Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реакция популяций дрожжевых клеток на длительное воздействие - излучением

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Реакция популяций дрожжевых клеток на длительное воздействие - излучением"

«V 19-98-81

V

На правах рукописи УДК 577.34

ЗЮЗИКОВ Николай Аркадьевич

РЕАКЦИЯ ПОПУЛЯЦИЙ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК НА ДЛИТЕЛЬНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ у-ИЗЛУЧЕНИЕМ

Специальность: 03.00.01 — радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск 1998

Работа выполнена в Объединенном институте ядерных исследований, г.Дубна, Московской области

Научные руководители:

- доктор биологических наук В.Г.Петин

- кандидат биологических наук В.Л.Корогодина

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук А.В.Севанькаев

- доктор биологических наук Б.И.Сынзыныс

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии РАСН

Защита диссертации состоится " 12 " мая 1998 г. в 11.00 на заседании диссертационного Совета Д 001.11.01 щ Медицинском радиологическом научном центре РАМН. Отзывы ] автореферат просим отправлять по адресу: 249020, Калужск; область, г.Обнинск, ул.Королева, 4. МРНЦ РАМ1 диссертационный совет.

Автореферат разослан " 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук

Куликов В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В ходе своей жизни человек постоянно подвергается воздействию шизирующей радиации (природный радиационный фон и техногенный он, возникший в результате деятельности человека). При определенных ¡стоятельствах может происходить увеличение в несколько раз эщности дозы выше естественного природного облучения на протяжении шольно длительного времени. Такое повышение облучаемости юисходит при работе в шахтах, на объектах ядерной энергетики, при юдолжительных полетах в космос, также превышение фона возможно и жилых помещениях. Хорошо известно, что наиболее щиочувствительными клетками организма являются активно делящиеся дифференцирующиеся клетки. В то же время в литературе редко тречагатся данные по хроническому (в течение нескольких клеточных нераций) воздействию ионизирующего излучения на пролиферирующие теточные системы и последствиям такого воздействия.

Особую актуальность проблема реакций клеток на длительное ¡лучение приобрела в связи с авариями на объектах ядерной энергетики, 1ких как химические комбинаты "Маяк" и "Томск-7", Чернобыльская ЭС и в связи с испытаниями ядерного оружия, которые привели к 1Грязнению биосферы долгоживущими радионуклидами. Активно слючаясь в круговорот веществ в биосфере, долгоживущие 1дионуклиды оказывают длительное радиационное воздействие на :ловека, растительный и животный мир. Актуальность этого травления исследований возрастает в связи с необходимостью оценки благоприятных последствий загрязнения окружающей среды здионуклидами.

ель и задачи исследования

Целью данной работы являлось установление закономерностей роявления летальных и адаптационных эффектов хронического зздействия у-излучения на растущие популяции дрожжевых клеток.

Для достижения указанной цели необходимо было решит следующие задачи:

1. Провести серию исследований по длительному воздействш гамма-излучения на активно растущие популяции дрожжевых клето разных генотипов;

2. Исследовать возможные пути адаптации популяций к длительном воздействию излучений;

3. Установить влияние мощности дозы облучения на проявлени обнаруженных эффектов;

4. Описать полученные результаты с помощью математической модели.

Научная новизна

В работе получен целый ряд новых приоритетных научных данных Впервые получена динамика роста-гибели клеточной популяции пр1 хроническом облучении в широком диапазоне мощностей доз у-излучения Теоретически и экспериментально показано существование пороговой I критической мощностей доз. Показано, что популяция клеток уже чере: несколько часов после начала воздействия адаптируется к хроническом; у-облучению, что заключается в повышении устойчивости клеток 1 последующему острому облучению. С увеличением интенсивносп хронического облучения в определенном диапазоне мощностей до; у-излучения резистентность популяции к последующему остром} воздействию повышается. Факт существования адаптивной реакции з дрожжевых клеток при длительном облучении также установлен впервые Предложена математическая модель для качественного и количественной описания экспериментальных данных.

