Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция транскрипции Yz-гена PTF 02. Факторы трансксрипции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция транскрипции Yz-гена PTF 02. Факторы трансксрипции"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

НА правах рукописи

СТЕПЧЕНКО Александр Георгиевич

УДК 575.11

РЕГЭТШЩ-Ш ТРАНСКРИПЦИИ У«- ГЕНА РТР 02. ®АКТОРЫ ТРАНСКРИПЦИИ.

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертация па соиспопие утепоП степени кандидата биологических паук

Москва - 1988

Работа вылаянеш в дабораторан иаввкзяярао-гекэтнче-овоЗ тгыунодогки Института моавЕужярной баслсгия АН СССР.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических шук ,, 0.Л.П0ШЮВСВИ1

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕШШ

доктор биолагичвокид наук А.П.РЫСКОВ

доктор биояагнчвоких Еаув ' " Г.А.ДВОРКИН

ЕВДУВДЯ ОРГАНИЗАЦИЯ *■ Шютртут ьазогргяряой гашиш АН СССР. _ " . \ /

Запета состоится Х988 р. в

1Ш 8аседаши спеца аотвнрсоашого войта Д.002.79.01 пра Институте молекулярной бзоасгад АН СССР во едргоу: 117984, Нооква, ух.Вавилова, дом 82.

С диосортадаеЗ ноево озвакоштьоя в бибдяотою Института ыалокудяриой баологш АН СССР.

Автореферат разослав

Учений состарь оиещшшвироваакого согзта кандидат хаьшчвоквх наук

А.Ы.КВЩЫН

«r'í't

П -1 -

Актуальность проблемы." Изучение конкретных механизмов трат-.

■л и

—кршщия ишуноглобулиновых генов, рв1уляторных последовательностей а тканеспоцифнческих белков, взаимодействующих с ними, является Еооша важным в современной молекулярной биологии, посжлt ву слушт основой в решении целого ряда фундаментальных и прикладных проблем. Успехи в установлении строения различных -га-нов, а такав их локализации в геноме были достигнуты в последнее врэмя благодаря использованию методов генной инженерии.

йммуиоглобулиновые гены в процессе клеточной дифференцировкв претерпевают соматические рекомбинации, в результате которых фор-шруотоя активно транскабаруеше гены. В настоящее время определена пзршчная структура генов до и после рекомбинация. Шесте о тем почти ничего на изваотно о событиях, происходящих после пере отройки и приводящих к активации транскрипции.

Для ншуноглобулиновнх генов опноано два рагуляторных алеман та. Один расположен в нитроне мевду вариабельной и константной ог> лаотямя гена, как тяиелых, так а легких цепей, и функционирует как энхансер (Ыах е.В.at al. ,198-1).Другой локализован в ближайшей 5*-области Уг -генов перед TATA боксом - "окта" послед о ват ал ь-ность (Relimar F.QjZaohau H.G, Возы окно, что прилегающая к

т г

Vü -гоцу 5 -область интрона /ооемэотно или без 8 -кодирующей об-лаотал/«-гена/ 4акаа контралзруэт уровень транскрипции, по край ней шрэ для гоков кашшх цэпйй.

В даффэрэнцщрованшз: 3-клетках, активно синтезирующих ншу цоглобузшц пршоторной области, поввдиыоыу, принадлежит опрч дадшядая pais в транскрапциа, т.к. делецаа, приводящие к потере энхансвра Jfy -гэпэв, пэ влияют на уровень их э копре о сии.

Кроме указанных рогудяторних последовательностей, в лим-фолдних клетках имеются тканоспецифическке белки, образунцзо комплекс с цао-регуляторншл аяементами, в определяющие аффективную транскрипцию имыуноглобулнновшс гонов. Они синтегсгруются только на определеншх стадиях клеточной днффвренцирошш, и ix*» личвство их в метко корролпруот о уровнем експроссик -гснои.

Вопроси о конкрэтной ролл тех пли ища рогуияторгшх слс-иентов, природе белкошх (|акторов транскрипции и ксшекуляршос механизмах втого процесса в настоящее время озд но роыоии.

Цель и задачи исследование. Далью ¡¿дстолщей работы явилось;

создание банков гонов к получение фрагментов Д11К, содержащих перестроошшв к ипоростроониые шдлуиогдобулкнохаа гони со всеми регуляторньии учссткамя;

роотрзЕцзонное картированас получениях гепоь, лоиалиавдг. регуляторшх олоызнтов в определение их шршчшй струоаура;

создание рзкэубдшштшх ысаскух:,'содор:«аи;:.х w iulü шщо рсгуляториио участка к слродслешо' кх рата z транохрлод^ ln vivo,

вденифлкация бйчшьлх 4а»мров «редокрцпцщ:, учаоялз к* ввалгодсЕствля о пршоторноЛ ойзаокьа, чазтгчися систгл рогуляториих белков п опрздйлзшз l;. po.ii в тракс1.р2яц^ in vitro.

^1аучная ноканп к пгог.тачаокаа рпняооге работ». В работе доказано, что транскрипция УЗс-гьиов илисспещ^ачш, на tors-out от ориентации анханссра и ссора стает при уменьшены расстояния иовду прсуоторос и ешсснсороа.

- s -

Показано, что в ядернцх экстрактах мивломшх клеток содержатся бвлкоша факторы, взалмодействугопдо с регулятор тм элементом претоторпой ойластз V*-генов - окта -последова-тэдьностью. В нолимфовдных клетках но обпаругэны бэлки, образуйте комплоте с окта - последовательностью с аналогичной олок.трофоретлческой подвижностью.

