Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция кальциевой проводимости в клетках гипофиза крысы линии GH3 под влиянием глюкокортикоидов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Регуляция кальциевой проводимости в клетках гипофиза крысы линии GH3 под влиянием глюкокортикоидов"

академія НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

РГ6 ОД На правах рукопису

І

Седова Марина Борисівна

РЕГУЛЯЦІЯ КАЛЬЦІЄВОЇ ПРОВІДНОСТІ В КЛІТИНАХ ГІПОФІЗУ ЩУРА ЛІНІЇ вНз ПІД ВПЛИВОМ ГЛЮКОКОРТИКОІДІВ

Спеціальність: 03.00.02 - Біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1995

Роботу виконано у відділі загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НДН У раїни

Науковий керівник - академік Платон Григорович Костюк.

Офіційні опоненти: академік Ігор Сільвестрович Магура;

д.б.н. Маргарита Костянтинівна Малишсва.

Провідна установа: Київський Державшій Університет ім. Т.Г. Шевченка

Захист відбудеться “ -3/ ” ТЛС-О^Ь ШН-У [995 р

на засіданні Спеціалізованої ради ,Д '-Of.Jb.Of при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інстнтугу фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Автореферат розісланий ** 1995

Вчений секретар спеціалізованої ради доктор бі ологічних наук

3.0. Сорокіна-Маріна

І

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Внутрішньоклітинний кальцій розглядається

у сьогоденні як один з найбільш універсальних посередників, що бере'

, /

участь у передачі сигналу під структур плазматичної мембрани до тіут-рішньоклітиннпх елементів, які забезпечують відгук клітини на зовнішній вплив. Іони кальцію запускають цитоплазматичні процеси, то лежать в основі клітинної збудливості, синаптичної передачі, скорочення та секреції.'

Ряд широко відомих патологічних станів пов’язаний з порушенням секреторної активності клітин аденогіпофізу, гормони якого беруть участь у регуляції багатьох фізіологічних процесів. Оскільки кальцій, що надходить у клітини переднього гіпофізу через потенціал-керовані кальцієві канали, грає суттєву роль в зв’язку стимул-секреція, безсумнівний інтерес викликають питаній відносно регуляції кальцієвої провідності під впливом речовин, які модулюють секреторну активність клітин цієї структури.

Є багато робіт, присвячених механізмам дії гіпоталамічних факторів на гіпофізарні клітини, але недостатня увага приділяється вивченню впливу гормонів періферійних ендокринних структур. Система гіпофіз-наднирннки привертає до себе увагу фахівців різних галузей медицини та неГіронаук. Проте, не дивлячись на інтенсивні дослідження метаболічних, протизапальних та антихлергічних зфектів глюкокортнкоїдів, потребують більш детального визначення шляхи регуляції цими гормонами електричної активності збудливих клітин, зокрема клітин гіпофізу, що експресують рецептори до цього класу гормонів. ,

Зручний об’єкт для дослідження регуляції функціонування потенціал-керованих кальцієвих каналів під час модуляції секреції в клітинах гіпофізу являють клітини клонованих ліній,. що дозволяють усунути труднощі, пов’язані з гетерогенністю популяції нормальних клітин. Однією з таких ліній є лінія вНз, клітини якої проявляють спонтанну електричну активність та виділяють гормон росту та пролактиіГ. ' .

Мета роботи полягала у вивченні регуляції кальцієвої провідності в клітинах гіпофізу щурів лінії ЄНз під впливом глюкокортнкоїдів. -

Задачі роботи'. 1. Вивчити вплив глюкокортикоїдів на секрецію гормону росту та пролактину в GH3 клітинах; 2. Дослідити зміни густини кальцієвих струмів різних типів в GH3 клітинах під впливом глкжо-кортнкоїдів; 3. Визначити часову та концентраційну залежності ефекту в умовах інкубації клітин з гідрокортизоном або дсксаметазоном; 4. Дослідити механізм дії глюкокортикоїдів.

Наукова новизна. Вперше виявлено вплив гллкокортиїкодів - стероїдів кори надннрників на кальцієву провідність в гіпофізариих клітинах. Показано, що гідрокортизон та дексаметазон збільшують густину низькопоро-гового та високопорогового компонентів кальцієвого струму при інкубації GH3 клітин в середовищі, що містить мікромолярні дози гормону. В ході посліджень визначені концентраційна та часова залежності ефекту. Наведені результати дозволяють пояснити описаний феномен на основі геномного механізму дії стероїдних гормонів. ■

Практична цінність. Виявлений ефект впливу глюкокортикоїдів на кальцієву провідність передбачає важливу роль регуляції експресії іонних каналів в опосередкуванні впливу глюкокоргикоїдів на електричну та секреторну активності клітин гіпофізу. _

Одержані дані можуть бути використані в майбутньому для ь.шчсннн механізмів спряження стимул-секреція, а також для з’ясування ролі потенціал-керованих каналів в регуляції стимульованої секреції в гіпофізариих клітинах.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені у вигляді стендової доповіді на радянсько-німецькому симпозіумі “Збудливі мембрани” (Київ, 1991), Па міжнародній робочій нараді “Механізми кальцієвого . гомеостазу клітин, які збуджуються” (Київ, 1993), а також доповідалися на засіданні Вченої ради Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України. (1994). ' '

Об'єм та структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, описання методів та експериментальної частини, обговорення, 7 висновків та списку літератури з 222 найменувань. Робота викладена на 115 сторінках друкованого тексту та ілюстрована 22 малюнками та З таблицями. За матеріалами дисертації опубліковано 3 роботи.

