Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние прогестерона в пре- и неонатальном периоде онтогенеза на развитие неокортекса и гиппокампа крыс

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Влияние прогестерона в пре- и неонатальном периоде онтогенеза на развитие неокортекса и гиппокампа крыс"

На правах рукописи

МАЛОФЕИ Юлия Борисовна

ВЛИЯНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА В ИРЕ- И НЕОНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ ОНТОГЕНЕЗА НА РАЗВИТИЕ НЕОКОРТЕКСА И ГИППОКАМПА КРЫС

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

2 4 НОЯ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2011

005003317

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дальневосточный государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Рыжавский Борис Яковлевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Каредина Валентина Семеновна

ГОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России»

кандидат медицинских наук Бородай Светлана Витальевна ГУЗ «Краевой диагностический центр», г. Владивосток

Ведущая организация: государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Амурская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Защита диссертации состоится «23» декабря 2011 г. на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2а

Автореферат разослан «_»_2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Г.В. Рева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Стероидные гормоны оказывают мощное действие на метаболические

процессы в клетках, являются необходимыми системными

детерминаторами и регуляторами основных процессов жизнедеятельности

организма (Розен В.Б., 1994). Они играют важную роль и в регуляции

эмбрионального развития головного мозга (Jiang N. et al, 1996;

Charalampopoulos I. et al, 2008). Прогестерон, являющийся одним из

стероидных гормонов, является ключевым компонентом в обеспечении

наступления и нормального протекания беременности (Graham J.D., Clarke

C.L., 1997; Challis J.R.G. et al., 2000; Szekeres-Bartho J. et al., 2001; Сергеев

П.В., Шимановский Н.Л., 2003; Тихомиров АЛ., 2007). Его недостаток в

организме служит одной из частых причин бесплодия и спонтанного

прерывания беременности (Speroff L., Glass R.H., 1994; Тихомиров A.JL,

2006; Сидельникова В.М., 2009). Экзогенное введение препаратов

прогестерона является одним из основных вмешательств при лечении

угрозы прерывания беременности. Для этого используются различные

виды и формы введения препаратов, но из них прогестерон является

единственным безопасным для применения на ранних этапах развития

беременности (Posaci С. et al., 2000; Roman Е. et al., 2000; Резников А.Г.,

2003; Гуменюк Е.Г. и соавт., 2008; Сидельникова В.М., 2009).

Наступление беременности, сопровождающееся длительным

сохранением функциональной активности желтого тела, , характеризуется

постепенно повышающейся выработкой прогестерона (Сергеев П.В.,

Шимановский Н.Л., 2003). Его уровень в первые недели беременности

составляет 10-30 нг/мл и к концу ее достигает 100-300 нг/мл

(Сидельникова В.М., 2009). Начиная с 4 месяца беременности, местом

образования прогестерона становится плацента и лишь незадолго до родов

3

его секреция снижается (Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., 2003). Таким образом, во время беременности уровень прогестерона в организме женщины повышается примерно в 10 раз. При этом у различных беременных его концентрация значительно варьирует, что, по-видимому, может сказываться на развитии плода.

В организме прогестерон взаимодействует с целым рядом органов-(тканей)-мишеней, к числу которых относится и головной мозг (Sutter-Dub М., 2002; де Линьер Б., 2003; Сергеев П.В., Шимановский H.JL, 2003; Тихомиров A.J1., 2007). Он служит субстратом для восстановленных 5а- и 5Р-метаболитов, оказывающих специфическое действие на половую дифференцировку плода, на клетки мозга (Wright F. et al., 1983; Jiang N. et" al, 1996). С другой стороны, прогестерон оказывает нейропротекторный и нейрорегенеративный эффекты на многие отделы головного мозга, прежде всего - неокортекс и гиппокамп (Schumacher М. et al., 2007; Brinton R.D. et al., 2008; Токмаков A.A., Фуками Я., 2009; Карева E.H. и соавт., 2010).

В то же время, в литературе вопрос о влиянии прогестерона на эмбриональное и постнатальное развитие головного мозга не освещен. Вышеизложенное определило цель исследования, являющегося фрагментом работы, проводимой на кафедре гистологии Дальневосточного государственного медицинского университета по изучению влияния стероидных гормонов на развитие головного мозга (Рыжавский Б.Я., 1991-2010).

Цель исследования

Изучить влияние воздействия прогестерона в пренатапьном и неонатальном периодах онтогенеза на морфометрические и цитохимические показатели развития неокортекса и гиппокампа крыс.

Задачи исследования

1. Изучить морфометрические показатели развития неокортекса и гиппокампа 1-дневных крыс - потомства самок, которым в разные сроки беременности был введен прогестерон.

2. Изучить морфометрические, цитохимические и физиологические показатели состояния неокортекса и гиппокампа 40-дневных крыс -потомства самок, которым в разные сроки беременности и в разных дозах был введен прогестерон.

