Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

РЕАКЦИЯ НОВЫХ СОРТОВ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО НА ИНОКУЛЯЦИЮ КЛУБЕНЬКОВЬМИ БАКТЕРИЯМИ В УСЛОВИЯХ СЕВЕРО-ВОСТОЧНОГО РЕГИОНА ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "РЕАКЦИЯ НОВЫХ СОРТОВ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО НА ИНОКУЛЯЦИЮ КЛУБЕНЬКОВЬМИ БАКТЕРИЯМИ В УСЛОВИЯХ СЕВЕРО-ВОСТОЧНОГО РЕГИОНА ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ"



УСТЮЖАНИН Игорь Александрович

На правах рукописи

РЕАКЦИЯ НОВЫХ СОРТОВ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО НА ИНОКУЛЯЦИЮ КЛУБЕНЬКОВЫМИ БАКТЕРИЯМИ В УСЛОВИЯХ СЕВЕРО-ВОСТОЧНОГО РЕГИОНА ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ

Специальность 06.01.05 - "Селекция и семеноводство"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Немчиновка, Московская область - 2003 г.

Работа выполнена в лабораторий селекции и первичного семеноводства многолетних трав Государственного учреждения Зональный научно-исследовательский институт сельского хозяйства Северо-Востока им. , Н.В. Рудницкого

Научный руководитель - кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник М.И. Тумасова

Научный консультант- доктор биологических наук, профессор Е.М. Панкратова

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Г.А. Дебелый кандидат сельскохозяйственных наук Г.В. Степанова

Ведущая организация -! титут бно™

НЦ УрО РАН

Защита диссертачг" на заседании диссерг . в' ных районов Нечернс новка-], Московская т. лп г

г. в 15 ч. 00 мин. НИИСХ Централь* Л Россия, п/о Немчи-'■"ГЦРНЗ

С днссертаи мг тральных районов,; р-

"Ж'З НИИСХ Цен-

■■'ЧЧ

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат экономических наук

іИерзлнкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Клевер луговой (Trifolium pratense L.) являете* одной из наиболее распространённых кормовых бобовых культур в Нечернозёмной зоне РФ. По потенциальной азотфиксирующен способности он занимает одно из первых мест в группе многолетних бобовых трав. Усвоение им молекулярного азота может варьировать от 20 до 300 кг/га в зависимости от почвенной кислотности, условий возделывания и сорта (Посы-панов с соавт., 1986),

Основной гарант надежных урожаев в условиях Северо-Востока Нечернозёмной зоны РФ - устойчивость самих культивируемых сортов. Особый интерес представляет создание сортов, способных при pH ниже 4,2 не только обеспечить сравнительно высокую урожайность, но и фиксировать до 120-200 кг/ra азота (Жученко, 1995). Поэтому селекция клевера лугового и создание сортов способных максимально использовать потенциал симбиотрофни имеет теоретическое и практическое значение. Актуальность данной проблемы возрастает в связи с новой парадигмой, возникшей в сельском хозяйстве Российской Федерации, связанной с резким снижением производства азотных удобрений. Этим вызвано расширение бобового клина в Нечернозёмной зоне РФ, что обусловило необходимость создания сортов с гарантированным созреванием семян и активной азотфикса-цией.

До 80-х годов XX века в Кировской области было только два районированных селекционных сорта клевера лугового Кировский 159 и Фа-лён ский 1. Благодаря работе селекционеров отдела многолетних трав НИИСХ Северо-Востока с 1993 по 2002 год районированы новые сорта клевера лугового, сочетающие такие ценные признаки, как скороспелость, зимостойкость и высокая урожайность семян. За счёт их внедрения доля клевера лугового в структуре трав в Кировской области увеличилась с 28 % (1986-1990 гг.) до 55 % (1996-2000 гг.). Однако реальные размеры азот-фиксации новых сортов и возможности повышения их способности К СИМ* биотрофному типу питания не изучены. Не ясной остаётся отзывчивость этих сортов на инокуляцию, которая является одним из важных приёмов повышения доли "биологического" азота в урожае бобовых. Приём требует научного обоснования при районировании новых сортов клевера и при рекомендации использования эффективных штаммов клубеньковых бактерий. Его эффективность зависит от условий конкретной зоны н, по-видимому, сорта, что требует изучения.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлось изучение симбиотрофни и отзывчивости на инокуляцию различными штаммами клубеньковых бактерий новых районированных на Северо-Востоке Нечеридзймной зоиы.РФ «ортов ил «ура лугового.

цгщ mvm

В задачи исследований входило:

- изучить способность к симбиотрофии районированных в нечернозёмной зоне сортов клевера лугового Трио, Дымковский, Кудесник, Крету-новский, Кировский 159 (стандарт) на фоне местной популяции клубеньковых бактерий;

- исследовать влияние инокуляции перспективными штаммами Rhizobtum leguminosarum bv trifolii: КС- 7, КС- 18 (кислотоустойчивые), КР-2 (для слабокислых н нейтральных почв) - селекции ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса, промышленным 348а - селекции ВНИИСХМ и местными нзолятамн из кислого местообитания в различных по кислотности условиях;

- выявить эффективные сочетания сортов клевера лугового и штаммов клубеньковых бактерий по хозяйственно-ценным признакам с целью использования их в селекции клевера лугового на повышение симбиотрофии;

- выявить тестерные штаммы R. bv trifolii для оценки и создания селекционного материала с повышенной симбиотрофией;

- сравнить диплоидные и тетрашгаидные сорта клевера лугового различной скороспелости по активности » эффективности формирующихся симбиотических систем;

- изучить внутрисортовую гетерогенность по эффективности симбиоза на ранних стадиях онтогенеза у выделившихся сортов, провести отбор растений, характеризующихся высоким уровнем симбиотрофии и продуктивности;

- определить вклад новых сортов клевера лугового в накопление органического вещества и азота в почве.

