Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляторная взаимосвязь Nа,К-насоса мембран нервных клеток с нейромедиаторными системами ацетилхолина и ГАМК при радиационном поражении организма

ВАК РФ 03.00.08, Зоология

Автореферат диссертации по теме "Регуляторная взаимосвязь Nа,К-насоса мембран нервных клеток с нейромедиаторными системами ацетилхолина и ГАМК при радиационном поражении организма"

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є.КАВЕЦЬКОШ

На правах рукопйсу

АНАНЬЄВА Таміла Володимирівна

РЕГУЛЯТОРНИЙ ВЗАЄМОЗВ’ЯЗОК Ка,К-НАСОСА МЕМБРАН НЕРВОВИХ КЛІТИН З НЕЙРОМДЦІАТОРНИМИ СИСТЕМАМИ АЦЕТИЛХОЛІНУ І ГАМК ПРИ РАДІАЦІЙНОМУ УРАЖЕННІ ОРГАНІЗМУ

03.00.08 - Радіобіологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-1997

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Науково-дослідному інституті біології Дніпропетровського держуніверситету.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор

A.Ї,Дворецький

Офіційні опоненти - доктор медичних наук, професор

B.АБарабой;

- кандидат біологічних наук ДАСутковий

Провідна установа - Національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра біохімії.

Захист відбудеться " іО *’ 0і/ 1997 р. о годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.83.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України (252022, Київ, вул. Васильківська, 45). З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий " 6 " ОЬ 1997 р.

Вчений секретар

спеціалізованої ради, . /

кандидат біологічних наук Г.ЙЛавренчук

Актуальність проблеми. Результати сучасних радіобіологічних досліджень свідчать, що молекулярного основою суттєвих порушень функціональної активності нервової тканини у ранні терміни після опромінення виступають зміни у системах регуляції метаболічних процесів (Кудряшов и др., 1992). Особливо це стосується дії низьких рівнів іонізуючого випромінювання» коли головну роль у виникненні радіаційних реакцій відіграють ураження мембранних структур (Кузин, 1964, 1986, 1991), що забезпечують життєдіяльність клітини і її регуляцію.

Як відомо, одним з найважливіших і еволюційно первинних факторів регуляції метаболізму є внутрішньоклітинний іонний гомеостаз (Болдырев, Твердислов, 1978), що підтримується системами іонного транспорту, провідним серед яких вважається Ш,К-насос. Слугуючи одним з метаболічних регуляторних механізмів, Ка,К~насос має власну систему бездоганної регуляції, що надійно забезпечує його функціонування у режимах відповідно до фізіологічних "потреб" клітини (Кравцов, Алексеенко, 1990). До модуляторів Ка,К-насоса нейрональних мембран належать синаптичні медіатори (Глебов, Крыжановский, 1978; Цакадзе, Кометиани, 1990; Айрапетян и др., 1990). Фізіологічна роль нейромедіаторної модуляції Ка,К-транспорту полягає в оптимізації функціонального стану нейронів, необхідного для передачі нервового імпульсу. Отже, певну увагу привертають дослідження порушень збалансованого взаємозв’язку між нейромедіаторними системами і ИаД-насосом, обумовлених опроміненням організму, які можуть, призводити до дезінтеграції активності нервової тканини і бути однією з причин виникнення патологій у ЦНС (Дворецкий, 1990).

І

Мета досліджень:,, Вивчити механізми порушень функціонального взаємозв'язку між Ка,К-насосом і системами ацетилхоліну (АХ) і у-аміномасляної кислоти (ГАМК) при тотальному опроміненні організму в летальних і нелегальних дозах. Для досягнення основної мета дослідження необхідно було розв’язати такі задачі:

1. Оцінити активність N а, К-насоса клітин головного мозку за умов тотального опромінення організму в дозах 150, 12, 8, 6, 0.25 і 0.50 Гр при різних варіантах радіаційної дії: одноразовій короткочасній з високою інтенсивністю і одноразовій тривалій або хронічній з низькою інтенсивністю.

2. Вивчити модифікацію впливу АХ і ГАМК (10‘10-10'5 М) на активність №,К-насоса клітин мозку після тотального опромінення організму у летальних і нелегальних дозах при одноразовій і хронічній дії радіації високої і низької інтенсивності.

3. З'ясувати, за участю яких селективних холіно- і ГАМК-рецепторів (ХР і ГАМК-Р) реалізуються, метаболічні ефекти АХ і ГАМК, спрямовані на модуляцію активності №,К-насоса, при одноразовому тривалому і хронічному опроміненні організму з низькою потужністю дози.

4. Вивчити можливий механізм радіаційного порушення функції Ка,К-насоса нервових клітин і його метаболічної реакції на вплив АХ і ГАМК через спрямовану модифікацію ліпідного бішару мембран при застосуванні фосфоліпаз і вільних жирних кислот ненасиченого і насиченого ряду.