3. Изучить влияние введения прогестерона крысам в неонатальном периоде онтогенеза на морфометрические, цитохимические и физиологические показатели развития неокортекса и гиппокампа в 40-дневном возрасте.

4. Сопоставить влияние эффектов пре- и неонатального введения прогестерона на показатели развития мозга крыс.

5. Изучить особенности поведения крыс, подвергнутых воздействию прогестерона в пре- или неонатальный период онтогенеза.

Научная новизна исследования

Морфология неокортекса и гиппокампа новорожденных крыс, матери которых получали прогестерон в разные сроки беременности, отличается от таковой у контрольных животных. Совокупность отличий может расцениваться как свидетельство опережающего развития коры мозга подопытных животных.

1. Пренатальное введение прогестерона вызывает отклонения в развитии неокортекса и гиппокампа мозга крыс в течение молочного и препубертатного периодов, что проявляется наличием у них в 40-дневном возрасте отклонений морфометрических, цитохимических характеристик нейронов, показателей поведения.

2. Введение прогестерона крысятам в неонатальном периоде онтогенеза существенно влияет на морфометрические, цитохимические показатели развития их неокортекса и гиппокампа. В 40-дневном возрасте это проявляется меньшей толщиной неокортекса, увеличенной численной плотностью в нем нейронов, уменьшением размеров их ядер.

Научная и практическая значимость работы

Представлены особенности развития головного мозга новорожденных и 40-дневных крыс, которые подвергались воздействию прогестерона в пре- или неонатальном периоде онтогенеза. Полученные данные представляют интерес для гистологов, неонатологов, акушеров-гинекологов, фармакологов, исследующих развитие мозга и разрабатывающих методы коррекции отклонений развития органа. Эти сведения расширяют представления о роли стероидных гормонов в регуляции развития мозга. Они могут быть использованы при чтении лекций в медицинских вузах на кафедрах гистологии, физиологии, психиатрии, акушерства и гинекологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Введение прогестерона беременным крысам оказьюает влияние на морфометрические и цитохимические показатели развития головного мозга их новорожденного потомства, которое зависит от времени введения. При этом часть наблюдаемых отклонений (увеличение толщины неокортекса, снижение численной плотности нейронов и др.) свидетельствует об опережающих темпах развития органа по сравнению с контролем.

2. В препубертатном периоде направленность изменений,

развивающихся под влиянием пренатального воздействия прогестерона,

однотипна с имеющимися у 1-дневных подопытных животных

(уменьшенная численная плотность нейронов, увеличенная толщина коры

6

в СТД и ее слоя I), что может расцениваться как показатель опережающего развития их мозга. Это подтверждается увеличенными размерами нейронов, повышенной активностью КАОН- и КАОРН-дегидрогеназ, сниженной концентрацией НК в структурах нейронов, характеризующими мозг 40-дневных подопытных крыс.

3. Введение гормона крысятам в неонатальном периоде онтогенеза оказывает действие с направленностью, противоположной по многим показателям по сравнению с наблюдавшейся при его инъекциях беременным самкам. Совокупность отклонений от контроля может рассматриваться как свидетельство замедления темпов развития коры у подопытных крысят.

Апробация диссертации Материалы исследования представлены и обсуждены на расширенном заседании кафедры гистологии, на конференции «Новые технологии в акушерстве и гинекологии» (г. Хабаровск, 2011), на заседании Хабаровского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов (г. Хабаровск, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы, из них 3 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации диссертационных материалов.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 233 страницах и содержит 26 таблиц, 79 рисунков. Список литературы включает 288 источников, в том числе 152 отечественных и 136 иностранных. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав собственных данных, заключения, выводов и списка литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе исследована 231 беспородная белая крыса из 23 пометов, из

них в возрасте 1 день - 78, в возрасте 40 дней - 153. Все крысята являлись

потомством 4-5-месячных самцов и самок. Все исследования проводились

согласно принципам, изложенным в Европейской конвенции по защите

позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных

научных целях. Исследованные животные были разделены на 2 группы:

В 1-й группе изучали влияние введения прогестерона крысам на 2-й

(1-я подгруппа) или 3-й неделе гестации (2-я подгруппа) на показатели

развития неокортекса и гиппокампа их 1- й 40-дневного потомства. В

нашей работе препарат инъецировали беременным самкам в дозе 12,5, 25,

50 мг/кг. Дозы прогестерона подбирали, исходя из имеющихся данных

литературы (Lonsdale D., Burnham W.M., 2003; Goss C.W. et al., 2003;

Gilmer L.K. et al., 2008; Wang J. et al., 2009; Jiang С. et al., 2009).