Научная вовизна исследований. Впервые в условиях Северо-Востока Нечернозёмной зоны РФ:

- проведён скрининг новых сортов клевера лугового, выведенных в Зональном Научно-исследовательском институте сельского хозяйства Се-веро-Воетока им. Н.В. Рудницкого, по интенсивности и эффективности симбиоза на фоне местной популяции клубеньковых бактерий и при инокуляции штаммами клубеньковых бактерий, полученными из ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса и ВНИИСХ микробиологии;

- выделены "местные" штаммы клубеньковых бактерий из клубеньков растений клевера лугового, выращенного на кислой почве и показана их кислою- и алюмоустойчнвость. Проведён селективный отбор и исследовано влияние местных изолято8 на симбиотрофию сортов клевера лугового;

- доказана внутрисортовая гетерогенность популяции сорта клевера лугового Кудесник (на фоне штамма КР 2) по показателям симбиотрофии и проведён селективный отбрр, найдены критерии на основе которых

можно вести отбор в процессе селекции клевера на повышенную азотфик-сацию;

- рассчитан вклад новых сортов клевера лугового в накопление органического вещества и азота в почве.

Практическая значимость работы. Проведена оценка сортов по способности к симбиотрофии и показана возможность её повышения за счёт инокуляции. Выявлены сорто-ризобиальные комплексы, отличающиеся высокой продуктивностью и способностью к симбиотрофии в уело-виях кислой и известкованной почвы. Доказана высокая гетерогенность популяции нового сорта клевера лугового Кудесник (на фоне штамма КР 2) по показателям активности и эффективности симбиоза. Показана возможность получения растительно-микробных систем, у которых способность к симбиотрофному типу питания сохраняется в условиях эдафи-ческого стресса, обусловленного ионами Н* и А13+.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научных конференциях Вятской государственной сельскохозяйственной академии (2001, 2002); VIII молодёжной научной конференции "Актуальные проблемы биологии и экологии", г. Сыктывкар (200!); на заседаниях методической комиссии Северо-Восточного селекционного центра (20012003); на заседании кафедры ботаники, физиологии растений и микробиологии Вятской государственной сельскохозяйственной академии (2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав, выводов, предложений для селекционной практики, включает 36 таблиц, 24 рисунка и 16 приложений. Список использованной литературы включает 202 наименования, в том числе 49 на иностранных языках.

Выражаю искреннюю благодарность за неоценимые научные консультации по вопросам симбиотической азотфиксации доктору биологических наук, профессору, Заслуженному деятелю науки Панкратовой Е.М.

УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Диссертационная работа выполнена в лаборатории селекции и первичного семеноводства многолетних трав НИИСХ Северо-Востока в 20002003 гг. по заданиям 20.01.02 и 03.01.01 (№ госрегистрации 01.200.203898 и 01.200.203899).

В годы исследований складывались контрастные метеорологические условия вегетационных периодов; в 2000 и 2001 гг. отмечен дефицит влаги

с середины июня по июль при температуре близкой к норме, вегетационный период 2002 г. был прохладным и дождливым.

Экспериментальным материалом служили новые районированные сорта клевера лугового Трио, Дымковский, Кудесник, Кретуновский, различающиеся по продолжительности вегетационного периода и плондности (учреждения-оригинаторы НИИСХ Северо-Востока, Фаленская селекционная станция и ВНИИ кормов) и ранее районированный позднеспелый диплоидный стандартный сорт Кировский 159.

С целью скрининга сортов по способности к симбиотрофии и отзывчивости на инокуляцию производственным штаммом клубеньковых бактерий 348а в оптимальных для функционирования симбиоза условиях был заложен вегетационный опыт. Опыт закладывали по методике Г.С. По-сыпанова (1991) в сосудах Митчерлкха на б кг почвы. Почва дерново-подзолистая со следующими агрохимическими показателями: рН,»* 4,75: Р;Оз - 65,б мг/кг, КгО - 46,4 мг/кг, Нг - 3,65 мг.-эквЛ 00 г почвы. Перед закладкой опыта в почву вносили фосфорно-халийные удобрения и известь (по 1/2 Нг). В сосуде выращивали по 10 растений.

Полевой опыт проводили с целью определения способности сортов к симбиотрофии и отзывчивости их на инокуляцию различными штаммами клубеньковых бактерий, выявления перспективных сорто-ризобиальных комплексов и тестерных штаммов клубеньковых бактерий. Штаммы клубеньковых бактерии: производственный 348а (селекции ВНИИСХМ) и перспективные КС 7, КС 18 - кислотоустойчивые и КР 2 - для слабокислых и нейтральных почв (селекции ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса), Опыт закладывали на двух фонах (кислая почва и произвесткованная - по 1/3 Нг). Исходная агрохимическая характеристика почвы участка: рН«,, 4,2; содержание Р205 152 мг/кг, К20 81 мг/кг; А13+ 1,87 мг/100 г почвы; Нг 4,11 мг-экв./100 г почвы (первый фон -кислая почва). Произвесткованный участок: рНсю 5,47; содержание Р205 186 мг/кг, К20 81 мг/кг; А!^ 0,68 мг/100 г почвы (второй фон - известкованная почва). Удобрения перед закладкой опытов и в годы проведения исследований не вносили.

Для определения количества фиксированного азота методом сравнения с небобовой культурой и изоляции блоков с различными штаммами клубеньковых бактерий в схему опыта введена тимофеевка луговая. Инокуляцию семян проводили в день посева бактериальной культурой (титр не менее 107 клУмл.). Контроль - вариант без инокуляции. Площадь делянкн 3 м2, повторность опыта четырёхкратная,. Посев сплошной рядовой, летний, беспокровный.

Для получения природных изолятов клубеньковых бактерий закладывали вегетационный опыт. Местные штаммы были выделены из клубеньков растений клевера лугового сортов Трио, Дымковский, Кировский 159 и Кудесник. Последние вырашивали на сильнокислой почве с высоким содержанием подвижных ионов алюминия (рНдм 3,8; А13+ 17,8 мг/100 г

почвы) и произвесткованной (по 1/3 Нг); в фазу кущения выделяли ризобий по методике Криг (1983),

Скрининг выделенных штаммов на кислото- и алюмоу стойчивость проводили на селективных средах (Ayanaba et al., 1983) с добавлением ионов ]гГ й A1J+ (рНсщ, 4,5; А13+ 1,5 мМ/л) в лабораторном опыте.

