Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция разложения органических веществ анаэробным сообществом микроорганизмов в системах биологической очистки

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция разложения органических веществ анаэробным сообществом микроорганизмов в системах биологической очистки"

РГ6 ОД

- 'I ;\П? 139*»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 579£51Л1/12

СЛОБОДКИН Александр Игоревич

РЕГУЛЯЦИЯ РАЗЛОЖЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ВК1ЦКС1В АНАЭРОБНЫМ СООБЩЕСТВОМ МИКРООРГАНИЗМОВ В СИСТЕМАХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ

ОЧИСТКИ.

Специальность (ШШГ7. • Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически! наук

Москва - 1994

Работа яыпогтена в Ивегагуте мякробиологиии РАН

Научный руководитель: чл.чсорр. РАН, профессор ГА. Заварзиа

Официальные оппоненты: доктор биологических наук СС. Беляев доктор технических наук ЛИ. Пантер

Ведущая организация: Институт биохимии я физиологии микроорганизмов РАН

Защита состоится 20 апреля 1994 г. в 14 часов на заседании тираштршдтпт совета ДХЮХ64Л1 в Институте микробиологии РАНпо адресу 117811, Москва, Проспект 60-летия Октября д. 7, кор. 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН

Автореферат рачостан " 1994 г.

Ученый секретарь

специализированного совета Никитин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Защита окружающей среды от различного рода антропогенных воздействий является острейшей проблемой современной цивилизации. Одной из наиболее экономически выгодных к экологически безопасных прнродохраиных технологий считается анаэробна* биологическая очистка промышленных, сельскохозяйственных и бытовых стоков. В основе работы систем анаэробной биологической очистки лежит деятельность сообщества микроорганизмов, осуществляющего деструкцию полютантов.

Анаэробное сообщество можно рассматривать как систему, состоящую из функциональных группировок микроорганизмов, между которыми реализуются определенные трофические взаимодействия (Завароян, 1986). Разложение органического вещества анаэробным сообществом регулируется концентрацией метаболитов. Биологическую основу регуляции составляют процессы синтрофного взаимодействия между различными микроорганизмами, -осуществляющими межвидовой перенос веществ (БсЬшк, 1992). В настоящеее время достаточно подробно изучена только регулягорная роль водорода (Вгуапк е1 аЬ, 1967; АУоЛп, 1982), регуляторная роль других метаболитов, вчаегности ацетата,' являющегося важнейшим продуктом анаэробной деструкции, исследована недостаточно.

Регуляторные процессы, основанные на межвидовом переносе вещества, предполагают определенную пространственную организацию микроорганизмов. I' Физическая структура анаэробного сообщества играет ключевую роль в работе высокоэффективных систем биологической очистки (ЬеиЬда е( а1, 1980; Уегйгаей, 1992). Исследование механизмов иммобилизации микроорганизмов разных физиологических групп имеет важное значение для понимания процессов разложения органических веществ я напрямую связано с задачами интенсификации процессов анаэробной биологической очистки.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение регуляции ' разложения органических веществ анаэробным сообществом микроорганизмов в системах биологической очистки. Особое внимание было уделено выяснению ретуляторной роли метаболитов, трофических связей в системе и биологических особенностей микрооорганшмов, лежащих в основе физической организации сообщества.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Выявить параметры функционирования сбалансированного микробного сообщества, могущие служил, для оценки работы действующих установок по " метановому сбраживанию органических отходов.

2. Изучить регуляторнуто роль ацетата в процессах разложения органичесщх веществ метаногенным сообществом микроорганизмов.

3. Исследовать биологические особенности процесса образования' . гранулированного ила. Выделить микроорганизм, способный образовывать 1ранулы и изучил» его адгезионные и кинетические характеристики.

Научная новизна работы. Выявлены параметры функционирования метаногенного микробного сообщества {концентрация метаболитов, микробная биомасса), могущие служить показателем его сбалансироваинрй работы.

Показано существенное влияние ацсггат-испальзугощнх меганогенов на процессы разложения органических веществ анаэробным сообществом. Впервые путем математического моделирования показана возможность эффекта межвидового переноса ацетата.

На основ? чии термодинамических расчетов установлено, что процессы ■ сшггрофного разложения органических веществ, основанные па межвидовом переносе ацетата, должны осуществляться целиком за счет увеличения энтропии.

Из метаногенного гранулированного ила выделена бахтерия-бродилыцпк, , способная образовывать гранулы в чистой культуре.

