Морфофункциональные изменения в миндалевидном комплексе мозга крыс линии WAG/Rij под влиянием половых гормонов

Садртдинова, Индира Илдаровна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Морфофункциональные изменения в миндалевидном комплексе мозга крыс линии WAG/Rij под влиянием половых гормонов
ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные изменения в миндалевидном комплексе мозга крыс линии WAG/Rij под влиянием половых гормонов"

На правах рукописи

САДРТДИНОВА Индира Илдаровна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В МИНДАЛЕВИДНОМ КОМПЛЕКСЕ МОЗГА КРЫС ЛИНИИ \VAGZRij ПОД ВЛИЯНИЕМ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВГ

Специальность 06.02.01 - Диагностика болезней и терапия животных,

патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 АПР 2015

УФА-2015

005566611

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»

Научный руководитель: Хисматуллина Зухра Рашидовна

доктор биологических наук, доцент

Официальные оппоненты: Абрамова Людмила Леонидовна

доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой морфологии, физиологии и патологии ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»

Шакирова Светлана Марселевна

кандидат биологических наук, доцент кафедры морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва».

Защита диссертации состоится «24» апреля 2015 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.003.02 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный аграрный университет» по адресу: 450001, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, 34.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» и на сайте www.bsau.ru

Автореферат разослан « /3 » 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Каримов Фоат Ахметович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время весьма актуальной проблемой является системная эндокринологическая регуляция возникновения абсансных приступов (Лекомцева Е.В., 2006; Меньшикова Н.С. и др., 2007; Толмачева Е.А., 2006; Bazyan A.S., van Luijtelaar G., 2013).

Эстрогеновые рецепторы выявлены экспериментальным путем во множестве подкорковых образований, локализованных преимущественно в отделах лимбической системы мозга (Karceski S. et al., 2005; Mikkonen К., Tauboll E., 2005; Murialdo G. et al., 1997). Научные и клинические исследования показывают, что среди структур, реагирующих на изменение гормонального фона, выделяют две наиболее важные, участвующие в патогенетических механизмах многих заболеваний, в том числе в патогенезе эпилепсии -миндалевидный комплекс (МК) мозга и гиппокамп (Авякан Г.Н. и др., 2002; Сагфак N. et al., 2014; de Oliveira J.C. et al., 2014; Flores-Mancilla L.E. et al., 2014; Kimura Y. et al., 2014; Markota M. et al., 2014; McHugh M.J. et al., 2014; Takeda Y. et al., 2001; Wu T. et al., 2014). Миндалевидный комплекс мозга обладает низким порогом чувствительности к судорожной активности (Ильюченок Р.Ю. и др., 1981; Flores-Mancilla L.E. et al., 2014), выполняет важную роль как звено репродуктивной системы организма, оказывая влияние на активность гипоталамических центров регуляции секреции гонадотропинов (Акмаев И.Г., Калимуллина Л.Б., 1993; Salamon Е. et al., 2005) и принимает участие в модуляции нейроэндокринной и иммунной систем (Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2003; Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б., 2010, 2011; Lin Y. et al., 2011).

Переднее кортикальное ядро (СОа) миндалевидного комплекса мозга относится к числу элементов нейроэндокринной системы мозга, так как его нейроны имеют рецепторы к половым стероидам и реагируют на их уровень изменением своей функциональной активности (Акмаев И.Г., Калимуллина Л.Б., 1993; Хисматуллина З.Р., 2009). Все вышеизложенное обосновывает актуальность настоящей работы в изучении роли переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга в нейроэндокринологических механизмах регуляции организма крыс линии WAG/Rij с генетической предрасположенностью к абсансной эпилепсии.

Цель исследования состояла в комплексной оценке влияния половых гормонов на морфофункциональные изменения в переднем кортикальном ядре миндалевидного комплекса мозга крыс линии WAG/Rij.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить влияние половых гормонов на электрическую активность нейронов переднего кортикального ядра у самок крыс линии WAG/Rij до и после овариоэктомии и заместительной гормональной терапии.

2. Провести анализ влияния разных уровней половых гормонов на ориентировочно-исследовательское поведение, эмоциональный статус и уровень депрессивности крыс линии WAG/Rij.

3. Выполнить сравнительный анализ цитологических особенностей и морфометрических параметров нейронов и глии переднего кортикального ядра у самок крыс до и после овариоэктомии и заместительной гормональной терапии.

4. Иммуногистохимическим методом определить содержание кислого глиального фибриллярного белка (СБАР) в переднем кортикальном ядре у самок крыс до и после овариоэктомии и заместительной гормональной терапии.

5. Выявить ультраструктурные изменения нейронов, глии и синаптического аппарата в переднем кортикальном ядре в ответ на овариоэктомию и заместительную гормональную терапию.