В первой подгруппе 1-й группы раствор прогестерона вводили

внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг четырем крысам во 2-ю неделю

беременности (на 11-й и 13-й дни) для изучения его влияния на

показатели развития неокортекса и гиппокампа их 1- и 40-дневного

потомства (35 животных).

Во второй подгруппе 1-й группы исследовали влияние введения

прогестерона крысам в 3-ю неделю беременности (на 17-й и 19-й дни) в

различных дозах на показатели развития неокортекса и гиппокампа их 1- и

40-дневного потомства. Изучали: 1) 40-дневное (п=28) потомство 3-х

самок, получавших внутрибрюшинно прогестерон в дозе 12,5 мг/кг; 2) 1-

и 40-дневное потомство 4-х самок (42 животных), которым вводили

прогестерон в дозе 25 мг/кг; 3) 40-дневное потомство самок, которым

вводили препарат в дозе 50 мг/кг (у двух из 3-х подопытных самок

8

наблюдалась пролонгация беременности и произошла внутриутробная гибель плодов, поэтому дальнейшая обработка этих данных нами не выполнялась).

Контролем для подопытных крысят являлось потомство самок, которым в те же сроки беременности вводили эквиобъёмные количества персикового масла и потомство интактных животных. Контрольные крысята для первой подгруппы были получены из 3-х пометов (30 животных). Контроль для второй подгруппы составили 32 животных из 3-х пометов. В качестве контроля нами были исследованы животные, являвшиеся потомством самок, которым инъецировали персиковое масло на 2-й или 3-й неделях беременности, а также крысята, получавшие масло неонатально.

Сами по себе инъекции персикового масла являются болезненной процедурой и могут выступать в роли стрессового агента. Сопоставление данных литературы о влиянии материнского стресса на показатели развития потомства, а также - о последствиях стресса, перенесенного в неонатальном периоде онтогенеза (Banks В. et al., 1999; Guinn D. et al., 2001; Соколова T.B., 2003; Ордян Н.Э., Пивина С.Г., 2003; Николаева И.В., 2009) с результатами, полученными в нашей работе, позволило сделать вывод о наличии постстрессорных последствий как пренатального, так и неонатального введения масла на показатели развития головного мозга у контрольных крыс.

Кроме того, исследовалось потомство интактных животных, полученное от 3-х самок (36 крысят). Потомство контрольных самок сравнивали с потомством интактных животных. Это дало возможность для проведения сравнительного анализа характеристик развития мозга экспериментальных крыс как с «масляным контролем», так и с мозгом интактных животных.

Во 2-й группе исследовали влияние введения прогестерона крысам в неонатальном периоде онтогенеза на показатели развития их неокортекса и гиппокампа в 40-дневном возрасте. Введение им препарата проведено в связи с тем, что крысы являются незрелорождающими животными, и их мозг к моменту рождения по ряду параметров сходен с мозгом плодов человека последней трети пренатального развития (В. Clancy et al., 2001). Эксперимент проведен на 3 пометах, полученных от интактных животных. Каждый из пометов был разделен на 2 подгруппы (опытную и контрольную). 1-ю подгруппу (п=14) составили крысята, которым пятикратно внутрибрюшинно вводили на (1-й, 3-й, 5-й, 7-й и 9-й дни жизни) прогестерон в дозе 30 мг/кг. 2-ю подгруппу (п=14) составили животные, которым внутрибрюшинно, в том же возрасте, вводили эквиобъёмные дозы персикового масла. Контролем к ним были также интактные 40-дневные животные, являвшиеся контролем и в 1-й группе (п=19).

Все исследованные животные содержались одновременно в условиях одного вивария, корм и воду получали ad libitum. Забивали интактных, контрольных и экспериментальных крысят декапитацией одновременно, в утренние часы.

В однодневном возрасте животных взвешивали, из помета забивали

по 1-3 самки и 1-3 самца и извлекали головной мозг для определения

гравиметрических и морфометрических показателей. У оставшихся в

пометах крысят в 7, 14, 21, 28 дней жизни определяли массу тела и в 30-

дневном возрасте тестировали поведение в приподнятом крестообразном

лабиринте (ПКЛ). 40-дневных интактных, контрольных и подопытных

животных забивали декапитацией одновременно, в утренние часы. Массу

тела, головного мозга, правого полушария определяли на электронных

весах. Левое полушарие 1- и 40-дневных крысят, после фиксации в

Ю

жидкости Карнуа и дегидратации в спиртах, разрезали, пользуясь схемами В.М. Светухиной (1962), строго перпендикулярно длиннику и его верхней поверхности и заливали в парафин. Из переднетеменной (ПТД) и собственно теменной (СТД) долей изготавливали срезы толщиной 7 мкм, которые окрашивали 1% метиленовым синим и на нуклеиновые кислоты (НК) галлоцианином по Эйнарсону (Кисели Д., 1962). Из СТД правого полушария 40-дневных животных изготавливали криостатные срезы толщиной 20 мкм для проведения реакции на NADH- и NADPH-дегидрогеназы (NADH-д, NADPH-д).