Проведена частичная очистка рогуляторных балков яэ платок кюлоки КОРС 21. Локализован участок связывания фактора о претоторпой облаотьа V* -гэна.

Разработан новый матод картирования участка взаямещей-еттл болта о ДНК, позвеяшдай использовать поочищенные бал-г.овнэ экстракты. Показано, что для взаимодействия фактора с ДНК необходим последовательно о ть ATTTGCAT. Учаотга, флшпа-рувщзв оста-нукяеотад, существенно не влпягт на связывание.

Показана тканеспоцяфзчность очищенного фактора пра до. бааавшя ого в готоролагнчеокоЗ сястсыэ тралскрзяцал.

Адтюбасдя работа. Материалы дзссортащга бняя далсссенн на У Есэссвзнса бзохгшпэскоа съезда Д?осква, 1986/, па УП Со-Еэтско-^ранцузскоы екмюзауиэ "Мояокуаярнся бдаяогяя белков a пуглеяпоэих ni слот" /Братислава, 1907/, па 71 Всосоззнся спапоотумэ "Молайулярныэ кэхапазш гэпзтачэсках процессов" /Носгаза, 1987/, па Цоздупсродаса евкаозпуиэ по гзолот^лярше! олемантам ггауяпоЙ састшгн /Пушкино, 1987/.

О&ьсп работа. Диссертация состегт аз ввздэим, обзора лзтэратура, эгяпэрпгзнтальноЗ часта, обсуздопзя результатов, выводов, списка литературу. Работа изложена па отрашщах кгаяпопаспого тзкета я оодорзат рлсупгов я I табляцу. Ьпл-соа датируемой лятературн насчитывает сснлса.

РЕЗУЛЬТАТЫ И Ш ОБСУЭДЕНИЕ

I. Гены ж. -цепей в кдетках миаломы и гибрддомы

При клонировании генов х -цопвС ядерную ДНК кдоток ми ол омы МОРС 21 расщепляли крупнощопящаш рас три кта зама, фрагмента разделяй! электрофорезом в агарозном гела, порэносшш на нитроцеллшозные фильтры и гибрвднровалл по Саузорну с >-52Р-меченой ДНК плазмидн P-8.I.

Геномное картироваше позволило сделать вывод, что oda аллель них гена в клетках маелош МОРС 21 перегруппированы. Эго подтвердилось при выделении и аталире генов х -цепей ез библиотеки МОРС 21. Ядерную ДНК миелоыкых глоток расщзс-лялй росгриктааой EcoRI н югошхровали в во к гор с Харон 4А, Било проанализировано 3*10^ рекшбянаыгцнх фатой. Отобрали бляшки, даюто позитивный сигнал пра гибрздизацяи. Лрп повторных рассевах с низкой плотностью но mix был лроизвсяьпо вибран гибрздпзярувщайая клон, обозитвптй С- 2, яозгориЁ подвергли дальшЁшецу анализу.

Рестрлкционноа картирование всхроанного в £аг фрагион-та проводили с помощью групноцопящлх рзотрпктаз Psi I, Вле;Н1 и Hint/ Ш. EcoPJ-Hm'i Щ фрагмент, содерЕашдй V область и часть нитрона, субкланпровали в плазицце, рУС 19 для бояоэ детального картирования молкощепящима ростриктазаип. Рестрг;:-ционное картирование в сочетании о гибридизацией по Спузорцу позволило построить физическую карту клонированного учаотта генома шеломы МОРС 21 и установить шстовахоздшшо в вэи вариабельной области гена /рис.1/. Результаты детального картирования и данные других авторов позволили установить, что в

&г«1 НШЖ

»« ^ «1 II»

МяаИ

ИМ М1 ншш 1а„щ ЛлйЛмИМтЯ /¡„„щ

из—!—Ц.

ЬоЩ ЛмП А<о! ХиВ ДЛвЯ Ли! ЯШ . ЛиЛ /й/юИ

Л1и\ А1и] А1м1

«то!

АШ АШ АШ

»Ч>Я»«|1

■ I .1,1,

АШ

Г»М

*с.1. Структура генов &-цепей

а - структура участка генома, содержащего гея

зародышевых клеток, б - физическая карта клонироваииого у^ -гейа плазмоцитомы МОНЗ 21 / влаяиэ с помощью редкс^епядюс рестрактаэ /, в - анализ 5-копцевого Есо Р1 - К1п<1 ХИфр&г-меята,

г - структура V области аллельиого геиа, ответственного за синтез &-цепей жиупоглобулииа в плаяиопигоме МОРС 21.

S^-cäs&csa клонированного $рагшп®а шходятся 4oíii¡w сосд::-шкаышх 3 согманта /сУ2 по 110 oïcyîcïiycv сзгцзк?

