Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция гликолиза эстрадиолом и прогестероном в головном мозге самок крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция гликолиза эстрадиолом и прогестероном в головном мозге самок крыс"

Форма 3.3

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КОСТАНЯН АМАЛИЯ АЛЬБЕРТОВНА

РЕГУЛЯЦИЯ ГЛИКОЛИЗА ЭСТРАДИОЛОМ и ПРОГЕСТЕРОНОМ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ САМОК КРЫС

03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1990

Работа выполнена в Институте экспериментальной биологии АН Республики Армения.

Научные руководители: кандидат биологических наук

К.Б.НАЗАРЯН

доктор биологических наук Б.А.КАЗАРЯН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Г.С.ХАЧАТРЯН

кандидат биологических наук Р.А.ЗАХАРЯН

Ведущая организация: кафедра биохимии Ереванского зоотехни-ческо-ветеринарного института.

по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Ереванском Ордена Трудового Красного Знамени государственном университете (375049, Ереван, ул.Мравяна I, Ереванский госуниверситет, биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

в

Защита диссертации состоится "

часов на заседании спациализ

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Л.Г.АНАНЯН

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение механизмов внутриклеточной рефляции является одним из главных направлений современной биохямзп [ молекулярной биологии. В атом аспекте большой интерес привлекает шгуляция ЦНС, поскольку эта уникальная биологическая система сонтролирует все физиологические и биохимические процессы, происходящие в организме. Особое значение имеет регуляция ЦНС хенскшс юловыми стероидными гормонами - эстрадаолом и прогестероном, спорными модулировать поведение человека и животных. Более того, >ти стероида оказывают модифицирующее воздействие на патогенез п зазвитие таких заболеваний нервной системы, как хорея, дискикззля, шзофренкя, эпилепсия. Предполагается, что подобные гормональные эффекты осуществляются через изменения метаболизма нервных клето™, еоторые отражаются на процессах возбуждения и торможения. Так как эти процессы требуют больших энергетических затрат, то щолне вероятно, что половые гормоны могут влиять на них, изменат шергетический статус нейронов. Поэтому выявление регуляции легальней стадии энергетического метаболизма — гликолиза эстрадно-юм и прогестероном в головном мозге самок крыс и изучение ос юзможных механизмов представляет значительный интерес. Рассгптр:г-зая подобную регуляцию, как один из механизмов стероидного воздействия в ЦНС, и установив взаимосвязь меэду нею и модифицирую-дам влиянием гормонов на судорожную активность клеток мозга, >'ог-ю приблизиться к пониманию механизмов реализации гормональных хрфектов при патогенезе и развитии таких заболеваний, как эпилеп-

!ия.

Паль работы. Исходя из вышеизлогенного целью настоящей ра-!оты было:

1. Изучение регуляции гликолиза эстраднолом и прогестероном > головном мозге самок крыс.

2. Выявление возможных механизмов подобной регуляции.

3. Установление взаимосвязи между гормональной регуляцией •ликолиза и модифицирующим действием стероидов на судорожную активность клеток мозга крыс.

Научная новизна и практическая значимость работа. Впервые >бнарукена регуляция 3-х ключевых ферментов гликолиза - гексоки-газн (ГК), фосфофруктокиназн (ФИО и пируваткинази (ПК) эстрадао-гам и прогестероном в головном мозге самок крыс, которая имеет

место в клетках нейронального типа. Выявлены геномный и внегеном-ный механизмы подобной регуляции. Получены данные о гормона-чувствительности отдельных изоферментоз индуцибелышх ферментов. Установлены перераспределение растворимой и мембраносвязанной форм ПК в сннаптосомальной фракции мозга крыс под действием эстрадиола и активация этого фермента пра его связывании с синаптосомальными мембранами к в присутствии фосфолшшдной фракции из того se источника. Показана тесная корреляция мааду гормональной регуляцией гликолиза и эпилептогеншы и антнконвульсантным действием scipa-•диола и хфогестерона на судорогшув активность клеток мозга крыс. Полученные результаты представляет несомненный интерес в понимании механизмов действия женских половых стероидных гормонов в ЦНС п, в частности, пх ыодулцрущего влияния на поведенческий статус и на патогенез и развитие некоторых неврологических заболеваний. Ими нухшо руководствоваться для правильного выбора лекарственных препаратов пра гормональной терапии при лечении эпилепсии.

Апробэштя работ». Результата работы долокены на П Республиканской конференции, посвященной проблемам физико-химической биологии (Ереван, IS36), на 6-ой Конференции, посвященной 70-летию Великой Октябрьской Социалистической революции (Ереван, 1987), на 4-ой Республиканской Ыолодегшой конференции по физико-химической биологии, посвяценной 70-(яетш> Великого Октября (Ереван, 1987), на И Конференции Молодых ученых ИЭБ АН АрмССР (Дилихан, 1983), на 8-ой Конференции ЕНО (Лейпциг, 1990) и на 6-ой научно-технической конференции молодух ученых и специалистов района 26 Комиссаров (Ереван, 1990).

Работа апробирована на заседании Ученого совета Института экспериментальной биологии АН Республики Армения от 18 сентября 1990 г. и на заседании кафедры биохимии биологического факультете Ереванского государственного университета от II октября 1990 г.