Гистологическое исследование головного мозга животных сравниваемых групп заключалось в следующем:

1. Обзорное изучение срезов переднетеменной и собственно теменной долей, окрашенных 1% метиленовым синим и галлоцианином.

2. Изучение архитектоники неокортекса и ее изменений.

Морфометрическое исследование головного мозга 1-й 40-дневных

крысят проводилось на сериях срезов препаратов ПТД и СТД и включало:

1. Определение толщины коры, слоя I коры головного мозга. Для этого на препаратах, окрашенных 1% метиленовым синим измерение проводили в трех участках при помощи окуляр-микрометра МОВ-15, при увеличении окуляра хЮ, объектива х8 - на препаратах мозга однодневных крысят и объектива хЗ,7 - 40-дневных животных (Автандилов Г.Г., 1990).

2. Определение численной плотности нейронов в слоях II и V ПТД и СТД и поле CAI гиппокампа проводили при увеличении окуляра хЮ, объектива х40 в 5 стандартных полях зрения, площадь которого при измерениях на препаратах мозга 40-дневных животных равна 10000 мкм2, 1-дневных-2500 мкм2.

3. Измерение площади сечения ядрышек, ядер и цитоплазмы

нейронов слоев И, V ПТД и СТД и поля CAI гиппокампа выполняли

н

методом компьютерной морфометрии на аппарате «МЕКОС» (Медицинские компьютерные системы). Для этого на окрашенных галлоцианином препаратах измеряли по 25 клеток из 5 стандартных полей зрения в каждом указанном слое.

Гистохимическое исследование головного мозга 40-дневных животных:

1. Определение активности NADH-д и NADPH-д в цитоплазме нейронов слоев II, V неокортекса и поля CAI гиппокампа на криостатных срезах из СТД правого полушария. Реакции на выявление ферментов выполняли в строго стандартизированных условиях по Lojda (Лойда З.и соавт., 1982). Инкубацию проводили в течение 30 мин в термостате при 37° С в среде, состоящей из 1,5 мл фосфатного буфера (рН=7,4), 4 мг нитросинего тетразолия и 2 мг NADH или NADPH. Результат оценивали измерением оптической плотности продуктов реакции в цитоплазме 25 клеток указанных локализаций при использовании зеленого спектра монохроматического света с Х=550 нм на аппарате «МЕКОС».

2. Определение концентрации нуклеиновых кислот (НК) в ядрышках, ядрах и цитоплазме нейронов слоев И, V неокортекса и поля CAI гиппокампа. Измерение оптической плотности указанных структур выполняли при использовании зеленого спектра монохроматического света с А.=550 нм на аппарате «МЕКОС». В каждом слое исследовали по 25 клеток из 5 полей зрения.

Показатели поведения 30-дневных животных оценивали в

приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ). При тестировании в

течение 3 минут регистрировали суммарное время и число

«элементарных» компонентов поведения: принюхиваний, движений,

стоек, груминга, свешиваний, выходов в открытый и заходов в закрытый

рукав лабиринта. По поведенческим актам рассчитывали интегральные

12

характеристики: исследовательскую активность и уровень тревожности (Сапожников Ю.А. и соавт., 2002).

Данные, полученные в работе, обрабатывали с помощью программы 81аПзПса 6.0. Оценивали среднее значение (М), ошибку среднего (±ш) и медиану. Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

1. Последствия пренатального воздействия прогестерона на показатели развития неокортекса и пшпокампа крыс

1.1 Однодневные крысы

Изучение мозга крысят показало, что введение их матерям во время беременности прогестерона оказало влияние на показатели развития неокортекса и гиппокампа их потомства, выраженность которого зависела от времени введения препарата. Тем не менее, общей чертой их действия явилось наличие того или иного числа признаков большей, чем в контроле, продвинутости в развитии исследованных отделов мозга. Так, инъецирование прогестерона в дозе 25 мг/кг на 2-й неделе гестации приводило к увеличению толщины неокортекса в ПТД (у самцов -718±11,3 мкм против 63 7± 19,5 мкм в контроле, у самок - 708±13,4 мкм против 658±11,8 мкм), толщины коры и её молекулярного слоя в СТД (выявлено у самцов и составило соответственно 537±8,4 мкм и 61,5±0,3 мкм против 500±7,3 мкм и 54,8±2,5 мкм). У подопытных животных отмечалось снижение численной плотности нейронов в слое V ПТД, что у самцов составляло 8,2±0,2 против 10,1±0,5, у самок - 8,5±0,3 против 9,9±0,4, слое II ПТД и СТД (отмечалось у самцов и равнялось 26,7±0,9 и 9,3±0,4 против 29,9±0,9 и 11,1 ±0,3). Введение той же дозы препарата на 3-й неделе беременности обусловило у 1-дневных самок уменьшение