утрачсншй в рэзузагезе noj>sxTj"çisïpoEra. Сопоз^едсхягз рззулыатсз настоящей рдбсли' р"'даишш проведанного рано о EOjuiBTopiioro анализа послсдсвйгсдшосгц V гона, oïûcïcï--бэпкого еа cuhïos логкдх дапсд гвафварлобувввй к isicscc.:3 СОРС 21, позволило ускшовкть одснгачшоть кзкпрезашхсго учетах гену У ох > который относится it другому сзизйсуву, coscas ron , екопрсссщумшй в шел со. Ио Шфювного p&-¿ сультата сгодусг, что oäzs иа йялодышх гзкоэ t кцшгю ШРС 21 иерзгрутшровац noscpiio, u eso? roa вз nccaï сбуагаь-£2ва» cu usos Здгшздохзд'ш» акаазшх.дапей хи^укзглобу^их:.; »

Следует оплатить, что ekdklo рааюош глгл;, ¡.лслса noosjwuo: объекте*.:, иа r-asepsu йа: о иссгздсзан;» ездолхо Грнов гт1-.57;огд'сбртг.но:;, Оделю поле i йа-п?гло«с дзеггке-boS юдбдгэ xz^fomtü, i:i6p;yic";i. cogvir:-'.- хргаэсогл

норкалышх -лшафейгоов, г, в çïcm tojHü^i 'ёц?. -öote? rtj^iruor:.'-ïcjïibh. Бнс прозадви. гкбрлхвящэнтп сдав» V« -ге::сз гибрадощ PÏP-02. Pastaр н та cao ru ваз - -цгцз;: к гояс:-: габрадоиа РТР. 02 и кгелогл Р8.1£3 еярело^хшг с гк-

брцдиоавдн по Саузорну, в vaóymcca РТР 02 octopyaciitx кса Va-гена, одни из которая ooosbosctejct по • шздвешосто гону родктельегой каслсз /5,7 se/, ггороЗ re;, içiîsçaû размзр 7,5 иш, прешзогзя ее дккфощл'ов, с fcotopica сакваяиоь шелошшз küsej. изйерзгрушароашао /ьсфсш^-tuv/ гоны в гибрэдоо PTF.02 кс oduipysciiu /ргз.2./

lipa нсслэдовшиа габрвдои сдсдуст учитывать, чта в us гопоао иызптоя гены обшх рекатедьон« кяатог.: как лнх][оц>-

1 2 3 4 M

11.3

7.5 5.7

f ЧА

i *

•I tí

19.9

11.1

7.3 6.6

5.6 43

л

Pao.2. Гпбрздаэшш пэ Саусзрпу Ihm IH @закгэп?ов.

I ~ Ihm HI гздраззаз ДНК ягзтсд аяоп с-зеЗ лают ЕШ/С. 2,3 - ДНК глоток габрзщсгя! PÎP 02. 4 - ДНК родзтшйдгаа кзелогз1 P3-x63-Ag8.653. и - тарпэру шявяулярзнх ЕЭ003.

та, так в taejic&si, вспаяьаоБащшх для олыяная. Odirnxo дайка

тагах кзслси на прсдущгруи' е2 лзгкях, es тяголых «¿ш§2 тj-

иуногдобринов. Б 1шедгаэ P3.IS3.ltj3.653 шлется дат, одев

/дефектный/ гец я -ценз, что сбгегтазт воазк и пдата&ша-

цаю коков, оодериечЗх окспргоовруеина геш не лвыфавдтов.

В табрздош РТР, 02 обифугепи два "Vü-r«?a - одап вз редг-

тшшншй ьзедегщ е второй - ее ДЕКфоцатов, Поозадплй еярз-

деляэт cauros L - цапей сштатол ж трааофзрзну. Из бзйяаоте-

кп генов, пояучэшшх в Харосэ 28, вцдалвны шоии, сэдорггв^о'

тот в другой гон. Гоп es лиафоцзтов пора a cnsposaa zitzu в

влаааздо рио 19 к устакогаака порютиая отруттра фувгцпо-

1 т

вадьш наябовдо , . ва^арзешг обя^одой: "Ьуобясета «-ее- • дораасзй лвдсфиай -уча«?» вш-

«здвва траедзддоа' % jtoascopa; Cípatemr сяЕвааровл-вая я иервэтёи titpjfwrypa •lísrjractcpsKX о&шиюй проьедоса ш р28.3. ' ; '

г

6х-обдаоть roin. В угаокэ врос;»и10сг1э £0-160 ев,

np«®G30TBjx«í-i двдврЕо1: воамдеовгешкхдо гева « -кегш,

крша TMTi- в САТ-бокаоа, в уаиатшвс давгяг квеяеа j-сзеа

быв обЕд.руаьш два ьэкоерз&шиае Еогзсдггаггдьвскта usasa-

дева /pd/ в дева /<fc/, ис&ащглб &Ц правильной вкзарас^з

V* -гоноз (Sülkasr F.O.SaotsB пд. Пааас устакку^к^л

'вэрвзчвой отрувтурм б^-обдезта гев^яоваавеовш) ейвсззвзо

ввдораого X. учаатва, Скшооздхшкзд о всьэотвша ледореза

воадодоЕагальЕооЕаа по&вэзвео тикать в геи « ьз

FTP 02 учаотса, m^sz^ü 70 ro:assre3 о L -Еосхгаогьгвзьвэ-

otieíb лзк^а ¡aass¿0K3Tcy И е Ь 6. ТАШ.- в САТ-бовсв я&взо ког^ш; es раоотешлв £2 к 77 rj;. o? ввацзврув^го A'ÍQ-ücacü

Щпйш ест киот ВаянГч 1РШ |Ми1 В0ШН1

и^д

[л)

ТОСАОСТОТО ССОАООАОТО ТТСАОАТОАА ОСгатТОО АТОТОСТОАа

АТОАТАТТСТ АСТООСООАО АОАТСТААТА АТСТСАТОАТ АОАОАСИОА

АОА®СОАТТО ТКНИОАООА ОАСОМОТОТ АААТОАОАСО ОТСТАТТОАД

ТГОСТСОООЕ СТКИТОУГО ТООСгТОАТО <ии(анстт ЯААСАТТОАА'