Оценку эффективности выделившихся кислото- и алюмоустойчивых природных изолятов проводили в серии микровегетационных ОПЫТОВ на сортах клевера лугового Трио и Кудесник в нейтральной (рН^ 7) и кислой среде (рНмя 4,8; 4,0), в присутствии и отсутствии ионов алюминия, в стеклянных пробирках на вермикулите (методика ВННИСХ микробиологии, 1990). Нужные значения рН№1 устанавливали добавлением 0,1н растворов HjSCU и NaOH. Алюминий вводили в форме сульфата в концентрации 1,5 мМ/л.

Внутрипопуляционную изменчивость сорта клевера лугового Кудесник ло показателям симбиотрофии оценивали на фоне штамма КР 2 в микровегета ционном и вегетационном опытах. Микровегетацнонный опыт - в пробирках на вермикулите. Вегетационный опыт - в ящике (1,7x3 м, толщина почвенного слоя 25 см) с дерново-подзолистой легкосуглинистой почвой: рНси 6,40; содержание Р3О5 129 мг/кг, К20 66 мг/кг. Семена проращивали в течение суток и высаживали в почву. На каждое семя вносили по 1 мл бактериальной суспензии (титр не менее 107 кл/мл). Растения выращивали в течение 55 суток.

Повторность опытов 100- кратная.

Учёты и наблюдения в опытах: фенологические наблюдения, учёты густоты стояния, зимостойкости, определение высоты растений, облист-венносги, урожая зелёной массы и сухого вещества, нщрогеназной активности по укосам проводили согласно Методическим указаниям по селекции клевера лугового (Москва, 1996). Коэффициент симбиотической азот-фиксации - методом сравнения с небобовой культурой и расчёт накопления органического вещества и азота по Трепачёву Е.П. (1999). Общий азот в пожнивно-корневых остатках и надземной части растений определяли в фазу бутонизации - начала цветения методом Къельлаля. Агрохимические анализы почвы и растительных образцов проведены в аналитической лаборатории ННИСХ Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого по следующим методикам: кислотность почвы (pHCOIt) - потеяциометрически; гидролитическая кислотность по Каппену; подвижный алюминий по Соколову; подвижные формы фосфора и калия в вытяжке 0,2н НС1 (по Кирсанову).

Математическую обработку данных проводили по Б.А. Доспехову (1972, 1985) и на IBM PC с использованием программ для статистического анализа: AGROS v. 2.07; STATGRAPHJCS for Windows v. 2.1 и 3.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Способность сортов клевера лугового к симбиотрофнн на фоне естественного заражения клубеньковыми бактериями

Нитрогеназная активность

Показатель нитрогеназной активности является характеристикой скорости восстановления молекулярного азота и используется при сравнительном анализе генетического материала (сорта растений, штаммы бактерий).

Скрининг сортов клевера лугового на фоне естественного заражения по уровню нитрогеназной активности в условиях вегетационного опыта показал, что новые сорта значительно превосходят стандартный сорт Кировский 159 (табл. I).

Таблица 1 - Показатели снмбиотрофин сортов клевера лугового на фоне естественного заражения (вегетационный опыт)_

Сорт Нитрогеназная активность, мкМ С2Н./г корней-час Биомасса растений, г/сосуд Накопление азота биомассой, г/сосуд

Трио, 2п 4.72±0.29 46,7 1,02

Кудесник, 4п 8.59±0.24 52,5 1,33

Кретуновский, 2п 1.11±0.18 40,6 0,85

Дымковский, 2п ].16±0.23 56,4 1,36

Кировский 159,2п 0.53 ±0.04 42,1 М2

НСР05 - 4,2 0,18

В зависимости от сорта уровень нитрогеназной активности формирующейся симбиотической системы в фазу начала цветения варьировал от 0,53 у сорта Кировский 159 до 8,59 мкМ С2Н4/1 г корней-час у сорта Кудесник. Максимальные показатели отмечены у раннеспелого тетраплоид-ного сорта Кудесник. Из диплоидных сортов выделялся раннеспелый сорт Трио (4,72 мкМ СгН|/1 г корней-час). Уступая тетраплоидному сорту, он достоверно превосходил раннеспелый Кретуновский и среднеранний Дымковский.

В условиях полевого опыта как на известкованном, так и на кислом фоне интенсивность азотфиксацни существенно зависела от метеорологических условий и, в первую очередь, от условий увлажнения, складывающихся к моменту её определения (фаза начала цветения). Потенциальные возможности сортов наиболее полно проявились при благоприятных условиях увлажнения, сложившихся в первом укосе второго года пользования на известкованном фоне (табл. 2). Максимальный показатель нитрогеназ-

ной активности так же отмечен у симбиотических систем раннеспелого тетраплоидного сорта Кудесник - 9,21 мкМ С;Н|/1 г корней-час и диплоидного Трио - 6,31 мкМ С2Н4/1 г корней-час, существенно превосходящих среднеспелый сорт Дымковский и позднеспелый стандарт Кировский 159.

Таблица 2 - Показатели симбиотрофии сортов клевера лугового на фоне естественного зпаражения (полевой опыт, 2000-2002 гг.; известкованная почва)____

Нитрогеназная Продуктивность Накопление

активность, (сухое вещество) азота биомас-

Сорт мкМ С1Н1/Г кор- в сумме за два сой в сумме за

ней-час укоса, два укоса,

1 УКОС 1 укос кг/м2 г/м2

1 год пользования

Трио, 2п ■ 0,98 4,63 1,15 39,8

Дымковский, 2п 0,98 5,49 1,10 33,0

Кировский 159,2п 1,43 4,29 1,22 38,9

Кудесник, 4п 1,80 7,14 1,17 40.8

НСР05 0,15 0,45 0,04 2,1

2 год пользования

Трио, 2а 6,31 4,92 0,44 18,8

Дымковский, 2п 5,73 - 0,46 16,7

Кировский 159,2п 4,58 - 0,47 15,5

Кудесник, 4п 9,21 7,95 0,70 22,7

НСР05 0,5] 0,48 0,03 3,3

Продуктивность (сухое вещество) и накопление азота

Наибольшей продуктивностью (сухое вещество) в вегетационном опыте отличались сорта Дымковский и Кудесник (56,4 и 52,5 г/сосуд, соответственно), существенно превосходящие остальные (табл. 1). Эти же сорта имели максимальные показатели накопления азота. Сорт Кировский 159, отличавшийся самым низким уровнем нитрогеназной активности, не уступал по накоплению азота раннеспелому сорту Трио. Это объясняется тем, что позднеспелые и среднеспелые сорта обладают большей продолжительностью функционирования симбиотического аппарата и даже при сравнительно невысоком уровне нитрогеназной активности имеют хорошую урожайность с высоким содержанием азота. Менее продуктивным оказался сорт Кретуновский при показателях 40,6 г/сосуд (сухое вещество) и 0,85 г/сосуд (накопление азота), поэтому он не был включён в дальнейшее изучение.