1.4. Практическая значимость

Полученные экспериментальные данные и предложенная модел! могут иметь практическую значимость для прикладной радиобиологии радиоэкологии, медицинской радиологии, а также для прогнозирование последствий длительного облучения. Результаты работы имеют \ фундаментальное значение, поскольку дополняют современный уровеш представлений о влиянии длительного воздействия ионизирующих

излучений. Математическая модель динамики роста-гибели позволяет эценить величины двух важных мощностей доз хронического облучения: пороговой, не влияющей на рост клеточной популяции, и критической, зыше которой существование популяции невозможно. Результаты исследований позволили предложить способ увеличения чувствительности эпухолевых клеток.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, практические предложения и рекомендации, заключение и зыводы; содержит 125 страниц машинописного текста, 25 рисунков и 11 таблиц. Список литературы включает 100 наименований, из них 42 на русском языке.

Апробация

Материалы диссертации доложены на International Workshop 'Modern Problem of Radiobiology" (Dubna, 1996), Научной конференции "Хромосомы и радиация", посвященной памяти Н.В.Лучника (Обнинск, 1997), Международном симпозиуме "Проблемы биохимии, космической и радиационной биологии" (Москва, Дубна, 1997), Первой Открытой Научной Конференции Молодых Ученых и Специалистов ОИЯИ (Дубна, 1997), Третьем Съезде по Радиационным Исследованиям (Москва, 1997), Второй Открытой Научной Конференции Молодых Ученых и Специалистов ОИЯИ (Дубна, 1998). Диссертация апробирована на :еминаре в Отделении Радиационных и Радиобиологических Исследований ОИЯИ.

На защиту выносятся:

- Результаты исследований динамики роста популяций дрожжевых ¡слеток разных штаммов при различных мощностях доз у-излучения;

- Результаты экспериментов по изучению адаптивной реакции дрожжевых клеток;

- Математическая модель динамики размножения-гибели при воздействии различными мощностями доз у-излучения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы дрожжей

В опытах использованы изогенные дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae дикого типа и их радиочувствительные мутанты: XS800 (RAD/RAD), XS1898 (rad52/rad52), S288C (RAD),

gl60/2d (rad52). В скобках указаны только те мутации, которые влияют на радиорезистентность клеток. Полностью генотипы штаммов приведены в работе

Среды и условия культивирования

Культивирование осуществляли при 30°С в суховоздушном термостате на поверхности питательного агар-агара. Облучение осуществляли в полной синтетической жидкой питательной среде в суховоздушном термостате при 30°С (если это не оговорено отдельно). Среды использовали стандартные 2.

При изучении действия хронического излучения при различных мощностях доз на рост клеточной популяции брали петлей трехдневную культуру клеток с косячка и после соответствующего разведения помещали в жидкую питательную среду. При изучении адаптивной реакции в экспериментах использовали популяцию клеток, предварительно культивированных в жидкой питательной среде в течение суток. Концентрация клеток во всех экспериментах по исследованию особенностей адаптивной реакции не превышала 106 кл/мл.

Определение выживаемости и концентрации клеток

Концентрация жизнеспособных клеток при хроническом воздействии определялась через каждые 1-4 ч (в зависимости от мощности дозы гамма-излучения) капельным методом макроколоний, описанным в работе3. Во всех других экспериментах долю жизнеспособной части популяции определяли стандартными методами макроколоний и микроколоний.

'Saeki Т., Machida I., Nakai S. //Mutation Research, v.73, n.2, p. 151-265, 1980

2Захаров И.А. и др. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Д.: Наука,

1984

'И.И.Морозов // Лабораторное дело, 1984

Источники ионизирующих излучений

Облучение осуществляли у-квантами 60Со и 137Сэ на 5-ти различных отечественных установках, указанных в таблице 1.

