Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экспрессии гена интестинального муцина MUC2 в нормальных и опухолевых клетках

ВАК РФ 03.00.00, Биологические науки

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грачев, Алексей

СОДЕРЖАНИЕ

БЛАГОДАРНОСТИ

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ НА АНГЛИЙСКОМ ЯЗЫКЕ

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Рак ободочной и прямой кишки

1.1.1 Генетические изменения при развитии рака ободочной и прямой кишки

1.1.2 Муцинозные опухоли толстого кишечника

1.2 Метилирование ДНК

1.2.1 Функция метилирования ДНК в прокариотах

1.2.2 Различия метилирования ДНК в эукариотах и прокариотах

1.2.3 Регуляция метилирования ДНК в эукариотических клетках

1.2.4 CpG островки

1.2.5 Регуляция экспрессии с помощью метилирования ДНК

1.3 Роль метилирования ДНК в канцерогенезе

1.3.1 Мутации метилированной ДНК

1.3.2 Снижение среднего уровня метилирования ДНК в опухолевых клетках

1.3.3 Региональное гиперметилирование в опухолях

2 ЦЕЛИ ПРЕДСТАВЛЕННОЙ РАБОТЫ

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Образцы ткани

3.1.1 Подготовка срезов тканей для микродиссекции

3.1.2 Микродиссекция

3.2 Клеточные линии

3.3 Реактивы

3.3.1 Растворы и среды

3.3.2 Киты для молекулярной биологии

3.3.3 Рестрикционные ферменты

3.3.4 Модифицирующие ферменты

3.3.5 Праймеры и олигонуклеотиды

3.3.5.1 Праймеры для ПЦР

3.3.5.1.1 MUC2 кДНК

3.3.5.1.2 Промотор MUC2

3.3.5.1.3 Участок 1-го интрона гена MUC2

3.3.5.1.4 Последовательность промотора гена MUC2 обработанного бисульфитом

3.3.5.1.5 Метилтрансфераза DNMT2 (Асс. Nr. AF045888)

3.3.5.1.6 Метилтрансфераза DNMT1 (Асс. Nr. Х63692)

3.3.5.1.7 p21waf (Асс. Nr.: U03106)

3.3.5.1.8 PDH (Асс. Nr. D90086)

3.3.5.2 Стандартные праймеры для реакции сиквенирования

3.3.5.3 Праймеры для однонулеотидной достройки праймера (SNuPE от Single Nucleotide Primer Extension)

3.3.6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

3.3.6.1 Анализ экспрессии MUC2

3.3.6.2 Амплификация участка промотора гена MUC2

3.3.6.3 Амплификация первого интрона гена MUC2

3.3.6.4 Амплификация обработанной бисульфитом ДНК из клеточных линий

3.3.6.5 Амплификация обработанной бисульфитом ДНК из срезов тканей

3.3.6.6 ПЦР для метшггрансферазы DNMT2

3.3.6.7 ПЦР для метилгрансферазы DNMT1

3.3.6.8 ПЦР обработанной бисульфитом плазмидной ДНК

3.3.6.9 Внесение мутаций в промотор MUC2 с помощью ПЦР

3.3.7 Зонды для Норзерн и Саузерн блот гибридизации

3.3.7.1 Анализ экспрессии гена MUC2 с помощью Норзерн блот гибридизации

3.3.7.2 Зонды для Саузерн блот гибридизации

3.3.7.3 Олигонуклеотид, содержащий первые 30 bp кДНК гена MUC2

3.3.7.4 18S рРНК

3.3.7.5 Проба для р21

3.3.7.6 Зонд для гена Люциферазы

3.3.8 Плазмидные вектора

3.3.9 Бактериальные штаммы

3.3.10 Геномная библиотека

3.4 Методы анализа фага X

3.4.1 Культура фага на чашках Петри

3.4.2 Определение титра фага

3.4.3 Скрининг фаговой библиотеки с помощью ПЦР

3.4.4 Приготовление фаговой суспензии с высоким титром

3.4.5 Выделение препаративных количеств ДНК фага лямбда

3.5 Выделение нлазмид

3.5.1 Трансформация E.coli

3.5.2 Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК

3.5.3 Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК

3.5.4 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей

3.5.5 Конструирование плазм ид

3.5.6 Клонирование продукта ПЦР в вектор ТОРО ТА

3.6 Анализ экспрессии генов

3.6.1 Выделение тотальной РНК

3.6.2 Норзерн блот гибридизация

3.6.2.1 Приготовление геля

3.6.2.2 Перенос РНК на мембрану

3.6.2.3 Мечение зондов

3.6.2.4 Гибридизация мембран

3.6.3 Обратная транскрипция-ПЦР (RT-ПЦР)