Наукова новизна. Уперше на переживаючих зрізах кори головного мозку щурів показано, що тотальне опромінення у летальних і нелегальних дозах змінює регуляторний вплив АХ і ГАМК на активність Ш,К-насоса. Характер променевої модифікації двофазної метаболічної відповіді нервових клітин на дію медіаторів

складним чином залежить від дози й інтенсивності радіаційного впливу, причому найбільш уразливою виявилась фаза, зумовлена низькими концентраціями (Ю10- 10'8 М) АХ і ГАМК. Встановлено, що

опромінення у дозах 0.25 Гр і 6 Гр спричиняє аналогічні порушення низькоконцентраційної компоненти нейро-медіаторного ефекту.

З'ясовано, що досліджувані метаболічні ефекти нейромедіаторів у нормі опосередковані відповідними іонотропними ХР і ГАМК-Р, але після променевого впливу метаботропні рецептори залучаються до реалізації регуляторних ефектів АХ і ГАМК, і, таким чином, нейромедіаторна модуляція іонного транспорту виявляється зв'язаною з процесами клітинного метаболізму.

Дослідження молекулярно-клітинних механізмів, що лежать в основі радіаційного порушення функцій Na,IC-mcoca і його регуляції синаптичними нейромедіаторами, показали можливість задовільної імітації in vitro ефектів високих доз опромінення дією . екзогенних фосфоліпаз, а ефектів низьких доз опромінення - введенням у ліпідний бішар нейрональних мембран довголанцюжкових жирних кислот насиченого

ряду-

Уперше було показано, що при порушенні функції Na,K-imcoca нервових клітин в умовах опроміненого організму або в експериментах in vitro модуляційний вплив ГАМК у концентраціях, близьких до фізіологічних (10'7-10~5 М), виявляє тенденцію до нормалізації іонного гомеостазу через відновлення процесів активного транспорту' іонів на нейрональній мембрані. Отримані дані дозволили припустити наявність ГАМК-ергічного механізму "гомеостатичного контролю”, спрямованого на підтримання функціонального стану нервових клітин і

З

оптимізацію умов для передачі збудження під дією екстремальних факторів. ’ .

Науково-практичне значення роботи. Отримані нові дані про модифікацію фізіологічної відповіді Иа,К-насоса нервових клітин на низькі концентрації АХ і - ГАМК після опромінення організму доповнюють і розширюють існуючі уявлення про особливості біологічної дії іонізуючої радіації. Установлені факти про існування ГАМК-ергічного механізму вирівнювання іонного гомеостазу клітини дають підстави для розробки профілактичних і терапевтичних основ фармакологічної корекції функціональних і адаптивних можливостей організму в умовах променевого впливу. Використання переживаючих зрізів головного мозку щурів як експериментальної моделі у поєднанні з фармакологічними методами дослідження створюють нові методичні підходи для адекватної оцінки радіобіологічних ефектів порушення складних процесів міжнейрональної регуляції.

Основні положення, винесені на захист.

1. Тотальне опромінення у діапазоні летальних та нелегальних доз з інтенсивністю відповідно 600 і 1.75 мГр/хв спричиняє у нервових клітинах аналогічну модифікацію метаболічних регуляторних ефектів АХ і ГАМК на активність Ка,К-насоса, які обумовлювались нейромедіаторними концентраціями, нижчими на < декілька ступенів за фізіологічні, і виявляли найбільшу вразливість до дії радіації.

2. Опромінення організму у низькій дозі 0.25 Гр обумовлює залучення метаботропних мускаринових холінорецепорів (М-ХР) і ГАМКБ-рецепторіз (ГАМКв-Р) до реалізації модуляційних ефектів АХ і ГАМК на активність Ш,К-насоса, тоді як у нормі вони опосередковані іонотропними нікотиновими

холінорецепторами (Н-ХР) і ГАМКд-рецепорами

(ГАМКа-Р).

3. Вплив іонізуючої радіації на функцію Na,K-насоса і характер його реакції на АХ і ГАМ К обумовлений модифікацією ліпідної компоненти мембран, причому ефекти високих доз радіації

визначаються дією фосфоліпаз, а низьких - наявністю довголанцюжкових насичених жирних кислот (бегеносої, С-22:0) у товщі мембрани.

Публікації і апробація дисертації. Основні результати досліджень опубліковані у 23 друкованих роботах, 13 з них - у міжнародних виданнях.

По матеріалах дисертації зроблені доповіді на II Всесоюзному симпозиумі "Синергизм в радиобиологии" (Пущино, 1991), Радіобіологічних з'їздах (Київ, 1993; Дніпропетровськ, 1995), І Міжнародній науково-

практичній конференції "Устойчивое развитие: загрязнение окружающей среды и экологическая безопасность" (Дніпропетровськ, 1995), X International Congress on Radiation Research (Wurzburg, 1995).

• Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 141 сторінці машинописного тексту; складається з вступу, огляду літератури (1 розділ), опису методів дослідження (2 розділ), результатів власних досліджень та їх обговорення (3, 4, 5, 6 розділи), висновків, списку рикористаної літератури (228 джерел, у тому числі 89 іноземних робіт). Текст дисертації ілюстровано 4 таблицями та 14 рисунками.

