Реакции врожденного и приобретенного иммунитета у рыб в естественных и экспериментальных условиях

Киташова, Александра Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Реакции врожденного и приобретенного иммунитета у рыб в естественных и экспериментальных условиях
ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Реакции врожденного и приобретенного иммунитета у рыб в естественных и экспериментальных условиях"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

-С2Ц1

Биологический факультет

2 ;•: ш

На правах рукописи УДК 597-11

КИТАШОВА Александра Анатольевна

РЕАКЦИИ ВРОЖДЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА У РЫБ В ЕСТЕСТВЕННЫХ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ

03.00.10 - ихтиология 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2002

Работа выполнена на кафедре клеточной физиологии и иммунологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук доцент И.А. Кондратьева

доктор биологических наук профессор А.О. Касумян

доктор биологических наук профессор В.Г. Галактионов

Всероссийский научно-

исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии

Защита состоится 17 мая 2002 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д.501.001.53 в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, ауд. 557.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ

Автореферат разослан/-^- апреля 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук ---Т.И. Куга

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОБЛЕМЫ

Актуальность проблемы. Исследование организации и функционирования иммунной системы рыб и других низших позвоночных представляет собой важный аспект сравнительной и эволюционной иммунологии. У них представлены все формы иммунного ответа, как естественного, так и приобретенного, но они изучены неполно и целостной картины иммунореактивности рыб нет [Лукьяненко, 1989; Фонталин, 1998; Acton ei ai., 1971; Ellis, 1977; Lobb et a!., 1984; Lie et a!., 1989; Hart et al., 1998; Scapigliati et al., 1999; Secombes et al, 1999; Douglas et al., 2001]. Недостаточность знаний проявляется в противоречивости накопленных данных, обусловленной значительными различиями между классами и группами рыб, а также лабильностью их иммунитета и его чувствительностью к изменениям условий среды обитания [Кондратьева и др., 2001; Stave et al., 1985; Houghton et al., 1990; Sheldon et al, 1991; Espelid et al, 1996; Zelicoff et al, 2000].

Изучение иммунных механизмов рыб предоставляет материал для создания научной базы современного рыбоводства, являющегося неотъемлемым звеном экономического развития России. В последние годы исследования, связанные с рыбоводством, существенно расширились [Вихман, 1984; Сильченко и Попов, 1992; Криксунов и др., 1999; Кондратьева и др., 2002; Landolt, 1989; Lillehaug, 1989; Schreck et al, 1991; Sakai, 1999], но до сих пор отсутствует системный подход к изучению иммунитета рыб, ихтиопатологии и терапии рыб, и рыбные хозяйства несут большие экономические потери от смертности рыб вследствие болезней. Перспективными являются исследования воздействия на иммунный ответ рыб различных внешних факторов, а также разработка и производство простых в применении, надежных и высокочувствительных тест-систем для диагностики болезней рыб, создание эффективных вакцин и лекарственных препаратов.

Параметры иммунитета рыб используются в настоящее время как показатели загрязнения воды в реках, озерах и морях [Cossarini-Dunier et al, 1990; Hart, 1997; Aaltonen et al, 2000; Dethloff et al, 2001;

Regala et al., 2001]. Оценка иммунного статуса морских и пресноводных рыб позволяет получать достоверную информацию о состоянии животных в естественных условиях обитания и, как следствие, о качестве среды, а также проводить биотестирование и биомониторинг техногенного воздействия на водную среду обитания диких видов.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение реакций врожденного и приобретенного иммунитета рыб в норме и патологии в естественных и экспериментальных условиях. В качестве объектов исследования были выбраны радужная форель, широко используемая в аоакультуре, навага и треска— распространенные в Белом море виды рыб.

Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать параметры врожденного иммунитета радужной форели, наваги и трески в норме и при патологии в зависимости от инфекции и зараженности паразитами.

2. Сравнить действие лекарственных препаратов в лечении энтерита радужной форели и выбрать наилучший класс терапевтических агентов.

3. Оптимизировать метод твердофазного иммуноферментного анализа и разработать экспериментальную тест-систему для изучения взаимодействия сывороток рыб с возбудителями заболеваний.

4. Выявить специфическое взаимодействие сывороток радужной форели с возбудителями энтерита с помощью разработанной тест-системы.

Научная новизна работы. Показано, что в сыворотке крови радужной форели, содержащейся в условиях прудового хозяйства, и тресковых рыб Белого моря присутствует активный лизоцим. Выявлена зависимость концентрации фермента от состояния рыб в норме и при патологии. Повышение концентрации лизоцима в результате паразитарной инвазии позволяет предположить существование новых, неизученных свойств этого белка. Результаты иммунохимиче-

ских исследований соответствуют данным клинических, патолого-анатомических, бактериологических и гематологических исследований. Сделано заключение, что параметры врожденного иммунитета, в частности лизоцим, являются надежными и достоверными показателями состояния рыб при инфекции и инвазии.

Практическое значение работы. Впервые проведено сравнение влияния различных лекарственных препаратов (нифулин, био-вит-80, кормогризин-40 и бацилихин-120) в лечении энтерита молоди радужной форели. Наибольшее терапевтическое действие оказали нифулин в дозе 1 кг/т корма и биовит-80 в дозе 12,5 кг/т корма. Эти лекарственные препараты можно рекомендовать для лечения энтерита рыб в аквакультурах.

Впервые разработана и апробирована экспериментальная тест-система на основе метода твердофазного ИФА1, позволяющая определять в сыворотках рыб специфические антитела к возбудителям энтерита условно-патогенным сапрофитным микроорганизмам Alcali-genes sp. и Citrobacter freundii и диагностировать заболевание.

Полученные результаты позволяют рекомендовать показатели врожденного и приобретенного иммунитета рыб (концентрация белка и лизоцима в сыворотке крови, наличие специфических антител) в качестве биомаркеров для определения состояния организма рыб и, как следствие, качества среды обитания.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 12-й Европейской встрече иммунологов (Барселона, 1994), 9-м Международном иммунологическом конгрессе (Сан-Франциско, 1995), заседа-

' Список сокращений и обозначений: — оптическая плотность при длине волны 492 нм; 2-МЭ — 2-меркаптоэтанол; БСА — бычий сывороточный альбумин; ДСП — додецил-сульфат натрия; ДЭАЭ -— диэтиламиноэтил; ИФА — иммунофер-ментный анализ; ЛПС — липополисахарид; МПА — мясопептонный агар; МПБ — ' мясопептонный бульон; НАФ — неполный адъювант Фрейнда; ОФД — дигидрохло-рид орто-фенилендиа.мина; ПААГ— полиакриламидный гель; ПАФ— полный адъювант Фрейнда; ПДГ — среда, содержащая пептон, дрожжевой экстракт и глюкозу; СОЭ — скорость оседания эритроцитов

ним Межведомственной ихтиологической комиссии РАСХН «Итоги научно-практических работ в ихтиопатологии» (Москва, 1997), Первой научной молодежной школе и конференции «Сохранение биоразнообразия и рациональное использование биологических ресурсов» (Москва, 2000), заседании кафедры клеточной физиологии и иммунологии МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, январь 2001), заседании лаборатории онтогенеза рыб кафедры ихтиологии МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, февраль 2001).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 185 страницах, иллюстрирована 21 рисунком и 11 таблицами.