Цубликрттта. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структур л д обт-ен диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.. Работа излояена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами и 14 рисунками. Библиография включает 199 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОШ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на самках белых беспородных крыс,массой 100-150 г. Животным внутрибршинно вводили эстрада ол-17^> (30 мкг/ЮОг массы) и прогестерон (3 мг/100 г массы). Актиномицин Д (30 мкг/ЮО г тассы) вводили за час до инъекции гормона. Крыс де-капитировали через 10, 30, 60 мин и через 4 часа после гормонального воздействия. Судорожные припадки вызывали введением коразола (7 мг/100 г массы) и забивали животных через 5, 10, 20, 30 и 60 мин после инъекции конвульсанта. Ткани головного мозга гомогенизировали в соотношении 1:10 в буфере для определения активности каждого фермента, центрифугировали при 1700« в течение 30 мин и надосадок использовали в качестве источника фермента. Цитоплазма-тическую и мембраносвязанную фракции ГК получали по методу Keilog et al (1974). Для получения синаптосомальной фракции' из мозга крыс использовали метод Hajos (1975), а для растворимой, лабильно- и прочносвязанной фракций гликолитических ферментов - метод Knüll ¿1980). Синадтосомальные мембраны выделяли по методу, описанному Parker et al (1978), а фосфолипиднун фракцию из головного мозга - по методу, описанному в работе Прохоровой (1982). Белок определяли методом Lowry et al (1951). Ферментативную активность определяли спектрофотометрически на спектрофотометре М-40 (" Carl Zeiss,Jena ) в непрерывном режиме регистрации при 240 и 340 нм. Для ПС, ФФК и енолазы использовали метода Chow, Wilson (1972), Kraaljenhagen. Van der Heijden .(1984) И Baranoweka ,Ва-ranoweki(1975) соответственно; для альдолазы, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (ГАФД), фосфоглицераткиназы (ФГК) и фосфоглн-цератмутазы (ФГМ) - метода, описанные Кочетовым (1980) и Назаря-ном с соавт. (1988). Изоэлектрическое фокусирование в ПААГ проводили по методике, разработанной Winter et ai (1377). Величины . VHax и ОПР0Д0ЛЯЛИ методом Лайнуивера-Берка в двойных обратных координатах. Биоэлектрическую активность клеток мозга 1фЫО записывали на электроэнцефалографе ("Nihon Kohden Япония).

Полученные данные обрабатывали статистически по t -критерию Стыедента, х - р-^0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Активность гликолитических ферментов в головном мозге самок крыс через 4 часа после введения эстрадиола-17^ и прогестерона

Для выявления гормональной регуляции гликолиза в головном мозге самок крыс нами было изучено действие женских половых стероидных гормонов на активность основных гликолитических ферментов. Как видно из табл. I и табл.2 через 4 часа после введения эстра-диола-17^> достоверно повышается активность цитоплазматической и ;.:е::бралосвязанной фракций ПС, активность ФФК и ПК, в то время как ферментативная активность альдолазы, ГАФД, ФГК, ФГМ и енолазы остается неизменной. При этом наибольшие изменения претерпевает активность ФФК (84$), что не может быть связано с.наличием аллосте-рзческих активаторов, поскольку активность этого сложного аллосте-рлтеского энзима определяли при pH 8,0, когда он начинает функционировать по типу гиперболической кинетики ( РоеДетр 1984). Относительно небольшое изменение ферментативной активности отмечается в ыембраносвязанной фракции ГК (20i), но т.к. эта форма фермента более активна, чем цитоплазматическая, то яовышэние уровня мембра-носвязанной ГК даже на несколько процентов достаточно для значительного уВвЛИЧеНИЯ СКОРОСТИ фосфоршшрования ГЛЮКОЗЫ ( Wilson 1980). Что касается изменения активности цитоплазматической фракции ГЕС и активнооти ПК, то по чувствительности к эстрадаоловоцу воздействию эти ферменты занимают промежуточное положение мевду ыембраносвязанной ГК и ФФК (40 и 63$ соответственно).

Учитывая то обстоятельство, что именно к 4-му часу действия эстрадиола в тканях-мишенях и, в том числе, в головном мозге наблюдается максимальное повышение тотального биосинтеза белков (Розен, 1984), ш предположили, что здесь имеет место эстрадиоло-вая индукция ГК, ФФК и ПК. Для того, чтобы проверить подобное предположение, использовали ингибитор белкового синтеза на уровне транскрипции- актиномицин Д, введение которого инактивирует мат-рзщу ДНК. Он полностью снимает повышение активности вышеназванных форментов, что может свидетельствовать в пользу их синтеза de novo (табл.1). То, что эстрада ол-17£> вызывает индукцию только о тих гликолитических ферментов из всех изученных нами, можно интерпретировать следувдим образом. Известно, что основные контроль-мае механизма гликолитического пути проявляются на 3-х киназных стадиях: гексо-, фосфофрукто- и пируваткиназной. Поэтому повышения

Таблица I

Активность регуляторных ферментов гликолиза в головном мозге самок крыс через 4 часа после введения эстрадаола-17^ и прогестерона

Вариант опыта ФФК ПК

питоплазматлческая мембоаносвязанная

Контроль Эстрадиол-17р Актиномицин Д+ эстрадиол-17|> Прогестерон 0,054*0,009 0,075*Р,005Н 0,053*0,007 0,037^0,007я 0,174*0,002 0,208*0,006й 0,Щ±0,001 0,136*0,005к 1,32*0,02 2,45*0,09я 1,31*0,05 0,79*0,03* 1,88*0,07 3,Ю*Р,06Н 1,96*0,04 1,51*0,01н

Активность гликолитических ферментов в головном мозге самок крыс через 4 часа после введения эстрадиола-17£ и прогестерона Таблица 2

Вариант опыта Альдолаза ГАФД ФГК ФШ Енолаза

Контроль Эсорадиол-17^ Црогестерон 0,73*0,02 0,75*0,02 0,70*0,05 0,139*0,04 0,72*0,08 0,146*0,04 0,80*0,09 0,130*0,03 0,71*0,07 1,86*0,03 1,88*0,07 1,85*0,04 1,01*0,03 1,03*0,01 1,02*0,02

активности этих ферментов достаточно, чтобы привести к активации гликолиза в целом (Прохорова, 1979).