3.6.3.1 Синтез кДНК

3.7 Анализ метилирования ДНК

3.7.1 Саузерн блот гибридизация

3.7.2 Анализ метилирования ДНК с помощью бисульфитного сиквенирования

3.7.3 Анализ метилирования при помощи SNuPE

3.7.4 Ингибирование метилирования 5-аза-2'-деоксицитидином

3.8 Репортерный анализ активности промотора

3.8.1 Метилирование ДНК in vitro

3.8.2 Трансфекция эукариотических клеток

3.8.3 Определение активности люциферазы и р-галактозидазы

3.8.4 Нормализация эффективности трансфекции при помощи дот блот гибридизации

4 РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Выделение и анализ промотора гена MUC2

4.1.1 Получение клона фага лямбда содержащего 5'участок гена MUC2

4.1.2 Сиквенирование и анализ промотора

4.1.3 Анализ регуляции промотора MUC2

4.2 Метилирование промотора в различных клеточных линиях

4.2.1 Метилирование промотора MUC2 в клетках экспрессирующих и не экспрессирующих MUC

4.2.2 Анализ метилирования промотора MUC2 бисульфитным сиквенированием

4.2.3 Подавление метилирования приводит к активации MUC2

4.3 Метилирование промотора MUC2 в клонированных клетках

4.3.1 Подавление метилирования и получение клонов

4.3.2 Метилирование промотора MUC2 в полученных клонах

4.3.3 Изменения экспрессии генов в клонах

4.4 Влияние сайт-специфичного метилирования на активность промотора

4.4.1 Влияние метилирования на активность промотора в различных клеточных линиях

4.4.2 Анализ мутаций цитозинов в CpG сайтах #5 и #8

4.4.3 Анализ потенциального de novo метилирования или деметилирования трансфецированной плазмиды

4.5 Метилирование промотора MUC2 в тканях

4.5.1 Использование микродиссекции

4.5.2 Анализ метилирования промотора MUC2 в тканях

4.5.3 Метилирование промотора MUC2 в бокаловидных клетках

5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1 Анализ последовательности промотора MUC2

5.2 Регуляция экспрессии MUC2 в клеточных линиях

5.3 Регуляция экспрессии MUC2 в нормальной и опухолевой тканях

5.4 Роль метилирования при развитии муцинозных карцином

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция экспрессии гена интестинального муцина MUC2 в нормальных и опухолевых клетках"

10 1.1 1.1.1 Введение Рак ободочной и прямой кишки Генетические изменения при развитии рака ободочной и прямой кишки Высокие показатели смертности от рака ободочной и прямой кишки (колоректального рака) во всем мире [1] послужили предпосылкой для его всестороннего изучения. В 1990 году Феарон (Fearon) и Фогельстейн (Fogelstein) предложили модель многоступенчатого процесса развития колоректальной карциномы [2]. Авторы предположили, что в процессе развития опухоль проходит через несколько стадий характеризующихся сериями генетических изменений, охватывающих онкогены [3] и гены-супрессоры [4]. Аденомы, развиваясь из нормальных эпителиальных клеток, проходят через несколько стадий дисплазии, и развиваются в карциному [2]. Инвазивная опухоль продолжает развиваться, и накопление новых генетических изменений коррелирует со способностью опухоли метастазировать. Этот длительный, многоступенчатый процесс занимает годы, а иногда десятилетия [2]. Среди генов-супрессоров, играющих роль при развитии колоректального рака, наиболее хорошо изучен ген р53. Мутации этого гена описаны для различных типов опухолей [4]. В случае рака ободочной и прямой кишки, мутации в области гена р53 обнаруживаются в 70% случаев спорадических опухолей [5]. Белок, кодируемый этим геном, отвечает за контроль повреждения ДВЖ, приводя к аресту клеточного цикла в фазе G1, что дает возможность системе репарации ДНК устранить повреждение. Если же репарация невозможна, р53 запускает программируемую клеточную гибель апоптоз. Мутации р53, как правило.Введение