ТАМСТАААА АЗАОТАТОТО АТОАООААТТ ТСТСМТССТТ САОАААААТО

иютгаоодг АТААТТДАГГ ТОАТСККЮАТ ТТСТОТТСТТ ТТТААТТАТА

ООТССТСАОТ ВДОАСАТОСА ОАЮАОАОАО ТОТССАТССТ САСТОТСТОО

СОТТААОТТА ТТТААССАС2 ЮТААТТАСТ ТТАААШАТ ОТОААТТССО ТТТТААОТАТ ТААТТТАТТТ ТААСККСКЗаА ААО<К?ТССТО АТААТТСТАЗ? тоотисетот ОСТАААОААС ТСТСАЕГТТТ СОТИТГАСТ АССТСТОТОА ССС^ААОАОТГ 03САТСТ0А1_ САОАОО<Н2Ш _ИТССаАОАа ОССАТОТССО АОТТОСМАА _ОАТСАОАА(1Т ^ААОТСТООО_ Асдасстссс _ ¿ЛОСАСгОТОа ^АЙАМАО. АСТТОАССТО ИО^ДСКГСТа СКУГАААААТТ вТТОСАТСТО ОСТАОАААОО АМАвАООАА ОИШАТОАД МООТОАвАД ТАТТТОТООА САСОСААА1А

Рис.3 V* гви гибридомн РТР 02.

а-фязичгская карта и стратегия сийввнироваияя регуляторных областей У*-гвиа.б-5чзбласть гена.в-эояа Маневра.СплошпоП линией подчеркнуты регуяяторныв участки и'лпдерная последовательность, пунктиром-оЗласть гомологии экхансера.

Vï-гена. Посладоватадшюош pci е ск> распозоаены m раоотоя-ш 91 к 118 п. и, от ншвдируюещго код он а. Как ввдно ав рис.3, pd-и ¿с-пооледоватольиостк поднос ею соответствую? проддоаези-иьш ранее Еонсоноусам.

В Yt-гонэ PTF, щэшэ нотанкой pd, кшотся saïas pd-подоб-ная последовательность. Гшшогачша З^-концы etax последовательностей располоаеш на расе годнее 10 нукяеотадов один от другого, т.е. на одной сторона двойной спирали ДНК. Воатакко, повторение мотива усиливает эффект, аалояенный в этой структура;

При сравнении нукяеотадных последовательностей V» • Си интронов в клетках различных организмов /мышь, кролик, человек/ был обнаружен высококонсорвативнцй участок разумей ISO п.и., но сущэстпонпой гомологии М8ЖДУ.Ш н*изеэстщйе1 посло-доватальностяш вирусках 8Ихансеров найдено нэ too. Легальный аиаша, проведанный в данной работа, позволил jsrteOEasi. короткую последовательность /кор/, которая присутствует во всех онхаксорах. В фрагменте ДНК рааьгэроя 475 Е.и. наш. бил обнаружен лшь одаи та uncu из дву?. дцер.йолйостьв оивэчазвдй требованиям, прод"яЕ2яе*ш к кору етднеора. След уст вкатить, что кор находится sa црздела^! сгшсерватизМой облаотз. Bos-UQ2HO, еихшсар иизет ыодульнуэ cïpysïypy, Которая содержит иного нзбыточшЙ информации в в которой ршеерютивше мотивы рааличаого типа равдшшы тиоо Еонсерваивак-а поеледогга-тельностяки ДНК.

2. Транскрипция КМКУНОХ^ОбтдШЮВЫХ JVвол n Р01Щр%_

В б^-обяазти каппа генов ншуиоглобртинов иа раоотсаши 91-Г1С п.н. от шшцпврувцэго ксдоыа расиалоеоны дека /йз/ в пентадекп /рс*/-цукяеотиды, огруктура котсрих Еоасереатшша

для всех псщгрупп каппа гэпоэ. Прн ах далецза транскрапцая становится некорректной, ( Falbiar 0.$,Zechau H.G. -1984 ). Другая рзгуяятсрная зона /протягенкостью около ISO п.я./ -эшспясер, расположена в интронэ ыеддуУ- и С -экзонами • ( Мах В,В. at al.1981 ).

Чтобы определять роль тзх ала иных регуляторкых участков в траяозфяппди V- гена, ах взаимного распоясяоппя, рас-отсяшя п ориентация относительно друг друга, были сконот-руарованн рэкоУбанантпна алазнздн, отроенаа гатррнх показано па pao.4.

Все пшшзди содержат участок прсштора, вкяючавщяй TATA- а CÁT-боЕсн, а такяэ pd- а £&-послодозатольиоста. Участок тэрпннапля траяифапцяа игазэт только полноразыер-внй каппа ген, вшзчсяшй в алазкзду р£Т*75. На иатраца этого rsna в ооцнтах яреимущоотаанно синтезируэтся мРВК .размером 4,1 т.п.п./рзо.5/, что соответствует полному транбкрлпту of точки агтпиадиз до учаотка тори напет трало-. крзпцза па каппа гена» Другаэ гаопирсвантшо фрагыанта каппа гейа пэ ссдбрга* собственного участка терганациа, а траяо-г$аацзя в о тзх плазкадах заввргэотся з Еэктсртя ДЫХ.