В табл.1 в табл.2 приведены также результат экспериментов по изучению действия прогестерона в головном мозге самок крыс. Установлено, что этот гормон оказывает противоположное эстрадаолу действие - подавляет активность индуцибельных ферментов. В то же время он не вызывает никаких изменений активности равновесных ферментов гликолиза. Существует несколько механизмов, посредством которых может осуществляться подавляодий эффект прогестерона. Во-пер-внх, это торможение матричной активности локусов ДНК и активности РНК-подвмеразы при взаимодействии гормон-рецепторного комплекса с хроматином нервных клеток. Bé-втррых,.активация ферментов, ответственных за их деградацию. И, наконец, подавление синтеза не самих ферментов гликолиза, а их аллостерических активаторов, стабилизаторов, а также ассоциации ало- и коферментов (Розен, 1984).

При совместном введении эстрадиола и прогестерона выявляется аддитивность их действия в клетках мозга - заметно снижается уровень индукции ГК, Ф$К и ПК'. В этом случае, по-видимоьу, наряду с вышеуказанными возможными механизмами, существенную роль И1рает их антагонизм на уровне рецепторов, т.к. прогестерон тормозит синтез рецепторов эстрадиола в мозге крыс, снижая тем самым чувствительность КЛеТОК-ШШвНеЙ К ЭТОЦГ ГОРМОНУ ( Dohenich et al, 1985).

Поскольку, действие эсорадиола-17£> в мозге самок крыс более выражено и вполне укладывается в классическую модель для механизма действия стероидных гормонов в тканях-мишенях, то при дальнейшем изучении феномена стероидной рефляции гликолиза в нервной ткани и поиске ее возможных механизмов мы использовали этот гормон.

2. Активность Ш, ФФК и ПК в культуре клеток мышиной нейробластомы С 1300 через 3,5 часа после введения эстрадиола-17р

Как известно, рецепторы эстрогенов в головном мозге животных содержатся только в клетках нейронального типа (№ Вяаа, 1982). Поэтому мы предположили, что эстрадаоловая регуляция гликолиза происходит именно в нейронах, что имеет весьма важное значение в аспекте возможного гормонального контроля энергетического обеспечения основной функции этих клеток - процесса передачи нервного имцульса. Для подтверадения этого предположения в качестве модели нейрона наш была избрана клеточная культура машиной нейробластомы С 1300. Эта культура клеток очень удобна в качестве модели,т.к.

сохраняет многие свойства дифференцированного нейрона, такие, как типичная морфология нейрональной клетки, возможность синтеза ней-ромедиаторов, способность генерировать потенциал действия и др. ( Pauwels et al , 1984).

На рис.1 можно увидеть, что в культуре клеток мышиной нейро-бластомы С 1300 наблюдается активация ключевых ферментов гликолиза через 3,5 часа после введения эстрадаола-17р> . При этом при концентрации гормона 25 мкг/мл ферментативная активность ГК, ФФК и ПК возрастает на 60,4; 84,8 и 140,8% соответственно. При дозах 50 и 100 мкг/мл обнаруживается увеличение активности на 97,3 и 147,5$ для ГК, на 72,2 и 60,3% для и на 211 и 134% для ПК. Примечательно, что по сравнению с экспериментами in viro в культуре клеток показана большая активация гликолитического пути при воздействии гормона. Это можно объяснить отсутствием в клеточной культуре факторов, обеспечивающих гомеостаз, как это имеет место в клетках головного мозга.

Таким образом, выявленная нами эстрадаоловая регуляция гликолиза, осуществляемая через геном, характерна для клеток нейро-нального типа.

Активность ( % )

Рис.1. Активность регуляторных ферментов гликолиза в культуре клеток мышиной нейробластомы С 1300 через 3,5 часа после введения эствадиола-17& . Активность в контроле принимается за 100%

□-25 мкМ/мл, а - 50 мкМ/мл и В - 100 мкМ/мл

3. Действие эстрзднола-17р в головном мозге самок крыс на изоферментный спектр ГК, ФФК и ПК

Обнаружив феномен эстрадиоловой индукции 3-х регуляторных ферментов гликолиза в мозге крыс, мы попытались выявить изменения на уровне их изоферментов. С этой целью изоэлектрическим фокусированием в Ъ% ПААГ с ам$олинами диапазона 3,5-10 были получены изо-ферментные спектры мозговых ГК, ФФК и ПК. На рис.2А представлены 2 пика активности с нзоточками при pH 4,9 (пик I) и 6,1 (пик 2), полученные для цитоплазматической фракции ГК. Известно, что в головном мозге еивотных содержатся 2 нзофермента ГК1 и ГКП, причем первый из них является преобладащам и его изоэлектрическая точка находится при pH 6,2 ( Hagnau! et al , 1984). Поэтому пики I и 2 можно идентифицировать, как ГКП и ГЫ соответственно. Через 4 часа посла введения зстрадиола-I7J> наблюдается повышение активности минорного компонента, тогда, как ГК1 не реагирует на гормональное воздействие (рис.2Б), что совпадает с литературными данными о степени гормончувствительности этих мозговых изоферментов ( Kaur et а] 1983). На рис.2В mosho увидеть, что 2 пика активности для ыембра-носеязшшой фракции ГК идентичны пикам I и 2 для ее цитоплазматической форш. Единственное различие мевду этими изофермэнтныш спектралш заключается в том,что суммарная ферментативная активности Ш выше в мембраносвязанной фракции. Это объясняется тем, что в мозге фермент преимущественно локализуется на датохондриальшх мембранах ( Kyriozi, Eaaford , 1986). Более того, гормончувствитель-ннм и в этом случае оказывается нзофермент ГКП (рис.2Г). Такое сходство изоферментных спектров обеих форм ГК как в контроле, так и цри введении эстрадиоланеудивительно, поскольку в настоящее время ряд авторов склоняется в пользу идентичности цитоплазматической И мембраносвязанной фракций ГК ( Carreras et al , 1981; Wilson , 1980).