з

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Клітини лінії гіпофізу іцура GH3 культивувалися як монослойна культура в середовищі RPMI 1640 (Sigma) з додаванням 10% ембріональної' телячої сироватки (м. Мінськ) при 37°С в зволоженій атмосфері, що містила 5% СО2. Для эксперименте клітини висаджувалися з щільністю 1+2 х 10s клітин на чашку Петрі (30 мм) та використовувалися на третій-четвертий день після пасгіжу. . '

В- даній роботі кальцієві струми досліджувалися за допомогою методу фіксації потенціалу на цілій клітині в умовах щільного контакту (Hamill et al. 1981) та перфорованого петчу (Нот and Marty, 1988) при використанні каналотвірного антибіотику - амфотерицину Б. Густина кальцієвих струмів визначалась як відношення максимальної амплітуди струму до ємності клітини. Для оцінки останньої проводилося інтегрування ємносного струму у відповідь на прикладення гіперполярізуючого зсуву потенціалу AU (10 мВ). Величина интегралу дорівнює заряду Q, необхідному для перезарядження ємності клітини, яка знаходилась за відношенням Q/AU.

Аплікації здійснювали ин’єкцією під тиском з мікропіпетки, розташованої безпосередньо над клітиною або за рахунок зміни розчину в експериментальній камері. ■

Зовнішньоклітинний розчин мав такий склад (в ммоль/л); 140 NaCl, 10 HEPES, 15 СаСІ2, 2 MgCl2, 20 глюкози. Натрієвий струм блокувався додаванням І мкМ тетродотоксину. Розчин для заповнення петч-піпеток в умовах стандартного методу фіксації потенціалу містив (в ммоль/л): 130 CsCI, 10 EGTA, 5 MgCI2, 5 ATP, 10 HEPES, а при використанні методу перфорованого петчу: 55 CsCI, 75 CS2SO4, 5 MgCh, 10 HEPES. Значення pH розчинів складала 7.35. •

Контроль секреторної активності клітин проводився методом радіо-імунного аналізу з використанням стандартних наборів для визначення концентрації гормону росту та пролактину в сироватці крові (Radioassay Systems Laboratories, Inc., USA). • •

Вимірювання внутрішньоклітинної концентрації Са2+ здійснювалося за допомогою флуоресцентного зонду фура-2 по відношенню флуоресцент-' них сигналів на двох довжинах хвиль збудження (Grinkiewich et al. 1985).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Виділеная та характеристика кальцієвого струму в ЄН] клітинах

Кальцієві струми реєстрували, використовуючи стандартні шляхи виділення їх у чистому вигляді. Для цього клітини перфузували внутрішньоклітинним розчином, що містив Ся+ як основний катіон - для усунення вихідного калієвого струму. Натрієвий вхідний струм блокувався додаванням 1 мкМ тетродотоксину. В таких умовах деполярізація клітин від мембранного потенціалу, що підтримувався на рівні -75 мВ, до значень більш позитивних ніж -40 мВ, викликала появу вхідного іонного струму, який повністю зникав при введенні в зовнішній розчин 4 мМ Со2+. Таким чином, реєструємий вхідний струм був результатом активації потенціал-керованих кальцієвих каналів.

В роботі ми використовували традиційний протокол для розділення низько- та високопорогового кальцієвих! струмів. На мол. 1 наведені суміщені кальцієві струми, зареєстровані при двох значеннях підтримуючого потенціалу (У|,): -80 мВ та -40 мВ.

Легко побачити наявність двох компонентів, що відрізняються потенціалозалежними стаціонарними та кінетичними властивостями. Поріг активації компоненту струму, що мав швидку кінетику інактивації, знаходився в районі -40 мВ, а максимум вольт. амперної характеристики - в районі -10 мВ.

Другий компонент, що відрізнявся повільною інактивацією, мав поріг активації -

¿00 І

В

-60-40-20 0 20 40 60

300 Іт(Р А)

Мал. І. Два компоненти потенціал-керованого кальцієвого струму в СНз кліти-

20 мВ та максимум при +10 мВ. Низько- нах- А. Реєстрації струмів,

„ . отримані при V), = -80 та -40

пороговин компонент кальцієвого струму мВ, В. Вольт-амперні харак-

зникав при підвищенні У|,, що віддзеркалює теристики інтегрального (#),

„ . ... ... ... низько- (■) та високопоро-

розвиток його стаціонарної шактивацп. Ці (ОВОГО (р) кальцк.вих стру.