Научная новизна. Впервые с помощью современных методов исследования (электрофизиологических, поведенческих, морфометрических, гистологических, иммуногистохимических, электронномикроскопических и статистических) дана комплексная оценка структурных и функциональных изменений в переднем кортикальном ядре миндалевидного комплекса мозга самок крыс линии \УАСЛ1у в ответ на модулирующее влияние половых гормонов. Выявлены изменения электроэнцефалографических показателей переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга и поведенческих характеристик в тесте «открытое поле» и «вынужденное плавание» у самок крыс линии \УАО/11у при различных уровнях половых гормонов. Впервые изучены реактивные изменения нейронов, глиоцитов переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга самок крыс линии \УАСг/11у на дефицит половых гормонов и заместительную терапию 17р-эстрадиолом в комбинации с прогестероном. Впервые проведен иммуногистохимический анализ астроцитарной глии переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга крыс линии \УАС/Щ| до и после овариоэктомии и заместительной гормональной терапии. Впервые проанализированы синапсоархитектоника и ультраструктурные особенности нейронов, глиальных клеток, нейропиля переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга крыс линии WAG/Rij при экспериментально вызванном дефиците половых гормонов и на фоне экзогенного введения овариоэктомированным самкам 17Р-эстрадиола в совокупности с прогестероном.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные новые сведения о морфофункциональных особенностях переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга крыс линии WAG/Rij расширяют представления о реактивных изменениях в переднем кортикальном ядре при различных уровнях половых гормонов. Результаты работы представляют научный интерес, т.к. была показана прямая зависимость пик-волновой активности мозга, поведенческих особенностей крыс, структурно-количественных и функциональных характеристик нейронов и глии переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга крыс линии \УАб/Лу от уровня половых гормонов. В настоящей работе выявлен позитивный эффект 17р-эстрадиола в комбинации с прогестероном на количественные и качественные характеристики пик-волновых разрядов и поведенческие реакции самок крыс линии \¥АС/11у.

Полученные результаты используются в учебном процессе на лекциях и практических занятиях на кафедре физиологии человека и зоологии Башкирского государственного университета и на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней Башкирского государственного аграрного университета.

Методология и методы исследования. Методологической основой нашего исследования является комплексный подход, включающий ряд электрофизиологических, поведенческих, морфометрических, гистологических, иммуногистохимических, электронномикроскопических исследований. Полученные количественные данные подвергали статистической обработке.

Положения, выносимые на защиту:

1. Уровень половых гормонов влияет на количественные и качественные характеристики пик-волновых разрядов в переднем кортикальном ядре миндалевидного комплекса мозга крыс линии WAG/Rij.

2. Двигательная активность, исследовательская деятельность, эмоциональный статус и депрессивноподобное поведение самок крыс линии WAG/Rij зависят от уровня половых гормонов.

3. После овариоэктомии и заместительной гормональной терапии выявляются структурно-количественные, функциональные и ультраструктурные изменения нейронов, глиальных клеток, синапсов в переднем кортикальном ядре миндалевидного комплекса мозга самок крыс линии WAG/Rij.

Степень достоверности и апробация работы. Исследование выполнено на достаточном по объему фактическом материале с применением комплекса современных нейробиологических методов исследования. Полученные результаты проанализированы с помощью адекватных методов статистической обработки данных.

Основные результаты данной работы были представлены на конференциях: XX и XXI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013», «Ломоносов-2014» (Москва, 2013, 2014); XVI и XVII Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей (с международным участием) «Фундаментальная наука и клиническая медицина - Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2013, 2014); Международная научно-практическая конференция «Актуальные направления фундаментальных и прикладных исследований» (Москва, 2013); XVII научная школа-конференция молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2013); X Международная научно-практическая конференция «Проблемы современной биологии» (Москва, 2013); III Международная научно-практическая конференция «21 век: фундаментальная наука и технологии» (Москва, 2014); Всероссийская конференция с международным участием «Биотехнология - от науки к практике» (Уфа, 2014); V Международная научно-практическая конференция «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2014).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 22 научные работы, пять из которых в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 196 страницах компьютерного текста и состоит из оглавления, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, практических рекомендаций, выводов и библиографического списка. Список литературы включает 460 источников, из них 144 отечественных и 316 иностранных. Иллюстрации представлены 50 рисунками (из них 28 - электронные микрофотографии), цифровой материал сгруппирован в 6 таблицах.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на половозрелых самках крыс линии WAG/Rij (п=120), массой тела 200-220 г. (в возрасте шести месяцев). Крыс содержали в стандартных условиях вивария кафедры физиологии человека и зоологии Башкирского государственного университета, характеризующихся постоянством комнатной температуры (20-22 °С) и уровнем влажности. Еду и питье крысы получали ad libitum. При работе с крысами полностью соблюдались международные принципы Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным (2000).

Цитологический метод определения стадии полового цикла у самок. Мазки (влагалищные смывы) брали в 12.00 часов дня (Комаров Ф.И., Рапопорт С.И., 2000) и определяли 4 фазы полового цикла: диэструс, проэструс, эструс и метэструс (Киршенблат Я.Д., 1969).

Метод овариоэктомии (Киршенблат Я.Д., 1969). Под эфирным наркозом производили двустороннее удаление яичников. Отсутствие эстрального цикла у самок подтверждали анализом влагалищных мазков в течение 4-х суток. Так как после гонадэктомии животные находятся в хроническом диэструсе, эксперименты с крысами группы контроль осуществляли на стадии диэструс.

Заместительная гормональная терапия (ЗГТ). Заместительная терапия овариоэктомированным крысам проводилась спустя месяц после операции. Самкам вводили 17Р-эстрадиол (10 мкг/ЮОг, растворяли в стерильном персиковом масле) один раз в сутки в течение двух дней, а на третьи сутки вводили 17р-эстрадиол в комбинации с прогестероном (5 мг/100г). Записи фоновой электроэнцефалограммы (ЭЭГ) проводили через три часа после инъекций.

Для проведения электрофизиологических исследований крысам имплантировали электроды с помощью стереотаксического прибора Хорслея-Делла (тип ЭМИБ-I). В качестве наркоза использовали хлоралгидрат в дозе 400 мг/кг. Активный электрод устанавливали по стереотаксическим координатам атласа мозга крысы Паксиноса-Уотсона (Paxinos G., Watson С., 1998) в переднее кортикальное ядро (АР=-1,8; LM=3,5; Н=9,5), референтный - имплантировали в затылочную кость черепа над мозжечком. Восстановительный период составлял в среднем 7-10 дней.