В обзоре литературы изложены современные представления о структурно-функциональной организации иммунной системы рыб и регуляции ее действия. Рассмотрены основные заболевания рыб, методы профилактики и лечения заболеваний.

Список литературы содержит 329 источников.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили: радужная форель Salmo gairdneri (Richardson, 1836), северная навага Eleginus navaga (Pallas, 181 ]) и беломорская треска Gadus morhua maris-albi (Derjugin, 1920).

Методы. Форель содержали в рыбном хозяйстве «Бисерово» в долевых садках при температуре 14-1б°С. Отлов наваги и трески производили ставными мережами, пойманную живую рыбу перевозили в емкостях с морской водой и непродолжительное время содержали в садках, подвешенных к плавучему причалу в море.

Первичные посевы микроорганизмов из кишечника и с жаберных лепестков рыб осуществляли на МПА, МПБ и ГТДГ. При исследовании микроорганизмов морских рыб в среды добавляли NaCI (2%). Выделенные бактерии идентифицировали по результатам биохимических и морфологических исследований.

Паразитологические исследования проводили по стандартным методикам.

Взятие крови у форели проводили из хвостовой артерии, у трески и наваги — из сердца. Форменные элементы крови подсчитывали в камере Горяева. СОЭ, концентрацию гемоглобина и цветной показатель крови определяли по стандартным методикам.

Двуступенчатый электрофорез иммуноглобулинов рыб, кролика и сывороток рыб проводили по методу Laemmli в 5/(5% ПААГ, содержащем ДСН и 2-МЭ в качестве восстанавливающего агента. Сыворотки рыб разводили в 20 раз и вносили в количестве 20 мкл в карман. Электрофореграммы обрабатывали с помощью оригинального программного обеспечения.

Концентрацию лизоцима в сыворотках рыб определяли по методу Лабинской2. Сыворотки рыб разводили в 5,5 раз. А492 измеряли на однолучевом спектрофотометре Uvidec4 фирмы Jasco при длине волны 540 нм через 15 и 180 с.

Фракцию иммуноглобулинов из сыворотки рыб и кролика осаждали насыщенным раствором сульфата аммония. IgM из сыворотки рыб очишали гель-фильтрацией на колонке с сефакрилом S300 (Pharmacia, Швеция), IgG из сыворотки кролика очищали на колонке с ДЭАЭ-сефарозой (Pharmacia, Швеция). Элюцию проводили 0500 мМ раствором NaCI.

2 Штаммы Micrococcus lysodeikticiis, № 137, Alcaligenes sp.. № 260, Citrobacter freundii. № 244, к Escherichia coli. № 52, любезно предоставлены музеем микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд и спек-трофотометрически при длине волны 280 нм.

Для получения поликлональной антисыворотки иммунизацию кролика проводили троекратно иммуноглобулинами рыб: первый раз подкожно в четыре точки (400-500 мкг белка в ПАФ), через 45 дней внутрибрюшинно (та же доза белка в НАФ) и третий раз через 45 дней внутривенно (та же доза белка без адьюванта). Полученную антисыворотку прогревали при 56°С в течение 30 мин и истощали эритроцитами и клетками печени рыб по стандартной методике.

Твердофазный ИФА модифицировали на основе стандартной методики. Панели сенсибилизировали клетками бактерий Alcaligenes sp., Citrobacter freundii и Escherichia coli в разведении 1:100 или разрушенными дезинтеграцией на ультразвуковом дезинтеграторе Bransonic 1510 при 100 Вт в течение 2 мин при температуре 0°С бактериальными клетками в концентрации 10мкг/мл. Поликлональные кроличьи антитела к иммуноглобулинам рыб вносили в концентрации 100 мкг/мл. Меченый конъюгат (сделан в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, серия 65) применяли в разведении 1:4 000. В качестве субстрата для ферментативной реакции использо-вати ОФД, Интенсивность окрашивания оценивали на вертикальном фотометре Multiscan фирмы Labsystems при длине волны 492 нм. Использовали оригинальное программное обеспечение, позволяющее получать в численном виде данные от фотометра и передавать их в электронные таблицы.

Данные исследований трески и наваги распределяли в интервальный вариационный ряд в соответствии с вариацией количества паразитов, приходящихся на одну особь. Число классов вычисляли по формуле Стерджеса. Достоверность полученных данных оценивали с помощью /-критерия Стьюдента(а=0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование параметров врожденного иммунитета радужной форели, наваги и трески в зависимости от инфекции и зараженности паразитами. Известно, что стратегия защиты в организме рыб основывается на реакциях врожденного иммунитета, и прежде всего гуморального. Одним из важных компонентов гуморального врожденного иммунитета является лизоцим [Fletcher & White, 1973; Fonge et al, 1976; Ourth, 1980; Grinde, 1989; Lie et al„ 1989]. Антибактериальные свойства лизоцима были продемонстрированы у многих видов рыб [Fletcher & White, 1973; Grinde, 1989; Kondratieva et al., 1995]. Основной функцией лизоцима, как считалось ранее, является уничтожение грамположительных бактерий в результате разрушения их клеточной стенки. Однако в последнее время обнаружено, что лизоцим обладает и другими свойствами: денатурированный нагреванием лизоцим способен разрушать грамотрицательные бактерии, он опосредованно стимулирует фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов, обладает противовоспалительной и слабой хитиноли-тической активностью [Kokoshis & Di Luzio, 1979; Pellegrini et al., 1992; Takada et al., 1994]. Менее известны его функции при паразитарной инвазии.