два компоненти обумовлені наявністю в мів.

мембрані вНз клітин двох типів кальцієвих каналів, що класифікуються як Т- і Ь-типи, знайдені в багатьох препаратах. .

Отже,'струм, іцо реєстрували при «= - 40 мВ, розглядали як струм, через високопорогові Ь-канали, а величина струму через низькопорогові Т-каиали оцінювалась по піку різницевого струму, який отримували відніманням високопорогового компоненту від загального кальцієвого струму.

Густини кальцієвих струмів визначались як відношення максимальної амплітуди до ємності мембрани клітини.

Вплив гідрокортизону (ГК) на секреторну активність клітин

Спочатку був здійснений контроль секреторної активності клітин шляхом відбору надклітинного середовища і проведення рааіоімунного аналізу з використанням стандартних наборів для визначення концентрації гормону росту та пролактну у сироватці крові.

Інкубація клітин на протязі 2 годин з 1 мкМ гідрокортизону приводила до підсилення секреції гормону росту на 44% та зменшення секреції про-лактину на' 10% в порівнянні з базальним рівнем секреції цих гормонів (мал. 2). Як базальна, так і індукована секреція повністю блокувалися додаванням у середовище 4мМ іонів Со2+.

Вплив гідрокортизону (ГК) на кальцієві струми різних типів

Малюнок 3 ілюструє вплив гідрокортизону на кальцієві струми в вНз клітинах. Верхні реєстрації отримані на клітині з контрольної групи, нижні

- на клітині, що була проінкубована 5 години з 1 мкМ ГК. Ліва колонка реєстрацій являє загальний кальцієвий струм, середня - високопороговий

І 1-контроль -гідрокортизон

Мал. 2. Вплив 2-годинної инкубації в 1 мкМ гідрокортизону на секрецію гормону росту (ГР) та гїролактину (ПРЛ) в клітинах.

компонент, а права - низькопороговий Т-компонент. Відповідні вольт-амперні характеристики (ВАХ) для цих двох клітин наведені знизу. Оскільки обидві клітини мали приблизно однакову ємність (~12 пФ), то можна побачити, що амплітуди обох кальцієвих струмів значно збільшилися після обробки гідрокортизоном. При цьому поріг активації та положення максимуму вольт-амперної характеристики обох компонентів струму не змінювались.

-80—1

1

10

\ґ~

_г

-40'

-30—!-

°"Ь

10

г

г

ЮОрЛ 1_

100 іт

20-^----------г

-40 -20 0 20тУ -40 -20 0 20тУ -40 -:0 О 20тУ

200рА

Мал. З, Вплив гідрокортизону на кальцієвий струм. А. Реєстрації, отримані на контрольній клітині (верхні) і на клітині, проінкубованій 2 годніш з І мкМ гормону (нижні). Ліва колонка - загальний кальцієвий струм, середня

- високонороговнй, права - низькоиороговий. Б. Відповідні ВАХ для контрольної VО) та обробленої гормоном (•) клітини. Мембранна ємність обох клітин ~12 нФ. ■

Концентраційна характеристика дії гідрокортизону В роботі була визначена концентраційна залежність дії гідрокортизону на кальцієву провідність при одногодннній інкубації. Ці результати зображені на мал. 4. Достовірне збільшення густин обох компонентів струму спостерігалося при концентрації гормону 10'8 М,‘ а максимальний ефект - при концентраціях - Ю'М0~* М.

Часова зaJ¡eжнicmь ефекту

Для дослідження часової залежності ефекту густина струму в клітинах, що піддалися дії 1 мкМ гідрокортизону на протязі фіксованого часу, статистично порівнювалася з густиною струму в клітинах, що були проін-кубовані в нормальному середовищі (мал. 5А). Вже через 0.5 години інкубації клітин з ГК, було зареєстровано збільшення густини обох компонентів струму. Максимальні значення густини струму спостерігалися після 2 годин' інкубації і становили 300% та 470% для Т- и Ь-струмів відповідно, порівняно з контрольними клітинами. Далі спостерігався спад густин обох компонентів струму до контрольного рівня за 24 години. Схожі результати були отримані при використанні синтетичного глюкокортикоїду - дексаметазону. В аналогічних умовах максимальний ефект досягався також після 2 годин інкубації з гормоном і становив 280% и 440% (мал. 5Б). .

Вплив глюкокортикоїдів иа інактивацію кальцієвого струму

Були проведені експерименти по дослідженню- впливу глюкокорти-коїдів на інактнваційні характеристики компонентів кальцієвого струму. Результати цих дослідів зображені на малюнку 6. Можна побачити відсутність суттєвих змін параметрів стаціонарної інактивації обох компонентів. струму (мал. 6А) та сталої часу інактивації Ь-каналів (мал. 6Б) після

1_в С (моль/л)

Мал. 4. Вплив різнігх концентрацій гідрокортизону на густину низько- (■) та висо-копорогового (0) струмів. Результат зображено порівняно з контролем.