Регистрацию фоновой ЭЭГ производили с помощью программно-управляемого компьютерного комплекса для регистрации и обработки биоэлектрической активности, включающей в себя предварительный усилитель

М-707 фирмы «WPInstruments, Inc.», конечный усилитель У5-10, а также плату АЦП-ЦАП, установленную в IBM-совместимый компьютер. Визуальный анализ фоновых ЭЭГ проводили по следующим параметрам: количество пик-волновых разрядов в единицу времени, общая длительность пик-волновых разрядов (сек), средняя продолжительность одного пик-волнового разряда (сек), пик-волновой индекс (%).

Поведенческие тесты. Эмоциональную реактивность, двигательную активность и исследовательскую деятельность крыс изучали в тесте «открытое поле» (Hall C.S., 1936). Уровень депрессивности крыс изучали в тесте «вынужденное плавание» по Порсолту (1977). Животных помещали в цилиндрический сосуд (высота 70 см, внутренний диаметр 38 см), заполненный водой на высоту 33 см. Температуру воды поддерживали на уровне 25±2°С. Поведенческие показатели регистрировали при помощи веб-камеры Logitech С 310 HD с автоматическим переносом видеозаписи на компьютер (в обоих тестах).

Исследование цитоархитектоники и цитологии нейронов и глин. Головной мозг фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и заливали в парафин, изготавливали серийные срезы толщиной 10 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином и крезиловым фиолетовым по Нисслю (Меркулов Г.А., 1969).

Подсчет количества нейронов и глии. Плотность клеточных элементов измеряли в поле зрения микроскопа МБИ-11 (JIOMO, Россия) на площади 0,031 мм2 при увеличении в 400 раз (объектив 40, окуляр 10). На основании полученных данных определяли величину нейроглиального индекса.

Иммуногистохимическое исследование глии. Образцы фиксировались в 10% забуференном формалине, далее после обезвоживания заливались в парафиновые блоки. Изготавливали срезы толщиной 4 мкм на микротоме Leica RM 2145 (Германия). Срезы окрашивали с помощью иммуногистостейнера Leica Microsystems BOND™ (Германия). Иммуногистохимическим методом выявляли содержание маркера глиальных клеток - кислого глиального фибриллярного белка (GFAP).

Электронно-микроскопическое исследование нейронов, глии и нейропиля. Кусочки ткани фиксировали в охлажденном 2,5%-ном глутаральдегиде на какодилатном буферном растворе (pH 7,2-7,4) и постфиксировали в 2%-ном растворе 0s04 на том же буфере, обезвоживали в этаноле восходящей концентрации и заливали в эпон-812. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-III 8800 (Швеция), контрастировали 2% водным раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу (Уикли А.Б., 1975) и изучали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-1011СХII (Япония).

Статистическую обработку данных проводили с использованием лицензионного пакета прикладных программ «STATISTICA» v.7.0 (Stat Soft Inc., США). Для оценки достоверности различий применяли непараметрические критерии (Вилкоксона, U-критерий Манна-Уитни). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты визуального анализа ЭЭГ показали, что на всех анализируемых фоновых ЭЭГ крыс линии \¥АС/К.ц присутствовали спонтанные пик-волновые разряды (БШ)) (Рисунок 1).

Рисунок 1 - Электроэнцефалограммы СОа МК мозга самок крыс линии \VAGZRij (пик-волновые разряды указаны стрелками): А) контроль;

Б) после овариоэктомии;

В) после двукратного введения 17р-эстрадиола;

Г) после заместительной терапии 170-эстрадиолом в сочетании с прогестероном (на первые сутки);

Д) после введения 17|3-эстрадиола в совокупности с прогестероном (на пятые сутки). Калибровка 1 с, 50 мкВ.

з *

После овариоэктомии (ОЭ) происходит сокращение количества и продолжительности SWD по сравнению с контролем. Введение овариоэктомированным самкам 17р-эстрадиола показало, что он не оказывает влияние на количество и продолжительность SWD. После введения ОЭ животным 17Р-эстрадиола в сочетании с прогестероном через три часа (на первые сутки) на ЭЭГ происходило нарастание количества и длительности SWD, а на пятые сутки их снижение (р<0,05) (Таблица 1). Пик-волновой индекс после овариоэктомии снижался, после инъекции 17р-эстрадиола с прогестероном через три часа он достоверно повышался, а на пятые сутки вновь понижался (Таблица 1).

Известно, что половые стероидные гормоны по-разному влияют на порог электросудорожной готовности мозга (Крыжановский Г.Н., Глебов Р.Н., 1984; Wang Q., 2000). Результаты нашего исследования демонстрируют следующее: эстрогены выступают как проконвульсанты, т.е. снижают электросудорожный порог, а прогестерон — как антиконвульсант, т.е. повышает электросудорожный порог.

Таблица 1 -Результаты сравнительного анализа количественных параметров пик-волновых разрядов на электроэнцефалограмме СОа крыс линии \МАО/11у в контрольной и опытных группах

Показатели группа контроль овариоэкто-мия овариоэк-томия +17ß-эстрадиол 17р-эстрадиол +прогестерон (на первые сутки) 17|5-эстрадиол +прогестерон (на пятые сутки)

Количество 3,75±0,44 2,0±0,31* 2,17±0,32 4,17±0,48л 1,33±0,21 4

Длительность одиночного 5\УО, сек. 2,6±0,38 1,73±0,39* 2,1±0,11 3,36±0,15л 2,23±0,25 4

Общая длительность Б:*!), сек. 9,49±1,49 4,08±1,18* 4,23±0,46 13,9±1,63л 3,2±0,854

Пик-волновой индекс, % 1,9+0,3 0,82±0,23* 0,85±0Д4 2,78±0,33л 0,64±0,174

Примечание: * - статистически значимые различия (р<0,05) по сравнению с контрольной группой; Л - статистически значимые различия (р<0,05) по сравнению с показателями после введения 17р-эстрадиола; 4 - статистически значимые различия (р<0,05) по сравнению с показателями после введения 17р-эстрадиола с прогестероном (на первые сутки).