МАТЕРІАЛИ 1 МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Експерименти проводилися на щурах лінії Вістар вагою 120-180 г, які перебували на стандартному раціоні годівлі. Тварин опромінювали тотально на установці РУМ-17.

ЦНС-синдром викликали опроміненням у дозі 150 Гр (10.7 Гр/хв, 250 кВ, 15 мА, А1-3.0); геморагічний і кишковий синдроми - опроміненням у дозах 6, 8 і 12 Гр (0.6 Гр/хв, 200 кВ, 15 мА, Си-0.5+А1-1.0). Тривалий вплив радіації з низькою інтенсивністю відтворювали одноразовим опроміненням у дозі 0.25 Гр (1.75 мГр/хв, 150 кВ, 6 мА, Cu-0.5+Cu-2.0). Моделлю хронічного радіаційного впливу у дозах 0.25 і 0.50 Гр було фракціоноване опромінення протягом 25 і 50 діб із добовою дозою 0.01 Гр та інтенсивністю 1.75 мГр/хв.

Терміни досліджень після опромінення: 6 хв, 1 і 6 год. - для надлетальної дози; 1, 3, 24 і 48 год. - для летальних доз; у наступну добу для низьких доз.

Після швидкої декалітації щурів на холоді виготовляли поздовжні зрізя кори головного мозку товщиною 0.3-0.4 мм і масою 10-12 мг на мікротомі МНТ-84 (Буданцев, 1985, 1987). Час від моменту

декапітації до виготовлення останнього зрізу дорівнював 10+1 хв. Для інкубації використовували бікарбонатами буфер Кребса-Рінгера хімічного складу (мМ): NaCl-122.4, КС1-2.4, КН2Р04-1.2, MgS04-1.3, СаС12-2.8, глюкоза-10.0, NaHC03-26.0, pH 7.4, який врівноважували газовими сумішами O^.COj або N2'.C02 у співвідношенні 95%:5% залежно від умов експерименту.

Транспорт калію у зрізах досліджували за схемою (Israel et al., 1966; Israel et al., 1970): преінкубація- 20» анаеробна інкубація- 10, аеробна інкубація- 30 хв. По здатності зрізів до протиградієнтної реакумуляції калію з омиваючого розчину, що визначалась як різниця вмісґу К+ у зрізах після анаеробної і аеробної інкубацій, оцінювали активність Na,K-Hacoca. Вміст К+ визначали на атомно-абсорбційному спектрофотометрі AAS-508 ("Hitachi", Японія) після завчасного розчинення зрізів у концентрованій HNO3.

Фармакологічні агенти (реактиви фірм "Fluka", Швейцарія; "RBI", США; "Serva", Німеччина) додавались в омиваючий розчин через 15 xd від початку преінкубації до кінцевих концентрацій (М): АХ, ГАМ К - Ю'10, 10'9, 10~8, 10'7, 10 6, 10'5; селективні антагоністи М-ХР і Н-ХР, ГАМКд-Р і ГАМКб-Р, відповідно: атропін (Amp), d-тубокурарин (d-TK), бікукулін (Бік), 5-аміновалеріанова кислота (5-АВК), факлофен (Факл) - 10~5; фосфоліпази: ФЛ Аз або ФЛ D - 0.1 акт.од./мл, вільні жирні кислоти: капринова (С-10:0), арахідонова (С-20:4), бегенова (С-22:0) - 1.5х10'3М.

Отримані в результаті експериментів чисельні дані піддавалися стандартній статистичній обробці. Достовірні відміни між варіаційними вибірками визначали за критерієм Ст'юдента при Р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Вплив іонізуючої радіації у летальних і пелетальних дозах

на активність Na,K-nacoca нейропалъних мембран

Результати експериментів по вивченню активного калієвого транспорту в зрізах кори головного мозку щурів показали, що тотальне опромінення в дозі 150 Гр необоротно пригнічувало функцію Na,K-Hacoca в усі досліджувані терміни. При опроміненні у дозах 6, 8 і 12 Ґр було виявлено дозозалежне послаблення активного транспорту К+ через 1 год. після радіаційного впливу відповідно на 25, 18 і 84%. Вивчення динаміки

радіаційної патології у тканині головного мозку після опромінення в дозі 12 Гр дозволило встановити, що Через 3 год. активний транспорт К+ у зрізах підвищувався до 67% від контрольних значень, через 24 год. - майже відновлювався і досягав 86% від норми, проте через 48 годин зрізи помітно втрачали здатність до

реакумуляції К+ - і рівень його проти градієнтного прибутку становив лише 38% від контрольного. Таким чином, зміни в активності Ш,К-насоса клітин головного мозку, протягом двох діб після летального впливу іонізуючої радіації мали фазовий характер. •

Одноразова і хронічна дія низьких рівнів радіації на організм зумовлювала нерівнозначні зміни у процесах калієвого розподілу у тканині мозку. Так, після одноразового тривалого опромінення в дозі 0.25 Гр спостерігалось достовірне зростання інтенсивності активного транспорту К+ (на 32%), тим часом як одноразове опромінення в дозі 0.50 Гр не впливало помітно на процеси трансмембранного переносу іонів К+. Хронічна дія іонізуючого випромінювання у тих же кінцевих дозах і з тією ж потужністю дози спричиняла певною мірою протилежно спрямовані ефекти на транспорт іонів К+ у зрізах мозку щурів порівняно з одноразовим опроміненням. Радіаційний вплив у дозі

0.25 Гр знижував інтенсивність активного транспорту К+ на 41%, а у дозі 0.50 Гр - на 55%. Отримані дані узгоджуються з існуючими уявленнями про нелінійну дозову залежність і осцилятивний характер ефектів іонізуючого випромінювання низької інтенсивності.