11_ обнаруживаются на поздних стадиях прогрессии от аденомы к карциноме. Таким образом, в большинстве ранних аденом мутации р53 не встречаются [4]. Инактивируюшие мутации другого гена-супрессора АРС (adenomatous polyposis coli) считаются наиболее ранним событием в процессе развития колоректального рака [6]. Наследственные мутации этого гена ведут к развитию семейного аденоматозного полипоза кишечника, для которого характерно развитие опухолей кишечника в раннем возрасте. Эти данные позволяют предположить необходимость АРС для регуляции пролиферации эпителия кишечника. В спорадических колоректальных опухолях мутации АРС встречаются в 60-80% случаев [7]. Мутации онкогена Ki-ras обнаруживаются в 50% случаев опзолей обводной и прямой кишки [2]. Частота мутаций на поздних стадиях развития опухолей мало отличается от частоты мутаций обнаруживаемых в крупных аденомах [2]. Кроме того мутации гена Ki-ras обнаруживались в 13% 58% случаев фокусов аберрантных кишечных крипт [8,9], считаюшихся предшественниками опухолей. Таким образом активация онкогена Ki-ras является ранним событием при развитии опухолей обводной и прямой кишки. Исследования так называемого наследственного не-полипозного колоректального рака (HNPCC hereditary nonpolyposis colorectal cancer) позволили описать дополнительную группу генов, вовлеченных в процесс канцерогенеза [10]. Первый из описанных генов hMSH2 относится к семейству генов отвечаюших за исправление ошибок репликации ДНК [11]. Следующий компонент системы репарации неспаренных оснований hMLHl был описан в 1994 Броммером (Brommer) с коллегами [12]. Мутации в этих двух генах были обнаружены в 60% Введение 12 исследованных случаях HNPCC. Кроме того в нескольких случаях HNPCC были обнаружены мутации в двух других компонентах системы репарации неспаренных оснований PMS1 и PMS2 [13]. Потеря этих генов, не являющихся классическими онкогенами, приводит, тем не менее, к существенному повышению вероятности мутаций ведущих, в свою очередь, к злокачественной трансформации. 1.1.2 Муцинозные опухоли Фенотипический анализ опухолей ободочной и прямой кишки позволяет ввести классификацию на основании количества содержащихся в них муцинов. Опухоли, в которых муцины составляют не менее 50% их массы, классифицируются как муцинозные. Муцинозные опухоли составляют около 1020% всех опзсолей ободочной и прямой кишки. Спорадические опухоли реже имеют муцинозный фенотип, чем наследственные (например HNPCC) [14]. Клинические исследования показали, что для муцинозных карцином молочной железы, яичника [15] и поджелудочной железы [16] характерен более благоприятный прогноз, чем для немуцинозных. В случае колоректального рака данные остаются противоречивыми [17-19]. Стоит заметить, что фенотипические различия коррелируют с различным спектром мутаций. Так мутации гена р53 встречаются только в 30% муцинозных карцином [20,21], в то время как мутации протоонкогена Ki-ras более часты в муцинозных карциномах (70%) опухолями (50%) [14]. Однако наиболее строгим молекулярным различием между муцинозными и немуцинозными опухолями является повышенная экспрессия гена интестинального по сравнению с неклассифицированными Введение 13 муцина MUC2 в 100% случаев муцинозных карцином [22]. Ген MUC2 кодирует секретируемый муцин, производимый в большом количестве в нормальном толстом кишечнике. Экспрессия гена MUC2 существенно понижена в немуцинозных опухолях по сравнению с нормальной слизистой толстого кишечника. Особенно интересен анализ усиления экспрессии MUC2 на разных стадиях развития колоректального рака. На стадии аденомы, статистически значимое усиление экспрессии гена MUC2 наблюдалось во всех исследованных случаях. В процессе дальнейшего развития аденомы в карциному экспрессия MUC2 изменяется в соответствии с фенотипом развивающейся опухоли. В случае немуцинозной опухоли экспрессия снижается ниже уровня наблюдаемого в нормальной ткани [22], а в слзае муцинозной опухоли продолжает повышаться (Рис. 1) [14,20]. Представленные данные позволяют предположить, что развитие муцинозных и не-муцинозных сопровождается карцином протекает по генетически различным путям и накоплением различных молекулярных изменений. Хотя прогностическая ценность повышенной экспрессии MUC2 не определена, это единственное молекулярное изменение, ассоциированное с муцинозным фенотипом в 100% случаев. Описание молекулярного механизма повышения экспрессии гена MUC2 позволит лучше описать процесс развития опухолей ободочной и прямой кишки.Введение 14 Муцинозные опухоли о о а. 1.2 Норма Аденома Не-муцинозные опухоли Карцинома Рисунок 1. Изменение экспрессии MUC2 в процессе развития колоректальной карциномы. Метилирование ДНК Физиологическое метилирование ДНК единственная ковалентная модификация молекулы ДНК осуществляется путем переноса метильной группы с S-аденозил метионина на 5-ю позицию пуринового кольца цитозина. Метилирование ДНК обнаруживается на разных стадиях эволюции в таких различных организмах как Е.соИ и H.sapience. Однако некоторые виды, такие как D.melanogaster обходятся без метилирования ДНК [23]. 1.2.1 Функция метилирования ДНК в прокариотах Метилирование ДЬЖ в бактериях подверглось тщательному и всестороннему исследованию. В бактериях, наряду с цитозином, метилированию подвергается также и аденин. Эта модификация служит для функциональной организации генома и играет роль при репликации. Существует целое семейство ферментов ДЬЖ метилтрансфераз (DNA-MTases), катализирзтощих метилирование цитозина в различных последовательностях [24]. Ещё одна функция метилирования ДНК в бактериях это обеспечение механизма распознавания чужеродной ДНК. Рестриктные эндонуклеазы способны отличить чужеродную ДНК от эндогенной на