численной плотности нейронов в слое V ПТД (8,4±0,2 против 11,2±0,4) и в слое II СТД (24,4±0,6 против 27,6±0,5). Оценка этих отличий в качестве признаков опережающего развития мозга базируется на данных литературы об уменьшении по мере созревания мозга плотности расположения в нем нейронов, обусловливаемом увеличением их размеров, а также - увеличением числа глиоцитов и объема нейропиля. Эти механизмы могли обусловливать также выявленные у животных обоего пола, матери которых получали гормон на 2-й неделе гестации в дозе 25 мг/кг, увеличение толщины неокортекса ПТД, а также у самцов этой группы - массы мозга и полушария, толщины коры СТД и ее слоя I. Сопоставление показателей развития неокортекса и гиппокампа крысят -потомства самок с введением прогестерона как на 2-й, так и на 3-й неделе гестации с таковыми у потомства интактных самок также выявило у животных опытной группы наличие признаков большей продвинутое™ в развитии мозга.

Таким образом, введение прогестерона беременным крысам оказывает существенное влияние на мозг их 1-дневного потомства, проявляющееся наличием признаков опережающего развития мозга по сравнению с мозгом как потомства контрольных, так и интактных животных.

1.2 40-дневные крысы

Максимальное проявление пренатального воздействия прогестерона

на показатели развития неокортекса и гиппокампа отмечалось у 40-

дневных животных - потомства самок, которым вводили гормон на 3-й

неделе беременности в дозе 25 мг/кг. Так, у самцов имелось увеличение

массы мозга и полушария, толщины коры в СТД (табл.). При этом у

крысят обоего пола в данной группе отмечалось уменьшение численной

плотности нейронов в слоях II ПТД, II и V в СТД и в поле CAI

14

гиппокампа, т.е. изменение этих показателей имело однонаправленный характер с изменениями, выявленными у однодневных подопытных крысят. Наряду с этими отклонениями, у них имелось увеличение размерных характеристик ядер нейронов слоев II и V СТД, цитоплазмы нейронов слоя II СТД. Кроме того, у самцов наблюдалось уменьшение размеров ядрышек нейронов гиппокампа и увеличение в них размеров ядер и цитоплазмы. У самцов также выявлено снижение концентрации РНК в цитоплазме клеток слоя II и V СТД (0,626±0,032 усл. ед. и 0,667±0,026 усл. ед. против 0,702±0,011 усл. ед. и 0,752±0,024 усл. ед. в контроле). Уменьшение концентрации РНК может быть следствием их «разведения» другими соединениями, а также - увеличения размеров цитоплазмы (Витвицкая Л.В. и соавт., 1982). Изучение активности ферментов выявило у самок повышение активности NADH-д в цитоплазме нейронов всех изученных локализаций, свидетельствующее об увеличении интенсивности окислительных процессов в митохондриях и генерирования в них энергии (Страйер JL, 1985). Активность NADPH-д возросла у самцов в клетках слоя V и поля CAI гиппокампа, у самок - в гиппокампе, что может рассматриваться как отражение интенсификации синтеза разных классов соединений, обеспечивающих, в частности, увеличение темпов роста мозга у животных опытной группы (Ашмарин И.П., Стукалов П.В., 1996).

Мозг потомства самок, получавших прогестерон в этой же дозе на 2-й неделе гестации, также имел ряд признаков опережающих темпов развития: снижение плотности расположения нейронов в слоях II, V ПТД и СТД (у животных обоего пола), а также - в гиппокампе (у самцов) (табл.). Таким образом, характер отклонений этих показателей от контроля был идентичным наблюдавшемуся в 1-дневном возрасте.

Таблица

Гравиметрические и морфометрические показатели развития неокортекса и гиппокампа 40-дневного потомства крыс, которым во время беременности вводили прогестерон

Группа Показатели Введение масла на 2-й неделе беременности Введение прогестерона (25 мг/кг) на 2-й неделе беременности Введение масла на 3-й неделе беременности введение прогестерона (12,5 мг/кг) на 3-й неделе беременности Введение прогестерона (25 мг/кг) на 3-й неделе беременности

<? (п=12) 9 (п=7) $ (п=15) $ (п=10) <3 (п=10) $ (п=7) $ (п=12) ? (п=16) с?(п=9) $ (п=8)

Абсолютная масса, мг: головного мозга 1589±10 1504±9,4 1580±14 1552±21" 1570±19 1507±36 1527*22 1459*17 1630*16' 1558*22

полушария 567±6,1 535±5,7 564±5,7 550±8,6 546±5,9 541±13 532*7,5 506*5' 602*9,5* 574*11