Інкубації клітин у середовищі, що містило 1 мкМ гормону, на протязі 1.5 годин.

А

6 В 10

. час (години)

Мал. 5. Часова залежність дії І мкМ гідрокортизону (А) і дексаметазону (Б) на низько- (■) та високопороговий (В) струми. Ордината являє збільшення густини струмів, в клітинах, нроінкубованих з гормоном, відносно густини струмів в клітинах контрольної групи.

V!, (мВ)

Мал. 6. А. Стаціонарна інактивація кальцієвих струмів в контрольній (О) та обробленій гідрокортизоном (•) клітинах. Б. Вплив дексаметазону на сталу часу инактивації Ь-каналів.

Вплив актиноміцину Д на виявлений ефект глюкокортикоїдів

Відомо, що механізм дії стероїдних гормонів передбачає індукцію біосинтезу протеїнів в результаті взаємодії гормон-ре-цепторного комплексу з генетичним апаратом клітини. Тому ми досліджували вплив актиноміцину Д, інгібітору протеїнового синтезу на рівні транскрипції, на виявлений ефект.

Не спостерігалося збільшення густини кальцієвого струму після 1 години інкубації клітин в середовищі, що містило 1 мкМ дексаметазону при одночасному додаванні актиноміцину Д у концентрації 100 мкМ.

Вплив дексаметазону на L-струм в умовах перфорованого петчу

Аплікація ГК на протязі 30-40 хвилин безпосередньо на діалізовану клітину не змінювала природнього зменшення амплітуди кальцієвого струму з часом, що було пов’язане з вимиванням внутрішньоклітинного вмісту.

З метою збереження цитоплазматичних компонентів, і в той же час реєстрації кальцієвого струму застосовувалася перфорація частки мембрани за допомогою каналоутворюючого антибіотику - амфотерицину Б.

Результати наступного експерименту наведені для порівняння залеж-^ності змін L-струму від часу в умовах стандартного методу фіксації потенціалу на цілій клітині та перфорованого петчу. Реєстрації проводились при Vit = -40 мВ и деполяризуючому зміщенні до +10 мВ. Амплітуди струму нормовані до початкового значення. При використанні стандартного методу фіксації потенціалу на цілій клітині амплітуда кальцієвого струму збільшувалася на протязі перших 1-3 хвилин, а потім спостерігався швидкий спад струму (мал. 8 А," С-Д). В умовах перфорованого петчу кальцієвий струм

О -контроль Ш -дексаметазон Ш - дексаметазон + актиноміцин Д

Мал. 7. Вплив актиноміцину Д на густину кальцієвих струмів в клітинах, про інкубованих в присутньості декса ' метазону.

практична не змінювався на протязі 30-60 хвилин після створення конфігурації (мал.8 В, С-О).

В

—І ¿О XII .— —11

200 пА ,э

І/ІО

1.0

0.5

100 мс

ч

<гЬ*Аг

чрс (хвил)

зо

60

90

Мал. 8. Зменшення високопорогового кальцієвого струму в умовах стандартного методу фіксації потенціалу на цілій клітині -1 і перфорованого петчу -2. А. В. Кальцієві струми в умовах 1, 2 відповідно. С. Залежність амплітуди струму від часу для методу І-Д та 2-0. Амплітуди струмів нормовані до початкових значень. •

’ Використання методу перфорованого петчу дозволило нам попередити швидкий спад висо-копорогового компоненту кальцієвого струму та. зареєструвати ефект глюкокортикоїдів на нього. Мал. 9 демонструє вплив тривалої аплікації дексаметазону на амплітуду Ь-струму, яка наведена в процентному відношенні до середнього початкового. значення (125 пА). Ефект становив через 1 годину 54 ± 31% (п=3).

200

Г/Іо (%)

100

•••

* А*«* «МІ”

чіс (хвил)

50

100

150

Мал. 9. Вплив аплікації дексаметазону на Ь-струм в умовах перфорованого петчу. Початок аплікації вказаний стрілкою.

Вплив апплікації дексаметамну на внутрішньоклітинну концентрацію кальцію

Щоб відповісти на питання про існування швидкого ефекту глюко-кортико'ідів проводилися вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію в ОНз клітинах при аплікації дексаметазону. Короткочасна аплікація дексаметазону (1 мкМ, ~1 хвилини) не впливала на базальний рівень внутрішньоклітинного кальцію (мал. 10А). При цьому також не змінювалася амплітуда кальцієвої відповіді на деполяризацію клітини зовнішньоклітин-ним прикладенням гіперкалієвого розчину (100 мМ) (мал. 10В).

В

[Са2+]ІП (нМ)

100 -»

Мал. 10. Реєстрації внутрішньоклітинного кальццо при аплікації 1 мкМ дексаметазону. А. Відсутність ефекту дексаметазону на базальний рівень кальцію. В. Аплікація гормону не змінювала відповіді на деполярізацію гіперкапієвим розчином (100 мМ).