Наиболее объективные данные по продуктивности и накоплению азота сортами получены в палевом опыте (табл. 2). Продуктивность (сухое вещество) всех сортов была выше в первый год пользования (1,10-1,22

кг/м3) и снижалась во второй (0,44-0,70 кг/м3). Снижение продуктивности было вызвано поражением растений склеротиниозом и более низкой зимостойкостью сортов ко второму году пользования. Наиболее стабильными показателями продуктивности (0,70; 1,17 кг/м2) и максимальными - накопления азота (22,7; 40,8 г/м1) по годам пользования отличался тетраплонд-ный сорт Кудесник, показавший достоверные преимущества перед диплоидными сортами.

Таким образом, выявлена дифференциация сортов по показателям симбиспрофии на фоне естественного заражения. Раннеспелый тетрапло-идный сорт Кудесник в симбиозе с аборигенными штаммами клубеньковых бактерий обладал максимальным уровнем нитрогеназной активности, продуктивности и накопления азота.

Коэффициент симбиотической азотфиксашш на фоне аборигенных штаммов клубеньковых бактерий, в среднем за два года пользования, в зависимости от сорта изменялся незначительно и составлял 76,1-80,8 %.

2. Реакция сортов клевера лугового на инокуляцию различными штаммами клубеньковых бактерий в контрастных почвенно-клнмагических условиях

На эффективность инокуляции существенное влияние оказывают метеорологические и почвенные условия, сорт макросимбионта и штамм микросимбионта, а так же совместимость генотипов последних.

Изучение сортовой отзывчивости на инокуляцию производственным штаммом 348а в вегетационном опыте показало, что в благоприятных для азотфиксации условиях наиболее отзывчивыми оказались сорта Трио, Дымковский и Кудесник. Сорта Кировский 159 и Кретуновский уступали вышеназванным сортам по всем показателям.

Как уже отмечалось выше, потенциальные возможности формирующихся симбиотических систем в полевом опыте наиболее полно проявились в сравнительно благоприятных для протекания симбиотической азот-фиксации условиях первого укоса второго года пользования (2002 г.). Сортовая специфичность клевера лугового в отношении штаммов Я. ¿V !п/оШ так же более чётко проявилась в этих условиях.

2.1. Известкованная почва (рН(ел 5,47)

Нитрогеназная активность

Наиболее отзывчивыми на инокуляцию оказались раннеспелые сорта. Диплоидный сорт Трио и тетраплоидный Кудесник в симбиозе с тремя штаммами (348а, КС 7, КР 2) из четырёх изучавшихся дали достоверные прибавки (10,7-25,4 %) к контрольному варианту (табл, 3). Наибольшей активностью из изучаемых штаммов отличался производственный 348а. Вы-

и

сокая эффективность отмечена на трёх сортах (Трио, Кировский 159, Кудесник) из четырёх изучавшихся.

Таблица 3 - Влияние инокуляции на сим биотическую активность (нитро-геназная активность) сортов клевера лугового (2002 г., 2 т.п., 1 укос; известкованная почва)__

Сорт Контроль (без инокуляции), мкМ С2Н4/Г корней-час ± к контролю (%) от инокуляции штаммами

348а КС 7 КС 18 КР2

Трио, 2п 6,31 13Д* 14,9* 3.0 12,5*

Дымковский, 2п 5,73 6,3 3,0 12,6* -13,6

Кировский 159,2п 4,58 18,3* 9,2 212* -7,9

Кудесник, 4п 9,21 25,4* 10,7* 2,6 11,1*

* - прибавки достоверны при Р<0.05

Продуктивность (сухое вещество) и накопление азота

Повышение уровня нитрогеиазноб активности не всегда сопровождалось увеличением продуктивности. Поэтому для оценки отзывчивости сортов на инокуляцию и их способности к симбиотрофил использовали комплекс показателей.

Наиболее чётко действие инокуляции на продуктивность (сухое вещество) и накопление азота сортами клевера лугового проявилось в 2002 г. на травостое второго года пользования. В первый год пользования только четыре сорто-ризобнальных комплекса имели достоверно большую (на 6,424,8 %) продуктивность по сравнению с контролем, а во второй - 11 {прибавка 10,0-34,8 %). Аналогичные данные были получены по накоплению, как общего, так и биологического азота.

Коэффициент симбиотической азотфиксацин при инокуляции достигал 84-86 %, Наиболее отзывчивыми на инокуляцию по продуктивности (сухое вещество) и накоплению азота оказались два сорта клевера лугового: тетраплоидньш раннеспелый Кудесник и диплоидный среднеранний Дымковский, формировавшие высокоэффективный симбиоз с тремя штаммами из четырёх изучавшихся.

Наибольшую ценность имеет выявление таких сочетаний сортов и штаммов клубеньковых бактерий, которые способны сохранять высокую продуктивность и давать прибавки к фону естественной инокуляции в контрастных метеорологических условиях. Это свойство является важным в организации селекционной работы на повышение способности клевера лугового к симбиотрофному типу питания.

По результатам изучения 16 сорто-рнзобиальных систем на произвесткованной почве по комплексу показателей (нитрогенаэная активность, продуктивность и накопление азота) можно выделить пять, отличающихся

наибольшей стабильностью показателей (табл. 4). Подбор комплементарных пар сортов и штаммов позволяет повысить продуктивность сухого вещества на 9,0-28,3 %, накопление азота - на 7,6-31,8 %, ннтрогеиазную активность - на 2,6-12,6 %, коэффициент симбиотической азотфиксации - на 1,3-5,4 %. Наиболее перспективным из них был комплекс Кудесник х КР. 2, превышавший контроль по продуктивности на 28,3 %, накоплению азота -на 31,8 %, нитрогеназной активности - на 26,0 %, коэффициенту симбиотической азотфиксации - на 5,4 %.

