Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика глюкокортикоидных рецепторов в мозгу крыс с разной стрессорной реактивностью гипофизарно-адренокортикальной системы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика глюкокортикоидных рецепторов в мозгу крыс с разной стрессорной реактивностью гипофизарно-адренокортикальной системы"

О А РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И. П. ПАВЛОВА

Ь Ш В95

На правах рукописи

ЕФИМОВ Станислав Вадимович

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛШЖОРТИКОИДШ РЕЦЕПТОРОВ В МОЗГУ КРЫС С РАЗНОЙ СТРЕССОРНОЙ РЕАКТИВНОСТЬЮ ГИПОФИЗАРНО- АДРЕНОНОРТИШЬНОЯ СИСТЕМЫ

Специальности: 03.00.04. - Биохимия

03.00.13. - Физиология человека и ливотннх

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Институте физиологии им. И. Е Павлова РАН. Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор К Г. Шаляпина.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ы. А. Флёров доктор биологических наук Е И. Емельянов

Ведущее учреждение:

Институт эволюционной физиологии и биохоыии им. И.М. Сеченова РАЕ

I ~ Защита диссертации состоится " -1995 г. б

— часов на заседании диссертационного совета по присуадению ученой степени кандидата наук К002.36.01 при Институте физиологии им. И.Е Павлова РАН (199034, С.-Петербург, наб. Макарова, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " ^ •" ■ - 1996 г,

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Э.А. КОНЗА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Глюкокортикоиды оказывают мощное влияние на углеводный и энергетический обмен и участвуют в физиологических процессах, которые связаны с выходом из стресса и нормализацией "всех " функциональных " систем, " активированных стрессорным возбуждением, К их числу относятся вегетативные функции и адаптивное поведение. Ещё более специфично с участием глюкокортикоидсв нормализуется функция самой гипофизар-но-адренокортичальной системы (ГАС) в ее гипофизарном и гипо-таламическом звеньях, а также в структурах, ответственных за настройку исходного регуляторного уровня.

К настоящему времени в области исследования механизма действия глюкокортикоидов на эффекторнне метки достигнуты немалые успехи. Сейчас твёрдо установлено, что основное действие этих гормонов в тканях-мишенях направлено на регуляцию эксп1 рессии генома. Посредниками в этом действии выступают рецепторы, образующие с глшжортикоидом гормон-рецепторный комплекс (ГРК). Состав, первичная структура и важнейшие свойства рецеп-тирующей молекулы сейчас известны. Установлено, что регуляция транскрипции гена осуществляется через связывание одного из ГРК, называемого активным, с гормон-чувствительным элементом (ГЧЭ) ДНК. С другой стороны, установлено, что глюкокортикоиды могут образовывать несколько ГРК со своим рецептором, различающихся по размерам, массе и способности связываться с ДНК (Yamamoto, 1985; Kali mi, Hubbard, 1983).

Таким образом, именно формирование активного коюлькса (АК), по. всей видимости, является ключевым событием передачи гормонального сигнала. В то re время механизм образования и

распада комплексов к настоящему времени не выяснен. Решение этой проблемы, как нам представляется, будет способствовать дальнейшему прогрессу в изучении регуляции ГАС в её гипофизар-ном и гипоталаыическом звеньях, а также в определении вовлечённости различных мозговых структур в эту регуляцию.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение и характеристика ГРК в структурах мозга крыс, различающихся по стрессореактивности и своему гормональному статусу. Для решения этого вопроса нами был разработан ряд новых методических приёмов, позволяющих регистрировать и оценивать состояние ГРК глюкокортикоидов в цитозольной фракции гомогена-та ткани.

Основными задачами работы являлось: 1) изучение молекулярного механизма формирования ГРК глюкокортикоидов и определение факторов, выьывающих их активацию-, 2) разработка метода оценки функционального состояния ГРК (активный, неактивный) и общего количества глюкокортикоидных рецепторов в цитозольных экстрактах гомогенатов тех мозговых структур крысы, участие '. которых в функционировании ГАС либо известно либо, предполагается; 3) с использованием разботанных методических приёмов, оценка функционального состояния ГРК в структурах мозга и гипофизе крыс на стандартных моделях повышенного и пониженного уровня кортикостерона в крови (адреналэктомия, стресс); 4)с использованием модели изменённого путём введения гидрокортизона в раннем онтогенезе состояния ГАС, сопоставление функциональной активности ГРК в изучаемых мозговых структурах со

стрессореактивкостыо тавотных; 5) определение обнаруживаются ли генетически-детерминированные различия в функциональном состоянии ГРК у линейных крыс, селектированных по порогу чувствительности к электрическому току; 6) регистрация изменений функционального состояния ГРК в структурах мозга у вышеупомянутых линейных крыс на фоне модификации ГАС путём краткосрочного й хронического стрессирования.