2. Взаємозв'язок між Ш,К-насосом і системами

ацетилхоліну і ГАМК після дії іонізуючої радіації

У ході експериментального дослідження ефектів А\ і ГАМК на транспорт К+ у зрізах кори головного мозку неопромінсних щурів були з'ясовані деякі закономірності нормальної чутливості Ка,К-наСоса нейрональних мембран до низьких концентрацій медіаторів (рис.1). Було встановлено, що ири зростанні концентрації АХ від 1010 до 10'5 М змінювалась спрямованість його ефекту на Ка,К-насос: від активації на 53% до пригнічення на

43.5% відповідно, що позначалося на рівні К+ у зрізах, інкубованих аеробно. ГАМК знижувала рівень К+ у клітинах мозку тільки в граничних концентраціях (ІО'10, 10'5 М).

35 т Б

25 ?

20

15

20 А*;

15

є

м

Рис. 1. Вплив ацетилхоліну (А) і ГАМК (Б) на транспорт К+ у зізах кори головного мозку іДурів у нормі.

Кожна точка є середнім статистичним для 6-10 зрізів від 3-4 тварин (М±А, Р<0.05). Вміст К+ у тканині мозку після ІО хв анаеробної інкубації (—о— ), ЗО хв аерообної інкубації ( —®— ), у відсутності нейромедіаторів ( —д- , —А~).

При опроміненні у дозі 6 Гр була відмічена суттєва модифікація активаційної компоненти ефекту АХ (10‘10 -10'& М), коли рівень протиградієнтного транспорту К+ змінювався від 50% до 88% відносно контрольних значень (рис.2,А); у відсутності АХ він становив 75% від норми. Водночас характер інгібіційної компоненти практично не зазнавав впливу, крива, що відображала зниження рівня К+ у зрізах мозку внаслідок присутності АХ (10'7-10*5 М), мала таку ж саму форму, як і в нормі.

Розглядаючи ефект ГАМК при опроміненні в дозі 6 Гр, можна помітити, що змінювались обидві його

складові (рис.2,1*), до того ж та компонента, яка відповідала концентраціям 10'10-Ю"8 М,. знову ж таки виявилася більш ураженою. Активний транспорт К+ у зрізах зменшувався під впливом низьких концентрацій ГАМК до 38% від норми. При аплікації більш високих концентрацій ГАМК (10‘7-10~5 М) активність ІЧа,К-насоса мало змінювалась у порівнянні з його станом при відсутності нейромсдіатора. Однак крива концентраційної залежності вмісту К+ у зрізах від присутності ГАМК мала зовсім інший вигляд, ніж у нормі.

£ 2 2 2 2 2 М

Рис. 2. Вплив ацетилхоліну (А) і ГАМК (Б) на транспорт К+ зрізах кори головного мозку щурів після рентгенівського опромінення в дозі 6 Гр.

Рінсігь К+ у нормі (—). Інші умовні позначення як на рис. 1,

Одноразове тривале опромінення в дозі 0.25 Гр також істотно змінювало ефекти нейромедіаторів на активний транспорт К+ у нервових клітинах. Обидві "концентраційні" криві, що відображали залежність вмісту К+ в аеробно інкубованих зрізах від присутності АХ і ГАМК в омиваючому розчині, відзначались

наявністю мінімуму в інтервалі нижчих концентрацій і максимуму в інтервалі більш високих (рис.З).

Рис. 3. Вплив ацетилхоліну (А) і ГАМК (Б) на транспорт К+ у зрізах Кори головного мозку щурів після одноразового тривалого опромінення в дозі 0.25 Гр.

Рівень К+ у нормі (—). Інші умовні позначення як на рис. 1.

Порівнюючи відрізки кривих на рис. 2 і 3, що відповідають ефектам АХ і ГАМК у концентраціях 10‘10-10*8 М, легко встановити, що променева модифікація низькоконцентрацШних компонент медіяторної модуляції нейронів має аналогічний характер у випадках радіаційного впливу на організм у дозі 6 Гр з високою потужністю (600 мГр/хв) І в дозі 0.25 Гр з низькою потужністю (1.75 мГр/хв). Отримані результати узгоджуються з даними інших авторів (Молочкина и др., 1995; Burlakova, 1995), які показали схожість біологічних ефектів, обумовлених рівнями. опромінення, що відрізнялись на один або кілька ступенів.