Таблица 4 - Характеристика выделившихся сорто-ризобиальных комплексов (полевой опыт, 2001-2002 гг.)____

Сочетание сортх штамм Ни троге« азная активность (второй год пользования) Продуктивность (сухое вещество) Накопление азота в урожае Коэффициент симбиотической азсггфвксагага (среднее за 2 года)

в сумме за цикл

мкМ СгШт кор-нейчас контролю W %к контролю г/м2 % к контролю % прибавка к контролю

Кудесник X КР2 1(Ш 111,1 2,40 128,3 53,8 131,8 86,1 5,4

Кудесник X КС 18 9,45 102,6 2,13 113,9 49,7 121,7 83 Д 23

Кяровскнй 159х КР 2 4,22 92,1 1,86 110,1 40,2 111,2 82,1 1,3

Дымковски S хКС 18 6,45 112,6 1,74 111,5 38,3 108,8 84,1 3,4

Дымковский х 348а 6,09 106,3 1,70 109,0 37,9 107,6 82,4 V

НСРо? 0І1 - 0,08 - 2.Ó - м -

На основании полученных данных можно заключить, что местные расы клубеньковых бактерий обеспечивали высокую эффективность сим-биотического взаимодействия. Это позволяет проводить оценку коллекционных образцов клевера лугового на способность к симбиотрофин на фоне естественной инокуляции. Однако, дальнейшую селекционную работу с выделившимися образцами необходимо вести на фоне высокоэффективных штаммов клубеньковых бактерий КС 18 и КР 2, с целью выявления конкретных симбиотических систем и использования их в параллельной селекции макро- и микросимбионта.

2.2. Кислая почва (рН 4Д)

В связи с тем, что Северо-Восточный регион Нечернозёмной зоны

России характеризуется наличием большого количества кислых почв, важное значение имеет изучение симбиотрофии сортов и влияния на неё инокуляции в условиях естественно кислой почвы.

Результаты дисперсионного анализа и расчёт вклада факторов в варьирование основных параметров продуктивности и нитрогеназной активности показали, что сорта Трио, Дымковский, Кировский 159 и Кудесник являются хорошо приспособленными к низким значениям рН (рис. 1).

а б

Рис. 1. Вклады генотипов партнёров и кислотности почвы в эффективность и активность симбиоза (Р<0,05):

а - продуктивность растений (сухое вещество); б - китрогеназная активность, Условные обозначения: А - фон {кислотность почвы); В - сорт клевера лугового; С - пгтамм клубеньковых бактерий; ВС - взаимодействие генотипов партнёров.

> Основной вклад в изменение продуктивности и азотфиксации вносит сорт макросимбионта, вклад генотипа которого оценивается в 5838; 65,5 %, в зависимости от анализируемого показателя. Кислотность почвы оказала существенное влияние на нитрогеназную активность (15,65 %) и недостоверно влияла на продуктивность изучаемых сорто-ризобиальных систем. На кислой почве эффективность различных штаммов зависит не только от их устойчивости к кислотному стрессу, но и от совместимости с партнёром симбиоза - вклад взаимодействия генотипов составляет 7,08; 13,85%.

Наибольшей активностью в условиях кислой почвы отличался кислотоустойчивый штамм КС 7. При инокуляции всех сортов этим штаммом снижение нитрогеназной активности формирующихся симбиотиче-ских систем не превышало 30 % в сравнении с известкованным фоном.

Анализ данных ло показателям активности и эффективности симбиоза позволил выявить четыре сорто-ризобиалышх комплекса, имеющие достоверные прибавки к контролю и существенно не снижавших уровень симбйотрофии по сравнению с известкованным фоном (табл. 5).

Таблица 5 - Характеристика сорто-ризобиальных комплексов, выделившихся по показателям симбиотрофшш в условиях кислой почвы (полевой опыт, 2001-2002 гг.) __

Сочетание сортх штамм Нетрогеназная активность Продуктивность (сухое вещество) Накопление азота в урожае

в сумме за цикл

мкМ СгШг кор-ней-час %к ЇОН- тролю КУ, % кг/м* %к контролю КУ, % г/м1 %к контролю КУ, %

Кудесник х КР2 8.16 112,6 79,8 2Л6 121,4 93,6 50,6 121,6 94,1

Кудесник і 348а гм 1)6,4 73,1 2,03 108,8 115,9 47,5 115,0 119,0

Кудесник * КС 7 8,01 110,5 78,5 1,88 101,0 95,9 46,9 П2,7 101,6

Дымковский хКС7 4,62 1213 783 1,69 107,8 103,5 37,6 114,6 111,8

НСРк 0,04 - - 0,06 - - 3,1 - -

Таким образом, инокуляция сортов клевера лугового в условиях кислой почвы (рН«,, 4,2) способствовала повышению их продуктивности (до 21,4 %) и накопления азота (до 21,6 %) по сравнению с контролем, при этом еб эффективность зависела не только от устойчивости микроснмби-онта к низким значениям рН, но и от совместимости партнёров симбиоза. Максимальными показателями снмбиотрофии на кислом фоне отличался комплекс Кудесник х КР 2, имевший преимущества и в условиях известкованной почвы.

Между нитрогенаэной активностью и показателями размера симбио-тического аппарата (общее количество и количество активных клубеньков), выявлена тесная корреляционная связь (г = 0,83-0,93). Это позволяет использовать показатели клубенькоообразования при визуальной оценке активности симбиотического взаимодействия.

2,3, Вклад сортов клевера лугового в накопление органического вещества и азота в почве

Дня более полной характеристики изучаемых сортов по способности к скмбнотрофии и отзывчивости на инокуляцию произведён расчёт накопления ими в почве органического вещества и биологического азота.