В первой части работы исследовали показатели врожденного иммунитета рыб, и прежде всего лизоцим. Иммунные реакции при бактериальной инфекции изучали у радужной форели, содержавшейся в условиях прудового хозяйства. Обычно промышленно разводимые рыбы характеризуются низкой зараженностью паразитами, но у них часты бактериальные инфекции из-за высокой плотности посадки рыб, нарушений температурных и иных условий содержания и воздействия стрессов, например из-за перевозки [Бауер и др., 1983; Кондратьева и др., 2002; Lillehang А. 1989]. Врожденную иммунореак-тивность при паразитарной инвазии изучали у морских рыб в естественных условия обитания (наваги и трески Белого моря). В этом случае инфекционные заболевания редки, однако паразиты являются ха-

рактерными симбионтами морских рыб [Гиченок, 1996; Безгачина, 2000].

Изучение иммунологических и гематологических показателей радужной форели при энтерите и исследование действия лекарственных препаратов. В работе использовали двухлеток радужной форели массой 500-800 г, выращенных в рыбном хозяйстве «Волгоре-ченское» и затем перевезенных в рыбное хозяйство «Бисерово», где рыб содержали при повышенной температуре (17-20°С) и недостаточности естественных кормов. У исследуемых рыб был ослаблен иммунитет, в кишечнике размножились условно-патогенные сапрофитные микроорганизмы (определенные как Alcaligenes sp. и Citrobacter freundij), и рыбы, в обычных условиях устойчивые к этим симбионтам, заболели энтеритом. Диагноз поставлен на основе данных клинического осмотра, патологоанатомического вскрытия, бактериологического, паразитологического и гематологического анализа. На основании этих данных заболевание отнесено к болезням смешанного типа с первичной бактериальной инфекцией.

Заболевших рыб (80 экземпляров) разделили на 5 групп по 1517 особей. Здоровые рыбы (6-я группа) служили контролем. В течение недели рыб адаптировали к экспериментальным условиям, затем вместе с кормом рыбам давали лекарственные препараты, рекомендуемые специалистами для лечения энтерита рыб [Микитюк, 1984; Ковалев и др., 1989]. 1-я группа заболевших рыб получала комплексный препарат нифулин (1 кг/т корма); 2-я группа— антибиотик из группы тетрациклинов биовит-80 (12,5 кг/т корма); 3-я группа — препарат группы антибиотиков-стрептотрицинов кормогризин-40 (1,2 кг/т корма); 4-я группа— относящийся к группе полипептидов антибиотик бацилихин-120 (1,5 кг/т корма). 5-я группа лекарств не получала. Биовит, бацилихин и кормогризин давали в течение двух недель с двухдневным перерывом между неделями. Нифулин — в течение одной недели.

После лечения проводили клинический, патологоанатомиче-ский, бактериологический и паразитологичеекий анализ, а также исследовали иммунологические и гематологические показатели. Данные табл. 1 подтверждают, что леченые рыбы были внешне практически здоровы (группы 1-4), у них улучшилось состояние кишечника и печени. В кишечнике леченых рыб уменьшилось вплоть до нормы количество бактерий, вызвавших заболевание (Alcaligenes sp. и Citrobacter freundii), на поверхности кожи не были выявлены эктопаразиты (Argillits sp. и Diplostomum sp.), обнаруженные у заболевших рыб до антибиотикотерапии (группа 5). Концентрация гемоглобина у леченых рыб соответствовала норме (83 г/л), тогда как у заболевших нелеченых рыб она равна 34 г/л. СОЭ также приблизилась к норме (7 мм/ч), у нелеченых рыб этот показатель равен 19 мм/ч. После терапии изменился белковый состав сыворотки крови рыб, появились новые фракции белка (рис. 1 А). Представленные данные, полученные разными методами исследования, полноценно отражают картину заболевания и лечения рыб.

Определение активности лизоцима показало, что уровень фермента в сыворотках радужной форели увеличился более чем в 2 раза (табл. 1), что соответствует данным литературы об активности лизоцима при бактериальных инфекциях [Fletcher & White, 1973; Grinde, 1989]. В зависимости от выбранного терапевтического агента концентрация лизоцима повышалась до 4,5-5,6 мкг/мл или понижалась до 1,9-2,1 мкг/мл.

Эффективность лекарственных препаратов различна: наибольший положительный эффект при лечении энтерита рыб проявили ни-фулин и биовит-80. Эти препараты можно рекомендовать для лечения энтерита при разведении рыб в рыбных хозяйствах.

Табл. 1. Клинические, патологоанатомические, бактериологические, паразитологические и гематологи- о ческие показатели радужной форели

Группа

Клинический осмотр

Осмотр при вскрытии

Бактериологическое Сопутствующие Гематологическое Концентрация

исследование

паразиты

Состояние ануса (кол-во рыб, %)

3 >5

з с; £

IX х

5 г- й

с га

о_ л о.

а. ьг

га

О.

о X

о »

исследование

Кишечник Печень «-»— отсутствуют; «+»—

присутствуют в единичном количестве;

«++» — присутствуют в большом количестве; «+++» — массовые колонии

<*>

О о

лизоцима (мкг/мл)

1 Нифупин

2 Биовит

О 0 100 Норма

Норма

±2

10 + 1

30 70

Слабо воспален

Норма

3 Кормогризин 29 30 41 Сильно

воспален

Норма

4 Бацилихин 10 40 50 Сильно

воспален

Бледная, с красной каймой

5 Нелеченые 50 30

20 Сильно воспален

Глинистого цвета, с красным краем

89 + 1

9± 1

34 ±5

19 ±5

6 Здоровые

0 0 100 Норма

Норма

83 1 2

7 + 1

5,6 + 0,2

4,5 ± 0,2

91+4 19 + 4 1,9 + 0,1

86+1 9+1 2,1+0,1

3,3 ± 0,2

1,5 + 0,1

о с2 о* об с» 1 а аг о* се ов % о с? оч об ®в 1 <

Ц ^ Щ\Щ' щ

25 С Са 23 1 кДа-^

1«4ка«->

Г ! 1 ,

0 2 0* 0 в 0.»

ог о* с«

97.4 "

бге«д«->

ве.в

:9 0>Ла-) 20.1 *Д»-|

2 п

йа

Г|

о 0.2 о.* с б о.е 1

Рис. 1. Двуступенчатый электрофорез сывороток крови рыб в ЛААГ, содержащем ДСН, в восстанавливающих условиях. А — радужная форель, Б — навага, В — треска. Справа: усредненный для группы профиль оптической плотности электрофореграмм (по оси ординат указана относительная оптической плотности), слева: молекулярная масса, внизу: группы рыб.