Практическая петшость исследования. Разработан метод оценки стабильности работы установок по метановому сбраживанию сельскохозя йствешшх отходов.

Дано микробиологическое обоснование оптимизации работы метантенков за счет введения в систему или накопления в ней ацетат-иотолыугащей микрофлоры.

Выделен и описан микроорганизм, способный к образовашпо гранул в чистой культуре, что позволяет интенсифицировать процесс образования гранулировазшого ила в реакторах с восходящим потоком (UASB).

Дпрпбаггия работы. Материалы диссертации были представлены на конференции "Архебактерии" (Лущило, 1987), па 2-ом совещании по технической биоэнергетике "БИОГАЗ-87" (Рига 1987), иа международном симпозиуме "Микробиология и биохимия стропа анаэробов, участвующих в межвидовом переносе водорода" (Франция, Марсель, 1989), на 8-ом международном Биотехиалогаческом симпозиуме (Франция, Париж, 19S9), на международном симпозиуме "Микробиология окружающей фсды" (Бельгия, Остенде, 1991).

Публика пии. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ (6 статей и 5 тезисов).

Объем ц структура лисертшгии. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающую описание объектов и методов исследования и результаты Я их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы (210 наименований). Материалы соложены на 141 странице, включая 16 таблиц и 18 рисупхов.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю ГА. Заварэшу, а также искреннюю благодарность W. Verstraete, AJÍ. Кожевниковой, С.Т. "Петрову, ИЛ Ведешшой, ВА. Бонч-Осмолоьсхой за помощь и поддержку в работе.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

/ ' '

Объектами исследования служили: промышленные и лабораторные системы анаэробной биологической очитки, обрабатывающие навоз крупного рогатого скота (КРСХ свиной навоз или отходы пищевого производства в. мезофильных и умеренно термофильных условиях; ассоциации я накопительные культуры микроорганизмов, выделенные к» этих систем; чистые культуры микроорганизмов Methanothrix therm oacetophila, Methanobacteriiuo tbermoformldcurn, полученные от сотрудников лаборатория микробных сообществ ИНМИ РАН. . .

Культивирование микроорганизмов праводшш с использованием анаэробной техники (Hungate, 1969) на бихарбонатной среде Пфеннига (Pfennig, 1965). В среду также добавляли 1 мл/л раствора шпсроолемевтов (Lippert, 1966), 0,002 % резазурина для контроля окислительно-восстановительного потенциала, 0JS г/л Na2S для создания восстановленных условий. В качестве факторов роста вносили 100 мг/л дрожжевого экстракта а 2 мл/л раствора витаминов (Wolin et al, 1963). Для выделения микроорганизмов, способных образовывать биоплешсу, использовали апаэробную среду с минеральным осадком (Slobodkin and Verstraete, 1993). Использование того или иного источника углерода и энергии зависело от конкретных задач исследования.

Морфало по клеток изучали ж световом михроскопе МБИ-3 и Polyvar-1200 с фазово-контрасгаыми устройствами, а также в электронном сканирующем микроскопе JSM-1300.

Биомассу микроорганизмов в пробах из биогазовых установок определяли, основываясь на содержании ДНК после ее экстракции, гидролиза и реакции с дифениламином (Irgens, 1971; Веденина, Слободана, 1988):

Метану водород, летучие жирные кислоты (ЛЖК) и спирты определяли

газохроматографически на хроматографе "Chrom-5". Газ-носитель аргон, расход

/ • ' ■ ' '', .

40 мл/мин. Для анализа метана и водорода к качестве сорбента использовали

' 1 | '

4

активированный уголь марки АГ-3, детектор - катарометр. ЛЖК и спирты анализировали с пламенно-иотпацношгым детектором, сорбент - chromosorb-101 (Слободкшт, Кожевникова, 1990).

Выделение Д1ГК и определение процентного содержания Г+Ц в ДНК осуществляли но описанным методам (Marmur, 1961; DeLey, 1970). Гпдрофг,(шость 1слеток оценивали модифицированным октановым методом (Rosenberg et nl, 1980). Выделение внеклеточной слюи проводили путем ее осаждения в этаноле, с последующей депротегошзацней (Mergenhagen, 1965). Общее содержание углеподов определяли феноловым методом, содержание rem» - антроновым методом (Herbert et al, 1971).