Таблица 1. Источники у-излучения, использованные в работе

Установка Источник у-излучения Мощности доз, Гр/ч

"Исследователь" 60Со 3000

ТУБ 20.000" 60Со 25; 150

"ЛУЧ-1" 60Со 1,6; 3; 7; 8; 12; 46

"Свет" 137 Cs 5; 12; 18; 1500

"Панорама" 137Cs Ю-2

Методы статистической обработки данных

Обработка данных заключалась в построении кривых, описывающих ту или иную экспериментальную зависимость. Такое построение осуществлялось после расчета оптимальных значений параметров методом наименьших квадратов, если для описания данного эксперимента имелась математическая модель, или графическим методом, в случае отсутствия такой модели. Ошибки среднего определяли по разбросу числа колоний по чашкам. Данный вид ошибок был максимальным из всех прочих.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Математическая модель

Для интерпретации экспериментальных данных по динамике роста-гибели популяции в ходе облучения в диссертации предложена следующая простейшая математическая модель. Динамика поведения популяций в питательной среде при прочих благоприятных условиях (температуре, кислотности, концентрации солей и т.д.) и действии па пес ■у-излучепия, то есть при одновременном протекании процессов деления,

роста и гибели клеток, описывается уравнением:

— = (1)

где М - число жизнеспособных клеток, ц - скорость размножения, Я - вероятность гибели в единицу времени под действием облучения. В случае независимости параметров ¡л и Я от времени для (1) получается довольно простое решение:

ЛЬ = • ехр[(//- Л) •/], (2)

где ЛЬо - число жизнеспособных клеток в момент времени 1=0. В зависимости от знака разности (// — Я) будет происходить либо

увеличение количества жизнеспособных клеток в популяции, либо гибель по экспоненциальному закону. График зависимости 1п(М/М0) от 1 должен представлять собой прямую линию с тангенсом угла наклона равным разности — Я):

к = /л - X. (3)

В общем случае к, а значит ц и Я могут зависеть от дозы (Б) и

мощности дозы (С). Предположим, что коэффициенты [л и Л не зависят от 1, то есть реализуется случай, описываемый выражением (2). Это означает, что при постоянной мощности дозы нет зависимости ц и Я от дозы, так как время и доза связаны соотношением:

£> = /)■/. (4)

Дрожжевые клетки, находящиеся в логарифмической стадии роста, характеризуются экспоненциальной кривой инактивации:

ЛЬ = ЛЬо-ехр {-ИЮа). (5)

Решением уравнения (1) в случае острого облучения является выражение:

№ = №о-ехр(-Л-г). (6)

Сравнивая (5) и (6) с учетом (4), имеем:

Я = ЬЮо. (7)

Окончательное выражение для зависимости числа жизнеспособных клеток от времени:

=лгю-ех р

(8)

Число ииактивированных клеток можно вычислить по уравнению

^ = (9)

Л

где М - число ииактивированных клеток,

Л^ - число жизнеспособных клеток, описываемых выражением (2). Решением (9) с учетом (2), (3) и (8) будет:

М = --Ыо-(ек' -1) + Мо, (10)

к

где Мо - число ииактивированных клеток в момент времени 1=0. В наших экспериментах N¡0=0.

Рассмотрим случай к > 0, тогда соотношение жизнеспособных и ииактивированных клеток будет:

Ш.Л.(\-екЛ. (11)

М к у ' При ?» 11 к , когда еы » 1, имеем:

N I Ь

№ к к-Во В случае А:<0, при 1»М\к\ получаем:

(12)

= ——(13)

к к-Бо

Данная простейшая модель динамики роста-гибели применима к популяциям клеток, находящимся в логарифмической фазе роста, не ограниченным в ростовых ресурсах и подвергающимся воздействию облучением с постоянной мощностью дозы. Модель позволяет определить значение величины 00 при хроническом облучении в ходе роста и размножения популяции клеток из соотношения числа жизнеспособных и

ииактивированных клеток ( —) и наклона кривой роста-гибели

Лй

Данная модель позволяет оценить значения мощностей дозы: пороговой (мощность дозы, при облучении ниже которой невозможно

определить отличие динамики роста популяции от контрольной) и критической (мощность дозы, при которой скорость роста равна по величине скорости гибели). При воздействии в критической мощности дозы на растущую клеточную популяцию, количество жизнеспособных клеток остается постоянным.

Экспериментальное исследование действия хронического облучения на растущую популяцию клеток

Для изучения хронического действия у-излучения на растущую популяцию клеток нами были поставлены эксперименты по длительному (до 2 суток) непрерывному облучению изогенных клеток, различающихся по плоидности и радиочувствительности, в условиях наиболее благоприятных для роста и размножения (рис.1 и 2).