Для <5ФК обнаруаено 3 пика активности с изоточками при pH 4,5 (пик I), 5,8 (пик 2) и 8,9 (пик 3) (рис.ЗА). В литературе имеется большое разнообразие весьма противоречивых данных относительно изо-ферментного состава ФФК в головном мозге млекопитающих, однако,все •де большая часть исследователей свидетельствует в пользу существования изоферментов L , В и М типа ( Davidson et al , 1983; Du-noway, Kaaten , 1985). Руководствуясь тем, что по величине отрицательного заряда мозговой В^ нзофермент занимает промежуточное положение мевду l 4 и М4 изоферментами (Foe.Kecp ,■ 1984), мы обозначили

0,020

0,016 0,012

0,008

0,004

0

Активность ( ылЯ-кшГ* )

0,020 0,016 0,012 0,008 0,004 О

а

рн

0,020 0,016 0,012 0,003 0,004

0,020 0,016 0,012 0,003 0,004

3,9 4,5 5,1 5,7 6^2 6,8 7,4 8,0 8,6 ¿,2

РЯ

: Активность ( ккМ-мкн )

2. г

г

1 г' 1

» Р 1 1

1 „ь 5 г

, , Г.] |

г \ а

1 г { ;

1 П 1 ; Г

1......:

I

ю

3,9 4,5 5,1 5,7 6,2 6,8 7,4 8,0 8,6 4,2

рЛ

Рис. 2 Активность ГКцат и ГК.к,ек(3 головного мозга самок крыс после ИЭ5 в ПААГ с

аифоллнаш диапазона 3,5-10 в контроле (А к В) и после введения эстрадиола-173 (Б И Г).

Рис.3. Активность ФФК и ПК головного мозга самок крыс после ИЭ$ в ПААГ с ам|олинами диапазона 3,5-10 в контроле (А и В) и после введения эстрадаола-17£ (Бе Г).

полученные пики I, 2 и 3, как l4, В4 и М4 соответственно. Примечательно, что чувствительным к действию гормона является изофермент В4 (рис.ЗБ), т.к. именно он в мозге крыс проявляет наиболее выраженные аллостерические свойства по сравнению с другими формами ФФК ( Yora et al , 1985). Возможно, регуляция этого гликолитического фермента, как аллостерическая, так и на уровне генома в нервной ткани осуществляется через мозговой В4 изофермент.

В случае ПК наш было выявлено 2 пика активности с изоточка-ми при pH 5,7 (пик I) и 6,5 (пик 2) (рис.ЗВ). Согласно данным литературы в головном мозге животных встречаются изоферменты ПК 2-х типов - M и К, причем изоферментный спектр сильно смещен в сторону первого ( Tolle et al, 1976). В то же время, изоэлектрическая точка для изоферментов М4 и К4, выделенных из разных источников, находится в довольно широком диапазоне значений pH - от 6,1 до 8,9 и от 6,7 до 8,3 соответственно ( Ibsen.Trippet, 1973). Для получения дополнительной информации мы использовали в качестве контроля очищенный препарат ПК из мышц кролика. Сравнив полученные данные с литературными, нами был сделан вывод о соответствии пиков I и 2 М4 и К4 роферментам ПК. Как видно из рис.ЗГ эстрадиол-17^ оказывает активирующее воздействие на К4 изофермент. Интересно, что до недавнего времени полагали, что индуцибельной можот быть только печеночная форма фермента и лишь в единичных работах была показана гормональная индукция К и M субъединиц ПК (Ngo,Ibsen , 1989).Наши результаты подтверждают возможность астрадаоловой индукции изо-фермента К4 в тканях-шшенях.

Итак, эстрадиоловая регуляция гликолиза в головном мозге крыс затрагивает определенные изоферменты индуцзбельннх ферментов, для которых показана чувствительность к различного рода регуляторам, в том числе и гормонам.

4. Влияние эстрадаола-17^ и прогестерона на судорожную активность головного мозга самок крыс через 4 часа после инъекции гормонов

Как уже отмечалось выше, предполагается, что женские половые стероидные гормоны способны модулировать поведение и оказывать модифицирующее влияние на патогенез и развитие некоторых заболеваний нервной системы, затрагивая процессы возбуждения и торможения. Известно, что, эпилептическая активность клеток мозга возникает в результате нарушения баланса между этими процессами, что влечет за собой возникновение очага патологически усиленного возбуждения,

которое монет захватывать весь мозг ( Barnes, 1986). Многие авторы, показала, что эпилептические припадки сопровождаются резким повы-пением уровня энергетического метаболизма мозговых клеток и, в частности,значительной активацией глвколитического пути ( Chapmen et ai, IS77; Duffy et ai , 1975). Результаты, представленные в табл.3, полностью совпадает с литературными данными. При судорожных припадках у крыс, вызванных введением коразола, отмечается повышение активности 3-х регуляторных ферментов гликолиза - ПС, ЗФК и ПК, начиная с 5-ой минуты после инъекции конвульсанта. Наибольшие сдвиги наблвдаэтся у ФФК (трехкратное увеличение) и ПК (двухкратное увеличение). К 60-ой минуте коразолового припадка активность ферментов падает, достигая своего первоначального значения.

С другой стороны, достоверно установлено, что частота и длительность эпилептических припадков зависит от циклических изменений соотношения уровня эстрадиола и прогестерона в организме женщин-эпилептиков. При этсм, эстрадиол выступает в роли эпилептоге-на, а прогестерон - в качестве антиконвульсанта ( Baokstroa ,1978; Maggi, Perez , 1985). Аналогичная картина наблюдается в экспериментах с животными, j которых эстрадиол понижает, а прогестерон повышает порог судорожной активности (Захария, 1974; Крынановский, Глебов,1984). Поскольку эпилептическая активность гиперактивных нейронов сопряжена с большими энергетическими затратами, то эстрадиол и прогестерон могут ее модифицировать, изменяя энергетический статус клеток через регуляцию начальной стадии энергетического метаболизма - гликолиза.