В результате было установлено, что накопление органического вещества и биологического азота увеличивается при инокуляции испытуемыми штаммами и изменяется в зависимости от сорта и кислотности. Так, в условиях известкованной почвы (рНмл 5,47) накопление азота в контрольном варианте увеличивалось от 44,7 кг/га у позднеспелого сорта Кировский 159 до 67,8 кг/га у тетраллоидного сорта Кудесник. Инокуляция всеми штаммами оказывала положительное влияние на накопление азота сортами Трио и Кудесник, повышая его до 110,32 кг/га (Трио х 348а) и 170,49 кг/га {Кудесник х КР 2). На сортах Дымковский и Кировский 159 были эффективны только перспективные штаммы КС 7, КС 18 и КР 2.

На кислой почве (рН«™ 4,2) накопление азота в пожнивно-корнсвых остатках сортов клевера на фоне естественной инокуляции составляло от 34,5 (Кировский 159) до 61,2 кг/га (Кудесник), а при инокуляции повышалась от 34,9 (Кировский 159 х КС 7) до 147,9 кг/га (Кудесник х КР 2). Инокуляция всеми штаммами клубеньковых бактерий повышала накопление азота у сортов Трио, Дымковский и Кудесник на 19,6-150,7 %. На сорте Кировский 159 был эффективен только штамм КС 18.

Аналогичное влияние инокуляция оказывала на накопление органического вещества сортами клевера лугового, повышая данный показатель в большинстве изучаемых вариантов в сравнении с контролем на 5,6-75,4 % - на кислом фоне и на 30,1-53,06 % - на известкованном.

3. Эффективность природных нзолятов Я ¿V гп/оШ, выделенных из клубеньков растений выращенных яа кислой почве

Результаты полевых опытов позволили предположить, что в кислых почвах имеются эффективные штаммы клубеньковых бактерий. Их использование позволит создавать симбиоткческие системы, сохраняющие способность к симбиотрофин и продуктивность в условиях низких значений рН (Дробышева с соавт., 2001).

Нами выделено 40 природных нзолятов из клубеньков растений четырёх сортов клевера лугового, выращенных на сильнокислой почве (рН™ 3,8) с высоким содержанием А13+ (18,3 мг/100 г почвы). В результате их скрининга на кислого- и алюмоустойчивость был отобран алюмоустойчи-вый изолят 9-4А и изучена его эффективность на сортах Трио и Кудесник при различных уровнях кислотности среды: рН^ 7; 4,8; 4,0. При умеренной стрессовой нагрузке (рН™, 4,8) и в нейтральной среде (рН«,,, 7) природный изолят 9-4А не уступал по эффективности производственному штамму 348а на сорте Трио. Токсическое действие ионов водорода и алюминия на симбиотические системы с участием сорта Кудесник проявлялось уже при рН 4,8. Поэтому дальнейшее изучение изолята 9-4А проводили на сорте Трио.

Реакция макросимбнонта (сорт Трио) на повышение кислотности до рН«,л 4,0 выразилась достоверным снижением длины корня, отмечена тенденция к снижению высоты и массы растений (табл. 6). Под действием кислотности произошло снижение нодулирующей активности изучавшихся штаммов клубеньковых бактерий. Общее количество клубеньков у растений, инокулированных штаммом 348а, снизилось на 20 %, а у растений, тюкулированных штаммом 9-4А, - на 33 % по сравнению с соответствующими вариантами инокуляции при нейтральной реакции среды (рНсои 7,0). Под влиянием кислотности существенно (на 40-50 % к контролю) сократилось количество активных клубеньков (рис. 2).

Рис. 2. Влияние кислотности и штамма клубеньковых бактерий на общее количество и количество активных клубеньков сорта Трио

Эти результаты согласуются с данными других исследований по влиянию кислотности среды на хемотаксис клубеньковых бактерий (Кур-диш с соавт., 2001) и их адсорбцию к корням растений (Игнатов с соавт, 2000).

Сочетание повышенной кислотности среды с токсическим действием ионов алюминия усилило снижение нодулируюшей способности штамма 348а: обшее количество клубеньков снизилось на 40 %, активных - на 51 %. Масса инокулированных им растений лрй этом сократилась на 15,5 %. В этих же условиях у растений, инокулированных штаммом 9-4А,

существенных изменений величины биометрических показателей не выявлено (табл. 6). Таким образом, штамм 9-4А, представляющий собой природный изолят из кислой дерново-подзолистой почвы и прошедший предварительную лабораторную оценку на устойчивость к токсичности алюминия, оказался не менее эффективным микросимбионтом клевера лугового Трио, чем производственный штамм-стандарт 348а в нейтральных и кислых условиях среды и превосходил его по массе растений (на 13,$ %), по количеству активных клубеньков (на 181 %) в условиях алюминиевого стресса.

Таблица б — Биометрические показатели растений клевера лугового сорта Трио при инокуляции клубеньковыми бактериями в зависимости от кислотных условий среды___

Штамм Вариант кислотности Высота растений Длина корня Масса растений

см % к контролю см % к контролю мг % к контролю

348а рНсад 7 (контроль) 7,71± ОД? 100,0 6,23± 0,45 100,0 6,30+ 0,27 100,0

рН«,4,0 7ДЗ± 0,27 93,8 5,54 ± 0,45 88,9 5,88± 0,27 93,3

РН», 4,0+АГ 6,661 0,27 86,4 6,18± 0,45 99,2 5,504 0.27 87,3

9-4А рНсол 7 (контроль) 7,43± 0,27 100,0 7,24± 0,45 100,0 6^6± 0,27 100,0

рНяи4,0 7,35± 0Л7 98,9 5,95± 0.45 82Д 6,06± 0,27 92,4

рНсол 4,0+А13+ 7,36± 0.27 99,1 7,15± 0.45 98,8 6,26± 0.27 95,4

4. Гетерогенность популяций клевера лугового по признакам развития симбиоза

Для успешной селекции клевера лугового на повышение симбиотро-фии необходимы источники, обладающие высокой активностью и эффективностью симбиоза.

По данным полевого опыта сорто-ризобиальная система Кудесник х КР 2 отличалась высокой активностью и эффективностью азотфиксацни. Она и была использована в качестве объекта исследований. Критериями развития симбиоза явились: симбиотнческая эффективность (сухая масса растений) и количество клубеньков (общее и активных). Полученные данные подтвердили высокую изменчивость сорто-ризобиальной системы Кудесник х КР 2 (табл. 7).