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грачев, Алексей, Б. м.

1. Jessup, J. М. and Gallick, G. E. (1992). The biology of colorectal carcinoma. Curr Probl Cancer 16, 261-328.

2. Fearon, E. R. and Vogelstein, B. (1990). A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 61, 759-67.

3. Yamashita, N., Minamoto, Т., Ochiai, A., Onda, M., and Esumi, H. (1995). Frequent and characteristic K-ras activation and absence of p53 protein accumulation in aberrant crypt foci of the colon. Gastroenterology 108, 434-40.

4. Marcsek, Z. L. and Konig, E. A. (1998). Accumulating mutations of p53 in colon tumor and hairy cell leukemia do not arise from methylation/deamination processes, but rather from nucleotide deletions and insertions. Biol Chem 379, 545-7.

5. Campo, E., Miquel, R., Jares, P., Bosch, F., Juan, M., Leone, A., Vives, J., Cardesa, A., and Yague, J. (1994). Prognostic significance of the loss of heterozygosity of Nm23-Hl and p53 genes in human colorectal carcinomas. Cancer 73, 2913-21.

6. Cunningham, C. and Dunlop, M. G. (1994). Genetics of colorectal cancer. Br Med Bull 50, 640-55.

7. Smith, A. J., Stern, H. S., Penner, M., Hay, K., Mitri, A., Bapat, В. V., and Gallinger, S. (1994). Somatic APC and K-ras codon 12 mutations in aberrant crypt foci from human colons. Cancer Res 54, 5527-30.

8. Pretlow, T. P., Brasitus, T. A., Fulton, N. C., Cheyer, C., and Kaplan, E. L. (1993). K-ras mutations in putative preneoplastic lesions in human colon. J Natl Cancer Inst 85, 2004-7.

9. Kinzler, K. W. and Vogelstein, B. (1997). Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers. Nature 386, 761, 763.

10. Hanski, C. (1995). Is mucinous carcinoma of the colorectum a distinct genetic entity? Br J Cancer 72, 1350-6.

11. Hermanek P., Gospodarovicz M.K., Hensen D.E., Hutter R.V.D., and Sobin L.H. (1995). Prognostic Factors in Cancer. Springer, Berlin.

12. Yonezawa, S. and Sato, E. (1997). Expression of mucin antigens in human cancers and its relationship with malignancy potential. PatholInt 47, 813-30.

13. Hermanek P, Guggenmoos-Holzmann I, and Gall FP (1989). Prognostic factors in rectal carcinoma. A contribution of the further developnemt of tumor classification. Dis Colon Rectum 32, 593-599.