На рис.1 представлена зависимость относительной концентрации жизнеспособных клеток от времени при нескольких мощностях доз хронического облучения для дикого диплоидного штамма. Каждую кривую для анализа удобно разделить на несколько частей. Начальный участок, от 0 до 3-10 часов соответствует лаг-периоду. Этот период -переходный между стационарной и логарифмической фазами роста после помещения клеток в жидкую питательную среду. Микроскопические исследования показали, что образование почек у клеток начинается через 2 часа после начала эксперимента, независимо от мощности дозы. Однако, как видно из рис.1, длительность лаг-периода зависит от мощности дозы у-облучения. Второй участок кривых (линейный) соответствует размножению-гибели клеток популяции во время облучения. Как видно из рис.1, мощности доз хронического облучения вплоть до величины 1,6 Гр/ч не влияют на скорость размножения популяций (нет различий с контролем). При более высоких мощностях доз скорость роста популяции клеток уменьшается, однако, при этом отсутствует зависимость от времени, а значит и от дозы хронического облучения, у всех изученных штаммов. Это означает, что в ходе хронического облучения растущей популяции не происходит накопления повреждений, влияющих на скорость роста (либо происходит, но с очень малой скоростью). Отсутствие зависимости скорости роста популяции от

Длительность облучения, ч

Рис. 1. Динамика роста-гибели популяции клеток дрожжей 5 а с с /г а гот у с е 5 сегеигягае дикого диплоидного штамма X Б 8 О О в ходе длительного облучения при разных мощностях доз у - и з л у ч е н и я в благоприятных для роста н размножения клеток условиях

дозы при хроническом облучении можно объяснить репарацией всех возникающих повреждений и элиминацией поврежденных клеток. Только репарацией данный факт объяснить не удается, т.к. в растущей и условиях хронического облучения популяции присутствует доля инактивированных клеток. По-видимому, в данном случае клетка либо полностью восстанавливается от таких повреждений, либо погибает.

При мощностях дозы выше 1,6 Гр/ч с увеличением мощности дозы облучения скорость увеличения числа жизнеспособных клеток в популяции уменьшается, а затем становится отрицательной. Замедление скорости размножения популяции клеток при хроническом облучении но сравнению с контролем может быть связано с гибелью части клеток под действием облучения и с увеличением длительности клеточного цикла. Для выяснения вопроса, с чем связано замедление роста клеточной

популяции при хроническом облучении, было определено значение величины радиорезистентности клеток (D0) при остром облучении после хронического воздействия при нескольких мощностях доз и по формуле (3) с использованием (7) вычислена скорость размножения клеток при этих мощностях доз (табл. 2). Оказалось, что замедление роста обусловлено как инактивацией клеток, так и увеличением длительности клеточного цикла под действием облучения. Такие же результаты получены из соотношения жизнеспособных и инактивированных клеток.

Таблица 2. Радиорезистентность (Do) и скорость размножения (//) клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae дикого типа в условиях роста популяции при 3-х мощностях доз хронического у-излучения.

Штамм Мощность дозы хронического облучения

(генотип) контроль 1,6 Гр/ч 3 Гр/ч 8 Гр/ч

XS800 D0, Гр 270 275 335 1500

(RAD/RAD) fl, Ч"1 0,47 0,44 <0,44 <0,37

S288c D0, Гр 40 - 170 225

(RAD) M> Ч"1 0,38 - - 0,13

XS1898 D0, Гр 35 35 - -

(rad 52/rad 52) H, Ч"1 0,19 0,11 - -

Кривая роста-гибели популяции клеток при мощности дозы 150 Гр/ч имеет сложный вид. Форма данной кривой говорит о том, что облучение даже при мощности дозы 150 Гр/ч не останавливает полностью продвижения клеток по циклу. В противном случае мы бы получили обычную (экспоненциальную) кривую выживания.