Исследование зависимости иммунологических а гематологических показателей наваги и трески от зараженности паразитами. В ходе комплексного обследования наваги и трески Белого моря определяли морфологические параметры рыб, зараженность рыб паразитами, состав бактериальной флоры жабр рыб, гематологические, биохимические и иммунологические показатели и сравнивали их в норме и при инвазии. Рыбы (навага — 36 экземпляров, треска — 48 экземпляров) были разделены на группы в зависимости от интенсивности заражения скребнем Echinorhynchus gadi (Müller, 1776) (табл. 2).

Оба вида рыб являются основными дефинитивными хозяевами паразита. Экстенсивность инвазии исследуемой трески составила 97,9% при средней интенсивности инвазии 11,7 паразита на особь (табл.2), а наваги— соответственно 52,8% и 1,4 паразита на особь. Выявлено, что интенсивность инвазии не зависит от длины и веса рыб (табл. 2). Это учитывали в ходе дальнейшей обработки данных.

Показано, что у зараженных рыб уменьшилось содержание в крови форменных элементов — эритроцитов и лейкоцитов (табл. 3). Уменьшение концентрации эритроцитов составило 30% у наваги и 45% у трески, снижение концентрации лейкоцитов— около 40% в обоих случаях. Зарегистрировали уменьшение концентрации гемоглобина в крови: на 13,8% у наваги и на 27,5% у трески (табл.3). Цветной показатель крови достоверно не варьировал (табл. 3). СОЭ незараженных и зараженных рыб не изменялась и находилась на уровне 2,5-3 мм/ч, но у наиболее зараженных рыб она снизилась до 2 мм/ч (табл. 3).

У наваги и трески выделены три культуры бактерий: бактерии с жабр наваги отнесены к группе Corynebacteria sp., а с жабр трески — к группам Bacillus sp. и Pseudomonas sp.

Табл. 2. Морфологические и паразитологические показатели наваги и трески

Группа 1. (см)1 I (см)2 О (г)3 Экстенсивность инвазии4 Интенсивность инвазии5 Средняя интенсивность инвазии Средняя удельная интенсивность инвазии6

Навага

1 22,7 ±2,2 21,1 ± 1,8 92,1 ± 28,0 0 0 0

2 22,6 + 2,2 21,0 ± 2,1 95,7 ± 33,1 52,8% 1 1 0,01

3 22,0 ±0,89 20,7 ±0,9 75,4 ±9,5 2 2 0,02

4 27,5 25,8 148,2 4 4 0,03

Треска

1 21,8 ± 4,3 20,0 ± 3,9 134,4 ±36,4 0-5 2,9 0,02

2 24,1 ±4,2 22,8+3,6 161,3 ±51,6 6-15 10.4 0,07

3 26,7 ±3,1 24,6 ±2,8 202,3 ±61,6 97,9% 16-25 18,8 0,09

4 20,9 ± 1,9 19,7 ± 1,5 106,2+17,8 26-35 26,5 0,25

5 24,5 22,5 137,7 36-45 36,0 0,26

6 30,2 28,1 315,0 56-65 65,0 0,21

1 Расстояние от переднего конца головы до конца хвостового плавника

2 Расстояние от переднего конца головы до конца чешуйного покрова

3 Масса рыбы

4 Приведена для данной выборки ь Количество паразитов на особь

6 Количество паразитов на 1 г тела особи хозяина

и!

Табл. 3. Гематологические и иммунологические показатели наваги и трески

Количество Концентрация Концентрация Цветной показатель

Группа крови

(пг гемоглобина/ эритроцит)

на особь Эритроцитов (млрд/мл) Лейкоцитов (млн/мл) Белка (мг/мл) Гемоглобина (г/л) Лизоцима (мкг/мл)

Навага

1 0 1,90 ±0,08 5,20 ±0,11 2,5 ±0,5 40,3 ±2,1 94 ±3 0,51 ±0,05 49,5

2 1 1,74 ± 0,09 4,94 ± 0,21 3,0 ± 0,3 45,5 + 1,7 88 + 5 2,34 ±0,13 51,1

3 2 1,58 + 0,07 3,61 ±0,12 2,5 ±0,4 52,4 ± 0,9 86 ±4 2,72 ±0,17 54,4

4 4 1,30 3,20 2,0 60,8 81 2,53 62,3

Треска

1 0-5 1,40 ± 0,09 8,17 ±0,19 2,5 + 0,2 35,5 ± 1,9 80 ±6 1,03 ± 0,07 57,1

2 6-15 1,46 ±0,04 11,06 ± 0,51 2,8 ±0,3 37,0 ± 3,1 79 ±2 1,29 ±0,10 54,1

3 16-25 1,24 ± 0,06 10,27 ±0,32 2,5 ±0,1 42,7 + 2,4 81+4 1,74 ± 0,05 65,3

4 26-35 0,77 ± 0.07 8,20 + 0,12 2,5 ±0,3 52,9 ± 1,7 68 + 5 1,98 ±0,15 88,3

5 36-45 1,01 6,41 2,5 59,7 60 2,03 59,4

6 56-65 0,98 6,35 2,0 68,3 58 1,51 59,1

Установлено, что у зараженных паразитами наваги и трески в естественных условиях обитания изменились показатели врожденного гуморального иммунитета: на электрофореграмме сыворотки крови выявлены новые фракции белка (рис. 1 Б, В), в том числе низкомолекулярная фракция (около 14,5 кДа); в сыворотке существенно увеличилась общая концентрация белка (на 50% у наваги и почти вдвое у трески) и содержание лизоцима (в 5 раз у наваги и в 2 раза у трески). Как обсуждаюсь выше, лизоцим, помимо широко известной глико-зидазной активности, субстратом для которой являются компоненты клеточной стенки бактерий, обладает и другими, не связанными с ферментативной активностью и неизученными в полной мере свойствами. Впервые обнаруженный рост концентрации лизоцима в зависимости от увеличения зараженности наваги и трески скребнем Echi-norhynchus gadi можно объяснить следующим.

Во-первых, любая биологическая агрессия стимулирует у рыб одновременное развитие различных форм врожденного иммунного ответа, который проявляется в том числе и в увеличении концентрации лизоцима в сыворотках крови рыб. Однако если считать, что основная роль лизоцима в организме — борьба с микробной инфекцией, то в случае паразитарной инвазии эта реакция оказывается напрасной. Во-вторых, из литературы известно, что заболевание паразитами может, с одной стороны, повысить риск вторичной инфекции рыб и спровоцировать развитие заболеваний смешанного типа, а с другой стороны — активировать иммунные реакции [Васильков, 1999; Johansen & Sommer, 2001]. Роль лизоцима оказывается превентивной, направленной на возможное предотвращение вторичной инфекции. В-третьих, лизоцим может обладать и неизвестными в настоящее время свойствами, эффективными в борьбе с паразитами. В таком случае активация лизоцима позволяет рыбам повысить общую сопротивляемость организма инвазии.