Изучение поведенческих реакций показало, что самки контрольной группы в тесте «открытое поле» показали большую двигательную активность и исследовательскую деятельность по сравнению с ОЭ крысами. ОЭ самки с последующей заместительной гормональной терапией демонстрировали высокую двигательную функцию и исследовательскую активность по сравнению с ОЭ самками, но значения не достигали контрольного уровня. При этом следует отметить, что самкам на всех этапах эксперимента была присуща тревожность, т.к. они предпочитали двигаться по периферии поля и редко посещали центр (Таблица 2).

Таблица 2 - Средние показатели (М±ш) двигательной активности самок крыс

линии WAG/Rij по результатам теста «открытое поле»

Группа Латентный период (сек.) Двигательная активность (количество пересеченных квадратов)

в центре по периферии общая

I 48,бЗ±4,70 17,75±1,99 149,25±7,98 167,0±8,75

II 278,75±27,90* 1,75±0,36* 55,63±5,76* 57,38±5,89*

III 65,40±8,96л 21,42±2,64Л 99,42±7,09Л 120,83±9,37л

Обозначения: I - контрольные животные; II - овариоэктомированные крысы; III - овариоэктомированные крысы с последующей заместительной гормональной терапией. Примечание: * - статистически значимые различия (р<0,001) по сравнению с I группой; л - статистически значимые различия (р<0,01) по сравнению со П группой.

У ОЭ самок мы наблюдали незначительное снижение числа актов груминга и увеличение его длительности. После ЗГТ происходило сокращение эпизодов груминга и его продолжительности (Таблица 3). У ОЭ крыс мы наблюдали

редкие, но продолжительные эпизоды груминга по сравнению с контрольными животными, что по предположению A.B. Калуева (2004) характеризует «стрессорный» груминг у грызунов. Количество болюсов дополнительно указывали на высокую степень тревожности животных после овариоэктомии.

Таблица 3- Средние показатели (М±ш) исследовательской деятельности и эмоционального статуса самок крыс линии WAG/Rij по результатам теста

Показатели Группа

I II III

Количество вертикальных стоек в центре 2,94±0,57 0,13±0,09* 1,58±0,38л

по периферии 35,44±4,04 7,38±1,24» !9,83±4,27лл

общее 38,38±4,17 7,50±1,25* 21,42±4,62лл

Груминг число актов 14,75±1,03 12,88±1,26 11,42± 1,3

длительность, сек. 54,63±3,2 197,75±15,82* 75,67±7,0ЛЛ

Среднее количество болюсов 1,13±0,27 3,69±0,18* 1,08±0,42лл

1 ...........—7-- " •" v — " * и IXpUlVUI )

III - овариоэктомированные крысы с последующей заместительной гормональной терапией. Примечание: * - статистически значимые различия (р<0,001) по сравнению с I группой; л - статистически значимые различия при р<0,05 и ЛЛ - при р<0,01 по сравнению со II группой.

Исследование уровня депрессивности у самок крыс линии WAG/Rij в тесте «вынужденное плавание» по Порсолту выявило следующее: ОЭ самки в отличие от контрольных животных проявляют более отчетливые признаки депрессивноподобного состояния, что проявлялось в увеличении времени продолжительности иммобилизации и сокращении времени активного плавания. У самок группы контроль количество ныряний и отряхиваний, то есть попыток освобождения от воды было больше по сравнению с их количеством у ОЭ самок (36,47±3,43 против 15,93±0,60 и 59,87±2,77 против 34,43±1,07, соответственно (при р<0,001)). Высокий показатель данных параметров свидетельствует о низком уровне депрессии у контрольных животных.

После проведения ЗГТ овариоэктомированным крысам, мы наблюдали увеличение времени активного плавания и сокращение времени иммобилизации с 130,14±4,99 сек. до 280,79±3,72 сек. и с 169,86±4,99 сек. до 19,21±3,72 сек., соответственно (при р<0,001). Вместе с тем, происходило возрастание количества ныряний до 25,64±0,64 и количества отряхиваний до 56,71±1,36. Нами отмечено увеличение количества актов груминга до 8,0±0,21 и понижение числа болюсов до 4,21±0,48 по сравнению с ОЭ животными. Введение ОЭ самкам 17ß-эстрадиола в комбинации с прогестероном приводят к снижению индекса депрессивности.

При исследовании структурно-функциональных характеристик нейронов в СОа МК мозга самок крыс линии WAG/Rij нами выявлены нормохромные, гипохромные (светлые), гиперхромные (темные) нейроны и клетки-тени. В группе контроль выявлялись преимущественно нейроны с четкими и округлыми формами тел. Гипохромные клетки характеризовались

овальной или округлой формой с ровными контурами тела. Основную часть перикариона занимало крупное ядро, характеризующееся светлой кариоплазмой, в центре располагалось ядрышко сферической формы. Цитоплазма имела вид узкого ободка. Гиперхромные нейроны имели неровные контуры, темное ядро, ядрышко трудно различалось на фоне глыбок хроматина. При визуальном анализе после ОЭ наблюдались качественные и количественные различия по сравнению с контрольной группой. Для гиперхромных нейронов была характерна тенденция к сближению друг с другом. В нейроцитах после овариоэктомии, в основном, наблюдали смещение ядрышка к одному из полюсов клетки. Относительная плотность нейронов при дефиците половых гормонов в сравнении с их количеством у крыс группы контроль значительно уменьшилась, вероятно, за счет гибели большей части клеток, т.к. при визуальном анализе определялись многочисленные «клетки-тени» с бледно окрашенной гомогенной цитоплазмой. После ЗГТ происходило увеличение количества гиперхромных нервных клеток. Наряду с гиперхромными клетками мы встречали нормохромные нейроны, находящиеся в состоянии покоя. Глиальные клеточные элементы были представлены астроцитами и олигодендроцитами.