При хронічному опроміненні в дозі 0.25 Гр "концентраційні" криві, які характеризують зміни рівнів

К+ в аеробно інкубованих зрізах мозку у присутності медіаторів, мали схожий вигляд з аналогічними кривими, отриманими при одноразовому опроміненні як для АХ, так і для ГАМК. Це наводить на думку про єдиний шлях модифікації досліджуваних процесів нейромедіаторної модуляції у клітинах мозку при обох варіантах радіаційного впливу на організм.

3. Роль специфічних рецепторів у здійсненні нейромедіаторної модуляції ІЇа,К-шсоса після опромінення організму з низькою потужністю дози

Щоб вивчити більш детально процес нейромедіаторної модуляції N а, К-насоса, провели серії експериментів по дослідженню ефектів АХ (10*10 М, ІО"6 М) і ГАМК (10‘9 М, 10*5 М) у присутності селективних антагоністів ХР і ГАМК-Р після одноразового і хронічного опромінення у дозі 0.25 Гр.

Атр у нормі не впливав на досліджуваний метаболічний ефект АХ, що виключало участь М-ХР у його реалізації. При вивченні сумісної дії АХ і Атр на активний транспорт К+ у зрізах мозку одноразово опромінених щурів спостерігалась модифікація ефекту АХ (ІО'10 М), ефекти Атр і АХ (10'6 М) складались. Цс свідчило, що вплив на активність ШД-насоса в першому випадку був зумовлений змішаним типом* (М+Н)-ХР, а в другому - тільки Н-ХР. Навпаки, аналіз експериментальних даних, отриманих при хронічному опроміненні щурів, показав, що в цьому разі ефект АХ (ІО'10 М) походив від активації Н-ХР, а у реалізації ефекту АХ (ІО 6 М) брали участь ХР обох типів.

сІ-ТК у нормі повністю знищував ефект АХ в обох точках, що підтверджувало його опосередкованість через Н-ХР. Дослідження спільного впливу АХ і сі-ТК при дії іонізуючої радіації у дозі 0.25 Гр показали, що при

одноразовому опроміненні сі-ТК не впливав на ефект АХ (Ю~10 М) і повністю ліквідував ефект АХ (10'6 М). При хронічному опроміненні метаболічний ефект АХ взагалі не проявлявся у присутності сі-ТК. : '

Отже, за умов опромінення організму з низькою потужністю дози модуляційний ефект АХ на Ыа,К-насос нейрональних мембран був пов'язаний переважно з Н-ХР, як це спостерігалось і в контролі. Проте М-ХР також були залучені до реалізації ефекту нижчих концентрацій АХ при одноразовому опроміненні і вищих його концентрацій - при хронічній дії радіації.

Бік у нормі повністю пригнічував метаболічний ефект ГАМК, 5-АВК не впливала на нього, а Факл виступав його модулятором. Отримані дані однозначно свідчили, що процес регуляційної дії ГАМК на Ка,К-насос нейрональних мембран був опосередкований виключно через ГАМКд-Р іонотропного типу. .

При одноразовому опроміненні спостерігали адитивний ефект Бік і ГАМК (Ю*9 М), але при сумісній дії Бік і ГАМК (105 М) визначався лише ефект першого. Отже, отримані дані вказували на те, що метаболічний ефект ГАМК реалізувався через ГАМКд-Р. 5-АВК при одночасній дії з ГАМК (10'9 М) не виявляла власної дії, проте вона суттєво впливала на ефект ГАМК (10'5 М). Факл модифікував ефект ГАМК в обох концентраціях. Таким чином, дані експериментів з 5-АВК і Факл свідчили про можливість залучення ГАМКб-Р . в опосередкування метаболічного ефекту ГАМК при тривалому низькоінтенсивному опроміненні.

Після хронічного, опромінення Бік не впливав на ефект ГАМК в обох концентраціях, однак при аплікації 5-АВК або Факл проявлялись їх власні ефекти. Таким чином, при хронічному впливі іонізуючої радіації модуляційний ефект ГАМК на активність мембранного Ыа,К-насоса здійснювався виключно через ГАМКб-Р.

Результата експериментальних досліджень також свідчили про те, що вплив іонізуючої радіації низької інтенсивності зумовлював структурно-функціональні

порушення у рецепторах мембран нервових клітин.

. 4. Внесок модифікації ліпідної компоненти мембран у

післярадіаційне порушення процесів міжнейрональної

модуляції

Відомо, що у викликаному дією радіації структурно-метаболічному ураженні біомембран вагому роль відіграє активація ендогенного фосфоліпазного гідролізу (ФЛГ). Для імітації in vitro ефекту посиленого ФЛГ на активність Na,K-Hacoca та його модуляції з допомогою нейромедіаторів АХ і ГАМК^було проведено модельні експерименти по вивченню реакумуляції К+ зрізами кори головного мозку щурів, коли в омиваючий розчин додавали агенти, які впливали иа ліпідну будову біомембран. Виявилось, що завчасна яреінкубація з ФЛ A2 і ФЛ D пригнічувала активний транспорт К+ у зрізах мозку до 13-14%> від норми* Таким чином, картина калієвого розподілу, отримала при використанні екзогенних фосфоліпаз, збігалася з даними про вплив іонізуючої радіації у дозі і 2 Гр через 1 год. після опромінення (розд.і)* Ефекти насичених жирних кислот І на активність N а, насоса залежали від довжини вуглецевого яанцшшаі капринова кислота (С-10:0) знижувала її ш §%%t бвгенош (С-22:0) - на 26%.