Компьютерные эксперименты проводились с математической моделью метаногенпого сообщества микроорганизмов, посгроешюй по блочному принципу (Засаршг и др, 1990). Описание замедления удельных скоростей роста микроорганизмов в зависимости от состояния системы было дополнено функцией, задающей термодинамическое ограничение роста биомассы и разложения субстрата па основе расчета текущих значешшй изменения свободной энерпш Гиббса химических реакций (Петров, Слободкшг, 1993). Изменения стандартной свободной энергии Гиббса химических рса.кц\ш (¿J G были рассчитаны по данным (Thauer et al., 1977). Стандартные изменения эптальпин химических реакций ( а Н°) были рассчитаны на основании стандартных энтальпий образования индивидуальных химических веществ (Мищенко, Равдель, 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Гягуяяторцая..ролкдпУгатП-В.Раздожении органических веществ апязрпбнмм

Ацетат является одним из важнейших продуктов анаэробного разложения органического пещества, "однако, его регуляторпая роль в анаэробном

сообществе мало изучена. Для исследования влияния ацетата на работу . системы мы использовали ассоциации, накопительные и частые культуры анаэробных микроорганизмов, а также математическую модель мегганогенного сообщества. '•■"/"

Концентрация летучих .жирных кислот и биомака шкрооргашсмар как показатель сбалансированной работы уетаногеиного сообщества. Мы исследовали концентрацию ЛЖК и содержание биомассы микрооргапшмов на разных стадиях метанового сбраживания навоза крупного рогатого скопа в модельных опытах и в действующих очистных сооружениях животноводческих ферм. В лабораторных экспериментах интенсивное образование биогаза сопровождалось потреблением / уксусной кислоты, образованием . и потреблением пропионовой и масляной кислот и ростом активной биомассы микроорганизмов (рис.1). '

V/V,/cxr«L,

14 сут. ;

Рис.1. Концентрация ЛЖК в - содержание ', микробной биомассы в сбраживаемом навозе КРС 1 • объем биогаза (У)/обьем бродящей массы (Vj) в сутки; в //л: 2 - абсолютно сухая биомасса (определенная по ДНК), 3 -уксусная, 4 - пропионовая, 5 • масляная -кислоты •

Таблива 1 Содержание биокассы н конпептрапия ЛК в бродяпей массе действующих нетантенков.

Объект вес сухого Вес сухой Сухая биомасса/ Кислота. г/ л

вешества. г/я биомассы, г/л Сухое вешество г уксус на я пропио- новая масляная

Но 1 . свежий навоз ЕРС 159.40 38.00 24.0 1.13 0.10 0,00

ыавозоотводный канал 76.97 16.00 20.0 1.50 0.10 0.05

навозограпнлпше 133.73 28.70 21.0 4.74 0,42 0.06

метантенк Тг35°с» секпии: 1-я 120.61 гг.70 18.8 3.00 0.91 0.03

г-н 90.22 гг.го 24.6 0.41 0.14 0.00

3-я 85,05 21.30 25.0 0.05 0.00 0.00

но г. тмоОс. навоз крс. 30.38 7.33 24.1 0.21 0.03 0.00

Но 3> свиной навоз, метантенки: т=50°с 58.39 11.00 18.8 2.79 4.50 0.00

Т-450с 30.55 7.32 23.9 1.40 3.43 0.00

Т=35°С 22.29 6.99 31.3 0.33 • 0.08 0.00

Таким образом, низкая концентрация ЛЖК и высокое содержание микробной биомассы являются признаком активного функционирования сбалансированной метаногешюй ассоциации. При этом низкая концентрация уксусной кислоты указывает на активную деятельность ацеггат-использующшс мегганогенов, а низкие концентрации прошюповой и масляной кислот - на активность сшпрофпой микрофлоры.

Сравнение концентрации ЛЖК и содержания биомассы микроорганизмов и бродящей массе действующих метантсшсов (табл1ща 1) позволяет оценить сбалансирован ость работы мстаногетюго сообщества и, в сочетании с другими критериями, может служить важной характеристикой процесса метанового сбраживания органических отходов.

РлущКй?_ММаЩЦЬрх._111егтоасс1орЫ1а на разложите этанола

метаногешюй ассоциацией микроорганизмов. Для выяснения регуляторной • роли ацетата в анаэробном сообществе одним из наиболее эффективных методов исследования является метод элективных культур, позволякшщй выделить группу микроорганизмов, осуществляющих превращения данного вещества. / .

На рис2Л представлены результаты опыта по разложению этанола

метаногешюй ассоциацией микроорганизмов, полученной путем 2% засева

среды, содержащей этанол в. качестве субстрата, сброженным навозом КГ С.

Газложсние этанола сопровождалось образованием уксусной кислоты и

метана, одна? полного использования этанола пе происходило. Процесс

прекращался вследспшс накопления уксусной кислоты ц падения рП среды.