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Більшість робіт, що, мають за мсту вивчення механізмів спряження стимул-секреція, пов’язана з дослідженням ролі змін внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію (lCa2+]¡) та потенціал-керованих кальцієвих каналів в цьому процесі. З одного боку, розглядається вплив речовин, що здатні модулювати секреторну активність, на |Ca1+|¡ та кальцієву, провідність мембрани клітин, а з іншого - вплив агоністів та антагоністів кальцієвих каналів на синтез та секрецію гормонів.

Раніше було показано, що гідрокортизон стимулює накопичення мРНК гормону росту та його секрецію in vivo та in vitro в пухлинних клітинах передньої долі гіпофізу (Evans et al. 1982; Bancroft et at. 1969). Наведені нами експериментальні дані підтверджують стимулюючий ефект гідрокортизону на секрецію гормону росту в GH3 клітинах лінії гіпофізу щура і демонструють збільшення кальцієвої провідності під впливом гідрокортизону чи синтетичного глкжокартикоїду - дексаметазону.

Класичний механізм дії стероїдних гормонів полягає в зв’язуванні з внутрішньоклітинними рецепторами^ внаслідок якого відбуваються їх кон-формаційні зміни; активований комплекс транслокуєтьси в клітинне ядро та приєднується до елементу ядерної ДНК, що модулює транскрипцію визначених генів та синтез специфічних протеїнів (Rossier, 1989). Ці геном-ні ефекти характеризуються затримкою порядку кількох годин та чутливістю до інгібіторів транскрипції та/або трансляції, тобто до актиноміцину Д та циклогексиміду.

' Останнім часом все більше з’являється робіт, присвячених швидким . ефектам стероїдних гормонів, які неможливо пояснити з точки зору геномного механізму та які опосередковуються рецепторами (Weliling et al. 1992), відмінними від класичних цитозольних та/або ядерних (Arriza et al. 1987).

Наприклад, був виявлений швидкий ефект альдостерону на клітини моноядерних лейкоцитів людини (Wehling et al. 1991) та гладком’язові клітини кровоносних судин щурів (Moura & Worcel, 1984). В результаті була запропонована двофазна модель дії мінералкортикоїдів, в якій перший етап обумовлений зв’язуванням гормону з мембранним рецептором, що запускає

швідкі зміни в системі електролитиого транспорту (Na+/H+-o6MiiinnK) та проявляється через хвилини, а другий етап реалізується за геномним механізмом, що приводить до синтезу нових молекул NaVK^-АТФааи і може • бути зареєстрований через 1-2 години. Були показані участь протеїн кінази С та інозитолтрифосфату (IPj), а також збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію на першому етапі (Webling et al. 1994). Модель дії, запропонована для мінералкортикоїдів, має багато спільного з мембранними' ефектами інших стероїдів (McEwen, 1991). Пізніше були описані значні варіації в механізмах дії кортикостероїдних гормонів на різні клітинні процеси (Joels & de Klet, 1992).

D основі ефекту збільшення кальцієвих струмів може полягати змі-нення функціонування окремих каналів або збільшення щільності працюючих каналів. У першому випадку - за рахунок збільшення часу відкритого стану та/або збільшення частоти відкривання каналів. У другому - за рахунок синтезу та вбудови канальних білків або регуляції протеїнів, які здатні переводити вже існуючі канапи в активний стан. ■

• Відносно повільний розвиток ефекту в наших експериментах показує, що найбільш вирогідним механізмом, опосередковуючим вплив глюкокор-тикощів на кальцієву провідність в GHj клітинах, є геномний механізм. На користь такого припущення говорять дані, отримані в експериментах з одночасним прикладенням актиноміцину Д, оскільки в таких умовах не спостерігалося збільшення кальцієвих струмів.

Можна порівняти результаті нашої роботи з іншими дослідженнями впливів гормонів цього класу на іонну провідність в клітинах інших тканин. Відомо, що дексаметазон індукував появу низькопорогового компоненту кальцієвого струму в культивованих клітинах кісткового мозку (Publicover et al. 1994). Інкубація CAI нейронів гіпокампу з селективним агоністом глюкокортикоідних рецепторів на протязі 2 годин призводила до значного збільшення кальцієвих потенціалів дії та кальцієвих струмів (Kerr et al. 1992). Це збільшення кальцієвої провідності блокувалося циклогексимідом, що доводить залежність ефекту від протеїнового синтезу. Hayashi et al. (1991) показали, що дексаметазон збільшував вхід міченого 45Са2+ у А7г5 • гладком’язеві клітини кровоносних судин. Вхід іонов кальцію через дигідро-

піридин-чутливі кальцієві канали також блокувався інгібіторами протеїнового синтезу. Щоправда, далі була виявлена блокуюча дія інгибіторів протеїнкінази С (ПКС) на цей ефект (Kato el al. 1992). На підставі наведених даних природньо припустити, що дексаметазон може безпосередньо впливати на синтез канальних білків або ініціювати синтез певних протеїнів, здатних брати участь в активації ПКС.