Научная новизна работы. В работе использован принципиально новый подход к решению задачи о регуляции передачи гормонального сигнала: в качестве критерия оценки физиологического действия гормона на ткань-мишень, в частности при регуляции ГАС, принято функциональное состояние ГРК кортикостероидов в экстракте гомогената ткани (активное, неактивное). Был разработан новый методический приём, позволяющий судить о функциональном состоянии ГРК; его использование позволило получить ряд конкретных результатов.

Впервые было показано: 1. Кадцьй из трёх выявленных гор-мон-рецепторных комплексов кортикостероидов существует в своём определённом интервале концентраций комплексобразуших элементов цитозоля (в том числе рецепторов) при данной температуре, солевом составе, рН, и обшэй концентрации белка цитозоля. 2. Образование и распад гормон-рецепторных комплексов' является последовательным и обратимым процессом. 3. Благодаря использованию экспериментальной зависимости величины рецепторного связывания от концентрации цитоволя, состояние репетирующей системы в структурах моага и гипофизе мотет быть оценено по двум

новым критериям: а) диапазону активного комплекса и б) насыщенности ткани рецепторами. Первый критерий пропорционален вероятности пребывания ГРК в активном (т.е. способном связываться с ДНК) состоянии; второй критерий прямо пропорционален концентрации комплекс-образующих элементов (в частности рецепторов) в цитозоле. 4. Генетические различия проявляются в состоянии рецептирующей системы,, оцениваемой по вышеуказанным критериям, при сравнении крыс двух генетических линий, селектированных по порогу чувствительности к электротоку (с высоким порогом* линия ВП-1 и низким порогом- линия НП-2). Крысы НП-2 имеют большую насыщенность ткани рецепторами в гипофизе чем крысы ВП-1, Стрессорное воздействие вызывает уменьшение диапа-вона активного комплекса в гипофизе и гипоталамусе у крыс НП-2 и его увеличение в этих структурах у крыс ВП-1. Е. Насыщенность ткани рецепторами изменяется вследствие достаточно длительных (несколько дней) и сильных воздействий, изменяющих состояние ГАС (адреналэктомия, хроническое стрессирование, не-онатальное введение гормона). Этот параметр отражает,, превде всего, количественные изменения в рецептирующей системе. 6. Диапазон активного комплекса изменяется как вследствие длительных и сильных воздействий, так и при краткосрочных и относительно слабых воздействиях, изменяющих состояние ГАС. Этот параметр отражает быстрые, качественные изменения в состоянии рецептирующей системы. V. Стрессорная реакция, сопровождавшаяся реличением уровня кортикостерона в крови, связана с переходом гормон-рецепторного комплекса в гипофизе й гипоталамусе

из активного в неактивное состояние (уменьшение диапазона активного комплекса). 8. Причиной отсутствия нормальной стрес-сорной реакции или снижения уровня кортикостерона после дрессирования является трансформация комплекса в активное состояние в гипоталамусе и в гипофизе.

Практическая вначиюстъ. Разработанный новый методический подход и полученные экспериментальные результаты могут способствовать дальнейшему прогрессу в изучении функционирования ГАС, что в свою очередь важно для решения проблем адаптации и устойчивости организма к стрессорным воздействиям.

Апробация работу. Результаты работы доложены и обеулщены на конференции по программе "Сигнал" (Москва, 1991). на заседании физиологического общества (С.-Петербург, 1992), на конференции молодых учёных "Механизм регуляции физиологических функций" (С.-Петербург, 1992), на симпозиуме по базальным ганглиям (Ялта, 1993), на заседаниях лаборатории физиологии и патологии эндокринной системы Ин-та физиологии им. И. П. Павлова (1991-1994).

Публикации, Основное содержание диссертации отражрно в 7 печатных работах.

Структура, и объем. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, излогения- методики, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, который содержит 146 работ. Объём диссертации 166 страниц машинописного текста, включая 41 рисунок и 3 таблицы.