Прекращение разложения этанола нельзя объяснять шгабпрующш действием

водорода, так как-концентрация Н2 в газовой фазе ие превышала порогового

значения его потребления водород-использующими метаногенами. При подсеве

к метаногешюй ассоциации ацетйт-исполиующего мстаногепа МсШапоЛпх

Леппоасе^ЬДа разложение этанола происходило значительно быстрее, этанол , / • ■ ■ '' разлагался^Ьолностыо, при этом не происходило накопления уксусной кислоты

и юменейия рН, увеличивалось количество образовавшегося метана (рис2Б).

- /•' ■ ' : \ ■ ' в

М мМ р// мАГ

Ю 2/7 <27 Мгумт Ю 2/7 Л7 Мсу/яла

Рп!х2. Разложение этанола метаногенной ассоциацией микроорганизмов. А -контроль; Б - совместно с МеШапоИтх ЛегтоасеюрЬЧа; В - с подтптровкон N8011; Г - пачальпая концентрация СН3СОО* - 50 мМ. 1 - этанол, 2 - уксусная кислота, 3 - метан, моль/л; 4 - рН

Поддержание начал того значения рН в системе путем подтнтровки образующейся уксусной кислоты также приводило к полному разложению этанола, (рисДВ), однако, скорость процесса в этом случае была ниже. Присутствие в среде экзогенного ацетата (50 снижало удельную скорость ■ разложения этанола, этапол полностью не разлагался (рисЗГ). Таким образом, ингибирующее действие на процесс разложения этанола оказывают как сложение рН чреды, та* н высокая концентрация ацетат-иона. Удаление

уксусной кислоты, осуществляемое ацетат-использующими метаногенами, в значительной степени стабилизирует работу' исследуемого сообщества микроорганизмов и процесс меганогенеза. . /."■".

Роль аиетат-испалюуюших метаногенов и литотрофнътх тмоапетатт-гт бактерий в разложении этанола накопительной культурой. Дпя; понимания регуляторной роли ацетата при разложении органических веществ, существенным является выяснение того, в какой степени удаление ацетата-может влиять на трофическую структуру сообщества. Из сброженного навоза КРС нами была получена устойчивая накопительная культура, разлагающая этанол с образованием метана и уксусной кислоты. Подсев кнакопательной культуре водород-использующего (Ме1ЬапоЪас1епшп Шегто!опгиасит) и ацетат-испОльзуюхцего (МеШапоШпх гЬегтоасеЮрЫ1а) метаногенов увеличивал потребление субстрата и количество образованного метана, однако, Ь случае удаления уксусной кислота не происходило изменения рН среды (таблица 2).

Таблица 2. Влияние метанообразующих бактерий на разложение этанола накопительной культурой. Продолжительность культивирования при 55^0. 30 суток. ,

Объект Этанол, мМ - исх. кон. ■ Уксусная ... кислота, . мМ -- Метан» мМ рн

: Накопительная

культура Е5 65,0 М 60,1. 14,4 3,0

Е5 + МЬ.

гЬеппойтшао: л 65,0 603 313 5,0

Е5 + АЛ.

ШегтоасеЮрЬИа 65,0 ад '. ¥ •■':":- . 64,9 45

Учет численности водород-использующих микроорганизмов в накопительной культуре показал одинаковый порядок численности (10?) метаногенной и ацетогенной микрофлоры. Ацегатобразующий водород-

• I..

1 ■■

использующий компонент данного сообщества был выделен в чистую . культуру. На основании морфологических и физиологических характеристик выделенный иггамм был отвесен к Clostridium thermoautotrophicum.

Таким образом, удаление уксусной кислоты из системы, возможно, позволяет функционировать метаногенным сообществам, в которых удаление водорода осуществляется лптотрофными гомоацетатными бактериями.

... О возможности_межвидового_ПСРСНОЯ_апетата в метаногенном

сообществе микроорганизмов: термодинамический расчёт. Механизмом ингвбирующего действия ацетат-иона может являться не только его токсичность для определенных микроорганизмов, по и смещение термодинамического равновесия процессов, идущих с образованием ацетата, в - сторону исходных веществ. В анаэробном сообществе разложение этанола, пропионата и бугврата до молекулярного водорода и ацетата (таблица 3, уравнения 1.1, 12, 13) может становиться энергетически выгодным хак за счет межвидового переноса водорода (уравнения 2.1, 22, 23), так и за счет межвидового переноса, ацетата (уравнения 3.1, 32, 33). Количественные оценки значения межвидового переноса ацетата при разложении ЛЖК и спиртов в настоящее время отсутствуют.