Толщина в ПТД, мкм: коры 1458±25 1451±27 1522±33 1533±30 1496±52 1448±49 1505±34 1449*20 1495*45 1414*22

слоя I 140±4 135±5 129±4 130±6 128±2 124±5 142*5' 134±3 140*6 139*5,5

Численная плотность нейронов в ПТД: слой II 21,1±0,7 22,0±0,7 18,9±0,4' 18,8±0,5* 21,8±0,5 20,6±0,7 20,5*0,5 18,9*0,4* 18,9*0,8* 18,8*0,5*

слой V 9,5±0,1 10,СШ),3 8,4±0,2' 8,3±0,2' 8,2±0,2 8,5±0,2 8,0*0,3 8,7±0,2 7,7*0,2 7,8*0,3

Толщина в СТД, мкм: коры 1076±25 I076±26 1016±18 1044±21 1068±23 1026±39 1035*26 1057*20 1190*39* 1112*58

слоя I 119±4 118±3 115±3 122±3 125±3 113±2 124*3 122*2' 126*3 И7±4

Численная плотность нейронов в СТД: слой II 23,2±0,8 22,6±0,6 19,4±0,4' 19,2±0,4' 21,6±0,7 24,8±0,8 20,7*0,8 20,5*0,7* 18,1 ±0,6' 18,6*0,8*

слой V 10,1±0,3 9,9±0Л 8,7±0,2" 8,4±0,11 8,6±0,2 9,1±0,3 7,9*0,2' 8,5*0,2 7,8*0,3' 7,3*0,3'

гиппокамп 26,6±0,4 25,8±0,6 24,0±0,31 24,5±0,3 25,7±0,6 25,6±0,5 25,1*0,2 25,6*0,3 23,0*0,8' 23,1*0,9'

Активность Ь'АОРН-д в нейронах, усл. ед.: слой II 0,508±0,026 0,472±0,019 0,473±0,017 0,488*0,047 0,429±0,027 0,557±0,037 _ 0,460*0,019 0,520±0,017

слон V 0,631±0,034 0,547±0,045 0,489±0,02б' 0,552±0,058 0,520±0,026 0,645±0,036 - - 0,652*0,026' 0,593*0,039

гиппокамп 0,704±0,033 0,591±0,044 0,572±0,028' 0,589±0,056 0,482±0,025 0,581±0,044 - - 0,719*0,047* 0,744*0,040'

Активность ЫАБН-д в нейронах, усл. ед.: слой II 0,633±0,031 0,524±0,031 0,482±0,039' 0,551±0,038 0,578±0,040 0,448±0,040 0,582*0,032 0,510*0,034 0,577*0,019 0,585*0,037*

слой V 0,691±0,041 0,661±0,066 0,459±0,0311 0,539±0,050 0,717±0,054 0,492*0,059 0,731 ±0,039 0,646*0,031' 0,626*0,015 0,670*0,048*

гиппокамп 0,594±0,033 0,578±0,049 0,435±0,035' 0,502±0,044 0,609±0,034 0,455*0,029 0,598*0,031 0,649*0,041' 0,641*0,031 0,703*0,046'"

Примечание:1 - различия с контролем (введение масла) статистически достоверны (р<0,05),

Кроме того, у подопытных самцов размеры цитоплазмы нейронов в слое V ПТД (111,97±3,75 мкм2) и ядер нейронов в гиппокампе (66,73±1,09 мкм2) были большими, чем эти показатели в группе контроля (99,47±3,27 мкм2 и 62,08±0,87 мкм2 соответственно). Экспериментальные самки имели увеличенные размеры ядер в слое V ПТД (84,99±2,15 мкм2 против 78,27±1,60 мкм2) и в гиппокампе (68,34±0,66 мкм2 против 59,59±0,75 мкм2). В то же время самцы характеризовались значительно сниженной активностью NADH-д и NADPH-д. Так, у них активность первого фермента была достоверно уменьшена во всех изученных локализациях, второго - в нейронах слоя V и гиппокампа. У самок активность этих ферментов не имела достоверных отличий от контроля (табл.).

У потомства крыс, получавших прогестерон в дозе 12,5 мг/кг на 3-й неделе геастации, различия с контролем выражались в уменьшении численной плотности нейронов в слое V СТД (у самцов), в слоях II ПТД и СТД (у самок) (табл.) и в увеличении размеров ядер этих клеток, отмечавшемся у самцов в слоях II ПТД и V СТД, у самок - в слоях II ПТД и СТД. Кроме того, у крысят опытной группы отмечалось увеличение толщины слоя I в ПТД (у самцов) и в СТД (у самок). Как известно, данный слой в основном формируется отростками нейронов глубжележащих слоев (Е.А. Чепур, 2001; В.Е. Охотин, С.Г. Калиниченко, 2002). В связи с этим можно предполагать, что и это различие отражает большую степень дифференцировки нейронов. Подопытные животные обоего пола имели меньшую, чем в контроле, концентрацию РЖ в цитоплазме нейронов в слое V СТД и поле CAI гиппокампа. Активность NADH-дегидрогеназы у самцов не имела различий с контролем, у самок она была повышенной в нейронах слоя V и поля CAI гиппокампа.