Дійсно, функціонування високопороговнх потенціал-керованих кальцієвих каналів L-типу залежить від рівня активності гіротеїнкіназ. Оскільки ми спостерігали потенціювання обох компонентів кальцієвого струму, то даний ефект важко пояснити за рахунок фосфорилювання канальних білків. До того ж, дослідження впливів активаторів ПКС на кальцієву провідність в GH3 клітинах показали, що синтетичні аналоги діацилгліцеролу інгібують як Т-, так і L-компоненти кальцієвого струму (Marghetti & Brown, 1988), а форболові ефіри пригнічують вхід іонів кальцію в клітину у відповідь на деполярізацію гіперкалієвим розчином (Tornquist & Tashjian, 1990; Haymes el al. 1992). Необхідно зазначити, що фосфорилювання канальних білків може каталізуватися цикло-АМФ-залежною протеїнкіназою (ПКА). Було показано, що введення каталітичної субодиниці протеїнкінази А в клітини або підвищення внутришньоклітинного рівня цАТИФ викликало в ОН3 клітинах збільшення L-струму та сповільнення його інактивації (Armstrong ' & Eckert, 1987; Chad el ai 1987; Kalman el al. 1988). При цьому відбувалося стимулювання секреції пролактину (Murdoch et al. 1982; Delbeke el al. 1984; Rae et al. 1986; Sikdar et al. 1990). Як і у випадку активації ПКС, вказані ефекти реєструються на діалізованих клітинах і розвиваються на протязі кількох хвилин. Всі ці дані свідчать про те, що активація протеїнкіназ С та

- А не може імітувати ефект збільшення густини обох компонентів кальцієвого струму та інгібування секреції пролактину, що спостерігалися в нашій роботі.

З кожним роком розширюється класифікація кальцієвих каналів, що базується на відмінностях у потенціалозалежності, фармакології та кінетики функціонування. Однак, функціональна роль такої різноманітності кальцієвих каналів недостатньо вивчена. '

Вважають, що високопорогові L-канали, активні під час потенціалів дії чи в умовах суттєвої деполярізації клітини, можуть значно збільшувати [Ca2+|j, запускаючи секрецію та скорочення, а пизькопорогові T-канали регулюють генерацію потенціалів дії в нейронах, серцевих пеіісмекерних клітинах та багатьох секреторних клітинах, що виявляють спонтанну електричну активність (Wliite et al. 1989; Suzuki & Rogawsla, 1989; Wang et al. 1991; Hagiwara et al. 1988).

Було показано, що в нормальних клітинах гіпофізу, секретуючих пролактин (лактотрофах) ч:і гормон росту (соматотрофах), присутні обидва класи кальцієвих каналів. Проте вони по-різному представлені в цих типах клітин: густина L-струму практично однакова в лактотрофах (8.0 ± 4.0 пА/пФ) та соматотрофах (7.4 ± 4.4 пА/пФ), в топ час як густина Т-струму в лактотрофах (8.1 ± 6.0 пА/пФ) значно вища, ніж в соматотрофах (3.3 ± 1.8 пА/пФ) (DeRiemer, 1989). Оскільки лактотрофи характеризуються високим рівнем базальної секреції, було зроблено припущення про те, що два типи кальцієвих каналів в цих клітинах опосередковують два типи секреторної активності: базальний рівень секреції пролактину підтримується за рахунок активності низькогіорогових кальцієвих каналів, а стимульована секреція запускається активацією високопорогових каналів (DeRiemer & Sakinann, I9S6).

В наведених нами даних двогодинний вплив глюкокортнкоїдів підсилював секрецію гормону росту та паралельно призводив до потеиціації обох типів ri оте ішіал - керованії х кальцієвих каналів. Але ефект відрізнявся для низько- та високоиорогового компоіісшів кальцієвого струму: збільшення густини останнього було набагато більшим. Це можливо відображує тон факт, що саме L-каналн, головним чином, відповідають за регуляцію секреції гормону росту. Проте, незважачи на сильну потенціацію високо-порогових струмів, секреція пролактину ме тільки не стимулювалася, а натомість незначно пригнічувалася. Важко, пояснити, чому збільшення' кальцієвої провідності не супровлжувалось по ііпі'гпним впливом на секрецію пролактину. Можливо, що існують принципові розбіжності в механізмах контролю за секрецією різних гормонів в ОН3 клітинах. На клітинах іншої лінії GH^Cj, також секреіуючик і пролакпім, і гормон росту, було

показано, що синтез кожного з цих гормонів по-різному регулюється на рівні транскрипції пептидними, стероїдними та тиреоїдними гормонами (Murdoch et al. 1985; Bancroft et al. 1985).

Той факт, що ми не спостерігали ефекту при аплікації гідрокортизону безпосередньо на діалізуєму клітину, говорить про сильну залежність дії гормону від цілісності внутрішньоклітинних процесів. Для ряду гіпофізар-них клітин вже було показано, що внаслідок внутрішньоклітинної перфузії клітини втрачали вдатність відповідати на тиротропін-рилізінг-гормон (ТРГ) (Benhatn, 1989). Kramer et al. (1991) використовували нистатин для вивчення інгібуючої дії ТРГ на кальцієвий струм в GH3 клітинах без впливу екзогенних буферів на ICa2+|¡.