14. Sasaki O, Atkin WS, and Jass Ж (1987). Mucinous carcinoma of the rectum. Histopathology 11, 259-272.

15. Halvorsen ТВ, S. E. (1988). Influence of mucinous component on survival in colorectal adenocarcinomas: a multivariate analysis. J Clin Pathol 41, 1068-1072.

16. Hanski, C., Tiecke, F., Hummel, M., Hanski, M. L., Ogorek, D., Rolfs, A., Schmitt-Graff, A., Stein, H., and Riecken, E. O. (1996). Low frequency of p53 gene mutation and protein expression in mucinous colorectal carcinomas. Cancer Lett 103, 163-70.

17. Costa, A., Marasca, R., Valentinis, В., Savarino, M., Faranda, A., Silvestrini, R., and Torelli, G. (1995). p53 gene point mutations in relation to p53 nuclear protein accumulation in colorectal cancers. J Pathol 176, 45-53.

18. Bird, A., Tate, P., Nan, X., Campoy, J., Meehan, R., Cross, S., Tweedie, S., Charlton, J., and Macleod, D. (1995). Studies of DNA methylation in animals. J Cell Sci Suppl 19,37-9.

19. Noyer-Weidner, M. and Trautner, T. A. (1993). Methylation of DNA in prokaryotes. EXS64, 39-108.

20. Cooper, D. L., Lahue, R. S., and Modrich, P. (1993). Methyl-directed mismatch repair is bidirectional. J Biol Chem 268, 11823-9.

21. Kisseljova, N. P., Zueva, E. S., Pevzner, V. S., Grachev, A. N., and Kisseljov, F. L. (1998). De novo methylation of selective CpG dinucleotide clusters in transformed cells mediated by an activated N-ras. Int J Oncol 12, 203-9.

22. Sasaki, H., Allen, N. D., and Surani, M. A. (1993). DNA methylation and genomic imprinting in mammals. EXS 64, 469-86.

23. Collick, A., Reik, W., Barton, S. C., and Surani, A. H. (1988). CpG methylation of an X-linked transgene is determined by somatic events postfertilization and not germline imprinting. Development 104, 235-44.

24. Araujo, F. D., Knox, J. D., Szyf, M., Price, G. В., and Zannis-Hadjopoulos, M. (1998). Concurrent replication and methylation at mammalian origins of replication. Mol Cell Biol 18, 3475-82.

25. Bestor, Т. H. (1990). DNA methylation: evolution of a bacterial immune function into a regulator of gene expression and genome structure in higher eukaryotes. Philos Trans R Soc LondB Biol Sci 326, 179-87.

26. Bird, A. P. (1993). Functions for DNA methylation in vertebrates. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 58, 281-5.

27. Monk, M. (1990). Changes in DNA methylation during mouse embryonic development in relation to X-chromosome activity and imprinting. Philos Trans R Soc LondB Biol Sci 326, 299-312.

28. Razin, A. and Cedar, H. (1993). DNA methylation and embryogenesis. EXS 64, 343-57.

29. Xie, S., Wang, Z., Okano, M., Nogami, M., Li, Y., He, W. W., Okumura, K., and Li, E. (1999). Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family. Gene 236, 87-95.

30. Hsieh, C. L. (1999). In vivo activity of murine de novo methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b. Mol Cell Biol 19, 8211-8.

31. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., and Li, E. (1999). DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 99, 247-57.

32. Tajima, S., Tsuda, H., Wakabayashi, N., Asano, A., Mizuno, S., and Nishimori, K.1995). Isolation and expression of a chicken DNA methyltransferase cDNA. J Biochem (Tokyo) 117, 1050-7.

33. Li, E., Bestor, Т. H., and Jaenisch, R. (1992). Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69, 915-26.

34. Lei, H., Oh, S. P., Okano, M., Juttermann, R., Goss, K. A., Jaenisch, R., and Li, E.1996). De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells. Development 122, 3195-205.

35. Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. U., and Bestor, Т. H. (1992). A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell 11, 865-73.

36. Yoder, J. A. and Bestor, Т. H. (1998). A candidate mammalian DNA methyltransferase related to pmtlp of fission yeast. HumMol Genet 7, 279-84.

37. Okano, M., Xie, S., and Li, E. (1998). Dnmt2 is not required for de novo and maintenance methylation of viral DNA in embryonic stem cells. Nucleic Acids Res 26, 2536-40.