Таким образом, нами установлен ряд морфометрических и

гистохимических отличий мозга подопытных животных от «масляного

17

контроля». В то же время нас интересовало, отличался ли мозг экспериментальных крыс от контроля. Проведенный анализ показал, что при введении прогестерона самкам на 2-й или на 3-й неделе беременности ряд показателей развития неокортекса и гиппокампа, различавшихся у контрольных и интактных животных, соответствовали норме. При этом их количество было максимальным при введении гормона в дозе 25 мг/кг.

Тестирование поведения крыс в ПКЛ выявило, что у интактных самок величина медианы исследовательской активности превышала таковую у самцов, а медиана уровня тревожности не имела тендерных различий. У контрольных самцов (введение масла на 2-й неделе гестации) напротив, медиана исследовательской активности была выше, чем у самок. При введении масла самкам на 3-й неделе беременности медианы исследовательской активности и тревожности их потомства обоего пола имели близкие значения. Потомство разного пола самок, которым вводили прогестерон в дозе 25 мг/кг на 2-й или на 3-й неделе беременности, по этим характеристикам имело аналогичное с таковым у интактных животных соотношение медиан исследовательской активности и тревожности. Введение препарата крысам на 3-й неделе беременности в дозе 12,5 мг/кг приводило у их потомства к нивелированию половых различий по медианам исследовательской активности.

2. Последствия воздействия прогестерона в неонатальном периоде на показатели развития неокортекса и гиппокампа 40-дневных крыс

Эффект от введения гормона крысятам в неонатальном периоде онтогенеза оказался по ряду показателей противоположным тому, что наблюдался при его инъекциях беременным самкам. Совокупность отклонений от контроля может свидетельствовать о замедлении темпов развития коры мозга у подопытных крысят. К таким отклонениям

18

относятся уменьшение массы полушария (у самцов - 491±19,9 мг против 540±Ю,1 мг в контроле, у самок - 484±16,3 мг против 523±9,6 мг), повышение численной плотности нейронов в неокортексе ПТД у животных обоего пола (у самцов: в слое II - 20,5±1,4 против 17,3±0,7, в слое V - 9,1±0,6 против 7,8±0,2; у самок, соответственно - 22,7±0,7 против 18,5±0,6 и 10,0±0,3 против 7,9±0,2). У самцов, кроме того, имелось уменьшение толщины коры в ПТД и слоя I СТД (1423±28 мкм и 116±2 мкм против 1568±52 мкм и 132±7 мкм соответственно), размеров ядер нейронов слоя V СТД (77,66±2,52 мкм2 против 87,62±3,24 мкм2), у самок -уменьшение массы мозга (1373±29 мг против 1505,5±17 мг), увеличение численной плотности нейронов в слоях коры СТД (в слое II - 21,4±1,3 против 17,б±0,4, в слое V - 10,1 ±0,4 против 7,8±0,2), уменьшение размеров ядер нейронов слоя V ПТД (80,61±3,64 мкм2 против 91,98±3,84 мкм2).

Неонатальное введение масла вызывало снижение медианы исследовательской активности у самок, и, напротив, увеличивало у них медиану уровня тревожности, тогда как инъекции прогестерона не изменяли характер тендерных различий медианы исследовательской активности, который был аналогичен таковому в группе интактных крыс.

Таким образом, полученные в работе данные свидетельствуют о том, что пре- и неонатальное введение прогестерона вызывает многочисленные и разноплановые изменения, локализующиеся в отделах мозга, имеющих разное функциональное значение. Они могут расцениваться как следствие прямого влияния гормона на рецепторный аппарат этих клеток, а также как результат его опосредованных влияний.

Оценивая в целом полученные результаты, можно сказать, что они способствуют более полному пониманию механизмов гормональной регуляции развития мозга, роли в ней прогестерона.

выводы

1. Введение прогестерона беременным крысам оказывает влияние на морфометрические и гистохимические показатели развития головного мозга их потомства в неонатальном и препубертатном периодах онтогенеза. Его характер зависит от срока гестации и дозы препарата, при этом часть наблюдаемых отклонений (увеличение толщины неокортекса, снижение численной плотности нейронов, увеличение размеров нейронов и др.) свидетельствует об ускоренных темпах развития органа. Выраженность изменений показателей развития мозга под влиянием введения прогестерона имеет тендерные отличия.