Слодув? отмотать, что для контрам трансйрзпвдонной актавяоога оодзгоэ аспашоваза няагэду psv2-gp2, содерга-щэ opt-гэй Е.соЦ под ксатродец прскэтора а онханоора гаруса SV"40. Эффэктзиость трапогршгош gpí-гена из загасила •. oí прясутстгня кяоточшх экстрактов, Дяазшда рЕР322 в укз-запшх услогаях по траНсгабзровалась. Это огадотальствовало о тем, что трзяскряап&я а Сонатах ааяцайровалась толы» на ауглраотэтеспах промоторах»

(•пЩ

Рис. 4. Плазмиды со встроенными фрагментами - гена иоглобулина.Двойной линией обозначена встроенные фрагызнтн гена,зачернены регуляторныо последовательности.

11 3 4 м и м н

I 5,4

20 —

IС,« —

I г '3-

м "н

5 е м

7 13

м н

О *

а V

«и с

«Й с?

->.1 \

■ч,ч .

Ш

_ а

— С,57

Рис. 5. Электрофоротическоа разделенно цРНК,синтезируемых на различных плазмлдах, инъецированных в ядра ооцитов. а: в оониты инъецировались плазмидо рНИс 75(1,2) рйЯ: б; в ооциты инъецировались плазмиды рЕТк (1-.з),рТЛ1Е (^-б), рТ/»,ь„ (?-9). ./ М / -вкстрак? из «иелошшс глоток,/ П /из клеток НэХа. в опыте " б ".на дорожки 2, 5 г 0 шшзсоя материал,предварительно обработанный РНКазой.

Из приведэнта вкоперямантов одадуот, что для траыо-гретщаз каппа-генов в ооцитах достаточно 5*-регуляторной области, в которой находится промотор, р^-и дс-нуклеотид-Енэ последовательности. ПоЕадимому, проинкубацяя с цельным елототшйл экстрактом из шелсшшх клеток способствовала взад-нодэйствгю ДНК о тканэспвцяфичэокаш стэточшна факторами, что з прздопрэделило образованно динамичных транскршщаонно активных етнихромосои в ооцатах. В тех случаях, когда енхан-сер присутствует в рэкшбшаатных «сдэкулах, ого палояшшэ относительно просторной области V* -гана существенно влая-от па оЕспрзссш. С ушнъшониам расстояния иэзду энхансарет п прсыоторол урозепь транскрмпцзш гена возрастает.

3. Связывание яд ер них балгов с прс/зториоа обдаст ¿.я V-гена

3 плазматических клетках активное состояла а хроматина лопусов тягвлнх и лапах цзпой ножет поддзрживаться независим от присутствия онхансора а целиком определяется рэгуля-торпкл олсманта2С1 щшоторной обласш V-генов а фактсрагя, о взкз взаклодзйствующзмл.

Известно, что различим лиши габраделных клэток отличаются по сеозй способности синтезировать аытатода, Ригуля-цзя пх оЕспроосая восаогна на различных уровнях, в частности, я па стадии инициации транскрипции.

Прозадся сщхшинг 19-тл линий габридемных, гаадошшх н велвифоздавс елзток С целью установления вораэтлиой гюррдляцаи мегду^палнчлем определенных б?лгаглк Авторов и уропг.ти экспрессия штата. В вачвотвэ воцдоп попользовали фрагменты про :.:о торной области ^ -гона Р'1Р 02, по п эрга пи а рзяллчнш) рягуля

- и -

отатаосслсо^ототтоАОЛтамсютсштаооиотостаАОДТО— ь 53

ВТТОАОАТОААООТйАтаТООАТАОША'ГСАТАтаса'АОТО------' 41.1

оттаАс&таААаотаАтттоамсоаАТОАТАТтстАота— <12.1

00ттaлвJULШT(^gтттa^ATллттлJiттf0AT0aйGATTт— рр

————— ^ ^

ОАТОООАа ЛАТ маОАТОАаТАСЯ1ТАСТ(Ц(ЦТО- . ро

5' стаАтттсжтаовто

3« СА0АСКШЗШШЕ1 окта

Рис.б Структура последовательностей дак,использованных при гибридизации.Подчёркнута октамуклеотидная последовательность,или псевдооктаиуклеотидпая;./ро /.В ДШ с! 2.1 последний / Т /нукле-отид окта-последовательности заменён на А."вкта"-сиктетический 2х-цепочечный олигонуклеотид,содерасщий октй-последовательиость, после лигироаання использовался в качестве конкурентной ДОК.

торные элементы,делеционные производные этих елемеитов.а таете синтетические олигоиуклеотиды.Строение их показано на рис.6. Поведение зондов^рр* окта' при гийридизапии с белками аналогично к 53.ДЖ ро'не конкурентоспособна £ зондов к53/содераит окта-последовательность с фланкирующими участками/ во всех исследованных клетках методом торможения подвижности бипи

обшруаош! рлЕличцна по подеышостя ДНК-бал кошю комплексы. В лжфэидных матках, продуциирукцях антитела, вняшнются кшзшз^си о подиианосгьа Во, на имеющие аналогов в надшм-фсодиых клотгах. Результаты такого анализа для трех линий глйрздоиь Р1У 01, 11ЕМ 57, РСМ 04 и шгагмацитомы МОРС 21 показаны на рис.7. .,

а б в г

• - _ ' I. 2 3 4 I г 3 4. I 2 Э 4 12 3 4

j ^ м

И и W № Й

, *«

оа Шао a t:d а -

Pao.7. Факторы, взшшдейотвующае о пршоторной область*) каппа гена в разных линиях алазиацитоы.

а,б,в,г - линия плсз^ацито!! P1Y0I, UEU 57, PQU 04 я МОРС 21 соответственно.