38. Laird, P. W. (1997). Oncogenic mechanisms mediated by DNA methylation. Mol Med Today 3, 223-9.

39. Bhattacharya, S. K., Ramchandani, S., Cervoni, N., and Szyf, M. (1999). A mammalian protein with specific demethylase activity for mCpG DNA. Nature 397, 579-83.

40. Antequera, F. and Bird, A. (1993). Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc Natl Acad Sci USA 90, 11995-9.

41. Bird, A. P. (1995). Gene number, noise reduction and biological complexity. Trends Genet 11, 94-100.

42. Baylin, S. В., Herman, J. G., Graff, J. R., Vertino, P. M., and Issa, J. P. (1998). Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Adv Cancer Res 72, 141-96.

43. Singer-Sam, J. and Riggs, A. D. (1993). X chromosome inactivation and DNA methylation. EXS 64, 358-84.

44. Tazi, J. and Bird, A. (1990). Alternative chromatin structure at CpG islands. Cell 60, 909-20.

45. Kass, S. U., Landsberger, N. and Wolffe, A. P. (1997). DNA methylation directs a time-dependent repression of transcription initiation. CurrBiol 7, 157-65.

46. Comb, M. and Goodman, H. M. (1990). CpG methylation inhibits proenkephalin gene expression and binding of the transcription factor AP-2. Nucleic Acids Res 18, 3975-82.

47. Clark, S. J., Harrison, J., and Molloy, P. L. (1997). Spl binding is inhibited by (m)Cp(m)CpG methylation. Gene 195, 67-71.

48. Holler, M., Westin, G., Jiricny, J., and Schaffner, W. (1988). Spl transcription factor binds DNA and activates transcription even when the binding site is CpG methylated. Genes Devi, 1127-35.

49. Meehan, R. R., Lewis, J. D., McKay, S., Kleiner, E. L., and Bird, A. P. (1989). Identification of a mammalian protein that binds specifically to DNA containing methylated CpGs. Cell 58, 499-507.

50. Jost, J. P. and Hofsteenge, J. (1992). The repressor MDBP-2 is a member of the histone HI family that binds preferentially in vitro and in vivo to methylated nonspecific DNA sequences. Proc Natl Acad Sci U SA 89, 9499-503.

51. Hendrich, B. and Bird, A. (1998). Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins. Mol Cell Biol 18, 6538-47.

52. Cooper, D. N. and Youssoufian, H. (1988). The CpG dinucleotide and human genetic disease. Hum Genet 78, 151-5.

53. Rideout, W. M. 3., Coetzee, G. A., Olumi, A. F., and Jones, P. A. (1990). 5-Methylcytosine as an endogenous mutagen in the human LDL receptor and p53 genes. Science 249, 1288-90.

54. Fearon, E. R. and Jones, P. A. (1992). Progressing toward a molecular description of colorectal cancer development. FASEBJ6, 2783-90.

55. Greenblatt, M. S., Bennett, W. P., Hollstein, M., and Harris, С. C. (1994). Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. Cancer Res 54, 4855-78.

56. Schmutte, C., Rideout, W. M. 3., Shen, J. C., and Jones, P. A. (1994). Mutagenicity of nitric oxide is not caused by deamination of cytosine or 5-methylcytosine in double-stranded DNA. Carcinogenesis 15, 2899-903.

57. Coulondre, C., Miller, J. H., Farabaugh, P. J., and Gilbert, W. (1978). Molecular basis of base substitution hotspots in Escherichia coli. Nature 274, 775-80.

58. Shen, J. C., Rideout, W. M., and Jones, P. A. (1992). High frequency mutagenesis by a DNA methyltransferase. Cell 71, 1073-80.

59. Yebra, М. J. and Bhagwat, A. S. (1995). A cytosine methyltransferase converts 5-methylcytosine in DNA to thymine. Biochemistry 34, 14752-7.

60. Kautiainen, T. L. and Jones, P. A. (1986). DNA methyltransferase levels in tumorigenic and nontumorigenic cells in culture. J Biol Chem 261, 1594-8.

61. Schmutte, C., Yang, A. S., Nguyen, Т. Т., Beart, R. W., and Jones, P. A. (1996). Mechanisms for the involvement of DNA methylation in colon carcinogenesis. Cancer Res 56, 2375-81.