Використання методу перфорованого петчу дозволило нам попередити швидкий спад високопорогового компоненту кальцієвого струму и зареєструвати вплив дексаметазону на нього. Характерний час розвитку ефекту - десятки хвилин. Нам не вдалося побачити швидкий ефект дексаметазону на рівень внутрішньоклітинного кальцію при аплікації гормону'на клітину. Через це взаємодія глкжокортикоїдів зі структурами плазматичної мембрани в таких умовах уявляється малоімовірною.

Таким чином, наведені дані свідчать про те, що глкжокортикоїди ініціюють ланцюг біохімічних реакцій, в результаті яких підсилюється 'секреція гормону росту та збільшується потік кальцію через потенціал-керовані кальцієві канали. Результати роботи говорять на Користь впливу глюкокортикоїдів за класичним механізмом дії стероїдних гормонів, що передбачає індукцію біосинтезу канальних білків внаслідок зв’язування гормону з цитозольними рецепторами і подальшої взаємодії гормон-рецептор-■' ного комплекс з генетичним апаратом клітини.

Вже відомо про гормональну регуляцію експресії генів іонних каналів на різних об’єктах (Boyle et al 1987; Folander et al. 1990; Pragnell et a!. 1990). Levitan' et al. (19911 показали, що дексаметазон регулює рівень мРНК потенціал-керованого калієвого каналу в GH3 клітинах. Зміни експресії різних типів кальцієвих каналів спостерігалися в первинній культурі меланотрофів при тривг тій інкубації клітин з нейротрансмітером, що впливає на секрецію меланосшмулюючого гормону (Cota & Hiriart, 1989) та в

ЄНз клітинах під дією р-естрадіолу (ГШсІїіе, 1993). Це підтверджує отримані

нами результати про важливу роль регуляції експресії іонних каналів в

опосередкуванні гормонального контролю різних функцій клітин.

ВИСНОВКИ

1. За допомогою методу фіксації потенціалу на цілій клітині в умовах

щільного контакту показана наявність в мембрані клітин гіпофізу лінії

вНі двох типів кальцієвих каналів: низькопорогового, який

. не~

інактивується (Т) та високопорогового, який і і (активується (І.). Струми

через ці канали можна розділити підвищенням підтримуючого

потенціалу.

2. В роботі був виявлений потенціюючий ефект природного глюкокор-

тикоїду - гідрокортизону та синтетичного аналогу - дексаметазону на густини низько- та високопорогового компонентів кальцієвого струму в клітинах гіпофізу щура лінії ОН з. .

3. Досліджена залежність збільшення густини обох компонентів кальцієвого струму від часу інкубації клітин в середовищі, що містило 1 мкМ глкжокортикоїдів. Максимальне збільшення спостерігалося при часі інкубації 2 години і складало 300% та 470% для Т- і 1*-струмів відповідно при дії гідрокортизону, і 280% та 440% - при дії дексаметазону.

4. Інкубація клітин з глюкокортнкоїдами в концентрації 1 мкМ на протязі 1.5 години не впливала на параметри стаціонарної інактивації обох компонентів кальцієвого струму та сталої часу інактивації Ь-компоненту.

5. Отримана залежність доза-ефект для гідрокортизону при терміні інкубації

1 година. Максимальне збільшення густи її низько- та високопорогового компонентів кальцієвого струму викликалось гормоном в концентрації 0.1 мкМ.

6. В роботі встановлено, що блокатор протеїнового синтезу на рівні транскрипції - актиноміцин Д в концентрації 0.1 мМ повністю пригнічує збільшення густин низько- та високопорогового компонентів кальцієвого струму, викликане інкубацією клітин з дексаметазопом (1 мкМ) на протязі І години.

7. Показано, що проявлення ефекту залежить від присутності цито-

плазматичних компонентів. Збільшення кальцієвого струму не спостерігалось при аплікації гормонів на перфузуємі клітини в умовах стандартного методу фіксації потенціалу, але реєструвалося через десятки хвилин післч початку аплікації дексаметазону при використанні перфорованого петчу. Отримані в роботі дані свідчать на користь геноми, го механізму дії глюкокортикоїдів на кальцієві струми GH3 клітин. •

8. Показано, що стимуляція секреції гормону росту супроводжується

паралельним збільшенням густини L-струму в значно більшій мірі, ніж Т-струму. Це може відображувати той факт, що саме L-канали, головним чином, відповідальні за регуляцію секреції гормону росту в GHj клітинах. Пригнічення секреції пролактину, що спостерігалася при цьому, свідчить про різні шляхи регуляції секреції різних гормонів в цих клітинах. .

Перелік робіт, опублікованих за тематикою дисертації.

Фомина А.Ф., Седова М.Б. Увеличение плотности кальциевого тока в клетках линии гипофиза крысы под действием гидрокортизона // 2-ой Всесоюзный симпозиум ’’Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии”: Тез. докд. 1991.