Сравнение комплексных данных, полученных в первой части работы при изучении инфицированных бактериями рыб в экспери-

ментальных условиях (радужная форель) и незараженных и зараженных паразитами рыб в естественных условиях обитания (навага и треска), показало, что факторы врожденного иммунитета являются надежными и достоверными показателями состояния иммунитета рыб. Нарушение целостности внутренней среды организма рыб вследствие внешней агрессии стимулирует повышение концентрации белка, лизоцима в сыворотке крови рыб и появление новых белков. Отклонение этих показателей от нормы свидетельствует о патологическом состоянии животных. Увеличение содержания лизоцима при паразитарной инвазии позволяет предположить существование новых, неизученных свойств этого белка.

Исследование специфического иммунитета рыб. Определено, что у рыб, как и у высших позвоночных, специфические иммунные реакции осуществляются антителами [Shelton & Smith, 1970; Marchalonis, 1971; Marchalonis et al., 1992; Smith et al., 1993], но данные о роли антител в иммунном ответе у рыб противоречивы. Антитела разных видов костистых рыб обладают неодинаковыми биохимическими и физиологическими свойствами; концентрация антител у здоровых рыб зависит от вида, возраста, размера животных, внешних воздействий. Есть данные об отсутствии у рыб синтеза специфических антител при иммунизации ЛПС [Magnadottir et al., 2001] и отсутствии выраженного вторичного иммунного ответа и иммунологической памяти при иммунизации рыб препаратом из бактерий Aeromonas hydrophila [Lamers et al., 1985].

Оптимизация метода твердофазного ИФА и экспериментальная разработка тест-системы для изучения специфического взаимодействия сывороток рыб с возбудителями заболеваний. Использование метода твердофазного ИФА для выявления антител и характеристики реакций антигенраспознающей системы рыб, а также создание на его основе тест-систем для определения не диагностируемых клинически болезней и диагностирования заболеваний рыб на ранних этапах представляется перспективным благодаря высокой чувствительности и специфичности метода. Его методическая и техническая простота разрешает проводить в полевых условиях скрининг большого количества образцов сывороток рыб. Поскольку для проведения анализа требуется всего несколько микролитров сыворотки, диагностирование заболеваний у рыб можно проводить прижизненно.

Задача подготовительного этапа работы состояла в получении поликлональных антител к иммуноглобулинам рыб. Для этого из сыворотки радужной форели выделили путем осаждения насыщенным раствором сульфата аммония и последующей гель-фильтрацией фракцию иммуноглобулинов, чистую по данным электрофореза в ПААГ. Количество белка составило около 350 мкг на 1 мл исходной сыворотки. Была подобрана схема иммунизации кролика для получения поликлональной антисыворотки к иммуноглобулинам рыб (см. методы). При иммунизации кролику ввели 1,5 мг иммуноглобулинов, что соответствовало 4 мл сыворотки рыб. Титр полученной антисыворотки составил более 1,5*105, значение фоновой реакции— 0,10,2. Из антисыворотки кролика выделили антитела к иммуноглобулинам рыб и использовали в дальнейшей работе.

Задача следующего этапа заключалась в выборе оптимальных условий проведения твердофазного ИФА. Определили: схему постановки анализа (непрямой твердофазный ИФА), оптимальное разведение конъюгата (1:4 000), оптимальную концентрацию иммуноглобулинов кролика (100 мкг/мл), сенсибилизирующих антигенов (разведение неразрушенных бактериальных клеток— 1:100, концентрация

разрушенных ультразвуком бактериальных клеток— Юмкг/мл). На каждом этапе блокировали неспецифическое связывание с помощью БСА и использовали твин 80 при отмывании панелей.

Применение метода твердофазного ИФА для определения специфического взаимодействия сывороток радужной форели с возбудителями энтерита. Экспериментально разработанная тест-система была апробирована при обследовании радужной форели, заболевшей энтеритом. Использовали те же группы рыб, что и в первой части работы. В качестве антигена были выбраны возбудители заболевания — бактерии Alcaligenes sp. и Citrobacter freundii. Бактерии Escherichia coli присутствовали в бактериологических пробах в единичном количестве и были выбраны в качестве контроля. Бактерии использовали в неразрушенном и разрушенном ультразвуком виде для сравнения влияния поверхностных и внутриклеточных антигенов, а также для сравнения влияния размеров сенсибилизирующих агентов.

На рис. 2 показано взаимодействие сывороток рыб с неразрушенными и разрушенными ультразвуком клетками бактерий. Для каждой серии, где сенсибилизирующим антигеном являлись бактерии Alcaligenes sp. и Citrobacter freundii (графики А и Б), профиль кривых экспериментальных групп (1-5) и контрольной группы (6) совпадает. Вначале (разведение 1:20- 1:5 120) А492 в лунках с сыворотками здоровых рыб выше, чем в лунках с сыворотками заболевших рыб. Затем значения А492 в лунках с сыворотками здоровых рыб резко снижаются. и при разведении 1:40 960 величина А492 падает до уровня реакции фона (0,2). В экспериментальных группах при разведении сывороток от 1:20 до 1:40 960 А492 уменьшается в среднем на 0,2-0,3 единицы и при максимальном разведении значения А492 превышают реакцию фона в два раза. Разница в А492 лунок с сыворотками разных групп очень мала. График, полученный для серии, в которой сенсибилизирующим антигеном служили бактерии вида Escherichia coli (В), отличается от первых двух тем, что лунки с образцами сывороток всех групп рыб показывают более низкую А492 как в начале (около 0,4 при

ШГМГГОЭ^СМ'З'СОЮ ntDOJtO'— (MIO)

Разведения сывороток рыб, х101 Разведения сывороток рыб, хЮ1 Разведения сывороток рыб, хЮ'

Рис. 2. Твердофазный ИФЛ сывороток крови рыб (1 — иифулин. 2 — биовит, 3 — кормогризин, 4 — бацилихин. 5 — нелеченые, 6 — здоровые). А, Ь. В: взаимодейст вие сывороток рыб с неразрушенными клетками бактерий (Alcaligenes sp., Citrobacterfreundii, Ecsherichia coli соответственно); Г. Д. К: взаимодействие сывороток рыб с разрушенными клетками бактерий (Alcaligenes sp.. _ Citrobacter freundii. Ecsherichia coli соответствен iio)

разведении 1:20), так и при конечных разведениях (1:5 120), соответствующих значениям фоновой реакции. Реакция сыворотки здоровых рыб не отличается от реакции остальных групп рыб.