- 6 -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Основу экспериментов составлял радио-рецепторный анализ при насыщающих концентрациях гормона (15-20 нМ) (А(?аг*е1, 1083) е использованием меченых гормонов высокой молярной активности. Разделение свободной и связанной рецепторами части растворённого гормона осуществлялось с помощью декстран-уголь-ной суспензии. При этом определялось несколько типов экспериментальных зависимостей, в том числе зависимость величины гормон- рецепторного связывания от содержания цитозольных рецепторов в экстракте гомогената ткани при постоянных температуре, рН, содержании гормона и времени инкубации (кривая обратного титрования). Определялись- также зависимости изменения рецепторного связывания от времени инкубации цитоэоля с меченным гормоном как при образовании ГРК, так и при их распаде, на ос нове чего строились кинетические кривые. В качестве лиганда использовали %-кортикостерон и ^Н-дексаметазон с активностью 2,7ТБк/мМэль производства Государственного Института Прикладной Химии (С.- Петербург).

В своих экспериментах мы использовали самцов крыс весом 250-300 г. Адреналэктомию осуществляли за 7 дней до опыта. Крысы получали стандартный корм и для питья 0.91 раствор 1Ш. В качестве стрессорного воздействия использовалось электрокожное раздражение крыс, помешенных в клетку с токопроводящим полом. Стрессирование продолжалось в течении 16 мин, при.этом электрический ток (1 мА, 60 Гц) подавался периодически по 16 с с интервалами меаду подачей тока в 46 е. Стрессирование кивот-

ннх проводилось за 24~часа~до забоя. При хроническом етресси-ровании использовалось комбинированное влияние злектрокомюй стимуляции и света, подаваемых в камеру по стохастической программе, предложенной Гехтом (Hecht und and., 1972). Этим способом крыс стрессировали 2 недели и забивали спустя 20 дней. Последнее воздействие вызывало у крыс стойкое невро-во-подобно» состояние, которое длилось около месяца (Гофман и др., 1987). Концентрация кортикостерона в крови определялась радиоиммунологическим методом (Морозов и др., 1988).

. Экспериментальные значения, представленные в таблицах и на рисунках, являются средним по 2-6 параллельным измерениям, ^верительный интервал определен по методу Стьвдента. В неравновесном эксперименте (кинетическая кривая) относительная погрешность определена из известных погрешностей приборов, она не превышала 57.. Использованы реактивы: Coomassl Blue (для определения белка) "SERVA"; Tris Мв-121,1 "SERVA"; Dextran Мв-100000 "SIGMA"; бычий сывороточный альбумин "SIGMA". Остальные реактивы отечественного производства имели категория Чистый Для Анализа,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ I. Образование и распад ГРК гтююргтиж/хв. .В резуль-. тате исследований было- обнаружено, что, в зависимости от выбранного диапазонз концентраций цитозольного экстракта гомоге-ната ткани, кинетические кривые рецепторного связывания км^егг Три различных вида (Ефимов, Шаляпина, 1991; Ефимов, 1993; Ефимов, Ордян, 1995), что свидетельствует об образовании трёх

различных ГРК. Эти кривые представлены на рис. 1.

Рис.1 Временные зависимости

ZO-

0

so *,"»»■

величины рецепторного связывания меченого кортикостерона (распадов в минуту (РВМ)) цитозолем печени при трёх концентрациях цитозоля: I- 7 г/л, II- 40 г/л, III- 100 г/л. Концентрация меченого кортикостерона- 54нМ. Ось ординат- (РВМ«10'}) для I, (РВМ0'3)/2 для II и

(РВМО*3 )/3 для III.

Кривая I получается при формировании ГРК в первом диапазоне концентраций экстракта гомогената 2-10 г/л (печень). Эта кривая хорошо соответствует модели Ой-молекулярного взаимодействия гормона с рецептором по уравнению : Н+Н -,НР , где Н- гормон, й- рецептор, что подтвердилось в наших модельных экспериментах на ЭВМ. Кривая И имеет место для второго диапазона концентраций 20 - 60 г/л. Форма этой кривой свидетельствует об образовании конечного ГРК через стадию образования и распада промежуточного комплекса, которым является комплекс НЯ. Рисунок кривой III (третий диапазон концентрации цитозоля печени 80 - 100 г/л) указывает на то, что образованию конечного ГРК предшествует образование и распад двух промежуточных комплексов. Таким образом, на основе анализа кинетики рецепторного овязывания можно предположить, что образование ГРК является последовательным процессом, а конечный продукт реакции зависит от концентрации комплекс-образующих элементов цитозо-'

ля (в-частности, рецепторов!; комплекс" простейшего состав? СИР! устойчив только в сильно разбавленных иитоэольных рзствсрах. Три выявленных диапазона концентраций цитозоля характеризуются не только своей особой кинетикой образования ГРК, но и своим особы" значением эффективности рецепторного связывания кортикостерон'1 Если за единицу удельного специфического связывания принять связывание ко|>!И"о?т®р°нч щгозол?м печени при концентрации п""»вР. него - lOOr/л, то при концентрации цитозоля -40г/л удельное специфическое связывание будет составлять 2 ециници, а при концеит■ *

рации цитозоля - 7г/л оно будет равно 4-м единицам.

