuclear maturation during the early stages of resumed mitosis in cultured mouse oocytes. Proc Natl Acad Sci USA 88, 5031-5035.

111. Van Aelst L., D'Souza-Schorey C. (1997). Rho GTPases and signaling networks. Genes Dev. Sep 15; 11(18): 2295-322. Review.

112. Wade R.H., Chretien D., Job D. (1990). Characterization of microtubule protofilament numbers. How does the surface lattice accommodate? J. Mol. Biol., 212, 775-786.

113. Wagner O.I., Lifshitz J., Janmey P.A., Linden M., Mcintosh Т.К., Leterrier J.F. (2003). Mechanisms of mitochondria-neurofilament interactions. J Neurosci 23, 9046-9058.

114. Wasserman S. (1998). FH proteins as cytoskeletal organizers. Trends Cell Biol. 8, 111-115.

115. Watanabe N., Kato Т., Fujita A., Ishizaki Т., Narumiya S. (1999). Cooperation between mDial and ROCK in Rho-induced actin reorganization. Nat Cell Biol. Jul; 1(3): 136-43

116. Wegner A. (1976). Head to tail polymerization of actin. J Mol Biol Nov 108: 1 139-50

117. Welch M.D., Iwamatsu A., Mitchison T.J. (1997a). Actin polymerization is induced by Arp2/3 protein complex at the surface of Listeria monocytogenes. Nature, 385: 265-269.

118. Welch M.D., DePace A.H., Verma S., Iwamatsu A., Mitchison T.J. (19976). The human Arp2/3 complex is composed of evolutionarily conserved subunits and is localized to cellular regions of dynamic actinfilament assembly. J Cell Biol, 138:375-384.

119. Welch M.D., Rosenblatt J., Skoble J., Portnoy D.A., Mitchison T.J. (1998). Interaction of human Arp2/3 complex and the Listeria monocytogenes ActA protein in actin filament nucleation. Science 281, 105-108.

120. Wells A.L., Lin A.W., Chen L.Q., Safer D., Cain S.M., Hasson Т., Carragher B.O., Milligan R.A., Sweeney H.L. (1999). Myosin VI is an actin-based motor that moves backwards. Nature 401, 505-508.

121. Wittmann Т., Bokoch G.M., Waterman-Storer C.M. (2003). Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Racl. J Cell Biol 161,845-851.

122. Wittmann Т., Waterman-Storer C.M. (2001). Cell motility: Can Rho GTPases and microtubules point the way? J Cell Sci. Nov 114:Pt 21 3795-803.

123. Wu X., Bowers В., Rao K., Wei Q., Hammer J.A. (1998). Visualization of melanosome dynamics within wild-type and dilute melanocytes suggests a paradigm for myosin V function In vivo. J Cell Biol. Dec 28 143: 7 1899-918.

124. Yaffe M.P., Harata D., Verde F., Edison M., Toda Т., Nurse P. (1996). Microtubules mediate mitochondrial distribution in fission yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 11664-11668.

125. Yaffe M.P. (1999). The machinery of mitochondrial inheritance and behavior. Science. Mar 5; 283 (5407): 1493-7. Review.

126. Yi M., Weaver D., Hajnoczky G. (2004). Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. Nov 22; 167(4): 661-72. Epub 2004 Nov 15.

127. Zeller R., Haramis A.G., Zuniga A., McGuigan C., Dono R., Davidson G., Chabanis S., Gibson T. (1999). Formin defines a large family of morphoregulatory genes and functions in establishment of the polarising region. Cell Tissue Res. 296, 85-93.

128. Zigmond S.H. (1998). Actin cytoskeleton: the Arp2/3 complex gets to the point. Curr Biol. Sep 10;8(18):R654-7. Review.

129. Zielinski B.S., Getchell M.L., Getchell T.V. (1988). Ultrastructural characterisitics of sustentacular cells in control and odoranttreated olfactory mucosae of the salamander. Anat Rec 221, 769-779.