ПеИНИЙ Інтерес мають Дані, які свідчать, що вплив ГАМІС (ІО'9; 10^ М) на активність Na,K-Hacoca і вміст К4 В Ійкубоааним in vitro зрізах мозісу у присутності бегеиоааї КИСЛОТИ Майже не відрізнявся від того, який спостерігайся після хронічного опромінення у дозі 0.25 Гр (рис.4). Справедливо на цій підставі припустите, що саме наявність бегснової кислоти (С-22:0) визначає деякі

фізико-хімічнІ властивості ліпідної компоненти мембрани, які приводять до модифікації метаболічної реакції клітини при хронічному опроміненні з низькою потужністю дози.

Рис. 4. Вміст К+ у зрізах кори головного мозку після ЗО хв аеробної інкубації у присутності синаптичних нейромедіаторів і вільних жирних кислот (1.5x10'3 М).

□ - Капринова кислота (С-10:0) + АХ; Е2 - бсгсиова кислота (С-22:0) + АХ; Е23 - капринова кислота (С-10:0) + ГАМК; £3 - бсгсиова кислота (С-22:0) + ГАМК; ( —®— ) - ефект ГАМК після хронічного опромінення в дозі 0.25 Гр. .

Цікаві результати дало порівняння- впливу ГАМК при летальному опррміненні організму і при імітації радіаційного ефекту шляхом експериментального порушення ліпідної будови нейрональних мембран за допомогою фосфоліпаз і арахідонової кислоти (рис.5).

Є 35 Т <0 Й

*о £

« 25 ••

І

20-

15

І

Ш

І

ш

І

¡35 т

Ы

830 + £

*

і 25 - •

§

20-

15

З 4 III

І X

а.

35 т

30-

25

20-

15

І

5 - . 1

35 т

ЗО -

Е=Ь 25 ■

20 ••

і

X

-)— Шк

і

-1

З

IV

1

й ш

¡и щ т

1 1

2 3

Рис. 5. Вплив ГАМК на транспорт К+ у зрізах кори головного мозку щурів при летальному опроміненні й імітованому посиленні фосфолілазного гідролізу.

І - опромінення в дозі 12 Гр/1 год., II - фосфоліпаза Аг (0.1 акт. од./мл), III - фосфаяіпаза 0 (0.1 акт. од./мл), [V - арахідонова кислота (1.5x10 і М); 1 - норма, 2 - дія контрагента без ГАМК, 3 -вплив ГАМК (10-7 М), 4 - вплив ГАМК (І0 6 М), 5 - вшіив ГАМК (10'5 М); ІШ - вміст К+ у зрізах мозку після інкубації у анаеробних умовах.

Отримані дані показали, що активний транспорт К+ у нервових клітинах, який майже повністю пригнічувався через 1 год. після опромінення у дозі 12 Гр, підвищувався відповідно до 72-58% за присутності ГАМК (10‘7-10‘5 М) в інкубаційному середовищі. При інактивації N а, К-насоса під час інкубації з ФЛ Аг найбільш ефективною для його відновлення була 10'6 М ГАМК (84% від норми), під час інкубації з ФЛ Э або арахідоновою кислотою - і О'7 М ГАМК (приблизно 75% від норми в обох випадках). Порівняння впливу ГАМК (ІО'МО*5 М) на активний транспорт К+ у зрізах мозку після дії іонізуючої радіації і при штучній модифікації ліпідної компоненти мембран підтверджує припущення про те, що ефекти летальних доз опромінення можна задовільно відтворити комплексним використанням екзогенних фосфоліпаз і ненасичсних жирних кислот.

ВИСНОВКИ

1. Вплив іонізуючої радіації високої інтенсивності на організм дозозалежно пригнічував функцію Иа,К-насоса у клітинах головного мозку, причому фазовість змін його активності, виявлена у динаміці перебігу ЦНС-синдрому (150 Гр) і шлунково-кишкового синдрому (12 Гр) у щурів, відповідала фазовості симптоматики загального стану опроміненого організму; ефекти опромінення низької інтенсивності (0.25 і

0.50 Гр) на протиградієнтний транспорт іонів були різноспрямовані при одноразовій тривалій і хронічній (фракціонованій) дії в однакових кінцевих дозах і не виявляли прямої дозової залежності.

2. Опромінення у летальних і нелегальних дозах модифікує двофазні регуляторні ефекти ацетилхоліну і у-аміномасляної кислоти на активність Ш,К- насоса нейрональних мембран таким чином, що помітніше

змінюється або зникає перша фаза метаболічної реакції клітини, яка відповідає більш низьким концентраціям (Ю'10-10~& М) обох нейромедіаторів.