Как было отмечено вьчве, в области концентраций цитозоля около 7г/л образуется простейший комплексе 1) - HR. Эффективность

связывания гормона этим комплексом выше в 2 и в 4 раза, чем коми лексами И » Ш, образующимися в области концентраций шаговом 40 и 100 г/л соответственно, отсюда мы делаем вывод, что состав комплекса И монет быть отраден Формулой HR2,а состав комплекса III- формулой Hfy. В соответствии с количеством рецепторов эти комплексы мы именуем лёгким, промежуточным и тякрлш.

Области существования трёх ГРК выявляются и на кривой обратного титрования (рис.Е). Каждой области концентраций цитозоля, соответствующей областям существования лёгкого, промежуточного и тяяйлого комплексов, соответствует свой участок кривой (1,11 я Ш), . отделённый от соеелних горизонтальными участками. Крутизн? этих участков убывает от I до Ш в полном соответствии с :*бгаа нием эффективности гормонального связывания в комплексах от лёгкого до тяжелого. Ваяно отметить, что вид кривой обратного титро-

вания полностью одинаков для двух вариантов последовательности формирования ГРК: в первом варианте меченый гормон вносится в пробы с различной концентрацией цитозоля, во втором варианте концентрированный цитоэоль (100-150г/л) инкубировался с меченым гормоном в течении 3 час для формирования тяжёлого комплекса, а затем из этого инкубата приготавливался набор проб с различной концентрацией цитозоля путём разведения раствором меченого гормона той же концентрации что и в инкубате, после чего осуществлялась вторичная инкубация в течении 3 час. Совпадение кривых обратного титрования может свидетельствовать о том, что образование ГРК не только последовательный, но и обратимый процесс.

Рис. 2 Зависимость величины специфического связывания меченого кор-тикостерона от концентрации цито-8оля печени(г/л). Ось ординат -тысяч распадов/мин. Концентрация гормона 20нМ. Лк, Пк и Тк -диапазоны лёгкого, промежуточного и тяжёлого комплексов.

Кривая обратного титрования очень удобна для сравнительной оценки преимущественного существования того или иного комплекса в клетках.исследуемых тканей: действительно, если на кривой обратного титрования экстракта гомогената ткани не выявляется участок! 1!, то мы шжем обоснованно предполагать, что образование

- 11 - _____

тяжёлого комплекса в клетках этой ткани маловероятно, и с другой стороны, если на той же кривой участок III доминирует, то это указывает на большую предпочтительность образования тяжёлого комплекса в клетках. При этом мы учитываем компартментализацкю клеток, способную обеспечивать неравенство концентраций цитозоль-ных комплексобразующих элементов по всему обтЗму клеток.

Яругой ря*яой особенностью комплексобразования является факт существования определённой минимально необходимой концентрации рецепторов для возникновения специфического связывания. Это проявляется в том, что кривая обратного титрования начинается не с нулевой концентрации цитоэоля (рис. 2): При этом наш было отмечено,' что для более насыщенных рецепторами тканей рецепторное связывание начинает проявляться при меньших концентрациях цитозоля (например, при сравнении печени и мозга, гипофиза и стриатума!. Отсюда мы делаем вывод о том, что величина, обратная координате начала кривой, пропорциональна обшей плотности рецепторов в ткани. Эту величину мы именуем насущтоспю ткани рецепторам (Нгк).

Важнейшим этапом в решении поставленной нами задачи бшга определение того, который из трёх выявленных ГРК является активным, то есть, через какой комплекс осуществляется гормон-зависимая регуляция экспрессия генома в тканях-мишенях. На основании литературных данных и собственных исследований по температурной активации ГРК и применения сильного агониста глюкокортикоилов (/ркояме-тазона) мы пршш к выводу о том, что активным ГРК является про межуточный комплекс. В пользу этого заключения мы приводим 5