Изменение свободной энергии Гиббеа химической реакции складывается из двух составляющих, - изменения энтальпии, (¿Щ и изменения энтропии (JS): ЛО » лН - T4S. Результаты расчетов величии 4 О, дН, TiS реакций 2.133. (рисЗ) показывают, что движущей силой сшпрофного разложения веществ, осиованиого на межвидовом переносе ацетата, является- изменение энтропии, тогда ках в процессах, основанных на межвидовом переносе водорода,

ан*Ч1Г1».пеи и икпяп тгпппвпт чффиггд р^гциц,

Завиашостъ изменения свободной знании Гкббса реакций LI, 12 и 13 от концентрации ацетата ¿яс.4), показывает, .что изменение концентрации ацетата в биологически значимом диапазоне (0,1-100 мМ) может определять термодинамическую выгодностъ процеоса разложевия бутнрата.

Таблипа 3. Реакпии разложения этанола, пропноната и бутирата и соответствуюиие изменения ¿в ИдН.

Но - Реакпня ¿'с0' лн°

кдх/ноль .кЛж/моль субстрата субстрата

Апетогенез

и СНзСН2ОН + Н20 = СНзСОО" ♦ Н*. + 2Н2 +9.6 +76.5

1.2 СНзСН2СОО" + ЗН20 = СН3СОО~ + Н+ + НСОз" + ЗН2 " . +76.1 +196,9

1.3 СН3СН2СН2СОО- + 2Н20 = 2СНзСОО~ Н+ + 2Н2 +46.1 +121.6

. И е ж в и в о в о а , п е р е н о с в о д о р о да

2.1 - СН3СН2ОН ♦ О.5НСО3- = СНзСОО" ♦ 0.5Н* + О.5СН4 + 0,5Н20 -56.2 -50.0

2.2 СН3СН2СОО~ + 0.5Н20 = СН3СОО" + :0.25С02 + О.75СН4 -26.5 +7 .1

г.з • снзснгснасоо" + о.5со2 + я2о = аскзсоо-♦ н* + о.5сн4 -17.5 -4.9 " -

Н е ж в нд ов о й перенос апетата

3.1 снзсн2он + гя2о = сн4 + нсбз- ♦ н* + гн2 -21.4 +95.1

3.2 СНзСН2СОО" + 4Н20 = СН4 + 2НС0з~+ Н* + ЗН2 +45.5 +215.5

3.3 СН3СНгСН2СОО- + 4Н20 = 2СН+ + 2НС0з" + Н+ + 2Н2 -13.8 +159.3

60 40 20 . О -20 -40

-во

-во

250

200 150 1оо 50 С) -50 . -100

" ВИД'!« - ВМИЧЦ 1'Я'^-Ч i .<■'<. '.J KiáV-í а

Д2

2.2

¿H Тдз. IsJ

lías 2.3

З.Т

кат-:1

аз

at

Ж

аз-

лгРисЗ; ИзмененияTüS реакций 2.1-33..

/¡G', kJ

y^[H2j-a.OOr atm;4HCC331«SamH, ICH41-1 äfm-T, [butyrcta]«• [propionate]- [othanolJ-Ч mM-.

-5 -4 -3 -2 -1 O

tog [acetatej, », rA}í

Рис. 4,ЗавякимотшмеЬен1ОТ~С1!оба^ Гиббса (4G),: реакций 1.1-13

Следует помшггь, что термодинамическая выгодность реакции определяется концентрациями всех веществ, участвующих в процессе. Одним из наиболее удобных методов, позволяющих учесть влияние этих параметров, является математическое моделирование.

Математическое моделирование межвидового_переносу апеггата в

ыетаипгенппм сообществе микроорганизмов. Объектом математического моделирования . было термофильное метаногенное , сообщество микроорганизмов, разлагающее бутират. Функция, задающая термодинамическое ограничение роста биомассы и разложевия субстрата, ■мест следующий вид:.

еос(т)<

' 0. еслилОШ>$2»ш£^<3^ ^»тах (у^+К,^ если40т-Ф»щ

те иг в. {ВД}; В - бяомягга; - концентрация субстрата; т - химическая рготщп, т » 1_М; Бщцр - пороговое значение потребления субстрата;|птахпт, - 1шшш1ш удельная скорость роста; К^щц - константа папунасыщеши; - уровень энергии; С1 - свободная энергия ГЬббса,равная:

ЛС" - ЖЗШ0 + 11Т1п( П Б^ц/ П * » j

заесь От0 - спжпрпш свободная «рпи Гиббса; Ц -универсальная газовая мшшм; Т - шящщр; -кашдепрацин веществ в левой и

правей частях двяни тямицшй цщции соопектсвш^ А^ -сиаявиш циими юаффчришы; Ц^К.