В настоящее время нейроно-глиальные соотношения с полным основанием можно рассматривать как один из показателей активности нейронов, находящихся в прямой зависимости от степени функционирования последних (Оржеховская Н.С., 2000).

В представленной работе нами проводился подсчет количества нервных и глиальных клеток до и после овариоэктомии в поверхностной клеточной и глубокой зонах СОа МК мозга у самок крыс линии \>/АО/Ку (Рисунок 2).

X контроль(глубокая зона СОа)

зг овариоэктомия (глубокая зона СОа)

¡Я контроль (поверхностная клеточная зона СОа)

жкЩхив " овариоэктомия ^лйгрякйй (поверхностная

сателлитам глн» вейроглиальный клеточная Зона СОа) индекс

Рисунок 2 - Количественные показатели нейронов и глии в СОа до и после овариоэктомии.

Сравнительный количественный анализ показал, что после ОЭ происходило снижение плотности нейронов с одновременным возрастанием плотности глии, что можно рассматривать как последствие экспериментально вызванной недостаточности гормонов, приводившее к увеличению

нейроглиального индекса. Явление выраженного увеличения плотности глиальных клеточных элементов в сочетании с уменьшением глиального расстояния, вероятно, является защитно-приспособительной реакцией в нейроглиальных комплексах со стороны нейроглии и направлено на поддержание жизнеспособности оставшейся части дистрофически измененных нейронов (Стрельцов В.Ф., 2009).

В нашем исследовании численная плотность сателлитной глии в СОа после ОЭ достоверно повысилась во всех изучаемых зонах. Из литературных источников известно, что астро- и олигодендроциты входят в состав сателлитно-глиальной популяции, которая указывает на степень активности нейронов. Отличаясь друг от друга морфологически и функционально, эти два вида глии внутри нейроно-глиального комплекса представляют единую метаболическую систему, непосредственно влияющую на функциональное состояние нейронов (Певзнер Л.З., 1972; Ройтбак А.И., 1993).

Иммуногистохимическое исследование показало, что астроциты СОа МК головного мозга реагируют на изменение уровня половых гормонов. После овариоэктомии мы наблюдали ярко позитивную реакцию астроцитарной глии на ОРАР, а после ЗГТ - умеренно позитивную реакцию астроцитов на ОРАР. Морфоструктурные изменения глиальных клеток после ОЭ проявлялись в виде гипертрофии и пролиферации астроцитов, диффузного разрастания и разволокнения их отростков. После заместительной терапии 17|3-эстрадиолом и прогестероном мы наблюдали уменьшение степени разбухания и разволокненности отростков, очертания глиоцитов становились более четкими.

Таким образом, астроцитарная глия СОа МК мозга крыс линии Л^АО/Яу активно реагировала на разный уровень половых гормонов.

При ультрамикроскопическом исследовании нами обнаружены следующие формы морфологической изменчивости нейронов: нормохромные, гипохромные, гиперхромные и пикноморфные клетки (Рисунок 3). Среди гиперхромных клеток мы выделили умеренно гиперхромные и резко гиперхромные. После ОЭ процент гипохромных и пикноморфных нейронов возрастал по сравнению с контролем (с 16 % до 40 % и с 5 % до 30 %, соответственно), а после ЗГТ увеличивался процент гиперхромных нейронов по сравнению с овариоэктомированной группой (с 10 % до 83 %). При этом доля гиперхромных клеток у овариоэктомированных самок была ниже по сравнению с контролем (21 %). После заместительной терапии нормохромных клеток стало 5%, а пикноморфных - 12 %. Высокий процент пикноморфных клеток в группе после овариоэктомии свидетельствует о большей степени поражения нейронов СОа МК головного мозга.

После ОЭ нами установлены ультраструктурные изменения ядерного и энергетического аппаратов клетки, комплекса Гольджи и других органелл цитоплазмы. Среди нейроцитов мы выявили два основных типа: умеренно измененные и нейроны со значительными деструктивными изменениями (Рисунок ЗБ, ЗВ). Последние были представлены сморщенными нейронами, в

которых наблюдали вакуолизацию, разрушение ядра и цитоплазматических органелл, наличие большого количества липофусциновых гранул. В умеренно измененных клетках нами было выявлено изменение формы и структуры ядра и смещение ядрышка к кариолемме. Выявленную гипертрофию ядер и ядрышек можно трактовать как проявление адаптационно-компенсаторных перестроек, направленных на увеличение числа свободных рибосом и поддержание синтеза белка в условиях недостатка половых гормонов. Обнаружено увеличение размеров и числа ядерных пор, перинуклеарное пространство местами было расширено. Наблюдались контакты митохондрий с наружной ядерной мембраной и с комплексом Гольджи. Такое явление у A.A. Маниной (1971) объясняется как повышенная потребность ядра и других органелл в энергии в виде аденозинтрифосфорной кислоты.

Рисунок 3 - Ультраструктура нейронов СОа:

A) нормохромный нейрон (контроль);

Б) умеренно измененный нейрон после ОЭ;

B) нейрон со значительными деструктивными изменениями после ОЭ;

Г) умеренно гиперхромный нейрон после ЗГТ. Сателлит ядрышка (стрелка). Обозначения: я - ядро; ЭПР — эндоплазматический ретикулум; м - митохондрия.