- 2. Инъецирование прогестерона в дозе 25 мг/кг самкам на 2-й неделе беременности обусловливает у их новорожденного потомства большую, чем в контроле, толщину неокортекса в ПТД, меньшую численную плотность нейронов в ее слое V. Кроме того, у самцов наблюдается увеличение массы мозга и его полушария, толщины коры СТД и ее слоя I, уменьшение численной плотности нейронов в слоях II ПТД и V СТД. Введение прогестерона в этой же дозе на 3-й неделе гестации приводит к сходным, но менее выраженным изменениям морфометрических характеристик неокортекса; при этом выявляется уменьшение массы мозга и полушария.

3. Максимальное влияние прогестерона на показатели развития мозга 40-дневных крысят выражено при его введении в дозе 25 мг/кг в период формирования рецепторов к гормону (3-я неделя гестации). Оно проявляется у животных обоего пола признаками опережающего развития мозга: уменьшением численной плотности нейронов в слое II ПТД, слое II и V СТД и гиппокампе, увеличением размерных характеристик нейронов неокортекса, повышением в них активности КАОРН-д. У самцов при этом наблюдается увеличение массы мозга и полушария, толщины неокортекса

20

в СТД. У самок этой группы имеется также повышение активности ЫАБН-д. Введение прогестерона в этот же период гестации в дозе 12,5 мг/кг по большинству показателей вызывает идентичные отличия от контроля. При этом у подопытных самок масса полушария головного мозга уменьшается по сравнению с контролем.

4. Введение прогестерона в дозе 25 мг/кг самкам крыс на 2-й неделе беременности ведет к уменьшению численной плотности нейронов в ПТД, СТД мозга и увеличению размеров ядер нейронов гиппокампа у их 40-дневного потомства обоего пола. У самцов, кроме того, наблюдается уменьшение численной плотности нейронов в гиппокампе, увеличение размеров цитоплазмы нейронов слоя V ПТД, снижение активности ИАВН- и КАОРН-дегидрогеназ. У самок имеется увеличение массы головного мозга, уменьшение размеров цитоплазмы нейронов слоя II ПТД, увеличение размеров ядер нейронов слоя V ПТД.

5. Введение прогестерона крысятам на 1-й, 3-й, 5-й, 7-й, 9-й дни жизни в дозе 30 мг/кг обусловливает и у самцов, и у самок в 40-дневном возрасте уменьшение массы полушария и увеличение численной плотности нейронов в ПТД. Вместе с тем, у самцов выявляется уменьшение толщины коры ПТД и слоя I СТД, а также - размеров ядер нейронов слоя V СТД. У самок отмечается уменьшение массы головного мозга, увеличение численной плотности нейронов в СТД, уменьшение размеров ядер нейронов слоя V ПТД.

6. Введение прогестерона беременным самкам и новорожденным крысятам, наряду с изменением морфометрических и гистохимических характеристик развития мозга экспериментальных животных, приводит к ряду отклонений их поведения.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Колмакова Ю.Б., Учакина Р.В., Рыжавский Б.Я. Влияние введения прогестерона новорожденным крысам на показатели развития мозга, гонад и надпочечников // Дальневосточный медицинский журнал. 2009. № 3. С. 96-99.

2. Малофей Ю.Б., Рыжавский Б.Я., Учакина Р.В. Влияние введения прогестерона беременным самкам крыс на показатели развития мозга, гонад и надпочечников их потомства // Дальневосточный медицинский журнал. 2010. № 1. С. 94-98.

3. Малофей Ю.Б. Влияние введения прогестерона беременным самкам крыс на развитие головного мозга их 1- и 40-дневного потомства // Новые технологии в акушерстве и гинекологии. Сб. науч. Тр. Дальневосточной региональной научно-практической конференции. 2011. С. 146-151.

4. Малофей Ю.Б., Рыжавский Б.Я. Влияние введения прогестерона беременным самкам крыс на показатели развития головного мозга их новорожденного потомства // Дальневосточный медицинский журнал. 2011. №2. С. 76-80.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ПТД - переднетеменная доля;

СТД - собственно теменная доля;

ШОП-д - ЫАОН-дегидрогеназа;

ЫАОРН-д - КАБРН-дегидрогеназа;

НК - нуклеиновые кислоты;

ПКЛ - приподнятый крестообразный лабиринт.

Малофей Юлия Борисовна

ВЛИЯНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА В ПРЕ- И НЕОНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ ОНТОГЕНЕЗА НА РАЗВИТИЕ НЕОКОРТЕКСА И ГИППОКАМПА КРЫС

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 14.08.2011 Формат 60x90 1/16. Усл. п.л. 1,0. Уч. изд. л. 0,75. Тираж 100 экз. Заказ 112

Отпечатано на участке оперативной полиграфии типографии ООО «Рея» г. Владивосток, ул. Адм. Юмашева, 126