В ИФА, где сенсибилизирующим антигеном были разрушенные ультразвуком клетки бактерий, для трех серий экспериментов (графики Г, Д, Е) характер поведения кривых зависимости А492 от разведения сывороток в пределах групп одинаков и соответствует зависимости, полученной в экспериментах с неразрушенными бактериальными клетками видов, вызвавших заболевание (А и Б).

Таким образом, с помощью тест-системы показано, что сыворотки рыб специфично взаимодействуют с энтеропатогенными бактериями, вызвавшими заболевание (Alcaligenes sp. и Citrobacter freundii). Титр сывороток заболевших рыб выше, чем титр сывороток здоровых рыб (4х 10 ). Это свидетельствует о наличии в сыворотках специфических антител к возбудителям энтерита. По-видимому, у здоровых рыб эти антитела обладают меньшей аффинностью по сравнению с антителами заболевших рыб. В связи с этим титр специфических антител у здоровых рыб невысок, и при разведении более 5 х 10" наблюдается снижение до уровня фона значений оптической плотности. Специфические антитела заболевших рыб являются высокоаффинными, и обнаруживаются при разведении более 4x10"4. Отсутствие различий между результатами серий экспериментов, соответствующих разным видам бактерий, объяснимо тем, что в препаратах разрушенных бактериальных клеток доминирует общий для изученных бактерий антиген.

ВЫВОДЫ

1. Лечение радужной форели, заболевшей энтеритом, лекарственными препаратами приводит к улучшению внешнего вида рыб, состояния кишечника и печени, уменьшению вплоть до нормы патогенных бактерий (Alcaligenes sp. и Citrobacter freandii) в кишечнике рыб и паразитов на поверхности кожи рыб (Argulus sp. и Diplostomum sp.), уменьшению скорости оседания эритроцитов, изменению белкового состава сыворотки крови и повышению концентрации гемоглобина и лизоцима в крови рыб. Наибольший положительный эффект в лечении энтерита рыб проявляют комплексный препарат нифулин в дозе 1 кг/т корма и антибиотик группы тетрациклинов биовит-80 в дозе 12,5 кг/т корма. Названные лекарственные препараты можно рекомендовать для лечения энтерита при разведении рыб в рыбных хозяйствах.

2. Заражение наваги и трески Белого моря скребнем Echinorhyn-chus gadi вызывает уменьшение содержания в крови форменных элементов и гемоглобина, повышение концентрации в сыворотке крови белка и лизоцима, появление в сыворотке новых фракций белка.

3. Оптимизирован метод твердофазного иммуноферментного анализа для определения специфического взаимодействия сывороток рыб с возбудителями заболеваний (подобраны концентрации антигена, антител и меченого конъюгата). На основе твердофазного иммуноферментного анализа экспериментально разработана и апробирована тест-система для диагностики заболевания рыб. Охарактеризован специфический иммунитет радужной форели к бактериям Alcaligenes sp. и Citrobacter freundii. Регистрируемое с помощью разработанной тест-системы увеличение в сыворотке крови рыб титра антител к микроорганизмам флоры кишечника позволяет определять патогены рыб.

4. Иммунологические параметры рыб (концентрация лизоцима, наличие специфических антител) могут служить биомаркерами в экспресс-тестировании состояния среды обитания рыб.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Naumova A.Ju., Kondratieva I.A., Kaigorodov V.A., Bolshakova A.A., Lashenkova N.N., Naumova A.M. 1994. The immunoreactivity stimulation in Cyprinus carpio and Sal mo gairdneri by nonspecific agents. 12th European Immunology Meeting. Spain, Barcelona, June, 14-17. Abst. W47/31.

2. Kondratieva I.A., Bolshakova A.A., Chernousova L.N., Naumova A.V., Naumova A.M. 1995. Modulation of lysozyme activity in fishes by extracellular bacteria infection and by treatment with drugs. 9th International Congress of Immunology. USA, San-Francisco, July, 23-29. Abst. W76/4469.

3. Киташова A.A., Кондратьева И.А., Наумова А.Ю. 1997. Исследование белков сыворотки крови рыб в норме и при патологии с помощью ИФА. Межведомственная ихтиологическая комиссия, РАСХН, Итоги научно-практических работ в ихтиопатологии (информационный бюллетень). Москва, с. 61-63.

4. Киташова А.А., Кондратьева И.А., Наумова А.Ю. 2000. Модификация метода твердофазного иммуноферментного анализа для исследования сыворотки крови рыб. В сб. «Паразиты и болезни рыб». М: ВНИРО, с. 86-87.

5. Киташова А.А., Кондратьева И.А. 2000. Изучение влияния экологических условий на устойчивость молоди радужной форели Oncorhynchus mykiss Richardson к заболеваниям с помощью иммунологических методов. Тезисы Первой научной молодежной школы и конференции «Сохранение биоразнообразия и рациональное использование биологических ресурсов». Москва, 27-30 сентября, с. 50.

6. Кондратьева И.А., Киташова А.А., Ланге М.А. 2001. Организация, функционирование и регуляция иммунной системы рыб. Деп. в ВИНИТИ 21.09.2001, № 2012-В2001.

7. Кондратьева И.А., Киташова А А., Ланге М.А. 2001. Современные представления об иммунной системе рыб. Часть I. Организация иммунной системы рыб. Вестник Московского университета, сер. 16 Биология, № 4, с. 11-20.

8. Кондратьева H.A., Киташова A.A. 2002. Функционирование и регуляция иммунной системы рыб. Иммунология, №2, с. 97-102.