3. Вплив іонізуючого випромінювання у дозі 0.25 Гр з низькою інтенсивністю (1.75 мГр/хв) спричиняє модифікацію метаболічної відповіді нейронів на низькі концентрації ацетилхоліну і у-аміномасляної кислоти, аналогічну до ефекту суттєво більш високої, летальної дози радіації (6 Гр при інтенсивності 600 мГр/хв).

4. Після опромінення організму у дозі 0.25 Гр до

реалізації метаболічних ефектів ацетилхоліну і ГАМК (Ю'10-10'5 М) на активність Ш,К-насоса залучались відповідні метаботропні мускаринові холінорецептори і ГАМКв-рецсптори, у той час, як у нормі ці ефекти були опосередковані іонотропними нікотиновими

холінорецепторами і ГАМКд-рецепто^ами; однією з причин суттєвого перестроєння процесів метаболічної нейромедіаторної модуляції є структурно-функціональне радіаційне порушення специфічних рецепторів.

5. Змінення структури ліпідного бішару мембран нервових клітин "у переживаючих зрізах головного мозку щурів при використанні екзогенних фосфоліпаз (ФЛ А2, ФЛ Б) або вільних жирних кислот приводить до наслідків, подібних до впливу іонізуючого випромінювання як високої, так і низької інтенсивності, що підтверджує ліпідозалежність радіаційних ефектів на іонтрансгіортуючі та регуляторні функції біомембран.

6. Показано існування ГАМК-ергічного механізму "гомеостатичного контролю”, який вирівнює калієвий внутрішньоклітинний гомеостаз нервових клітин, порушений дією екстремальних факторів, і здійснюється через ГАМК-модуляцію активності Ка,К-насоса принципом рецепторно-опосередкованої стругсі-урНс*-мембранної регуляції.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дворецкий А.И., Шаинская А.М., Панченко (Ананьева) Т.В., Куликова И.А. Пострадиационные изменения в системах активного транспорта ионов в ЦНС. Рсаккумуляция ионов калня переживающими срезами мозга //Радиобиология.-1988.- Т. 28, вып. 4. - С. 470-473.

2. Dvoretsky A.I., Shainskaya AM., Ananieva T.V., Kulikova I.A Survival brain cortex slices as a model in the estimation of ionizing radiation harmful effect on the central nervous system //The 5th Nat. Conf. on Biomedical Physics arid Engineering. Abstr.-, Sofia, 1988. - P. 143-144.

3. Дворецкий А.И., Шаинская A.M., Ананьева T.B., Куликова НА, Анненкова С.В. Пострадиационные изменения в системах активного транспорта ионов в ЦНС. Влияние сверхлетальных доз ионизирующей радиации на Na,K-Hacoc в переживающих срезах мозга //Радиобиология.- 1989.- Т.29, вып. 4. - С. 477-480.

4. Дворецкий А.И., Шаинская А.М., Ананьева Т.В., Куликова И.А. Действие ионизирующей радиации в летальной и сверхлстальной дозе на Na,K-nacoc нейрональных мембран //I Всссоюз. радиобиол. съезд: Тез. докл.- Пущино, 1989.-Т.4.-С. 871-872.

5. Dvoretsky AI., Shainskaya AM., Ananieva T.V., Kulikova IA. Ionizing radiation action on transport system of Na+ and K+ of neuronal membranes. Potassium ions reaccumulation with brain slices //Studia biophysica.- 1990.- Vol. 136, N. 1.- P. 55-64.

6. Дворецкий А.И., Куликова ИА, Ананьева Т.В. Влияние

однократного и хронического облучения п малых дозах на Na,K-Hacoc нейронов //Радиобиологические последствия аварии на ЧАЭС: Тез. докл. Всссоюз. конф. - Минск, 1991.-С. 34. '

7. Дворецкий А.И., Ананьева Т.В., Куликова И .А. Нейромсдиаторная регуляция Na, К-насоса нейронов при хроническом облучении в малых дозах //Гам же. - С. 35.

8. Дворецкий А.И., Ананьева Т.В. Пострадиационный эффект ацетилхолина и ГАМК на активный захват калия срезами ■

коры головного мозга крыс //Радиобиология,- 1992.- Т. 32, вып. 4. - С. 540-545. ,

9. Дворецький А.І., Кулікова 1.А., Ананьева Т.В. Транспорт калію в зрізах мозку щурів, опромінених малими дозами //6-й Укр. біохімічний з'їзд: Тез. доп. - Київ, 1992.- Т.З.- С. 157-158.

10. Кулікова ІЛ., Ананьева Т.В., Дворецький А.1. Вплив нейротрансмітерів на активність Na,K-mcoca за умов хронічного опромінення малими дозами //Там же.- С.162-163.

11. Dvoretsky A!., Ananieva T.V., Kulikova LA. Neurotransmitter regulation of Na,K-pump activity in rat brain slices after chronic irradiation with low doses //The Int. Conf. on Low Dose Irradiation and Bilogical Defense Mechanisms. Abstr.- Kyoto, 1992. - P.115.

12. Dvoretsky A.I., Kulikova I.A., Ananieva T.V., Kudryashov Yu.B. Changes in Na,K-pump activity after acute and chronic X-irradiation with low doses //Ibid. - P. 116.