На рис.2 представлена динамика роста-гибели популяции клеток дрожжей дикого гаплоидного штамма в ходе хронического облучения при нескольких мощностях доз. Все особенности, характерные для дикого диплоидного штамма, наблюдаются и у гаплоидного. Однако сравнение наклонов прямолинейных участков кривых на рис.1 и рис.2 при одних и тех же мощностях доз позволяет заключить, что дикий диплоидный

о И

1 0 20 30 40 50

Длительность облучения, ч

- контроль

- 1 ,6 Гр / ч

- 7 Гр/ ч

- 12 Гр/ч

- 25 Гр/ч

- 46 Гр/ч

- 150 Гр/ч

Рис.

ДР и д ч е бл Ус

2. Динамика роста-гибели популяции клеток ожжей S accharom у ces cerevisiae дикого гапло-ного штамма S288c в ходе длительного о б л у -ния при разных мощностях доз у-излучения в агоприятных для роста и размножения клеток л о в и я х

штамм является более резистентным по сравнению с диким гаплоидным в данных условиях эксперимента. При одинаковых мощностях доз хронического облучения скорость роста популяции клеток дикого гаплоидного штамма ниже, чем у дикого диплоидного.

В экспериментах на мутантных штаммах дрожжей получены качественно подобные кривые. Однако мутантные клетки оказались еще более чувствительными к облучению по сравнению с клетками дикого гаплоидного штамма, исходя из наклонов прямолинейных участков при равных мощностях доз.

В ходе экспериментов были обнаружены и некоторые другие интересные факты. Например, с увеличением продолжительности облучения повышается гетерогенность популяций по размерам и форме колоний, образующихся после рассева облученных клеток (данные не

приведены). Наибольшая индуцированная гетерогенность наблюдается у дикого диплоидного штамма ( ХБ800 ), наименьшая - у мутантного гаплоидного ( §160/2с1 ). Это свидетельствует о том, что, получив повреждение, мутантная клетка либо выживает, либо погибает. Клетки же диких штаммов, получив повреждение, с некоторой вероятностью могут погибнуть, но могут продолжать делиться, передавая в последующие поколения нелетальные повреждения, обусловливающие пониженную вероятность успешного деления.

Адаптивная реакция

Реакция адаптивного ответа проявляется в том, что предварительное воздействие на клетки повреждающего агента в малых дозах, практически не вызывающих повреждений, увеличивает их устойчивость к повторному воздействию этого же, а иногда и другого агента, в больших повреждающих дозах. Основные закономерности проявления адаптивного ответа при облучении исследованы на лимфоцитах человека, лимфоцитах кролика, клетках китайского хомячка линии У-79, клетках костного мозга и сперматоцитах мышей, дрожжах, а также на растительных объектах. Исследования механизма, обусловливающего развитие адаптивного ответа, показали, что в его основе лежит активация синтеза ферментов репарации ДНК 456.

До настоящего времени адаптивной реакции при длительном облучении на клетках дрожжей обнаружено не было. Для выяснения особенностей адаптивной реакции у дрожжевых клеток нами была проведена серия экспериментов по острому облучению популяции клеток предварительно подвергавшейся действию гамма-излучения на протяжении 16-25 часов. На рис.3 представлены кривые выживаемости популяции клеток дикого диплоидного штамма предварительно облученных в условиях роста при различных мощностях доз у-излучения.

Из рис.3 видно, что начиная с мощности дозы 1,6 Гр/ч длительного предварительного облучения возрастает устойчивость

"Газиев А.И. // Радиобиология, 1986 т.26, вып.4, с.447-452 5Уо1кеП М.Я. //Епу1гоп. Мо1. М^еп., 1988, У.11, № 2, р.241-255 '1дпс1аЫ Т. // Апп. Иеу. ВюсЬеш., 1988 У.57, р. 133-157

популяции к последующему острому облучению. Такое повышение устойчивости можно объяснить индукцией системы репарации. Так как все кривые выживаемости являются экспоненциальными, то повышение устойчивости популяции к острому облучению за счет увеличения доли клеток, находящихся в более резистентной стадии клеточного цикла объяснить не удается. В противном случае кривая не была бы экспоненциальной, а имела сложный вид (например двухкомпонентная кривая, в случае наличия в популяции части более резистентных клеток, возникших в результате предварительного облучения), и с увеличением мощности дозы изменялась бы не общая резистентность всех клеток (которая связана с наклоном кривой на графике), а доля резистентной части популяции. Повышение радиорезистентности невозможно объяснить за счет отбора облучением более резистентной части популяции или за счет возникновения мутантов по той же самой причине.