Так, коэффициент вариации массы растений увеличивался от 16,35 % - в микровегетационном до 55,38 % - в вегетационном опытах. Высокая гетерогенность изучаемых показателей проявляется уже на ран-

1Е

них этапах онтогенеза (микровегетационный опыт) и увеличивается с возрастом растений (вегетационный опыт).

Таблица 7 - Внутрисортовая изменчивость клевера лугового Кудесник на фоне инокуляции штаммом ризобий КР2__

Анализируемый признак Условия опыта Среднее Минимум Максимум Коэффициент вариации, %

Масса растений, мг г макровеге-тационный 7,02 5,08 9,20 16,35

вегетационный 17,40 1,14 53,59 55,38

Общее количество клубеньков, штфаст. микро вегетационный 4,70 1,00 14,00 57,02

вегетационный 67,00 4,00 322,00 75,25

Количество активных клубеньков, шт^раст. микровегетационный 2,90 0,00 8,00 60,56

вегетационный 51,43 0,00 308,00 93,66

Более выраженный полиморфизм отмечен по показателям клубень-кообразования - коэффициент вариации по количеству активных клубеньков достигал 93,66 %. Таким образом, сорт Кудесник на фоне штамма КР 2 имеет четко выраженную гетерогенность по симбиотической эффективности (масса растений) и количеству клубеньков (общее и активных).

Интересные данные получены при распределении растений по классам эффективности симбиоза (в процентах от общего числа). В строго контролируемых условиях микровегетационного опыта 59,2 % растений формировали симбиоз со средней эффективностью, а 10,2 % - с высокой. Анализ этой же сорто-микробной системы в условиях почвенной культуры вегетационного опыта показал, что распределение смещается в сторону менее эффективного симбиоза - число растений с высокой и средней эффективностью резко сократилось и составило 2,5 % и 37,2 %, соответственно.

Полученные данные свидетельствуют о том, что полиморфизм популяции может изменяться. Можно предположить, что в условиях жёсткой конкуренции между вносимым штаммом и аборигенной микрофлорой почвы в вегетационном опыте, часть растений заражается низкоэффективными штаммами, присутствующими в почве, что смещает распределение растений в сторону уменьшения эффективности.

В селекции на повышение способности клевера лугового к симбио-трофному типу питания, необходимо учитывать сортовой полиморфизм и

эффективность используемого штамма клубеньковых бактерий. Высокая изменчивость популяции изучаемого сорта Кудесник на фоне штамма КР 1 и наличие в ней источников высокой эффективности обуславливает возможность использования данного сорта в качестве исходного материала в селекции на повышение симбиотрофного типа питания.

По результатам оценок отобрано 9 генотипов, отличающихся максимальными показателями симбиотическон эффективности и клубенькообра-зования (превышение над среднепопуляционным уровнем не менее чем в 1,5 раза), которые будут использованы в качестве исходного материала для селекции.

ВЫВОДЫ

1. Проведён скрининг новых для Нечернозёмной зоны сортов клевера лугового, отличающихся различной продолжительностью вегетационного периода и уровнем плоидносги - Трио, Дымковский, Кудесник, Кре-туновсюай, по способности к скмбиотрофии в сравнении с ранее районированным сортом-стандартом Кировский 159. В благоприятных для функционирования симбиотического аппарата условиях увлажнения и кислотности почвы максимальным уровнем нитрогеназной активности на фоне естественного заражения обладал раннеспелый тетралл оидный сорт Кудесник (до 9,21 мкМ С:Н«/г корней*час). Размах варьирования по данному показателю у диплоидных сортов составлял от 0,53 до 631 мкМ С2Н4/Г корнейчас. Коэффициент симбиотической азотфиксации за счёт аборигенных штаммов клубеньковых бактерий в зависимости от сорта изменялся незначительно и составлял 76,1-80,8 %.

2. Показана сортовая специфичность на инокулянию разными штаммами клубеньковых бактерий. Штаммы 348а, КС 7, КС 18 и КР 2 обладают различной комплементарностью к изучаемым сортам. Наиболее отзывчивыми на инокуляцию по показателям продуктивности (сухое вещество, накопление азота) оказались раннеспелый тетраплоидный сорт Кудесник и среднеспелый диплоидный сорт Дымковский, формировавшие высокоэффективный симбиоз с тремя штаммами из четырёх изучавшихся,

3. Выделены перспективные для составления сорто-ризобиальных комплексов штаммы - КС 18 (эффективный на сортах Дымковский, Кудесник) и КР 2 - (на сортах Дымковский, Кировский 159 и Кудесник). Эти штаммы могут быть рекомендованы в качестве тестерных при оценке и создании селекционного материала клевера лугового с повышенной способностью к симбиотрофии в условиях Северо-Востока Нечернозёмной зоны России.

4. Существенное влияние на симбиотрофию сортов клевера лугового, как на фоне заражения аборигенной популяцией ризобий, так и при инокуляции штаммами 348а, КС 7, КС 18 и КР 2, оказывают погодные ус-

лови*. При дефиците почвенной влаги интенсивность азотфиксаоии снижается в 3-5 раз по сравнению с потенциально возможным уровнем. Количество клубеньков при засухе было более чем в два раза меньше, чем при благоприятных условиях увлажнения.

5. Сорта клевера лугового существенно различаются по активности азотфиксацин и отзывчивости на инокуляцию в зависимости от кислотности почвы. Потенциальные возможности симбиотрофии изучаемых сортов проявились на фоне известкования (рНс, 5,47). За счёт подбора комплементарных пар сортов клевера лугового и штаммов клубеньковых бактерий активность азотфиксацин можно повысить на 10,7-25,4 %, продуктивность - на 9,0-283 накопление азота в биомассе - на 11,2-31,8 % и коэффициент симбиоткческой азотфиксацин - на 5-8 % по сравнению с контролем. На фоне известкования выявлено пять сорто-рнзобиальных комплексов (Кудесник х КР 2, Кудесник х КС 18, Кировский 159 х КР 2, Дымковский х КС 18 и Дымковский х 348а), достоверно превысивших по показателям продуктивности и накопления азота контрольный вариант. Наиболее перспективным из них был комплекс Кудесник х КР 2, превышавший контроль по продуктивности на 283 %> накоплению азота - на 31,8 %, нит-рогеназной активности - на 26,0 %.