йыювш доводоь; 1) 0 гормон-чувствительным элементом да активный комплекс связывается в димерной форме (Rupprecht et al., 1993; Реагсе and tocto, 1993); димером (по рецептору) является и промежуточный комплекс. 2) Нагрев цитозоля до 3?'С с последующим охлаждением до 0*0 приводит к активации ГРК (Agarwel, 1983); проведённый нами нагрев высоко концентрированного цитозоля приводил к исчезновению второго пика.на кинетической кривой и к исчезновению участка Ш на кривой обратного титрования, что свидетельствует о разрушении тяжёлого комплекса и доминировании промежуточного ГРК, 3) Неактивный комплекс больше по размерам и массе активного(А«аг*в1, 19??); следовательно, тяжёлый комплекс не может быть активным. 4) Разведение цитозоля приводит к активации ГРК in Vitro (Andersen, 1977); промежуточный комплекс устойчив при меньших концентрациях цитозоля чем тяжёлый. 6) Известно, что дексаыетаэон по сравнению с кортикостероном имеет более сильное ядерное проникновение и действие in vitro и более выраженный биологический эффект in vivo (Голиков, 1988); проведённое нами сравнение кинетических кривых и кривых обратного титрование показало, что тяжёлый дексаметазоновый комплекс неустойчив и что в широком диапазоне концентраций цитозоля доминирует промежуточный ГРК дексаметазона. Этот вывод следует из того, что кинетическая кривая связывания дексаштазона (ДЮ, даже при болыш концентрациях цитозоля имеет только один пик, а на кривой обратного титрования для Ш участок Ш (рис.2) Чётко не выявляется из-за большого разброса значений в этой области. В остальном кривые обратного титрования да КС и ДМ схожи. Таким.образом, одним-из результатов

- - 13 - ---------

перьсй части исследований явилась разработка метода оценки функционального состояния ГРК в тканих-мииенях. Из кривых обратного титрования для экстрактов гомогената ткани мы извлекаем величину диапазона промежуточной^активного) комплекса (АН), отражапэдую вероятность его(комплекса) существования в клетках и величину насыщенности ткани рецепторами (Нтк). Слвъуе? отметить, что акти вация рецептируюшей системы мотет проявляться как через увеличение диапазона АК (отрезок Пк на рис. 2), так и через уменьшение Нтк (сдвиг кривой вправо). Кроме этих критериев мы измеряли величину рецепторной ёмкости - традиционной характеристики рецептиру-ющей системы (Емельянов, Герасимова, 1990)

II. Оценка функционального состояния ГРК в структурах мозга и в гипофизе крыс с изменённой стрессо^аюиьностыа

Оценка функционального состояния ГРК в структурах мозга и в гипофизе по разработанным нами критериям и с использованием ДМ и КО была проведена на пяти экспериментальных моделях как в норме, так и после активации или подавления функции ГАС.

В первой серии опыты проводились на крысах линии Вистар. Их стреееирование (единичный электрошок) вызывало уменьшение диапазона АК в гипофизе и гипоталамусе и его увеличение в етриатуме. Изменений в Нтк не было обнаружено. Рецепторная ёмкость по ДМ уменьшилась в гипофизе и гипоталамусе, а по КСв гиппокампе и стриатуме, что согласуется с литературными данными (Заро^зку е>. в1., 1984; Мэапеу а1., 1988). Спустя 1 неделю после адреналэк-томии, в соответствии с литературными данными (Емельянов, Герасимова; 1990), наблюдалось увеличение рецепторной ёмкости во всех

структурах кроме гипофиза. Диапазон АК возрос в стриатуме и гип-покампе, а в гипофизе не изменился. В стриатуме и гиппокампе возросла и Нгк, в то время как в гипофизе этот показатель достоверно снизился. Результаты этой серии показали, что Нтк не меняется при краткосрочном стрессировании, но меняется при достаточно сильном и длительном воздействии, что, по всей видимости, связано с синтезом рецепторов de novo. Диапазон AR меняется как при краткосрочном, так и при длительном воздействии на ГАС и отражает в большей степени качественные изменения в состоянии рецептирующей системы.

Вторая серия опытов была проведена на крысах с неонатальннм введением гидрокортизона, который применялся в дозе 0,1 мг с 1-го по 6-й день жизни крысят. У этих животных в возрасте 1,6 мес, по сравнению с контролем (вместо гидрокортизона вводился физраствор), диапазон АК в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме был сни-jssh, а величина Нгк в этих структурах возросла, при этом рецеп-торная ёмкость оказалась сниженной, вероятно, 8а счёт уменьшения диапазона АК. Стрессорное воздействие не вызывало у этих крыс обычного подъёма уровня кортикостерона в крови, вместе с тем, по отношению к нестрессированным сверстникам, у них наблюдалось достоверное увеличение диапазона АК (по КО) в гипофизе, а не уменьшение, как в контрольной группе. К 3-х мес возрасту различия в состоянии рецептирующей системы опытной и контрольной групп бы1 ли незначительными. В этом возрасте крысы имели нормальную стреесореактивность, и стресс вызывал у них уменьшение диапазона АК Ь гипофизе и гипоталамусе и увеличение в стриатуме, как-й в

_____- ¡5 - . . - ------ -

контрольной группе. Результаты этой серии показали, что введение гидрокортизона крысятам в неонатальном онтогенезе модифицирует РАС на срок до 1,5 мес. Модификация проявляется в изменении состояния рецептирущей системы в гипофизе и структурах мозга, а таш в отсутствии нормальной стрессореактивности, характеризующейся выбросом кортикостерона в кровь.