. Пргцешип изтод задержки подвианоош ьонда а ьяим раТЭСЕОЦ поло; 1,2 - ИСХОДНЫЙ ЗОНЯ к 511 /см, ¡ '1с. б/, вштШ а количестве 0,5 в 1,0 иг в р«агашв; & - го so, что а "2" в присутствий ДНК di Л; i - то что "2" а присутствии (12,1,

В гибридомэ PQQ 04, также являющейся хорошим продуцентом антител, комплексы с подвижностью Во не обнаружены. Во всех трех гибрвдоиах шдвы также шнорные компоненты, соответствующие комплексам о промежуточной подвижностью.

Поскольку использованный зонд, кроме октаиукпоотлда,. ответственного за образование ксыплексов с белкошыа факторами транскрипции, содержит довольно протяженную последовательность, предшествующую ТАТА-бокоу, п, поскольку детектируется несколько белковых комплексов о использованным вовдоы, возникают вопросы, безусловно требующие ответа, - . образуются ли вое наблюдаемые комплексы о участием окта-нукяеотида; насколько необходимы нуклоотпдн, фяаякирующаа в ту последовательность, для образования комплекса белок-ДНК. Чтобы ответить ,m era вопросы, были разработаны в использовайн подходы для картирования участка овязыва-ння белка с использованием нукяеазы Bal 31.

Первый метода., состоял, в тон, что» -i гибридизацию белковых экстрактов о -^Р-зовдом проводили в присутствии кок- ' курирующих помеченных фрагаэнтов ДНК. В качестве Еонкуренг-ной ДЖ при гибридизации использовала плазкиды, имеющие до-лецип различной величины в области наеду ома и CAT боксами,и частично затрагивающие окта-посяедовательнссть. . Тем самым, с одной стороны, изменяется расстояние ыезду окта и TATA боксом, что является существенным для транскрипции, с другой стороны, изменяется последовательность, фланкирующая октануклеотид е. 3*-конца. Как ввдно иэ

p:to.7, smv.iCL нуклеотидов а 3 -ф»Г'Лрукэдв области окга-по-ояодоватааьноота сущзстЕЗННо. fiar- .сВа?ывзотся ва способности конкурировать о оовдга, cr.zy сака огланукяаотндная посявдова-тальнссть пэ сзтронутаг>Црз добагло>sui KouisypaE3®E3Û ДНК, со-

• дорласэй ссэ октащй'остаднув последовательность, подавляется способность образования ДНК-белковнх комплексов как о еноо-есЗ, так а р'низкой подгзааостьа /рзс.7, а, б, а, г - дорок-ва 3/. При сакезв хотя бн одного нугавотада на 3*- юнце окя-поагзд огл сэлытс га, ДНК отаковатся из то m-yp о ытносао-соблс1, Такии образом, для см s ива язя ДНК с бел пои каобхо-дгга иагавткад сктй-аоалздо.пат0лы.'оогь, йуклеотздц, фяанхз-

т

pyrnjie ов о 3 »веща, суцзотвэшо на влияют на овя&ывашэ.

Дчя устапоЕЗОнзд точнис rpL-iH участка ДНК о 51-Еоада, г* обходного для Ï3овмад-зйотзня с $агл срами, Сил пелользо-г;:г. яругой псяхсд. Каг. ивезогло, ¡аташая 2-н.зпочвянея ДНК п агяигвмтся о вятрсцатамозкицв iïiœpsiia, го ваеювва оорбдаа ДНВ-беявогах вошкэЕоог. Eus m овягхзавад ядораы гэ ^автора ггобюд»! утотоя ДКХ саределовного строения, то Т2ЭЕПЕ8Я дслогря огвго огйта о аот^э Cal 31 ара вздет s гзрягйшэ сглз1са:г:л ДЁ£ с фактором. 3 отс.ч слугаэ dpar^au-ти ДКл езяхзэ ояредозовпоа «язви по будут ебвзругяватмя а

глторглгэ, СОрбЯрОЕ22ШО!» ИЗ ВЗ!рсЦЗДГ2«ОЗИНХ ^паф^х.

• • Дзя подушевая набора гаСр^эдауг'-ых фрэпйатов шшаоед i'.LCIO, содор-л^ а^-сйтаоть Vt-roiia раи-эрсм БЗ и.о., рас-

рсотривпсс! liv\é D.. Дгиеэ «рог-эдила обработку цу-г/гзясоЗ Гз1 81 п розтрпгтаеоЗ 2сэ!Ц. О результата «аду чала габор фрагстзятоз ïî^aissr^laя дляни, тгэггзЗ гсаогашшЗ EcoRI-Eoaa /рло. оХ

ílind XIX octa . Eco Ш

I

t~n, - .............

} --

_—■■ -■ •••"I

==э-—e-—

^ -Й

en----

--»

Pac.a. Схема получешгя фрагментов ДНК, содзрааязх дслршт в б^-прогазторной области Vm -гена с Еспояьзовашси нуююаэы Bal 81.

Аналогичным способов получали образ фратеэнтоз, шкгзхг двлэцпз iu 31-кощо. После ввэдошя мэтки по EooRI-гопцу смесь фрапмнтов бша попользовала для гпбрддпбйцаа с бсл-каыа ддер!)их сг.с трактов. Надптаз кжазшдной ДНК во кссзло посладувщагу анализу, так кап бша подобраны такав условия, чтобы пвопец^этеские ДШ-белковио веааэдбйотшя бшв из-низальшага.