Для того, чтобы установить возжицую взаимосвязь мевду гормональной регуляцией гликолитического пути и модифицирующим действием стероидов на судоронные припадки, мы записывали биоэлектрическую активность клеток мозга самок крыс при коразоловых судорогах, вызванных на фоне 4-х часового действия эстрадиола и прогестерона.

На рис.4 можно заметить, что эстрадиол и прогестерон совершенно однозначно влияют как на частоту и амплитуду,судорожных припадков, так и на активность 3-х регуляторных ферментов гликолиза. Иначе говоря, существует параллелизм между активирующим и подавлявшим влиянием этих гормонов на гликолиз и их модифицирующим воздействием на судорожную активность. Очевидно, эстрадиол снижает судорожный порог, поставляя дополнительную энергию для проявления судорог, а прогестерон повышает этот порог, создавая определенный

Таблица 3

Активность регуляторнах ферментов гликолиза в головном мозге самок крыс при введении коразола

Фермент До введения

Время после введения (в мин)

10

20

30

60

1'КЦИТ.

^мемб. ФФК

ПК

0,051^0,005 0,050^0,002 0,052+0,001 0,062±0,004к 0,063^0,001й 0,053^0,004 0,170^0,002 0,229.^0,003* 0,241^0,002й 0,198^,003* 0,199^0,004х 0,176^0,002 1,30^0,01 2,08±0,04й 2,70±0,06к 3,47^0,01й 3,95.±0,03н 1,40^0,02

1,81+р,05 3,00^0,05 3,56^0,02 2,38*0, ОГ

2,21±0,05

1,90*0,04

со I

^ а. € в

' ^Л/ЧА^^Л^

. лур^тгдЛр*^

■ /^^^л, Л^^'ЛЛ'

Рис.4. ЭЭГ затылочной (I) и лобной областей коры головного мозга самок крыс через 5 (а), 10 (б) и 20 (в) мин после введения коразола на фоне действия гормонов.

К - контроль, Э - эстрада ол-17£>, П - прогестерон. Момент введения коразола отмечен стрелкой

дефицит энергии. Т.к. стероидная регуляциявшссшза осуществляется физиологическими концентрациями гормонов, то она может являться одним из механизмов, посредством которых циклические изменения уровня эстрадиола и прогестерона обусловливают "предрасположенность" кенского организма к судорожным припадкам.

Поскольку, используемый нами лекарственный препарат прогестерона применяется при гормональной терапии, то мы изучали также действие другого гормонального препарата - эстрадиола-дипропиона-та в головном мозге самок крыс на активность ГК, ФФК и ПК. И в этом случае через 4 часа после введения гормона наблюдается тенденция к повышению активности изучаемых ферментов. Отсюда следует, что эти лекарственные препараты могут активировать или купировать судорожный припадок, что необходимо учитывать даже при единичных инъекциях гормонов женщинам, страдающим эпилепсией.

5. Активность ГК, М>К и ПК в головном мозге самок крыс, на ранних этапах действия эстрадиола-17£> и прогестерона .

Для того, чтобы выяснить, имеет ли место внегеномная регуля-чия гликолиза женскими половыми стероидными гормонами, было'изуче--быстродействие эстрадиола-17^ и прогестерона на активность'3-х

peiy ля торных гликолитических ферментов в головном, мозге самок крыс. Полученные результаты представлены в табл.4, из которой видно, что для обеих фракций ГК на 60-ой минуте гормонального Бездействия отмечается повышение ферментативной активности на 20 и 13? при введении эстрадаола и ее соответствующее понижение на 20 и 12% при введении прогестерона. В то же время, активность Ф5К и ПК повышается, уже через 30-мин после инъекции эстрадиола на 38 и 2&% и падает на 40 и 2CS? после инъекции прогестерона. Скорее всего, такие быстрые изменения активности ферментов являются результатом внегеномных эффектов женских половых стероидов, т.к. при геномном механизме их действия в тканях-мишенях подобные гормональные эффекты реализуется только через 1-2 часа (Розен, 1984). Известно, что внегеномное действие этих гормонов осуществляется при их непосредственном влиянии на мембраны, что приводит к'изменениям их структуры и функции, а это, в свою очередь, влечет за собой изменение активности мембраносвязанных ферментов. Следовательно, чтобы допустить существование такой внегеномвой регуляции гликолиза, необходимо учитывать компартментализация гликолитичес-ких ферментов в нервной ткани. Так, для ГК достоверно установлено, что этот фермент в головном мозге крыс преимущественно локализован на митохондриальных мембранах ( Dorbani et ai, 1987). Что касается ФФК и ПК, то было показано, что в нервных окончаниях мозга крыс до 90$ их активности связано с мембранными фракция}.® ( Knüll, 1978). Тот не автор, обнаружил, что по способности к фиксации глутаральдегидом на синаптосомадьных мембранах гликолити-ческие ферменты из того же источника можно разделить на 2 группы. Представители первой группы - группы ПК, по всей видимости, концентрируются в непосредственной близи к мембранам, что облегчает процесс фиксации, а ферменты второй ipynmi - группы енолазы, равномерно распределены по синалтоплазме и только небольшое количество их молекул соседствует с мембранами ( Knüll, 1980).