Адаптивная реакция обнаружена и на диком гаплоидном штамме. На рис.4 представлены кривые выживаемости дикого гаплоидного штамма после предварительного воздействия у-излучением на растущую популяцию при нескольких мощностях доз. Из рис.4 видно, что величина адаптивной реакции, также как и в случае с диким диплоидным штаммом, зависит от мощности дозы предварительного облучения. Изменение формы кривой выживаемости после адаптирующего облучения свидетельствует о повышении устойчивости клеток во всех стадиях клеточного цикла.

Адаптивной реакции не наблюдалось для мутантного но системе репарации диплоидного штамма XS1898 (совпадают кривые выживаемости контрольных и облученных клеток). Это прямое подтверждение того, что адаптивный ответ связан с активацией системы репарации, в которой участвует продукт гена RAD 52.

Не наблюдалось увеличения резистентности пи для одного из изученных штаммов к ультрафиолетовому излучению после длительного у-облучепия. В этом случае также не было различий н кривых выживаемости при облучении ультрафиолетовом светом контрольной и длительно облученной у-излучепием популяций.

Доза острого облучения, Гр

400 800 1200 1600 2000

2 Я

Рис. 3. Выживаемость клеток дрожжей 5. сегеглл'ае дикого диплоидного штамма Х5800 после последовательного действия адаптирующего (в течение суток) и тестирующего (острого) облучения при трех мощностях доз адаптирующего воздействия

Доза, Гр

200 300

X *

а ю-' а

..........$

К

1 - сутки 8 Гр/ч +

острое облучение

2 - сутки 3 Гр/ч +

острое облучение

К - только острое облучение

Рис. 4. Выживаемость клеток дрожжей 5. сегес15гае дикого гаплоидного штамма Б288с после последовательного действия адаптирующего (в течение суток) и тестирующего (острого) облучения при двух мощностях доз адаптирующего воздействия

о s

и я и s й

3 «

0.8 -

0,6

0,4

44

Ьг

rzt

Л-;...................5

.л.

--Я7Г-

0 50 100 150 200 250 300 350 Продолжительность адаптирующего облучения, мин

Рис. 5. Выживаемость клеток дрожжей cerevisiae дикого диплоидного штамма XS800 после последовательного действия адаптирующим и острым облучением на растущую популяцию при мощности дозы адаптирующего воздействия 8 Гр/ч и при 3-х дозах острого у-излучения : • - воздействие только адаптирующим излучением о - 210 Гр □ - 550 Гр Д - 890 Гр

Для изучения динамики повышения радиорезистентности при :роническом облучении нами были поставлены эксперименты по ледующей схеме: хроническое облучение растущей популяции клеток + ютрое. На рис.5 представлены результаты экспериментов по определению ¡ыживаемости в различные моменты времени после начала хронического |блучения при мощности дозы 8 Гр/ч при 3-х дозах острого облучения. !з рис.5 видно, что увеличение радиорезистентности происходит через 10-140 минут после начала облучения. Наши исследования показали, что ; период увеличения радиорезистентности не происходит ни замедления, [и задержки в размножении популяции клеток. Изменение длительности неточного цикла происходит сразу после начала облучения клеток, а, ледовательно, связано с повреждением массовых структур клеток. 1риведенные на рис.5 данные еще раз подтверждают, что адаптивный 1твет у дрожжевых клеток не связан с увеличением доли клеток в более >езистенгной стадии клеточного цикла, с отбором облучением более »езистентной части популяции, с мутациями, возникающими в ходе |блучения, а по-видимому, связан с индукцией системы репарации.