62. Lapeyre, J. N. and Becker, F. F. (1979). 5-Methylcytosine content of nuclear DNA during chemical hepatocarcinogenesis and in carcinomas which result. Biochem Biophys Res Commun 87, 698-705.

63. Gama-Sosa, M. A., Slagel, V. A., Trewyn, R. W., Oxenhandler, R., Kuo, К. C., Gehrke, C. W., and Ehrlich, M. (1983). The 5-methylcytosine content of DNA from human tumors. Nucleic Acids Res 11, 6883-94.

64. Feinberg, A. P., Gehrke, C. W., Kuo, К. C., and Ehrlich, M. (1988). Reduced genomic 5-methylcytosine content in human colonic neoplasia. Cancer Res 48, 1159-61.

65. Christman, J. K., Sheikhnejad, G„ Dizik, M., Abileah, S„ and Wainfan, E. (1993). Reversibility of changes in nucleic acid methylation and gene expression induced in rat liver by severe dietary methyl deficiency. Carcinogenesis 14, 551-7.

66. Wainfan, E. and Poirier, L. A. (1992). Methyl groups in carcinogenesis: effects on DNA methylation and gene expression. Cancer Res 52, 2071s-2077s.

67. Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983). Hypomethylation of ras oncogenes in primary human cancers. Biochem Biophys Res Commun 111, 47-54.

68. Schmid, M., Grunert, D., Haaf, Т., and Engel, W. (1983). A direct demonstration of somatically paired heterochromatin of human chromosomes. Cylogenet Cell Genet 36, 554-61.

69. Walker, C. and Nettesheim, P. (1986). In vitro transformation of primary rat tracheal epithelial cells by 5- azacytidine. Cancer Res 46, 6433-7.

70. Baylin, S. В., Hoppener, J. W., de Bustros, A., Steenbergh, P. H., Lips, C. J., and Nelkin, B. D. (1986). DNA methylation patterns of the calcitonin gene in human lung cancers and lymphomas. Cancer Res 46, 2917-22.

71. Loh, W. E. J., Scrable, H. J., Livanos, E., Arboleda, M. J., Cavenee, W. K., Oshimura, M., and Weissman, В. E. (1992). Human chromosome 11 contains two different growth suppressor genes for embryonal rhabdomyosarcoma. Proc Natl Acad Sci USA 89, 1755-9.

72. Antequera, F., Boyes, J., and Bird, A. (1990). High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell 62, 503-14.

73. Greger, V., Debus, N., Lohmann, D., Hopping, W., Passarge, E., and Horsthemke, B. (1994). Frequency and parental origin of hypermethylated RBI alleles in retinoblastoma. Hum Genet 94, 491-6.

74. Swafford, D. S., Middleton, S. K., Palmisano, W. A., Nikula, K. J., Tesfaigzi, J., Baylin, S. В., Herman, J. G., and Belinsky, S. A. (1997). Frequent aberrant methylation of pl6INK4a in primary rat lung tumors. Mol Cell Biol 17, 1366-74.

75. Jones, P. A. and Gonzalgo, M. L. (1997). Altered DNA methylation and genome instability: a new pathway to cancer? Proc Natl Acad Sci U SA 94, 2103-5.

76. Issa, J. P., Vertino, P. M., Wu, J., Sazawal, S., Celano, P., Nelkin, B. D., Hamilton, S. R., and Baylin, S. B. (1993). Increased cytosine DNA-methyltransferase activity during colon cancer progression. J Natl Cancer Inst 85, 1235-40.

77. Laird, P. W., Jackson-Grusby, L., Fazeli, A., Dickinson, S. L., Jung, W. E., Li, E., Weinberg, R. A., and Jaenisch, R. (1995). Suppression of intestinal neoplasia by DNA hypomethylation. Cell 81, 197-205.

78. Bodmer, W. F., Browning, M. J., Krausa, P., Rowan, A., Bicknell, D. C., and Bodmer, J. G. (1993). Tumor escape from immune response by variation in HLA expression and other mechanisms. Ann N Y Acad Sci 690,42-9.

79. Gum, J. R., Byrd, J. C., Hicks, J. W., Toribara, N. W., Lamport, D. Т., and Kim, Y. S. (1989). Molecular cloning of human intestinal mucin cDNAs. Sequence analysis and evidence for genetic polymorphism. J Biol Chem 264, 6480-7.