Оледувидя серия опытов была проведена на линейных крысах, селектированных по порогу чувствительности периферического отдела нервной системы к электротоку - линия ИИ характеризовалась высоким-, а линия НП-2 низким порогом чувствительности. Эти две линии различались и по многим другим параметрам, характеризующим возбудимость нервной системы (Байдо и др., 198?; Лопатина, Шно-маренко, 1987). !&жлинейные различия проявились и в состоянии репетирующей системы. В гипофизе Нтк у крыс НП-2 была достоверно выше, чем у ВП-1. Диапазон АК (по ДМ) у БП-1 был меньше в гипоталамусе и больше в гиппокампе, чем у НП-2. Нэвротизация по Гехту вызвала разнонаправленное изменение уровня кортикостерона у крыс этих линий, сохранявшееся вплоть до 20-го дня после воздействия. Спустя 20 дн. после 2-х недельной невротизации у крыс БП-1 наблюдалось снижение уровня кортикостерона, а у НП-2 его повышений. Невротизация вызвала и разнонаправленные изменения в состоянии рецептирущей системы. На 20-й день у крыс ВП-1 диапазон АК был увеличен, а Нтк была снижена б гипофизе и гипоталамусе. У крыс нь НИ- 2, наоборот, в этих структурах диапазон АК был снижен, а Нтк увеличена (контролем служили крысы этих т линий, не подвергнутые невротизации). Как и в предыдущей серии, наблюдалась взаимосвязь

между увеличением уровня кортикостерона в крови в ответ на стрессируотее воздействие и дезактивацией рецептирующей системы в гипофизе и гипоталамусе (уменьшение диапазона АК и увеличение Нгк). Основные результаты представлены в обобщённой форме в таблице 1.

Таблица 1.

Изменение состояния рецептирующей системы после воздействия, сопровождавшегося изменением уровня кортикостерона (КС) в крови. 1. - невротизация крыс линии БП, 2. - невротиаация крыс линии Ш. Стрессирование крыс, подвергнутых неонатальному введению гидрокортизона: 3.- в возрасте 1,5 мес. и 4.- в возрасте 3 мес. (+), (-) и (0) - активация, дезактивация и неизменность состояния гормон-рецепторного комплекса соответственно.(КС-), (КС+) и (КО 0) - уменьшение, увеличение и неизменность концентрации гормона в крови, соответственно.

IВовдействие 1__

II. (КС -)

гипофиз (гипоталамус [гипяокамп |стриатум

,_I_I_I_

+ 1 ♦ 1-10

1—.........!....... |£. (КС +) 1 - 1 - 1 _ ♦ 1 - 1

|Э. (КС 0) | + 1 0 1-10 1

14. (КС 4) ,| -1 ...... 1 ., I - 1 . 1 0- 1 4 • I 1............1 •'. 1

- 17 •• ...... _ _________

При рассмотрении приведённых данных легко обнаружить закономерность связи активации/дезактивации ГРК в гипофизе и гипоталамусе и увеличением/не увеличением уровня КС в крови крыс ъ ответ на стрессорное воздействие. Закономерность заключается в том, что дезактивация ГРК в гипофизе и гипоталамусе сопровождается стрессорным подъёмом уровня гормона, а активация ГРК в зш структурах является индикатором либо отсутствия стрессореактиь-ности (крьюы с неонатальным введением гидрокортизона), либо аномального снижения уровня гормона в ответ на невротивацию (крысы ВП-1).

Как известно, активный по отношению к ДНК гормон-рецепторный комплекс является регулятором транскрипции в клетках тканей-мишеней. Приведённые данные и их анализ позволяют сделать более определённое заключение, а именно, что в гипофизе и гипоталамусе активный ГРК является репрессором транскрипции генов, участвующих в регуляции ГАС по механизму обратной связи.