1.0

0.2 -

1,00 0,80

Я °.60 "

£ 0,40 -

О

| 0,20

К 0,10 -^ 0,08 ■

л

Ю 0,06

0,04

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Доза острого облучения, Гр

Рис. 6. Кривые выживаемости клеток дрожжей 8. сегеу1з1ае дикого диплоидного штамма Х5800 после культивирования популяции при разных схемах экспериментов:

• - суточное культивирование без облучения при комнатной температуре (-20°) + острое облучение,

О - суточное облучение при мощности дозы 18 Гр/ч при комнатной температуре (-20°) + острое облучение,

V - суточное облучение при мощности дозы 18 Гр/ч при комнатной температуре (-20°) + дальнейшее культивирование без облучения при температуре 30° в течение 18 часов + острое облучение

На рис.6 представлены кривые выживаемости клеток дикого диплоидного штамма, полученные в различные моменты времени после начала и завершения хронического облучения. Ряд подобных опытов, поставленных при различных условиях культивирования, показал, что адаптивная реакция исчезает через некоторое время при культивировании клеток после прекращения облучения. Данный факт позволяет предположить, что индукция репарации происходит вследствие повреждений, возникающих непосредственно в ходе облучения. Кривая выживаемости клеток, культивированных после прекращения облучения в течение суток, располагается ниже контрольной кривой. Данный факт отражает наличие нерепарируемых сублетальных повреждений в популяции клеток после хронического облучения.

Моделирование адаптивной реакции дрожжевых клеток

Для объяснения полученных результатов по изучению адаптивной реакции предложена следующая математическая модель. Модель основана на ряде предположений:

1. Повреждения возникают в ядре клетки вероятностным образом под действием облучения и элиминируются ферментами репарации. Динамика возникновения-элиминации повреждений в каждой клетке описывается уравнением:

ф Ь

л=ТГк1'с'р- (14)

где р - общее количество повреждений, рп - количество повреждений, возникших в данном клеточном цикле (репарабельных), Ь- мощность дозы, с - концентрация ферментов репарации, ^ - соответствующие

коэффициенты (параметры модели). Слагаемое ^^ описывает

возникновение повреждений под действием облучения пропорционально дозе. Слагаемое к1-с-р„ описывает восстановление от репарабельных повреждений по механизму фермент-субстратной химической реакции.

2. Увеличение количества повреждений в каждой клетке, возникших в течение данного клеточного цикла, приводит к увеличению концентрации репаративных ферментов. Динамика изменения концентрации репаративных ферментов описывается выражением:

— = къ-р„-к4-с + к5 , (15)

где рп - количество повреждений, возникших в течение данного клеточного цикла, с - концентрация ферментов репарации, ki - параметры модели. Слагаемое ку ■ р„ описывает индукцию синтеза дополнительных ферментов, индуктором при этом являются реиарабсльные (незакрепленные) повреждения. Слагаемое к4-с описывает инактивацию ферментов репарации с течением времени, а къ - конститутивный уровень синтеза этих ферментов.

3. Закрепление повреждений происходит при делении клетки, после чего повреждения становятся нерепарабельными.

4. Инактивация клетки происходит при делении в случае, если в клетке на этот момент присутствует более п повреждений (п > 1).

Модель прогнозирует увеличение поврежденности клеток до уровня, который зависит от мощности дозы у-излучения в течение нескольких десятков минут после начала облучения. Из модели также следует, что при последующем хроническом воздействии средняя поврежденность клеток с течением времени увеличивается медленно. Это означает, что в хронически облучаемой популяции быстро устанавливается динамическое равновесие между возникновением и репарацией повреждений. Очевидно, что степень поврежденности популяции, при которой устанавливается равновесие, зависит от мощности дозы, и с ее увеличением уровень "равновесной" поврежденности повышается. Одновременно с увеличением поврежденности клеток популяции (с некоторой задержкой) в них происходит повышение концентрации репаративных ферментов. Концентрация ферментов репарации повышается до определенного уровня, который также зависит от мощности дозы хронического облучения. Повышение концентрации репаративных ферментов обеспечивает большую емкость систем репарации, что проявляется при остром воздействии после хронического в виде адаптивной реакции.

После прекращения хронического облучения количество возникающих повреждений становиться равным нулю и, как следует из модели, концентрация репаративных ферментов падает до контрольного уровня. Однако поврежденность клеточной популяции остается близкой к "равновесной". Этим объясняется большая чувствительность к острому облучению популяции клеток размножавшейся сначала в условиях хронического облучения, а затем без облучения.