13. Ананьева T.B., Панченко И.В. Влиянйе ацетилхолина и ГАМК на транспорт К+ в срезах мозга крыс при действии ионизирующей радиации низкой интенсивности //Радиобиологический съезд. Киев, 20-25 сент. 1993 г.: Тез. докл. - Пущино, 1993.- Т. 1. - С. 296. .

14. Dvoretsky АЛ:, Kulikova I A, Ananieva T.V. Neurone reactions to acute and chronic low dose irradiation //The 25th Ann. Meet, of the ESRB. Abstr. - Stockholm, 1993,- P. 01:02.

15. Ананьева T.B., Дворецький А.І. Вплив ацетилхоліну на активність Na,K-Hacoca в зрізах мозку щурів //1-й З’їзд Укр. біофіз. т-ва: Тез. доп. - Київ, 1994.- С. 29.

16. Ananieva T.V. Regulation of neuronal Na,K-puinp activity with GABA after irradiation //The 26th Ann. Meet, of the ESRB. Abstr.

- Amsterdam, 1994.- P. 150.

17. Ananieva T.V., Kulikova IA., Dvoretsky A.L Low dose irradiation induced disturbances in neurotiansn^ttcr regulative processes in central nervous system //Journ. of Physical, Health Resort and Rehabilitat. Medicine.,- I?95'.- VoI.XXXIII, N 5.- P.38.

18. Kulikova IA, Ananieya T.V., Dvoretsky A.I. Ion homeostasis of nervous cells under the environmental dose irradiation //Ibid.

- P. 44.

19. Ananieva T.V., Dvoretsky АЛ. Radiation-induccd changes in

neuronal cholino- and GABA-receptors //Radiation Research 1895-1995. Proceed, of the 10th Int.’ Congr. Vol. 1: Abstr. -Wurzbuig, 1995. - P. 221. :

20. Dvoretsky A.I., Kulikova I.A., Ananieva T.V. Low level radiation action upon ion transfer across membrane and neurotransmitter regulation in brain //Ibid. - P. 287.

21. Ананьева T.B., Дворецкий А.И. Процессы нейромедиатор-ной модуляции при облучении с малой мощностью дозы //"Устойчивое развитие: загрязнение окружающей среды и экологическая безопасность"; Тез. докл. 1-й Междунар. науч.-практ. конф. - Днепропетровск, 1995.- Т. 1.- С. 165.

22. Ананьева Т.В., Дворецкий А.И. Процессы нейромедйатор-ной модуляции при облучении с малой мощностью дозы //Матср. 1-й Мсждунар. науч.-пракг. конф. "Устойчивое развитие: загрязнение окружающей среды и экологическая безопасность". - Днепропетровск, 1995. - С. 172-176.

23. Ananieva Т. GABA-er&ic mechanism of radiation defence in CNS //Exp. Toxic Pathol. - 1996. - Vol. 48, N 5. - P. 327-328.

АННОТАЦИЯ

Ананьева Г. В. Регуляторная взаимосвязь Na,K-Hacoca мембран нервных клеток с нейромедиаторными системами ацетилхолина и ГАМ К при радиационном поражении организма (рукопись) .

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.08 - радиобиология, Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого НАН Украины. Киев, 1997.

Защищаются 23 работы,’ содержащие данные об искажении модулирующего действия ацетилхолина и ГАМК на активность Na,K-nacoca нейрональных мембран при общем облучении организма в летальных и нелегальных дозах. Исследована роль метаботропных мускарнновых холинорецепторов и ГАМКв-рсцепторов _ а опосредовании

метаболических эффектов нейромедиаторов при воздействии ионизирующей радиации. Показана возможность моделирования пострадиационного состояния Иа.К-насоса нейронов путем направленной экспериментальной модификации фосфолипидной структуры мембран с помощью экзогенных фосфолипаз и свободных жирных кислот.

. ANNOTATION

T.V-Anaaieva. Regulatory interconnection between Na,K-pump and the systems of acetylcholine. iind GABA neuromediators in nervous cells under radiation injury of organism (manuscript)

Dissertation for the scientific degree of Candidate of Biological Sciences in radiobiology, 03.00.08. Institute 'of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology named after R-E.Kavetsky of Ukrainian NAS. Kyiv, 1997.

23 scientific works are defended; they have been contained data on changes in the Na,Iy-,pnmp activity modulation with acetylcholine and GABA in neuronal membranes after whole-body irradiation with lethal and non-lethal doses. The both metabotropic muscarinic cholinoreceptors and GABAa-receptors have been found to mediate metabolic neurotransmitter effects under low dose irradiation influence. The Na»K-pump postirradiation status was possible to be imitated tyy directed modification of membrane structure with exogenous phospholipases and- free fatty acids applied to brain cortex slices. '

Ключові слова! рентгенівське опромінення, низькі дози, Ыа,К-насос, хоЛІнорецептори, ГАМК-рецептори, метаболічна рМ^Лгіція, ліпіди мембран.

¡rhUh , ЮгУ Si G - іDO