Белковые вхсстракты получали из клеточках леезА

PLV 01, МОРС 21 и рад'о4. Поело сорбция ДНК-бал со шх когш-t

лекоов на фильтрах и влюцяи штериела размер фркгмэнтов, об-

-IB -

раэузтх ксгзооко с бслкани, опрэдвяяди олэктрофорезом 3 догагурлруздсм ПААГ, При такой постановка акснорзнаи-?а йрпгт'зпт ктаглольной Еалнчхшн, поторкй агэ взпиксдейег-3373-2 о бсдпэтд а оотдотея на <рш>трэ, опредпяя-эт взрхкгэ гриппу /о б^гонца/облаоет» нэобгод^.'мй для оеязцезшщ. Лгагсггппоо .гартзросед^'.л- В^-конца- овродвляо? шага rpr^T сгггруг:иш.\,К& вгяпо из рпоч язя всех иосига-дспалтх гздточкв? лзйяй сэрззгэй грзпгщэй епязяванкя яэ-«rwt П, октднуглзопдной посло-

др-а-1лн!сс'П о З^-глплд I пугягмяд/. Еолзо точшя лст'жиглг'я а дангс! сгучпя глгор'отяа пз-за пзрягно-рпсчзгиепчя ДКХ lyi'T^iPo'l EiI3I. Долоцля хотя ill сд::огэ iiyncoTOVi в сэтпяугюстлдпсЛ последовательно гл тотршт? ея-чегЗтзокоз ДПП-бгиюгаэ связигаиз»..

ТйКГЛ 0бр130!5, Об-Шр/ГЛШШЧ Й ЕЯ0ТК32 ПД83?<г>ЦаТС!1

™;i3pi"-'} ззгаксдв!?отгувг о овга-посладоЕсгеаьпэ-о?ю прс:'сторт:с:1 сйлгата. Дзлзцгя габо г&чссэгаэ пуглз-отддой па или Э^-гакцэ о?е! псшодовзу-эльноота га-рзгзог отпхп'ж:'), Э-'-зна сопозаччЯ в учаотгзх, грани-тзгтз: о огггаяуктс-сгпдс:;, кз глялзt г&мояаз* образом на сродетго. Кзртзроъииа учаотгл опяаивэ.'ля о испольсова-usca чгсг,лко отщэшгаго {отлс-р! тагт) проводила us-1годст5 footprlatlrs Псшучсш! cotnanie-vio роаузьтатц.

а

I 2

б

I 2

в

I 2

о о

б

Ряс. о. Уотанотаепве границ участка связывания факгсра с ДНК с помощью нуетеавы В&1 31.

а,б,в - линия гаеток МОРС 21, Р1У 01, Рдц 04 соответственно.

1 - фрагменты ДНК, взагмодсйствующзэ о фавторса

и овявцЕавззеся с Еатрсцаизшозвшш фальтрахз.

2 - н а подана фрашенты ДЕК, испадьвувкые в реакция

связывания о бадкса.

4, Очистка ДНК-свя8Ывасщяж ¿акторов

ЯдрргшЯ экстрпкг, иолучошшй вв кяэток МОРС 21, еспояь-8ошзв для очес таи ДКК-связневдншх факторов. На всех стадиях очистки регистрацию белков проводили по ыетоду тсрмоавния в воле, г хрия отестки представлена на рас.®.

- а -

ядерный экстракт

I

ДЕ52 .-1

НО мМ KCl

350 u'í KCl

I

Гидрокеялапатит 120 ííÍ Ш

Рзо. IQ. Схс.а о^птсгга фактора лз ядорпого экстракта глоток гзоле^и Ï.Î0PC 21.

Яд ерша о гл тракт дзалязовзлп против буфэра, содорза-сэго 50 i¿l К Ci я sEH02S.ua га в сношу ДЕАЕ цаллгдозы, олвзрошша ллпоЗшгм градпонгсл гэкцентрэдзл ксг /50-ЭСЮ t-'V. Гзлкз, оглзиггэосо.': о ДНК-зонд см, обпарухпт-зоятол главке* образел во Фракща, выходщой о 50 r.íl Kf¿ /90$ c7î"'3pno3 аггглзкоста - фрегдш! Д 50/. При поветовая г-оицэпгрзшга до НО кМ гнходпт гппоргтл фраппя

/Д НО/. Порцто ¡ftpcciGS пзпосялп па колонку с фосфоцалда-

60 м',( KCl

I

I- P II ~

650 иШ Ш

дозой. Бшпш, взаимодействующие с октануклотидиой посяо-довательпостью, ^люируются при 350 мМ KCÍ /Р 350 - основная фракция/ и при 650 ыМ KCg /Р 650 - шнорная фракция/. Основную фракцию дналивовапи против 50 i¿< фоо-фатного буфера pH 7,2 а наносили па колонку с гедроговг-апатитом. Элюцпю проводшш ступенчато, повышая концентрацию фосфатного буфора до 120

Степень очистки по гибрздпзационноцу тс о ту пршдзрно 400-кратная. Полученный балок использовали для определения участка связывания с прсмоториой областью мэтодои • footprlntins п дня траншфипцпя

6. Влпянао фактора на_транскрипццю. Ух. .-гена в гетэрологачоской системе

Многократная очистка ядерного фактора из лпмфоцд-пых клеток позволила осуществить его функциональную проварку в беевлеточной системе транскрипции. В качества матрицы был попользован фрагмент Va -гона юяаупоглобузш-на, содержащий вариабельную часть и все влеманты промо-ториой области без еихансера, Было показано, что в гете-рологачсской бесклоточпой сеотшэ фрагкэнтн Va -reПа транскрибируются слабо в точка инициации транскршщаи кз-постоянна.