Итак, 3 регуляторных фермента гликолиза имеют возможность взаимодействия с мембранными структурами благодаря своей околомембранной локализации в нервных окончаниях мозга крыс^

6. Действие эстрадаола-I7j> на активность ПК в растворимой, лабильно- и прочносвязанной фракциях елнаптосом. из головного мозга самок- крыс

На следующем этапе работы ш попыталась.на примере Iii выяснить, действует ли эотрадиол-17^> на кемпартментадизацию азучзелкх

Таблица 4

Активность регуляторных ферментов гликолиза в головном мозге самок крыс на ранних этапах действия эстрадаола-17^ и прогестерона

_2£1ВМШ=Цё_Прогестерон_

Фермент Контроль _^ др(?л? _

10 30 60 10 30 60

^цат. 0,050*0,002 0,052* 0,001 0,052* 0,002 0,060+ 0,004« 0,055* 0,003 0,054* 0,001 0,040* 0,002*

^мемб. 0,172*0,001. 0,173* 0,002 0,171.* 0,001 0,193+ 0,004* 0,174* 0,003 оо 0,150+ ■0,001*

ФФК 1,35*0,01 1.34* 0,02 0.03& о'.оО^ 1,31* 0,03 0,81* 0,045 0,78+ 0,01«

ПК 1,84*0,03 1,85* 0,01 0,03» 1,82* 0,01 1,47+ 0,04» &

ферментов в нервннх окончаниях мозга крае. В связл с этим в качестве модели нервных скончаний попользовала синалтоссма, выделенные из мозга крыс, поскольку онн сохрагявт ыорфологаческде л функциональные характеристика нервных окончаний in aitu . Нагл была получена 3 субсзналтосомалыше фракции: растворимая, лабажко- з прочлосгязггаая, в которнх определяли фврмептазстлув аатяззостъ ПК п енолаан, как представителей обеих зазсупемяцута: груш г.тлко-латаческэх фэртгэнтов. Результата экспериментов полностью согпзгд-ла с данника Xnuli (1980), что дало вослоглость попользовать предложенный ям метод фансацаа глутаральдегадом в наикх дальнейших исследованиях.

На рас.5 место упздеть, что на раннях этапах действия гормона обнаруживается перераспредолзнпе мезду субспналтосоиалыгип фракциями ПК из мозга самок крыс. Начиная с 10-ой лзнута после введения эстрадиола-17р отмечается увеличение ферментативной активности в прочносвязанной фракции с соответствующим понижением в 2-х первых фракциях. При этом суммарная активность ПК остается неизменной, что свидетельствует об истинном перераспределении фракций. Это подтверздают результаты экспериментов, в которых яа-вотным за 4 часа вводили гормон, обеспеч!Ш таким образом синтез de novo молекул ПК. В этом случае значительное повышение активности фермента в растворимой фракции (на 90?) неравномерно распределяется по всем 3-м фракциям после фиксации глутаратьдегидом, достигая 43$ в прочносвязанной фракции, что происходит за счет связывания вновь синтезированных молекул ПК, которые локализуются преимущественно вблизи от синаптосомалышх мембран (зло. 6)

Поскольку, известно, что для гликолитических ферментов характерно слабое связывание с мембранными структурами, которое обеспечивается электростатическими силами (Фридрих, I98S), то мы предложили следующее объяснение внегеномного влияния эстрадиолз на субклеточную локализацию ПК. На ранних этапах действия этого гормона имеют место значительные сдвиги в структуре мембран - изменение в составе фосфолипвдов, полисахаридов, холестерина, $ос-форилирование мембранных белков и др. (Duval et al, 1983; Геворкян, 1990). Совокупность этих процессов не может не отразиться на поверхностном заряде различных участков мембраны и, следовательно, на ее способности электростатически связываться с ферментами гликолиза. Т.е. при непосредственном воздействии на енядатоссыазь-ные мембраны эстрадиол вызывает такие изменения их поверхностных свойств, которые облегчают процесс связывания о И\ и о.юсоостзугт

лАктганость С мкИ-иин-мг"')

2,0

1.0

Р

Ряс,5. Активность Ж в синаптосомальных фракциях головного мозга самок крыс после фиксации глутаральдегидом в контроле (I), через 10 (2), 20(3) и 30(4) мин после введения астрадиола-17^

3,0

2,0

Активность ( мнМ-миГ^-мт"1 )

,0 г

=еа.

Актгьность Ж ь синаптосомальных фракциях головного мозга самок крыс в контроле до (I) и после фиксации глутаральдегидом (2) и через 4 часа после введения эстрада ола-17/ (3 и 4)

□ - растворимая фракция, в - лабнльносвязанная фрахцкя, в - прочносвяаанная фракция

связыванию большего числа молекул фермента, чем это происходит в обычных условиях.

7. Активация ПК при связывании с синаптосомальными мембранами из мозга крыс и в присутствии фосфодипвдной фракции из того же источника

В литературе имеются многочисленные данные об изменении кинетических параметров - vmax и Ку для некоторых гликолитических ферментов в результате изменения их микроокрукения и при связывании с различными клеточными структурами ( Liou,Anderson , 1980; Maaters , 1977). Поэтому, можно предположить, что при связывании ПК с синаптосомальными мембранами"из мозга крыс имеет место его активация или инактивация. Для выявления возможных изменений кинетических параметров этого фермента при его связывании с мембранными структурами применялся уже использованный нами метод фиксации глутаральдегидом. Поскольку, в головном мозге животных преобладавшей является мышечная форма фермента ( Tolle et al , 1976), то на синаптосомальных мембранах фиксировали ПК, очищенную из мышц кролика. Как видно на рис.7 значения н F^ в контроле равны 28 мкм'мин-* и 3,3«10-5М, что совпадает с литературными данными ( Boranowska.Baranowskl , 1975; Cardenaa et al , 1973). При связывании с синаптосомальными мембранами наблвдается понижение значения ^в 3 раза по сравнению с контролем, в то время, как величина 7тх остается неизменной, т.е. происходит активация ПК. Т.к. основными компонентами мембран являются белки и липлды, причем значительную часть последних составляют фосфолипиды, то наш также было исследовано, как на кинетические свойства изучаемого фермента может влиять фосфолипидное окружение. На рис.8 можно увидеть, что в присутствии фосфоляшщной фракции из головного мозга крыс в концентрации 20 мкМ/мл обнаруживается некоторое уменьшение значения К^,, а при двухкратном увеличении концентрации отмечается более значительное его понижение - з ~ раза по сравнению с контролем. Величина з обоих случачх не меняете.?.Следовательно, и в этом случае имеет место активация ПК, хотя и з меньшей степени, чем при связывании с мембранами. Очевидно, подобное липта-ферментнов взаимодействие осуществляете.-: посредством связи между заряженными остатками аминокислот в молехуле фермента и полярными головками фосфолипидов, что влечет за oeio?, структурную модификацию ферментативной молекулы. Такая модификация может затрагивать центр связывания суосграта и тем самым повышать

Рис.7. Определение и Кц препарата ПК из шиц кролика

в контроле (Г)и при связывании с синаптосомальными мембранами из головного мозга крыс (2).