80. Israel, D. I. (1993). A PCR-based method for high stringency screening of DNA libraries. Nucleic Acids Res 21, 2627-31.

81. Olek, A., Oswald, J., and Walter, J. (1996). A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res 24, 5064-6.

82. Griffiths, В., Matthews, D. J., West, L., Attwood, J., Povey, S., Swallow, D. M., Gum, J. R., and Kim, Y. S. (1990). Assignment of the polymorphic intestinal mucin gene (MUC2) to chromosome 1 lpl5. Ann Hum Genet 54 ( Pt 4), 277-85.

83. Gum, J. R., Hicks, J. W., and Kim, Y. S. (1997). Identification and characterization of the MUC2 (human intestinal mucin) gene 5'-flanking region: promoter activity in cultured cells. BiochemJ 325 ( Pt 1), 259-67.

84. Velcich, A., Palumbo, L., Selleri, L., Evans, G., and Augenlicht, L. (1997). Organization and regulatory aspects of the human intestinal mucin gene (MUC2) locus. J Biol Chem 272, 7968-76.

85. Holliday, R. and Ho, T. (1998). Evidence for gene silencing by endogenous DNA methylation. Proc Nail Acad Sci USA 95, 8727-32.

86. Kudo, S. and Fukuda, M. (1995). Tissue-specific transcriptional regulation of human leukosialin (CD43) gene is achieved by DNA methylation. J Biol Chem 270, 13298-302.

87. Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L„ and Frommer, M. (1994). High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res 22, 2990-7.

88. Goldstein H., S. D. J. (1996). League tables and their limitations: statistical issues in comparisons of institutional performnance. J.R.SS. A159, 385-443.

89. Velcich, A. and Augenlicht, L. H. (1993). Regulated expression of an intestinal mucin gene in HT29 colonic carcinoma cells. J Biol Chem 268, 13956-61.

90. Silverman, A. L., Park, J. G., Hamilton, S. R., Gazdar, A. F., Luk, G. D„ and Baylin, S. B. (1989). Abnormal methylation of the calcitonin gene in human colonic neoplasms. Cancer Res 49, 3468-73.

91. Juttermann, R., Li, E., and Jaenisch, R. (1994). Toxicity of 5-aza-2'-deoxycytidine to mammalian cells is mediated primarily by covalent trapping of DNA methyltransferase rather than DNA demethylation. Proc Natl Acad Sci USA 91, 11797-801.

92. Tate, P. H. and Bird, A. P. (1993). Effects of DNA methylation on DNA-binding proteins and gene expression. Curr Opin Genet Dev 3, 226-31.

93. Martinez-Delgado, В., Robledo, M., Arranz, E., Osorio, A., Garcia, M. J., Echezarreta, G., Rivas, C., and Benitez, J. (1998). Hypermethylation of pl5/ink4b/MTS2 gene is differentially implicated among non-Hodgkin's lymphomas. Leukemia 12, 937-41.

94. Bohm, M., Wieland, I., Schutze, K., and Rubben, H. (1997). Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. Am J Pathol 151, 63-7.

95. Chen, M. L., Shieh, Y. S., Shim, K. S., and Gerber, M. A. (1991). Comparative studies on the detection of hepatitis В virus DNA in frozen and paraffin sections by the polymerase chain reaction. Mod Pathol 4, 555-8.

96. Cheng, H., Bjerknes, M., and Amar, J. (1984). Methods for the determination of epithelial cell kinetic parameters of human colonic epithelium isolated from surgical and biopsy specimens. Gastroenterology 86, 78-85.

97. Tycko, B. (1997). DNA methylation in genomic imprinting. MutatRes 386, 131-40.

98. Feinberg, A. P. (1999). Imprinting of a genomic domain of 1 lpl5 and loss of imprinting in cancer: an introduction. Cancer Res 59, 1743s-1746s.

99. Cheng, H. and Leblond, C. P. (1974). Origin, differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. I. Columnar cell. Am J Anat 141, 461-79.

100. Serrano, A., Garcia, A., Abril, E., Garrido, F., and Ruiz-Cabello, F. (1996). Methylated CpG points identified within MAGE-1 promoter are involved in gene repression. Int J Cancer 68, 464-70.

101. Jones, P. A. and Laird, P. W. (1999). Cancer epigenetics comes of age. Nat.Genet. 21, 163-167.