Таким образом, активированный стрессом ГРК в гипофиое и гипоталамусе, по всей видимости, действуя ¡сак репрессор в процессе регуляции транскрипции, препятствует развитию нормальной стрессорной реакции и даже приводит, в конечном счёте, к аномальному снижению уровня кортикостерона после сильного стрессирова-ния. Нормальный стрессорный ответ свяван с переходом ГРК в неактивное состояние в гипофизе и гипоталамусе, что вызывает снятие репрбссорного действия ГРК и активацию транскрипции, что в конечном итоге приводит к возрастанию уровня кортикостерона 8 крови.

Особое место занимает Случай адренэлэктомии. Как отмечено в

работе DaHiran(Dallman et al., 1987), в первые несколько дней после операции все изученные компоненты адренокортикальной системы повышают уровень своей активности. В паравентрикулярном ядре гипоталамуса в нейросекреторных клетках, синтезирующих кортикот-ропный ре лизинг гормон (КРГ) и аргенин-вазопрессин (АВП), повышался уровень препро КРГ мРНК и препро вазопрессин мРНК, это повышение предотвращается введением дексаметазона. Спустя неделю после адре'налэктомии уровень АВП в портальном кровотоке увеличивался по сравнению с контролем (ложнооперированные крысы). После адренааэктомии значительно усиливается кортикотропная активность гипофиза и пролифирация кортикотропов, при этом значительно увеличивается концентрация мРНК проопиомеланокортина (ГОМК мРНК). Все отмеченные последствия адреналэктоши предотвращаются введением кортикостероидов. и, как справедливо отмечает Dallman, эти изменения являются специфическим следствием размыкания (opening) петли обратной связи. Вызванный адреналэктомией всплеск транскрипционной активности в клетках гипофиза и гипоталамуса яб-ляется убедительным подтверждением нашего вывода о репрессорном свойстве активного ГРК в этих структурах. Действительно, удаление из системы кортикостероидов приводит к исчезновению всех гор-мон-рецепторных комплексов, в том числе и активного, операторный участок ДНК освобождается от репрессора, что вызывает неконтролируемую транскрипцию. Введение äse гормона адреналэктомированньМ хквбтным приводит к образованию комплексов, активный ГРК подавляет Транскрипцию и таким обрайом исходное состояние на некоторое вреда восстанавливается. Особенно эффективно в этом смысле вво-

дексаметазон, который, как было показано в первой части, образует преимущественно активные ГРК. На ДНК, с которой транскрибируется ПОМК мРНК, по-видимому, кроме операторного имеется и промоторный участок, так как изоляция гипофиза от гипоталамуса хирургическим путём, таким образом, что гипотаяамический КРР не попадает в гипофиз, уничтожает всплеск транскрипционной активности в кортикотропах у адреналэктомированных животных (0а11тап 91 а1., 1987). Является ли промотором сам гипоталамический КРГ, пока не ясно. Что касается гиппокампа и стриатума, то прямой связи между активацией ГРК в этих структурах и уровнем кортикостеро-на в крови, которая нашла бы подтверждение на разных моделях животных и при различных воздействиях, не обнаруживается (табл.1). Можно лишь констатировать, что, поскольку адреналэктомия вызывает увеличение насыщенности ткани рецепторами и увеличение диапазона активного комплекса, значительно повышая рецепторную ёмкость в этих структурах, кортикостероиды играют важную роль в их функционировании. Нами также отмечено, что при нормальной стрессореак-тивности ГАО, ГРК в стриатуме переходит в активное состояние, в противоположность гипофизу и гипоталамусу. Однако, невротизация крыс линии Ш-1, сопровождавшаяся увеличением уровня кортикосте-рона в крови, вызвала активацию ГРК не в стриатуме, а в гиппокам-пе. Складывается обшее впечатление, что состояние ГРК в шо$де>е и гипоталамусе, о одной стороны, и в гиппокампе и стриатуме, о другой, при воздействиях на ГАС изменяется разнонаправленно.

выводи

1. В цитозоле гормон-компетентных тканей могу? бшь выявлены

три кортикоотерон-рецепторных комплекса, именуемых нами как лёгкий, промежуточны^активный) и тяжёлый, и два дексаметазон-рецеп-торных комплекса : лёгкий и промежуточный (тяяйлый дексаметазоно-вый комплекс не устойчив).

2. Каждый из гормон-рецепторных комплексов кортикостероидов существует в своём определённом интервале концентраций комп-лексобразувдих элементов цитозоля (в том числе рецепторов) при данной температуре, солевом составе, рН, и общгй концентрации белка цитозоля.