№цяош мв—инмг жгпгришшов пргаляш на ряс. 5А4\ Ьамщи'и»! прпцкш, ■ когормх цидпив бушрц* осущеспшига: . '

"полным" сообществом микроорганизмов: бутиратразлагающий микроорганизм + Ме&алоЬааепит ЛетюаиилгорЫсша + МеШапоЛггх 5р. + МеШапо5атс1па ф, оба продукта разложения * водород и ацетат удаляются го системы (рис5А);

- бутиратразлагающим микроорганизмом 4- МеЛапоЬайепит йегтоаиЮ&орЫсит, ацетат из системы не удаляется (рисЛБ);

бутиратразлагающим микроорганизмом + МеШапоИтх $р. + Ме&ааскагёпа 5р. без удаления водорода (рис5В);

- только бутиратразлагающим микроорганизмом (ри&5Г% .

Риа5Б иллюстрирует явление межвидового переноса водорода, те, в

данном случае, возможность роста бутиратразлагающего микроорганизма за счет удаления водорода МЬ. ШетюаиЮЦорЫсиш.' Рис5В показывает возможность протекания реакции разложения бутирата в отсутствие водород-использующих метаногенов, тл. только за счет удаления ацетата ацетат-использующими метаногенами и иллюстрирует межвидовой перенос ацетата. Полученные данные позволяют оценить кинетические характеристики данного процесса. Видно, что основную роль в моделируемом здесь межвидовом - переносе ацетата играет МеШапоШНх, а МеШашкагсша из за относительно высокого значения растет значительно медленнее. _

Анализ изменения свободной энергии ГЪгббса, представленный здесь как функция времени, позволяет . выявить ' термоди нямические ■ режимы функционирования системы. Межвидовой' перенос ацетата осуществляется в термодинамическом режиме, менее выгодном' для сообщества, чем р?жим, в котором разложение бутирата происходит за (Лет межвидового- переноса водорода.' ".'•'."■,-.

Таким образом, концепция межвидового переноса ацетата не противоречит данным, полученым нами в ходе машинных экспериментов. Скорости микробиологических процессов, которые могут протекать за счет межвидового " переноса ацетата, являются достаточными до* его экспериментального наблюдения. ■

«хеппоаиюггорЫаш. 3 - НеМшпоигПх гр. САЬЗ-1. 4 - Ме'Ьапоэагста зр. СНТ1; Б - энергия Гиббса. КДж.уч-удевьная скорость разложения бутирата. час"', в - бутират. нн

бактерии, образующей гранулы.

Гранулированный 1Ш, образующийся в реакторах с восходящим потоком сточной воды через слой анаэробного ила (UASB), представляет собой сообщество анаэробных микроорганизмов, иммобилизованных _ в форме сферической биопленки. В настоящее время не существует однозначного обьяшешм явления гранулообразовадая, роль неметаногешшх микроорганизмов, в частности бактерий-бродилыциков, в этом процессе практически пе изучена.

Из метаногенного гранулированного ила UASB реактора, обрабатывающего отходы пищевой промышленности, мы выделили в чистую культуру микроорганизм, способный к иммобилизации за счет образования биоплешш (штамм S119). SX19 - облигатпый анаэроб, морфологически представляет собой неподвижные кокки 0,8-1,0 мкм в диамеггре, спор не образует, окраска по Граму - отрицателпая. Содержапие Г+Ц в ДНК - 41 мол.

Штамм S119 использует для роста ограниченный набор. субстратов (таблица 4), сахара пе используются. В качестве продуктов брожения образуются ацетат, пропиопат и водород. Рост наблюдается в интервале рН от 4,5 до 8Д отймальпая температура - 33-37°С. Удельная скорость роста на лактате 0,28 час*. Штамм S119 имеет высоко гидрофобную поверхность клеточной сгепки (октановый тест . - - 85%). На основе морфологии, цитологических и физиологических свойств хвалят 'отнесен к роду Veillonella.

Характерной чертой штамма S119 является образование внеклеточной слизи. Образование слизи зависело от роста биомассы и концентрации субстрата (таблица 5). Общий выход биомассы и внеклеточной слизи па моль лактата был относительно постоянным. Химический анализ слизи показал наличие полисахаридных фракций, состоящих, в основном, из гексоз.