9. Кондратьева И.А., Киташова A.A., Наумова АЛО. 2002. Действие лекарственных препаратов на молодь радужной форели. Вопросы рыболовства, №1 (9), с. 125-136.

oj,

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Киташова, Александра Анатольевна

Список сокращений и обозначений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Органы и ткани иммунной системы рыб

2.1.1. Почка

2.1.2. Тимус

2.1.3. Селезенка

2.1.4. Скопления лимфоцитов, ассоциированные со слизистыми оболочками внутренних органов

2.1.5. Ткань эпикарда

2.1.6. Краниальный гемопоэтический орган

2.1.7. Периферическая кровь

2.2. Клетки иммунной системы рыб

2.2.1. Гранулоциты

2.2.2. Макрофаги

2.2.3. Неспецифические цитотоксические клетки

2.2.4. Лимфоциты

2.3. Факторы гуморального иммунитета рыб

2.3.1. Факторы врожденного иммунитета

2.3.2. Факторы приобретенного иммунитета

2.4. Развитие иммунного ответа

2.4.1. Первичный и вторичный иммунный ответ, формирование специфической памяти

2.4.2. Трансплантационные реакции

2.4.3. Реакции гиперчувствительности

2.4.4. Противоопухолевая активность

2.5. Регуляция иммунной системы

2.6. Болезни рыб

2.6.1. Краткая характеристика болезней рыб

2.6.1.1. Инфекционные заболевания

2.6.1.2. Инвазионные заболевания

2.6.1.3. Болезни смешанного типа

2.6.2. Методы профилактики и лечения заболеваний рыб

2.6.2.1. Использование химиотерапевтических препаратов

2.6.2.2. Вакцинация

2.6.2.3. Пассивная иммунизация

2.6.2.4. Повышение иммунитета путем селекции

3. Цель и задачи исследования

4. Объекты и методы исследования

4.1. Объекты

4.1.1. Радужная форель Salmo gairdneri (Richardson, 1836)

4.1.2. Северная навага Eleginus navaga (Pallas, 1811)

4.1.3. Беломорская треска Gadus morhua maris-albi (Derjugin, 1920)

4.2. Методы

4.2.1. Отлов и содержание морских рыб

4.2.2. Клинический осмотр рыб

4.2.3. Вскрытие рыб и осмотр при вскрытии

4.2.4. Бактериологическое исследование

4.2.5. Паразитологическое исследование

4.2.6. Взятие крови и получение сыворотки

4.2.7. Подсчет форменных элементов крови

4.2.8. Определение скорости оседания эритроцитов

4.2.9. Определение концентрации гемоглобина в крови

4.2.10. Определение цветного показателя крови

4.2.11. Двуступенчатый электрофорез сывороток крови рыб в полиакриламидном геле, содержащем додецил-сульфат натрия, в восстанавливающих условиях

4.2.12. Компьютерная обработка электрофореграмм

4.2.13. Определение концентрации лизоцима в сыворотке

4.2.14. Выделение иммуноглобулинов

4.2.15. Определение концентрации белка по методу Бредфорд

4.2.16. Спектрофотометрическое определение концентрации белка

4.2.17. Получение антисыворотки

4.2.18. Получение разрушенных клеток бактерий

4.2.19. Твердофазный иммуноферментный анализ

4.2.19.1. Непрямой твердофазный ИФА для тестирования антисыворотки кролика к иммуноглобулинам рыб

4.2.19.2. Прямой твердофазный ИФА для стандартизации рабочего разведения конъюгата

4.2.19.3. Непрямой твердофазный ИФА для стандартизации рабочей концентрации иммуноглобулинов кролика

4.2.19.4. Непрямой твердофазный ИФА для стандартизации рабочего разведения клеток бактерий

4.2.19.5. Непрямой твердофазный ИФА для стандартизации рабочей концентрации разрушенных ультразвуком клеток бактерий

4.2.19.6. Непрямой твердофазный ИФА для определения взаимодействия сывороток рыб с поверхностными антигенами бактерий

4.2.19.7. Непрямой твердофазный ИФА для определения взаимодействия сывороток рыб с антигенами разрушенных ультразвуком клеток бактерий

4.2.19.8. Получение данных с помощью компьютера

4.2.20. Статистическая обработка данных

5. Экспериментальные результаты и их обсуждение

5.1. Исследование параметров врожденного иммунитета радужной форели, наваги и трески в зависимости от инфекции и зараженности паразитами

5.1.1. Изучение иммунологических и гематологических показателей радужной форели при энтерите и исследование действия лекарственных препаратов

5.1.1.1. Клинический осмотр и патологоанатомическое исследование

5.1.1.2. Бактериологический анализ

5.1.1.3. Паразитологический анализ

5.1.1.4. Изучение гематологических показателей

5.1.1.5. Сравнение электрофореграмм сывороток рыб

5.1.1.6. Определение концентрации лизоцима в сыворотках рыб

5.1.2. Исследование зависимости иммунологических и гематологических показателей наваги и трески Белого моря от зараженности паразитами

5.1.2.1. Морфологические параметры рыб

5.1.2.2. Показатели зараженности рыб скребнем ЕсЬтогЬупсЬиБ

§асИ

5.1.2.3. Бактериологический анализ

5.1.2.4. Изучение гематологических показателей

5.1.2.5. Определение концентрации белка в сыворотках рыб

5.1.2.6. Сравнение электрофореграмм сывороток рыб

5.1.2.7. Определение концентрации лизоцима в сыворотках рыб

5.2. Исследование специфического иммунитета радужной форели

5.2.1. Оптимизация метода твердофазного иммуноферментного анализа и экспериментальная разработка тест-системы для изучения специфического взаимодействия сывороток рыб с возбудителями заболеваний

5.2.1.1. Выделение иммуноглобулинов из сыворотки рыб

5.2.1.2. Получение поликлональной антисыворотки и поликлональных антител кролика к иммуноглобулинам рыб

5.2.1.3. Подбор условий для проведения твердофазного ИФА

5.2.2. Применение метода твердофазного иммуноферментного анализа для определения специфического взаимодействия сывороток рыб с возбудителями энтерита радужной форели

Введение Диссертация по биологии, на тему "Реакции врожденного и приобретенного иммунитета у рыб в естественных и экспериментальных условиях"

В последние годы в связи с развитием рыбоводства и увеличением промысловой добычи рыбы в пресноводных водоемах, морях и океанах возрос интерес к изучению иммунной системы и иммунного ответа у рыб. Исследования иммунитета рыб можно разделить на три основных категории.