Введение овариоэктомированным самкам 17р-эстрадиола в сочетании с прогестероном приводило к сокращению количества пикноморфных нейронов. В ядрах большинства нейронов наблюдали ядрышкоподобные структуры, свидетельствующие о высокой активности процессов транскрипции в ядре нейрона (Рисунок ЗГ).

Глиальные элементы были представлены в основном протоплазматическими и фибриллярными астроцитами (Рисунок 4) и олигодендроцитами. По сравнению с группой контроль у ОЭ самок нейроглия претерпевала дистрофические и деструктивные изменения. Цитоплазматические органеллы трудно распознавались в связи с тем, что в них происходили процессы набухания и структурные разрушения. В цитоплазме выявлялись фаголизосомы (Рисунок 4Б). Введение ОЭ животным 17Р-эстрадиола в сочетании с прогестероном приводило к развитию восстановительных процессов в глиальных клетках. В них мы наблюдали хорошо развитые цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума (ЭПР), четко сформированные митохондрии (Рисунок 4В).

Рисунок 4 - Ультраструктура астроцитов: протоплазматический (А и Б); фибриллярный (В). Обозначения: я - ядро; ЭПР - эндоплазматический ретикулум; м — митохондрия.

В настоящее время синапсоархитектоника является одной из наиболее важных проблем в изучении головного мозга. В СОа МК мозга нами выявлены различные типы химических синапсов. Чаще всего во всех изучаемых нами группах встречали аксо-дендритные синапсы, реже - аксосоматические и аксо-аксональные синапсы.

По действию на иннервируемую клетку, т.е. функционально у крыс группы контроль среди анализируемых синаптических контактов выявлено 33,3 % симметричных (тормозных) синапсов, 66,7 % асимметричных (возбуждающих) синапсов. У ОЭ животных зарегистрировано 48 % симметричных и 52 % асимметричных синапсов, после ЗГТ количество их в процентном соотношении изменилось: 53 % и 47 %, соответственно.

Анализируя кривизну постсинаптической мембраны, нами выявлены следующие поверхности: плоские, вогнутые и выпуклые. В группе контроль синапсы с отсутствием кривизны постсинаптической мембраны составили -55,3%, с выпуклой постсинаптической мембраной - 28 % и вогнутой - 16,7 %. У ОЭ крыс на долю синапсов с отсутствием кривизны постсинаптической мембраны приходилось 69,1%, с изменением кривизны постсинаптической мембраны - 30,9 %, у самок с ЗГТ - 65 % и 35 %, соответственно.

Определялись сложные синаптические комплексы дивергентного и конвергентного типов, свидетельствующие об активном функциональном состоянии нейронов. В СОа МК мозга ОЭ животных наблюдались процессы демиелинизации аксонов, а введение ОЭ самкам эстрадиола и прогестерона приводили к образованию хорошо оформленных миелиновых оболочек, что согласуется с результатами исследований Я. Ра1е1 с соавторами (2013), полученными на трансгенных мышах РЬР-ЕОРР.

Независимо от места образования нейроактивных стероидов, очевидным остается их вовлечение в процессы созревания нейронов, глиального роста и формирования синаптических контактов (Тешет « а1., 2000). Эти структурные изменения могут служить морфологической основой для изменений в настроении, поведении, вегетативных и когнитивных функций организма (Рагёисг Й а1., 2006).

Таким образом, в представленной работе были изучены морфо-функциональные изменения в СОа МК мозга у самок крыс линии \¥АО/11у, являющихся признанной генетической моделью абсансной эпилепсии и

депрессии, под влиянием половых гормонов. Проведенные нами исследования выявили определенные электрофизиологические, поведенческие, структурно-количественные изменения в СОа МК головного мозга самок крыс линии \УАО/11ц в ответ на экспериментально вызванный дефицит половых гормонов и заместительную гормональную терапию 17р-эстрадиолом в совокупности с прогестероном.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты, полученные при выполнении диссертационного исследования, могут быть рекомендованы для использования:

- в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических и лабораторных занятий, а также при выполнении научно-исследовательских работ на биологических, ветеринарных и медицинских факультетах высших учебных заведений;

- при написании монографий и соответствующих разделов учебников, учебных пособий и методических рекомендаций по цитологии, гистологии и эндокринологии;

- в лабораториях НИИ, занимающихся проблемами нейроэндокринной регуляции функций организма.

ВЫВОДЫ

1. Анализ суммарной фоновой ЭЭГ переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга крыс линии \VAGZRij показал, что после овариоэктомии происходит снижение среднего количества пик-волновых разрядов с 3,75±0,44 до 2,0±0,31 (р<0,05) и их общей продолжительности с 9,49±1,49 сек. до 4,08±1,18 сек. (р<0,05). Заместительная терапия 170-эстрадиолом не оказывает влияние на указанные параметры. Введение овариоэктомированным животным 17р-эстрадиола в сочетании с прогестероном вызывает снижение количества и длительности пик-волновых разрядов на пятые сутки (1,33±0,21 и 3,2±0,85 сек., соответственно (р<0,05)), т.е. наблюдается снижение судорожной чувствительности мозга.

2. Экспериментально вызванный дефицит половых гормонов сопровождается увеличением эмоциональности, тревожности и уровня депрессивности у самок крыс линии \УАС/Иу по сравнению с аналогичными показателями контрольных животных. Экзогенное введение овариоэктомированным самкам 17Р-эстрадиола в сочетании с прогестероном приводит к увеличению двигательной и исследовательской активности с одновременным снижением уровней эмоциональности и депрессивности.