Определение V и Кщ препарата ПК из шиц кролика

ь контроле (X) и ь присутствии фракции Фоофояипидов из головного мозга крыс в концентрации 20 нкМ/мл (2) в 40 мкМ/мл (3).

сродство к нему, что проявляется в понияении значения к^. Разалеется, в процессе активации принимают участие и другие компонента синаптосомальных мембран, вместе с тем, приведенные данные свидетельствуют о значительном вкладе липидных компонентов в этот процесс.

В связи с обнаруженной нами активацией ПК, необходимо -отметить, что согласно гипотезе о "вездесущем" ферменте в экстремальных ситуациях, требующих интенсивного протекания энергетического метаболизма, повышение скорости одной из ключевых реакций гликолиза з клетках мозга происходит при "переходе цитоплазматической формы ГК в мембраносвязанную, что приводит к ее активации С 'А'Иаоз , 1980). Возможно, подобное перераспределение свойственно и 2-м другим ключевым гликолитдческям ферментам - Ф5Х и ПК. Целесообразность такого механизма регуляции при отклонениях от нормы, когда нулно незамедлительно среагировать на изменение условий существования и функционирования нейрональных клеток, не вызывает сомнений. Возможность существования универсального контрольного механизма подтверждают результаты экспериментов, которые прозодились на той не модели нервных окончаний мозга крыс при судоролшых припадках. В^ло показано, что уже на 5-ой минуте после введеная коразола происходят перераспределение мезду растворимой, лабильно- и прочноезязан-ной фракциями ПК, при котором постепенно повышается содержание фермента в последней фракции. Т.е. здесь также используется механизм, приводящий к активации фермента при его переходе з езязанзуг форму, обеспечивая тем самым энергетические потребности лперзез-бунденных нейронов при судорояном припадке.

8. Влияние эстрадиола-17^ и прогестерона на судерсннуя активность головного мозга самок крыс на ранних эт:-лах гормонального воздействия

Выявленная нами внегеномная регуляция гликолиза з мозге хрко, которая осуществляется при непосредственном влиянии гср.уоноз нл мембранные структуры нервных клеток, позволяет предполохлть, что на ранних этапах гормонального воздействия, наряд" с изменениями электрогенеза нейронов, быстрые изменения их энергетического мзгд-болизма могут лежать в основе модифицирующего действия и прогестерона. Для того, чтобы подтвердить првдполагае-чут зз-ллж:-связь, мы записывали биоэлектрическую активность хлэтон голозноге мозга самок крыс, у которых судорожные припадки вызывали ооз.месг-ным введением коразола и гормонов и через 30 а 60 мин псолз инъекций эстрада ола и прогестерона.

$30

си 6 Ь

^Птм^

«ЛЛЛЛ^Ч*»

JvЫr-Wлt Щ^УлМ х^Лмжи^.

''^тм^чууч

А^Г^Ц Щу^Й*

'"^-л^гл чп^^У'М'^4*^

А'^уЛЛ/НлЛ Ь^и^ч^цу

ФШч^

Рис.9. эаг затылочной (I) и лобной (2) областей коры головного мозга самок крыс через 5(а), 10(6), и 20(в) мин после введения коразола на фоне быстродействия гормонов,

К - контроль, Э30 и Э60 - введение эстрада ола-17£>

за 30 и 60 мин, ПоП и Пкп - введение прогестерона за 30 и 60 мин, Кз+Э - совместное введение коразола и эстрада ола-17р>, Кз+П - совместное введение коразола и прогестерона.

Момент введения коразола отмечен стрелкой.

На рис.9, где представлены результаты этих экспериментов, можно увидеть, что если эстрадиол повышает частоту и амплитуду судорог, то прогестерон вызывает обратный эффект. При совместном введении коразола и гормонов также проявляется их эпилептогенное и антиконвульсантное действие. Это хорошо согласуется с литературными данными о том, что эстрадиол усиливает эпилептическую активность клеток мозга, а прогестерон - подавляет ее (Васкаи-от, 1978; Еааг1, Регег , 1985). При этом динамика изменений судорожной активности полностью совпадает с динамикой сдвигов активности 3-х регуляторкых ферментов гликолиза, вызванных быстродействием гормонов (см.табл.4). Если допустить, что предложенный нами вне-геношый механизм активации ПК свойственен и 2-ы другим регуля-торным глюсолитячесхим ферментам - ГК и ФФК, то подобная активация гликолиза может являться одним из путей реализации эпилелто-генного ай-екта эстрада ола, Что касается анткконвульсанта - про-

гестерона, то, вероятно, его непосредственное влияние на мембраны нейрональных клеток затрагивает те мембранные компоненты, взаимодействие с которыми приводит к инактивации гликолнтических ферментов. Такое частичное ингибирование имеет место для некоторых ферментов при изменении их микроокружения, при связывании с мембранными структурами и в присутствии определенных фосфошгадов ( Pierce .Philip воп , 1985; Wriggle sworth et al , 1976).