6. Кислая реакция среды (рНеш, 4,2) снижала нитрогеназную активность формирующихся сорторизобиальных систем до 50,3 %, в сравнении с известкованным фоном. Ингибирующее действие кислотности не превышало 30 % при инокуляции сортов кислотоустойчивым штаммом КС 7. Даже в условиях кислой почвы инокуляция изучаемыми штаммами способствовала повышению уровня азотфиксацин. Выделено четыре сорторизобиальных комплекса (Кудесник х КР 2, Кудесник х 348а, Кудесник х КС 7, Дымковский х КС 7), имевших прибавки к контролю по ннтрогеназ-ной активности (до 213 %), продуктивности (до 21,4 %) и накопления азота (до 21,6 %). При этом коэффициент устойчивости по активности нитро-геназы в зависимости от комплекса составлял 73,1-79,8 %, а по показателям продуктивности - 93,6-119,0 %. Максимальными показателями симбиотрофии, как и в условиях известкованной почвы, характеризовался комплекс Кудесник х КР 2.

7. Показана возможность эффективного симбиоза клевера лугового с изолятами ризобий из кислого местообитания. Выделенный нами изолят 9-4А оказался не менее эффективным микросимбионтом сорта Трио в нейтральных (рН™ 7) и кислых (рНсоа 4,8; 4,0) условиях среды, чем производственный штамм-стандарт 348а и превосходил его в условиях алюминиевого стресса по массе растений на 13,8 %, количеству активных клубеньков -на 181-%.

8. Установлено, что основной вклад в определение показателей симбиоткческой активности и эффективности вносит генотип макроснмбионта (58,38; 67,09 %) и суммарное действие партнёров симбиоза (7,08; 13,85 %).

Вклад фактора кислотности был достоверным только по показателю интенсивности азотфиксации и составлял 15,65 %. Неспецифическое действие генотипа микросимбионта было существенно по показателю нитроге-назной активности и незначительно - по показателям продуктивности (Р<0,05).

9, В популяции клевера лугового Кудесник (на фоне инокуляции штаммом KP 2) выявлена высокая изменчивость по массе растений (V = 16,4-55,4 %) и количеству активных клубеньков (V = 60,6-93,7 %) на ранних стадиях онтогенеза. Отобраны генотипы, отличающиеся максимальными показателями сим биотической эффективности и клубе нькообразова-ния (превышение над среднепопуляционным уровнем не менее чем в 1,5 раза). Установлена тесная коррелятивная связь между нитрогеназной активностью и количеством активных клубеньков (г = 0,84-0,93).

Ю.Инокуляция изучаемых сортов производственным и перспективными штаммами способствовала существенному (в 1,2-2 раза) увеличению размеров накопления органического вещества и азота в почве, причём максимальные показатели отмечены в оптимальных по кислотности условиях.

Предложения селекционной практике

С целью отбора перспективных генотипов по способности к симбно-трофии оценку генофонда клевера лугового можно проводить на фоне аборигенных штаммов клубеньковых бактерий в благоприятных по влаго-обеспеченносги условиях. Выявление конкретных сорто-ризобиальныX систем необходимо осуществлять на фоне штаммов, показавших высокую эффективность. В качестве таковых рекомендуется использовать кислотоустойчивый штамм КС 18 и KP 2 - для слабокислых и нейтральных почв, селекции ВНИИкормов им. В.Р. Вильямса,

В селекционных программах клевера лугового на повышение снм-биотрофии использовать выделившиеся по эффективности сорто-ризобиальные комплексы, что позволит повысить степень комплементар-носги партнёров симбиоза.

В качестве косвенного показателя, характеризующего активность сим биотического взаимодействия, использовать количество активных клубеньков. Отбор растений с высоким уровнем симбиотрофии следует проводить в условиях дефицита азота, используя показатели биомассы и количества активных клубеньков.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Устюжанин И.А, Реакция клевера лугового (Trifolium pratense L.) на инокуляцию Rhizobium leguminosarum bvtrifolii //Тез. докл. 1-ой городской научной конференций аспирантов и соискателей, - Киров, 2001. -С. 41-42,

2. Устюжанин ИЛ. Влияние инокуляции Rhizobium leguminosarum i>v tri-folii на интенсивность азотфиксации и продуктивность сортов клевера лугового (Trifolium pratense L.) Н Сб. науч. трудов НИИСХ Северо-Востока. - Киров, 2001. - С. 189-192.

3. Устюжанин И.А., Широких A.A., Широких И.Г., Тумасова М.И. Сим-биотическая эффективность изолятов бактерий из клубеньков клевера дугового, выращенного на кислой почве // Сб. науч. трудов НИИСХ Се-веро-Востока.-Киров, 2001.-С. 193-198.

4. Устюжанин RA. Оценка сортов клевера лугового (Trifolium pratense L.) по интенсивности азотфиксации и эффективности симбиоза Н Тез. докл. VI11 молодёжной научной конференции. - Сыктывкар, 2001. - С. 208210.

5. Устюжанин И.А., Широких A.A., Тумасова М.И. Природные изоляты клубеньковых бактерий клевера лугового в условиях эдафнческого стресса И Материалы науч. сессии (14-15 ноября 2001 г.). - Киров, 2001. -С. 231-232.

6. Устюжанин И.А. Влияние перспективных штаммов клубеньковых бактерий на продуктивность и интенсивность азотфиксации сортов клевера лугового (Trifolium pratense L) i! Тез. докл. DÍ молодёжной научной конференции. - Сыктывкар, 2002. - С. 208-210.

7. Устюжанин И.А. Симбиотическая эффективность штаммов клубеньковых бактерий (Rhizobium leguminosarum bv trifolií), выделенных из кислой почвы // Материалы 2-й научной конференции МОГнС, поев. 115-летаю Н.И. Вавилова. - М.: МСХА, 2003. - С. 269-270.

Лицензия № 0207067 от 08.04.1998 г. Подписано к печати 14.05.2003 г. Формат 60x80й6. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 80 экз. Заказ № 61.

Отпечатано с оригинал-макета. Типография ГУ ЗНИИСХ Северо-Востока им. Н.В, Рудницкого 610007, Киров, ул. Ленина, 166а