3. Сравнительный анализ цитологических особенностей нейронов и глии во всех изучаемых нами зонах переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга крыс линии \УАб/Ку выявил морфофункциональные изменения при различных уровнях половых гормонов. В контрольной группе выявляются нормо-, гипо- и гиперхромные нейроны, после овариоэктомии кроме этих типов нейронов определяются деструктивно измененные - «клетки-тени». После заместительной терапии преобладают крупные гиперхромные нейроны.

Овариоэктомия приводит к снижению численности нейронов в поверхностной клеточной и глубокой зонах переднего кортикального ядра с одновременным увеличением плотности глии. Увеличение количества суммарной глии в сочетании с уменьшением глиального расстояния является защитно-приспособительной реакцией со стороны нейроглии и направлено на поддержание жизнеспособности оставшихся нейронов. Вместе с тем, происходит возрастание количества сателлитной глии, что указывает на высокую степень функциональной активности нейронов.

4. Иммуногистохимический анализ у овариоэктомированных животных выявил ярко позитивную реакцию астроцитов на кислый глиальный фибриллярный белок, а после заместительной гормональной терапии - умеренно позитивную реакцию клеток. Астроцитарная глия в ответ на овариоэктомию претерпевала морфоструктурные изменения в виде пролиферации и гипертрофии, диффузного разрастания и разволокнения отростков астроцитов. Заместительная терапия нивелирует вышеуказанные нарушения в клетках.

5. Электронно-микроскопическое исследование нейронов и глии переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга самок крыс линии \УАС/11у показало, что:

а) большую часть клеточной популяции у самок группы контроль составляют нормохромные нервные клетки (58 %), на долю гипер- и гипохромных нейронов приходится 21 % и 16 %, соответственно. Овариоэктомия приводит к увеличению гипохромных (40 %) и пикноморфных нейронов (30 %). Резко гиперхромные нейроны, находящиеся в стадии функционального напряжения, составляют 10 %. После заместительной терапии численность пикноморфных нейронов снижается до 12 %, количество умеренно гиперхромных нейронов, находящихся в состоянии активного синтеза и внутриклеточной репарации, возрастает;

б) после овариоэктомии наблюдаются альтеративные процессы в нейронах и глие: ядра клеток - крупные, складчатые и занимают эксцентричное положение. Органеллы цитоплазмы претерпевают также изменения, выраженные в разрушении крист митохондрий, резкого расширения канальцев ЭПР, в образовании фаголизосом, липофусциновых телец, вакуолей и т.д. У овариоэктомированных крыс после введения 17р-эстрадиола в сочетании с прогестероном в клетках определяются хорошо развитые цистерны гранулярного ЭПР, увеличивается количество митохондрий и наблюдается сохранность мембран, что свидетельствует о развитии компенсаторно-приспособительных реакций в нервных и глиальных клетках;

в) миелинизированные аксоны у контрольных и гонадэктомированных животных имеют многослойную структуру, миелиновая оболочка плотно прилегает к аксону, отмечаются структурные изменения в виде вакуолеподобных расширений миелиновой оболочки, набуханий и незначительных выпячиваний, а также расслоении ламелл миелина, свидетельствующие о возможных нарушениях проведения нервных импульсов. Заместительная гормональная терапия снижает деструктивные нарушения и приводит к восстановлению миелиновых волокон. Анализ синаптического аппарата нервных клеток показал

количественные различия: по характеру постсинаптического потенциала в контрольной группе и после овариоэктомии преобладают асимметричные синапсы, по характеру кривизны постсинаптичсской мембраны - выпуклые. После заместительной терапии наблюдается незначительное снижение количества асимметричных синапсов, большинство из них имеют вогнутую форму.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в ведущих рецензируемых научных изданиях

1. Хисматуллина, З.Р. Характеристика синапсоархитектоники в переднем кортикальном ядре миндалевидного тела мозга / З.Р. Хисматуллина, И.И. Садртдинова//Морфология.-2013.-Т. 144,№5,- С. 125.

2. Садртдинова, И.И. Влияние дефицита половых гормонов на нейроглиальное соотношение в центральном ядре миндалевидного тела мозга / И.И. Садртдинова, Л.А. Шарафутдинова, З.Р. Хисматуллина // Морфология. - 2014. - Т. 145, № 3. -С. 169.

3. Садртдинова, И.И. Исследование поведения крыс линии \УАО/11ц с учетом полового фактора / И.И. Садртдинова, З.Р. Хисматуллина // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2014. - №2 (22). - С. 62-66.

4. Садртдинова, И.И. Стероидная регуляция нейронной возбудимости в переднем кортикальном ядре миндалевидного комплекса мозга у крыс линии \УАС/11ц / И.И. Садртдинова, З.Р. Хисматуллина // Биомедицина. - 2014. - №2. -С. 64-72.

5. Хисматуллина, З.Р. Реактивные изменения в переднем кортикальном ядре миндалевидного комплекса мозга у крыс линии \УАС/11ц при различных концентрациях половых гормонов / З.Р. Хисматуллина, И.И. Садртдинова // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 6 (часть 3). - С. 516-519.

Публикации в других изданиях

6. Хисматуллина, З.Р. Показатели электрической активности нейронов репродуктивных центров миндалевидного комплекса в динамике эстрального цикла / З.Р. Хисматуллина, И.И. Садртдинова // Актуальные вопросы физиологии, психофизиологии и психологии: Сборник научных статей Всеросс. заоч. науч.-практ. конф. - Уфа: РИЦ БИФК, 2012. - С. 77-83.

7. Садртдинова, И.И. Влияние овариоэктомии на спайк-волновую активность мозга крыс линии \УАО/11и / И.И. Садртдинова // Ломоносов-2013: материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных. -М., 2013.-С. 256.