Таким образом, модель качественно описывает результаты, полученные в эксперименте.

ВЫВОДЫ

1. В широком диапазоне мощностей доз ионизирующего излучения от 10"7 до 3103 Гр/ч получены экспериментальные данные по динамике

роста-гибели дрожжевых клеток различного генотипа, подвергавшихся облучению в условиях, оптимальных для их размножения. При этом выявлены некоторые новые, ранее неизвестные закономерности: отсутствие зависимости скорости роста популяции от дозы и повышение резистентности клеток в ходе хронического облучения.

2. Показано, что с увеличением мощности дозы хронического облучения выше некоторой пороговой происходит замедление роста клеточной популяции вследствие как инактивации клеток, так и замедления продвижения клеток по циклу.

3. Предложена математическая модель, постулирующая отсутствие зависимости скорости деления клеток и радиорезистентности от дозы хронического облучения и описывающая экспериментальные данные но динамике роста клеточной популяции в условиях хронического облучения при различных мощностях доз ионизирующего излучения.

4. Модель позволяет определить величину пороговой мощности дозы, начиная с которой можно выявить замедление роста клеточной популяции, и оценить величину критической мощности дозы, при которой гибель популяции полностью компенсируется ее приростом. Прогнозирование этих мощностей доз может представить интерес в различных направлениях прикладной радиобиологии.

5. Адаптивная реакция, заключающаяся в повышении радиорезистентности хронически облучавшихся при малых мощностях доз дрожжевых клеток к последующему острому облучению, проявляется в растущей популяции дрожжевых клеток дикого типа. Величина адаптивной реакции, оцениваемая по изменению радиорезистентности (Do), возрастает при увеличении мощности дозы хронического облучения от 3 до 18 Гр/ч.

6. Адаптивная реакция не связана с увеличением доли клеток и более радиорезистентной стадии клеточного цикла, с отбором в результате облучения более резистентной части популяции, с возникающими в процессе облучения мутациями, а обусловлена индукцией системы репарации, в которой участвует продукт гена RAD 52.

7. Предложена математическая модель адаптивного ответа, которая качественно объясняет экспериментальные данные, прогнозирует у растущей в условиях хронического облучения популяции быстрое установление динамического равновесия между возникновением и элиминацией повреждений, а также увеличение в процессе облучения средней по популяции поврежденности клеток, степень которой зависит от мощности дозы.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Зюзиков H.A., Петин В.Г. Хроническое действие гамма-излучения на растущую популяцию дрожжей Saccharomyces cerevisiae при различных мощностях доз. Радиационная биология. Радиоэкология, т.36, вып.6, с.888-894, 1996.

2. Зюзиков H.A., Петин В.Г. Хроническое действие гамма-излучения на растущие клеточные популяции дрожжей Saccharomyces cerevisiae при различных мощностях доз. Тезисы докладов международного симпозиума "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии". Москва, Дубна, с.49 (149), ОИЯИ, Дубна, 1997.

3. Петин В.Г., Зюзиков H.A. Закономерности проявления адаптивной реакции у дрожжевых клеток. Тезисы докладов Третьего съезда по радиационным исследованиям. Т.1, с.161-162, Пущино, 1997.

4. Зюзиков H.A. Модель адаптивного ответа дрожжевых клеток при длительном воздействии гамма-излучением. Тезисы докладов Третьего съезда по радиационным исследованиям. Т.1, с. 150, Пущино, 1997.

5. Зюзиков H.A., Петин В.Г. Особенности действия хронического гамма-излучения на растущие популяции клеток при различных мощностях доз. Труды международного симпозиума "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии". ОИЯИ, Д19-97-284. Т.2. с.133-144. Дубна,1997.

6. Зюзиков H.A. Адаптивный ответ дрожжевых клеток на хроническое гамма-облучение при сублетальных мощностях доз. Труды конференции Первая открытая научная конференция молодых ученых и специалистов ОИЯИ. ОИЯИ, Д-97-376. с. 183-186. Дубна, 1997.

Рукопись поступила в издательский отдел 3 апреля 1998 года.