3. Образование и распад гормон-рецепторных комплексов является последовательным и'обратимым процессом. Лёгкий комплекс образуется непосредственно из свободных молекул гормона и рецептора, промежуточный комплекс образуется из лёгких, а тяжёлый образуется из промежуточных. Распад комплексов осуществляется в обратной последовательности.

4. Благодаря использованию экспериментальной зависимости величины рецепторного связывания от концентрации цитозоля, состояние рецептирувдей системы в структурах мозга и гипофизе может быть оценено по двум новым критериям: 1) по диапазону активного комплекса и 2) насыщенности ткани рецепторами. Первый критерий пропорционален вероятности пребывания ГРК ь активном {т.е. способном связываться о ДНЮ состояний; второй' критерий прямо пропорционален Концентрации комшекс-обраэуювдх элементов (в Частности рецепторов) в цитозоле.

5. Генетические различия проявляются' в состоянии рецентирую-вдй системы, оцениваемой по вышеуказанным критериям, при с ран не-

_ - ...... - 21 -

нии крыс двух генетических линий, селектированных по ¡юрогу чувствительности к электротоку (с высоким порогом- линия Ш-1 и ниаким порогом- НП-2), Крысы НП-2 имеют большую насыщенность ткани рецепторами в гипофизе, чем крысы БП-1. Стрессорное воздействие вызывает уменьшение диапазона активного комплекса в гипофизе и гипоталамусе у крыс Ш-2 и его увеличение в этих турах у крыс Ш-1.

б. Насыщенность ткани рецепторами изменяется вследствие достаточно длительных (несколько дней) и сильных воздействий, ка-меняющ состояние ГАС (адреналэктомия, хроническое стрессирова-ние. неонатальное введение гормона). Этот параметр отражает, прежде всего, количественные изменения в рецептирувдрй системе.

?. Диапазон активного комплекса изменяется как вследствие длительных и сильных воздействий, так и при краткосрочных и относительно слабых воздействиях, изменяющих состояние ГАС. Этот параметр отражает быстрые, качественные изменения в состоянии ре-цептирувдей системы.

8. Стрессорная реакция, сопровождающаяся увеличением уровня кортикостерона в крови, связана с переходом гормон-рецепторного комплекса в гипофизе и гипоталамусе из активного в неактивное оостояние (уменьшение диапазона активного комплекса).

9. Причиной отсутствия нормальной стрессорной реакции или снижения уровня кортикостерона после стрессиревания является переход гормон-рецепторного комплекса в активное состояние в гипо таламусе и в гипофизе.

- 22 -

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ Ш ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ефимов О.Е .Шаляпина ЕГ. Кинетика взаимодействия корти-костерона и дексаметаЗона о цитозольными рецепторами клеток мозга// Биологические мембраны. 1991. Т. 8. N.11. С. 1168-1169.

Й. Ефимов С. Е Фазовые состояния и фазовые переходы рецепторных комплексов кортикоотерона// Зоологические мембраны. 1992. Т. 9.'N.10. С. 1032-1034.

8. Ефимов С. Е Отражение генетических раэличий в состоянии кортикостероидных рецепторов мозга крьв / Тез.. Докл. С. -петербургский конференции молодых учёных и специалистов "Механизмы регуляции физиологических функций". Санкт-Петербург. 1992. С. 93-94.

4. Ефимов С. Е Кинетическая характеристика и стехиометрия взаимодействия кортикоотерона с цитозольными рецепторами// Фи-зиол. лурн. им. И. М. Сеченова. 1693. Т. 79. N.10. 0.23-28.

6. Ефимов С. Е . Вайдо А. И., Шаляпина Е Г., Ширяева Е Е Рлкко-кортикоидные рецепторы в гиппокампе у крыс с разной возбудимостью нервной системы. // Физиол. журя. им. Е м, Сеченова. 1994. Т. 80. N 10. 0. 26-59.

6. Шаляпина Е Г., Ефимов 0. Е, Вайдо А. И., Лопат ла Е Г., Ра-кицкая ЕЕ, Ширяева Н.Е Свойства глюкокортикоидных рецепторов в стрйатуме и гипоталамусе крыс, селектированных' по порогу возбудимости нервной йкйтемы /У Фшол. журн. им. ИМ.Сеченова. 1994, Т.60. К 1. 0. 41-46.

?. Ефимов С. 8. Ордям Н. 9. Оценка состояния реиейгоров кортй-

- - - 23 -

коотероидных гормонов в структурах мозга стрессиров&нных и адреналэктомированних крыс Н ®шол. журн. им. И. М. Сеченова. 1965. Т. 81. N 2. С. 33-39.