Таблица 4. Использование субстратов и образование продуктов брожения штаммом 8119. Бели не указано в скобках (мМ), начальна; концентрация субстратов 20 мМ. . '

Субстраты использумые для роста

Субстрат ОП^ Продукты, ммоль/л Экономический

-------- коэффициент

ацетат пропионат Н2 г са/моль •

Лактат . 0,21 ■ИЗ 123 зз зз

Пируват 0,26 19,0 43 м 4Д

Цитрат (ЦП . 407 83 2,7

Малат 0,17 10,4 1М м 2,7

фумарэт 0,19 Ц» П9 ад 3.0

СукциватОДО АО т ад ад

Субстраты, не использумые для роста .

Глюкоза <10Х фруктоза (5), лактоза (5), мальтоза (5Х сахароза (5), мшпкод (5), целдобиаза (5), арабшгаза (5^ ксилоза (5), рибова (5), маннитол (5)> глицерин (20), крахмал (5 г/л), океалэт, акрилэт, бутират, метанол, этанол, аланин, лизин, аспаргат, дрожжевой экстракт (1 г/л), пептон (5 г/лХ ^¡СО^ (8020* об/об>

Таблица 5. Выход биомассы и внеклеточной слшп штамма 8119 при различных начальных концентрациях лактата.

Лактат ММ! Биомасса иг/л Слшь-мт/л. ^биомасса г/маль у 'слизь г/маль. Урбцпга г/МОЛь

10 4^2 233 4,0 23 63

20 70,г з&.о 33 13 5,0

40 97,4 едо 23 4,0 63.

60 104,1 162,0 V 2,7 43

Таблица б. Характеристики гранул, образованных штаммом 8119.

Параметр ' Количество ПАУ

ОД г/л 03 г/л

Число гранул • 115 118

Распределение УН5 115 35

по размерам ^5-2,0 62

(мм) 2,0-3,0 - 21

■Сухой вес (мг) • 9,0 24,7

Масса гранулы (мят) ' 78 209

Беззольное, вещество (мг) 4,5 6,6

(биомасса + внеклеточная слизь)

При культивировании штамма 5119 па качалке на среде, содержащей нерастворимые порошкообразные вещества (минеральные осадки, . активированный уголь), происходило образование гранул, диаметром 1,0-3,0 ММ. Образование гранул наблюдалось только в определенном/диапазоне скоростей перемешивания. Биомасса и внеклеточная слизь в сумме составляли от- четверга до половили массы гранулы в зависимости от концентрации порошкового аетипированного угля (ПАУ) (таблица 6),

^ Неспособность УеШопеИа $119 использовать углеводы, являющиеся осповйым источником углерода, поступающим в реактор, указывает, на то, что . даятлй организм должен расти в тесных ассоциациях с микроорганизмами, продуцирующими лактат. При развитии УеШойе11а в метапогенном сообществе ■ создается наибольшее количество трофических пит, а сипрофной и метаногепной частям сообщества доступна большая часть свободной энергии . Гиббса, чем при развитии других микроорганизмов, использующих лактат ' (таблица 7).

Таблица 7. Количество функциональных группировок микроорганизмов метаногенного сообщества и распределение изменения свободной энергии Гиббса (%) между ними при различных путях разложения лактата. ¿О реакции образования метана из лактата принято за 100%.

Микроорганизмы, Количество компо- ¿G, доступное для

осуществляющие нентов метаиоген- сшггрофиой и мета-

разложение лактата ного сообщества погешгай частей

сообщества, %

Гомоацетатные бактерии 2 45

Сульфатредуцирующие бактерии 3 96 (в отсутствие сульфатом)

Piopionibacterinm spp. 4 46

Vettlonella или Seleûomonas 4 59

Следовательно, разложение лактата, осуществляемое Veillonella - это наиболее выгодный процесс для сообщества в целом. Таким образом, Veillonella sp. S119 благодаря своим ростовым характеристикам, высоким адгезионным свойствам и ' энергетике использования субстратов является наиболее вероятным компонентом трофической цепи, проходящей через лакгат.

выводы.

1 .Установлено, что вязка* концентрация летучих жирных кислот я высокое содержание биомассы микроорганизмов являются признаками активного функционирования сбалансированного метаногенпого сообщества. Данные параметры могут быть применены при оценке работы действующих установок анаэробной биологической очистки.