8. Садртдинова И.И. Количественная характеристика спайк-волновых разрядов у гонадэктомированных самок крыс линии \УАО/Кц / И.И. Садртдинова // Фундаментальная наука и клиническая медицина — Человек и его здоровье: Тезисы XVI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием). — СПб.: Изд-во СПбГУ, 2013. - С. 354-355.

9. Садртдинова, И.И. Изменение электрической активности нейронов репродуктивных центров миндалевидного комплекса в динамике эстрального

цикла / И.И. Садртдинова И.И., З.Р. Хисматуллина // Актуальные направления фундаментальных и прикладных исследований: материалы Междунар. научно-практической конференции. — М., 2013 - Т.2. - С. 1-5.

10. Sadrtdinova, I.I. The rôle of estrogens in dynamics of neuronal oscillation of the structures of the amygdaloid complex of the brain / I.I. Sadrtdinova // Иностранный язык в профессиональной коммуникации: материалы Научно-практической студ. конф,- Уфа: РИЦ БашГУ, 2013. - С. 118-119.

11. Садртдинова, И.И. Количественные характеристики спайк-волновых разрядов у крыс линии WAG/RIJ после гонадэктомии / И.И. Садртдинова // Актуальные вопросы науки и образования: материалы Всероссийской молодежной научно-практической конференции. - Уфа: РИЦ БашГУ, 2013. - С. 222-223.

12. Бакирова, Ю.А. Изменение нейроглиального соотношения у гонадэктомированных крыс / Ю.А. Бакирова, И.И. Садртдинова // Фундаментальная наука и клиническая медицина — Человек и его здоровье: Тезисы XVI Всеросс. медико-биол. конф. молодых исследователей (с международным участием). — СПб.: Изд-во СПбГУ, 2013. - С. 27-28.

13. Бакирова, Ю.А. Особенности реактивных изменений в переднем кортикальном ядре миндалевидного комплекса на дефицит половых гормонов / Ю.А. Бакирова, И.И. Садртдинова // Актуальные вопросы науки и образования: материалы Всероссийской молодежной научно-практической конференции. -Уфа: РИЦ БашГУ, 2013. - С. 182.

14. Садртдинова, И.И. Особенности фоновой электрической активности нейронов репродуктивных центров миндалевидного комплекса мозга / И.И. Садртдинова, З.Р. Хисматуллина // XVII научная школа-конференция молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН). -М.,2013.-С. 54.

15. Садртдинова, И.И. Особенности поведения крыс в тесте вынужденного плавания в ответ на овариэктомию / И.И. Садртдинова, Л.А. Шарафутдинова, З.Р. Хисматуллина // XVII научная школа-конференция молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН). — М., 2013. -С. 53.

16. Садртдинова, И.И. Изучение влияния овариоэктомии на психоэмоциональные функции и уровень депрессивности / И.И. Садртдинова, З.Р. Хисматуллина // Проблемы современной биологии: материалы X Международной научно-практической конференции. - М., 2013. - С. 48-51.

17. Sadrtdinova, I.I. The characteristics of electroencephalogram of the anterior cortical nucleus the brain amygdala before and a fier ovarioectomy / I.I. Sadrtdinova, Z.R. Khismatullina // 21 век: фундаментальная наука и технологии: материалы III Международной научно-практической конференции. - М., 2014. - Т.1. - С. 13-15.

18. Садртдинова, И.И. Нейроно-глиальные соотношения в переднем кортикальном ядре миндалевидного комплекса мозга у крыс линии WAG/Rij /

И.И. Садртдинова // Ломоносов-2014: материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных. - М., 2014. - С. 166.

19. Садртдинова, И.И. Влияние уровня половых гормонов на пик-волновую активность в переднем кортикальном ядре миндалевидного комплекса мозга при абсансной эпилепсии / И.И. Садртдинова // Фундаментальная наука и клиническая медицина — Человек и его здоровье: Тезисы XVII Всеросс. медико-биол. конф. молодых исследователей (с международным участием). — СПб.: Изд-во СПбГУ, 2014. - С. 383-384.

20. Sadrtdinova, I.I. The influence of sex hormones on spike-wave activity in the anterior cortical nucleus of amygdala at WAG/Rij rats / I.I. Sadrtdinova // Иностранный язык в профессиональной коммуникации: материалы IV Научно-практической студ. конф. - Уфа: РИЦ БашГУ, 2014. - С. 158-159.

21. Садртдинова, И.И. Особенности ориентировочно-исследовательского поведения и эмоционального статуса у овариоэктомированных крыс / И.И. Садртдинова, Т.В. Антипина, A.A. Сагадеева и др. // Биотехнология - от науки к практике: материалы Всероссийской конференции с международным участием. -Уфа: РИЦ БашГУ, 2014. - Т.2. - С. 68-71.

22. Садртдинова, И.И. Влияние экспериментальной овариоэктомии и заместительной гормональной терапии на поведенческие параметры крыс / И.И. Садртдинова, З.Р. Хисматуллина // Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды: мат-лы V Междунар. науч,-практ. конф. - Челябинск: Изд-во Челяб. гос. пед. ун-т, 2014. - С. 215-218.

Список сокращений

МК - миндалевидный комплекс СОа - переднее кортикальное ядро ОЭ - овариоэктомия

ЗГТ - заместительная гормональная терапия

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ЭЭГ - электроэнцефалограмма

SWD - пик-волновой разряд

GFAP-кислый глиальный фибриллярный белок

САДРТДИНОВА Ицдира Илдаровна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В МИНДАЛЕВИДНОМ КОМПЛЕКСЕ МОЗГА КРЫС ЛИНИИ \УАС/11Ц ПОД ВЛИЯНИЕМ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ

Специальность 06.02.01 - Диагностика болезней и терапия животных,

патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