Седова М.Б., Фоміна А.Ф. Регуляція кальцієвої провідності в GH3 клітинах під впливом глюкокортикоїдів // Конференція Львівського медичного інсллтуту: Тези доп. - Львів, 1995.

• P.G.Kostyuk, A.V.Kozlov, Z.Yu.Tkachuk, S.V.Viatchenko-Karpinski, M.B.Sedova, l.A.Mahailopulo, V.i.Kvasyuk and V.I.Teslenko. Eflect of "core" 2‘,5'-oligoadenylates on the phosphorylation-depedent calcium channels in GH3 cells //Україн. біохім. журн.-1995.-67, N l.-C. 26-32.

■ A.F. Fomina, F .G. Kostyuk and M.B. Sedova. Glucocôrticoids modulation of calcium currents in growth hormone 3 cells. // Neuroscience.-1993.-55, N 3,-P. 721-725. - • . :

В работе исследовалось влияние природного глюкокортиконда-гидрокортизона и синтетического аналога - дсксаметазона на плотность кальциевых токов и секрецию гормона роста и лролактина в клетках гипофиза крысы лшши СНз. При использовании метода фиксации потенциала на целой клетке в условиях плотного контакта было показано, что в мембране этих клеток присутствует два типа кальциевых каналов: низкопороговый инактивирующийся (Т) и высокопороговый неннактивирую-щийся (Ц, которые могут быть разделены повышением уровня поддерживаемого потенциала. Инкубация клеток на протяжении 2 часов в среде, содержащей 10'6 М гидрокортизона, приводила к стимуляции секреции гормона роста на 44% и подавлению секреции пролактина на 10%. Одновременно наблюдалась потеншіацпя низко- и высокопорогового кальциевых токов. Максимальное увеличение плотностей обоих компонентов тока вызывалось двухчасовой инкубацией и составляло 300% и 470% для 'Г- и Ь-токов соответственно при действии гидрокортизона, 280% и 440% - при действии дексаметазопа. При атом не наблюдалось изменения положения максимумов вольт-амперпых характеристик, параметров стационарной инактивлццн обоих компонентов тока и постоянной времени инактивации высокопорогового компонента. Получена концентрационная зависимость влиянии гидрокортизона при времени инкубации с гормоном 1 час. Максимальное увеличение плотностей обоих компонентов тока вызывалось гормоном в концентрации 10'7 М. Добавление 10'4 М актиномицин Д -блокатора протеинового синтеза на уровне транскрипции - одновременно с дексаметазоном в инкубационную среду полностью подавляло еффект. Аппликация глюкокортикоидов на диализнрованную клетку не изменила естественного спада . высокопорогового компонента кальциевого тока. Использование метода перфорированного пэтча поизвилило сохранить цитоплазматические компоненты и зарегистрировать увеличение Ь-тока через десятки минут после начала аппликации дексаметазопа. Кратковременная аппликация дексаметазона (1 мин) неИїзмешіла базального уровня внутриклеточного кальция и ответа на деполяризацию клетки внеклеточным приложением гиперкалиевого раствора.

Clonal malignant pituitary GH3 cells were used for the analysis of

glucocorticoid modulation of calcium permeability. We studied the influence of

hydrocortisone and dexamethasone 011 voltage-gated calcium currents and

hormone secretion. The whole-cell patch-clamp technique and perforated patch-

clamp were used. We shown the presence of low-threshold inactivating (T) and

high-threshold persisting (L) components in the total calcium current which could

be separa! d at less negative holding potential level. The growth hormone

secretion (measured by radioimmunoassay method) was increased by 44% after 2

h of incubation in the presence of 1 (iM hydrocortisone, while the secretion of

prolactin was slightly depressed (10%). Incubation of GH3 cells in the solution

containing 1 jiM hormone led to ail increase in current densities, that was

' maximal for both types of currents after 2 h exposure of cells. The elevation of the

HT current densities was significantly higher (more than a 4-fold) than that of LT

ones (about a 3-fold). We measured the dose-dependence of hydrocortisone effect

after 1 hour exposure of cells. The elevation of both types of Ca current densities

was clearly discernible with I0‘7 M hydrocortisone. Parameters of current

inactivation and current-voltage dependence were unaffected. Potentiation of

currents was blocked by audine 0.1 mM actinomycine D, suggesting that protein

synthesis was required for this effect. The stimulatory action of dexamethasone 011

HT current was observed under conditions of perforated patch clamp recording (T

' *= 29°C) after 20-30 min from the beginning of hormone application to the bath

solution but disappeared with the whole-cell patch technique used. Application of

1

dexamethasone did not influence the basal level of intracellular calcium and calcium transient evoked by high concentration of external potassium. The presented experiments suggest an important role of the regulation of genomic expression of Voltage-gated ion channel in glucocorticoids effects on pituitary cells.

5atra3 H22 Tup. iCO 9113.1995_r .yKpcneuMDHTasnpoeKT