Раствор, содеряаЕЗЙ частично очищенный баякошЁ фактор, добавляла до, либо после добавления к ДНК экстракта из клеток Hola. Результаты опыта приведены на рис.11. Транскрипция многократно-усиливается при добавления фактора независимо от порядка его введения в

- 23 -

траиокрзлцзонную систему. Прд атом инициация транскранцаи, как глдно из того so рлоухша, становится значительно бодаа воррзктроЗ.

Hlad III 2оо HI

i га

" В20 ~ —

TATA

1910 --

171O _

1380 ----

9¿tO --

830 -----

570 ---

ГзоЛ2 Ipruoxpaniçui la vitro ц-аьаадц Eco Ri

3 эœтраста эдотох Usía.

0 - трапевранная Vit -rem n li-jla икстракте бе* д<»

баало!ЗЯ фактора,

1 - 10 мдд фахстсра б!по добахихано а ДШ

рУл-« • Eco HI . инкубировали 10 itju, аатил бил добаапон экатрлха глоток Нэ1д,

2 - поело яняубацгд n тзчишо 10 ьаи с вклтравтои

етэтак НэЬа добавляла фа»ср тр?лск{аш;'1н .- /10 нкл/. Сдогл - i'Tprj¡4 тшкудяришс паеоа в п.в. Впзрху - стровизд аеппльзугиач) яд и трннсхгяшша Гека в пплслсн««' т"чозной точка чкянитвп Tf-нш« КрЛПЦКЯ.

ВЫВОДЫ

1. Созданы ÓuáSEOTOJSi гонов из шолс6шых клзгое МОРС 21 а гибредомных FTP 02, из которых выделены вкопрэсоируеьшв в не&кспрассируемыо v*-remi иммуноглобулинов. Проведано рэстри-кшоыное картирование генов и определена першчшя струкзура рогуляторных участков.

2. Получаны рекомбинантныа плаашды, садеркасро снхан-серные влементы гена в различной ориентация относительно промотора, Показано, что lía vivo транскрипция Va -гена «кашспа-

t

цинична, вэ зова cas о? ораентащш енхансара а возрастает ври уменьшена® раостаяшя иеаду анлансерои в срсшторш. Уоишов-лено, что рбласть цитрона иазду caüs£s.ui Pjt X Hind Ш ооущзог-аляет Еогатввкца контроль рсгулящщ'транскрапщш Vs-roua в ооцитах ипорцавой ддаушкл,•

3. Показано, что в ядерных вкотракгах ьшалсыных'клоток содержатся белковые факторы, отсутствую ¡да а тлныфоидиых клетках. Проведена чаотачная очистка байкового фактора на клоток ЮРС 21. Локализован участок связывания фактора о промоторной областью Vá-гона.

4. Разработан новы!! ызгод картирования области вашшо-дойствия ДНК о белкой, поаволящзй использовать грубые экстракты. Показано, что для .вайлцэдейстапя факт ера о ДНК необходима октанукяоотидшая последовательность 5*-ATTTQCAT-3*. Учаотки, фланкируемо вту последовательность, оущзотионпэ

не влияют на взаакюдейотвие.

5. Показана ткЕнзспедафачеокая активность очиеэиного фактора, lipa добавлении его a resepasогачпой система уровень транскрипции возрастает.

- üb -

СЛШСОК РАБОТ, ОНУЕШОВАШй* Ш ЗШК jtHUCliFlAJWM

1. О.М.Дввв, А.Г.Охапчеако, О.Л.Паяяновский. ж -Гены якмуноглобулянов. Ююыдрованаа, габраднвация а структурдай гшаяиз. - Цолакулнр. биология. 1985, 9.19, S 1, о.209.

2. А.Г.Стэпчеагю, В.А.Аддалов, С.И.Деоа, О.Л.Подаиов-огай. Регуляторяиэ последокагэлькоога в геие к-цаавЗ, эео-нреоеаруемоы з гябрядода РТР 02.-Генагака, 1986, ».9,

0. 2228-2234.

3. Ötapoheaka A.Q., Bsyav 3.11., Polyanovaliy O.L. * i

Котаг 3,, 3?raliefe 3, Irausoslobulin Ь chata ganaa Ib. попав

hybrlflcaa VT3 £52 ead parsat nyoloon. Iiiaortion ot hjbrldoaa

& gena ia fco tba plasald pSV2 gpt. ?olia biologioa (Praga). i > > »

1986, 7. 32. P. 161-166,

4. А.Г.Стегпвнко, H.H. Лучина, B.A. Адяагов, О.Л.Иолянов-oes3. факторы тваивсаецифзчесЕой трааскрявдзд х -геиоз sts-iy-поглобузяЕов. - Ыааекуэяраая гэЕзтаса, кнкробаологая а глру-ослагая. 1987, а 8, о. 14-16.

5. А.Г.Стоггчаазсо, П.З.Фальгощ-еувр, В.А.Адааюз, О.Л, Ио-ляловсзеЗ. Рэгуляцяя трацокрлпцдз ге -генов вшуноглобулыноа в оопзтах шорцэвса дягупха. - Генатака, 1987, т.НШ, 8 8, 0,1377-1881.

6. 3. H.Dayov, V.A.AJalov, D.H.Uraokov, A.O.Stepohenko,

• а ( i

O.b.Polyaaovoby. Investigatioa of tesuaoglobulin ligtit Oha In geaea reeponaiblo for tJia aynthaaia of antibodies in hyferldcna Pffi? 02. Hafcaboliaa ааЛ ansysologj of auoleio seifig lksladiag gsna «aaoipulationa, 19»?.?.6.F. 371-581.