Поскольку при совместном введении конвульсанта и стероидных гормонов отмечается довольно выраженное модифицирующее действие эстрадиола и прогестерона, то мы попытались обнаружить, отражается ли это на активности ГК, ФФК и.Ж. Однако, в этом случае не наблюдается разнонаправленных изменений ферментативной активности. Это можно объяснить тем, что на фоне резких изменений активности изучаемых ферментов при судорожном припадке -црудно выявить небольшие сдвиги, вызванные ранним воздействием гормонов.

Таким образом, используемые нами физиологические дозы эстрадиола и прогестерона способны влиять на судорогяуи активность клеток мозга крыс на различных этапах своего действия. Геномную и внегеномную регуляцию гликолиза можно рассматривать, как механизмы , посредством которых осуществляется модифицирующее воздействие женских половых стероидных гормонов, причем, если на ранних этапах преобладает первый путь, то на более поздних - цреващ>ует второй.

ВЫВОДЫ

1. Эстрада ол~17_£> вызывает повышение активности 3-х регуля-торных ферментов гликолиза - ГК, ФФК и ПК в головном мозге самок крыс через 4 часа после введения гормона, в то время, как прогестерон оказывает противоположное действие.

2. Показана эстрадаоловая индукция ГК, ФФК а ПК, которая имеет место в клетках нейронального типа.

3. Воздействие эстрада ола-17^ затрагивает лишь определенные изоферыенты индуцибельных ферментов гликолиза, а тленно - ШД, В4 и К4 для ФФК и ПК соответственно.

4. Выявлена взаимосвязь между гормональной регуляцией гликолиза и модифицирующим действием эстрадиола в прогестерона на судорожную активность клеток мозга крыс.

5. Гормональная регуляция гликолиза обнаружена также на ранних этапах действия эстрадиола и прогестерона в головном мозге самок крыс.

- at -

6. Бнегеношшй эффект эстрадвола-17р> проявляется в перераспределении растворимой формы одного из рехуляторных гликолити-ческих ферментов - ПК в мембраносвязанвую форму в синаптосомаль-ной фракции мозга крыс.

7. При связывании с синаптосомальными мембранами из головного мозга крыс и в присутствии фосфолипвдной фракции из того Ее источника происходит активация ПК.

8. Разнокаправленность влияния эстрадаола и прогестерона на ранних этапах действия в мозге крыс тесно коррелирует с эпилепто-гекным и антккоывульсантным быстродействием этих гормонов.

S. Эстрада ох. к прогестерон могут изменять энергетический статус нейрональных клеток через геномный и внегеномный механизмы регуляции начальной стадии энергетического метаболизма - гликолиза. Тем сашм они мо1ут повышать или понижать порог судорожной активности % усиливать или облегчать тяжесть судорожных припадков, поставляя дополнительную энергию шш создавая определенный дефицит энергии.

СПИСОК РАБОТ, ОШШИКОВАЙШХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Костакян A.A.»Назарян К.Б., Геворкян Э.С., Казарян Б.А. Рефляция активности ключевых ферментов гликолиза стероидными гормонами // Тезисы докладов П Республиканской конференции, посвященной проблемам физико-химической биологии, Ереван, 1986. - с.57.

2. Назарян К.Б.', Геворкян Э.С., Костанян A.A., Акопян Н.С., П&зосян Г.А. О взаимосвязи гормональной индукции регуляторных Ферментов гликолиза и судорожной активности головного мозга // i^pE.невропат, и психиатр. им.С.С.Корсакова. - 1987. - Л 6. -о.670-&7£.

3. Костанян A.A. Действие половых стероидных гормонов на ферменты гликолиза и эпилептическую активность головного мозга // Тезиса 6-ой Конференции, посвященной 70-летгю Великой Октябрьской Социалистической Революции. Сборник статей молодых ученых, Боевая, 1987. - с.16.

4. Костанян A.A. Активность ключевых ферментов гликолиза в иоггу крыс при действии эстрадиола и прогестерона // Тезисы доклад» 4-ой Республиканской молодежной конференции во физико-хи-кпбской сголсотк, посвященной 70-летию Великого Октября, Ереван, 2S&7. - с.

5. Костаняя A.A., Манукян К.Л. Влияние эстрадиола-17£ на ключевые ферменты гликолиза в головном мозге крыс и в культуре клеток мышиной нейробластомы С 1300 // Зурн.экспер. и клинзч.ьед. - 1988. - Т.28, № I. - с.41-45.

6. Костанян A.A. Активность гексокиназы, фосфофруктокиназн, пируваткиназы и ацетилхолинэстеразы под действием эстрадиола-дп-пропионата в мозгу крыс // Тезисы докладоз Ш Конференции молодых ученых ИЗБ АН АрмССР, Дилижан, 1988. - с.43.

7. Геворкян Э.С., Назарян К.Б., Костанян A.A. Модифицирующее действие эстрадиола и прогестерона на эпилептическую актив-. ность головного мозга крыс // Проблемы эндокринологии. - 1989. -Т.35, № I. - с.72-76.

8.Kostanian A.A.,Nazaryan K.B. Central Hervous System Glycolysis Regulation By Sex Steroid Hormonsa // Abstracts of 8th General Meeting of European Society for Neurochemistry,Leipzig, July 23-28,1990. - P.92.

9. Костанян A.A. Регуляция гликолиза в ЦНС эстрадаолом-1?р // Тезисы докладов 6-ой научно-технической конференции молодых ученых и специалистов района 26 Комиссаров, Ереван, 1990. - с.67.

10. Костанян A.A., Казарян Б.А., Назарян К.Б. Регуляция гликолиза в головном мозге крыс эстрадиолом-17^ и прогестероном // Нейрохимия. - 1990. - Т.9, № 3.

Уъ.

закав ¿30

«украв

кап., киок. участок Гос. Инл*и?ут фкзичеокоа культура Ереван 375070, ул. Кравя«а II.