2. Показано, что поддержание низкой концентрация ацетата за счет его \ удаления ацетат-Яагользующими метаногенами значительно увеличивает

скорость и полноту разложения этанола анаэробным сообществом микроорганизмоа Влияние ацетата на работу сообщества обусловлено изменением рН среды и ишибирующим действием ацетат-иона на процесс разложения этанола.

3. Путем математического моделирования дано кинетическое обоснование эффекту межвидового переноса ацетата в метавогевиом. сообществе. Показано, что скорости микробиологических процессов, которые могут, протекать за счет межвидового переноса ацетата, являются

■ достаточными для его экспериментального наблюдения. На основании , термодинамических расчетов установлено, что процессы сшпрофного разложения органических веществ, основанные на межвидовом переносе ацетата, должны осуществляться целиком за счет увеличения энтропии.

4. Из метаногенного гранулированного ила выделена и охарактеризована бактерия-бродильщик, способная образовывать гранулы в чистой культуре. На основании морфологических, физиологических и ' цитологических свойств дяяотлй организм отнесен к роду УеШопеПа.

5. Установлено, что образование гранул УеШопе11а $р. 5119 обусловлено высокой гвдрофобностью клеточной поверхности и образованием- внеклеточной слизи. Показано, что благодаря своим ростовым характеристикам, адгезионным свойствам и энергетике использования субстратов этот

микроорганизм является наиболее вероятным компонентом трофической цепи, проходящей через лактат.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Слободкин AJI, Кожевникова АЛ.

Влияние мегганообразующих бактерий на разложение этанола, термофильной метаногсшшй ассоциацией микроорганизмов. Тезисы докладов совещания по технической биоэнергетике БИОГАЗ-87, (отв.ред. MJE-Бекер), Pina 1987, сгр.93

2. Ведеаина ИЛ, Некрасова В.К, Слободана, А Л.

Методы оценки эффективности процесса метанового сбра>Ы1вага1я отходов животноводческих комплексов. Тезисы докладов совещания по технической биознергетике БИОГАЗ-87, (отв.ред. МЕБекер), Рига 1987, стр30

3. Веденшша ИЯ, Слободкин АД

í

Характеристика метанового сбраживания отходов животноводческих комплексов по содержанию биомассы микроорганизмов и летучих жирных кислот Микробиология, 1988, т57 вып.4, сгр.695-697

4. Ножешшкова АЛ, Симанькова МЛ, Слободкин AJL, Еоднар

ИИ. Соколова ТТ.

Роль мепшогенных архебактерий в анаэробном разложении органических веществ. Архебактерий, Пущшю, 1988 стр, 29-36

5. Кузнецов Л.Е, Ножевникова AJI, Некрасова В.К, Слободкин

АЛ, Симанькова MB, Ведешшпа ИЛ. Микробиологическая характеристика трехсекционной горизонтальной биогазовой установки, работающей на

отходах крупного рогатого скота

Прикладная биохимия и микробиология, 1989, т.25, вып.4, сгр. 540-547 б. Nozhevnikova АЛ, Slobodkin AJ.

The role of Methanothrix thennoacetophila in anaerobic thermophilic degradation of ethanol with nr'hane formation. Abs. 8th International Biotechnology Symposium, Paris, 1989, 2nd add. list, p.8 v 7. Сяободкип АЛ, Ножевникова АЛ.

Влишше Methanothrix thermoacetophila на разложенце этанола метаногенной ассоциацией микроорганизмов Прикладная Снохюгая и микробиология, 1990, т26, выпД сгр. 260-267

8. Nozhevnikova АЛ, Slobodkin Al

The participation of litholrophic homoacetogenic bacteria and Methanothrix in thermophilic anaerobic ethanol degradation with methane formation. In: Microbiology and Biochemistry of Strict Anaerobes Involved in Interspecies Hydrogen Transfer. J-P. Belaich (ed). New-York: Plenum Publ, 1990, pp 431-433.

9. Nozhevnikova AJi, Slobodkin AJ.

Regulaning role of acetate in anaerobic degradation of volatile fatty acids by methanogenic microbial community. In: International Symposium Environmental Microbiology, Ostend, Belgium, 22-25 april 1991, Part % pp 547-550

10. Петров GT, Слободнш AJI

О возможности межвидового переноса ацетата в метапогенном сообществе микроорганизмов. Микробиология, 1993, т. 62, вып. 5, стр. 869-875

1L Sobodkia A, Ventnete W.

Isolation and characterization at Vei'Unnella ip. from methanogenic granular sludge.

Applied Microbiology and Biotechnology, 1993, v. 39, pp. 649-653