1. Сравнительные и эволюционные исследования

Изучение иммунной системы рыб внесло существенный вклад в развитие сравнительной и эволюционной иммунологии. Галактионов указывает: «на эволюцию специфического иммунитета не следует смотреть только как на самостоятельное явление исторического развития; скорее, ее следует оценивать как такой процесс, который обеспечил прогресс в мире животных по линии увеличения абсолютного количества соматических клеток» [Галактионов, 1998, с. 391]. Первые исследования, связанные со строением органов иммунной системы рыб, относятся к 1920-м- 1940-м годам: например, труд Г.Н.Калашникова (1939) посвящен клеточному составу крови рыб, работа А.К. Скворцова (1947)— строению селезенки костистых рыб. Позднее появились труды Zapata о структуре лимфоидных органов рыб [Zapata, 1979; 1980] и Ellis, посвященные функционированию лейкоцитов рыб [Ellis, 1977; 1980; 1986]. В 1990-х годах в связи с разработкой новых методов, таких как иммунохимические методы, гибридомная технология, анализ ДНК и генно-инженерные технологии, ученые стали уделять большое внимание молекулярным механизмам иммунитета [Cadwell et al., 1990; Bengten et al., 1991; Abelli et al., 1996; 1997; 1999; Scapigliati et al., 1999a; Secombes et al., 1999]. Исследования иммунной системы прояснили эволюционное положение рыб и внесли вклад в понимание структурного и функционального становления системы иммунитета млекопитающих. Так, было показано, что рыбы наряду с врожденным иммунитетом, свойственным и низкоорганизованным животным, обладают всеми основными элементами специфической иммунной системы высших позвоночных, но различные регуляторные механизмы иммунного ответа у рыб менее развиты.

Однако до сих пор нет целостной картины организации и функционирования иммунной системы рыб. Основной причиной недостаточности знаний является противоречивость накопленных данных, обусловленная, прежде всего, большими различиями между классами и группами рыб: ДНК хрящевых и костистых рыб отличаются по степени гибридизации больше, чем ДНК птиц и млекопитающих [Медников и др., 1973].

2. Исследования, связанные с промышленным разведением рыб

При разведении рыб в аквакультуре условия их содержания должны благоприятствовать оптимальной активности врожденного иммунитета. В этом направлении были проведены исследования влияния условий содержания на параметры иммунитета рыб. Было показано, что иммунитет рыб в значительной мере зависит от внешних воздействий, и условия среды обитания представляют собой активные регуляторы иммунореактивности рыб.

Современное рыбоводство является неотъемлемым звеном экономического развития России. В последние годы научная база рыбоводства существенно расширилась, однако до сих пор заболевания рыб и способы их лечения изучены недостаточно, и рыбные хозяйства несут большие экономические потери от смертности рыб вследствие болезни. Наиболее эффективным методом контроля заболеваний рыб, вызываемых характерными для аквакультуры патогенами, является вакцинация рыб. Применяют также различные лекарственные препараты, но нет данных о сравнительной эффективности этих средств. Существуют ограничения для успешного применения этих методов, поскольку использование лекарств связано с риском загрязнения ими среды обитания, а вакцина дает защиту только от специфического инфекционного агента, в случае появления новых болезней требуется разработка новых вакцин. Поэтому проводятся исследования, с одной стороны, вирулентности и патогенности бактерий, характерных для рыб, содержащихся в рыбных хозяйствах, изучение этиологии и биологии паразитов рыб, а с другой стороны— факторов, влияющих на иммунный ответ рыб и усиливающих его. Изучаются возможности применения иммуностимулянтов — эволюционно консервативных веществ, свойственных микроорганизмам и стимулирующих реакции врожденного иммунитета у животных. Кроме того, изучаются возможности селективного разведения устойчивых к заболеваниям рыб. Наконец, перспективными представляются разработка и производство простых в применении, надежных и высокочувствительных тест-систем для диагностики болезней рыб.

3. Изучение показателей иммунитета рыб как биоиндикация состояния водной среды обитания

В последнее время в связи с ростом техногенного воздействия на среду обитания и возникновением угрозы для выживания и здоровья живых организмов параметры иммунитета рыб используются как показатели загрязнения воды в реках, озерах и морях. Наиболее широко используются такие иммунные параметры, как концентрация лизоцима, антител и лейкоцитов в крови рыб, а также тесты функциональной активности комплемента, макрофагов и лимфоцитов. Поллютанты не только оказывают вредное воздействие на животных, но и нарушают естественное развитие экосистемных процессов. Поллютанты могут подавлять функции иммунной системы рыб или приводить к развитию реакций гиперчувствительности и аутоиммунных реакций из-за дисфункции механизмов регуляции иммунной системы, тем самым участвуя в нарушении гомеостаза организма рыб [Cossarini-Dunier et al., 1990; Hart et al., 1997; Baumann, 1998; O'Halloran et al., 1998; Aaltonen et al., 2000; Dethloff et al., 2001; Regala et al., 2001]. В результате наблюдается увеличение количества заболевших рыб, возрастание интенсивности и экстенсивности зараженности рыб паразитами, изменение восприимчивости рыб к условно-патогенным симбионтам микрофлоры кишечника. Кроме того, загрязняющие вещества могут действовать как канцерогены [Grizzle et al., 1981; Baumann, 1998]. Оценка параметров иммунной системы морских и пресноводных рыб позволяет получать достоверную информацию о состоянии животных в естественных условиях обитания и о качестве среды, а также проводить биотестирование и биомониторинг техногенного воздействия на среду обитания диких видов. Кроме того, учет симбионтов рыб (паразитов, бактерий) позволяет оценивать биоразнообразие в экосистемах и прогнозировать развитие протекающих в экосистемах динамических процессов. Влияние токсических веществ и других промышленных отходов на иммунную систему рыб стало предметом иммунотоксикологии.

Как известно, иммунная система представляет собой защитную систему, в результате действия которой поддерживается постоянство внутренней биологической среды организма, то есть развивается иммунитет1 к чужеродным агентам молекулярной, надмолекулярной и клеточной организации, уничтожаются собственные измененные клетки и нейтрализуются продукты их жизнедеятельности. В иммунной системе позвоночных животных выделяют две основных составляющих — врожденную и приобретенную, каждая из них представлена клеточными элементами и продуцируемыми ими веществами — гуморальными факторами иммунитета [Ярилин, 1999].

Врожденная составляющая иммунной системы позвоночных формируется в процессе естественного развития организма, и механизмы, относящиеся к этой части иммунной системы, называют также естественными. Они начинают действовать сразу после любого воздействия, которое нарушает целостность внутренней среды организма, то есть являются неспецифическими. Действие врожденных механизмов иммунитета кратковременно и неизбирательно, то есть не зависит от уникальных особенностей активизировавшего защитные реакции чужеродного агента. При повторной встрече с чужеродным агентом клетки и гуморальные факторы естественного иммунитета не «узнают» его и реагируют на него так же, как и при первом контакте, то есть не происходит формирования иммунологической памяти. Это звено иммунитета позвоночных животных имеет много общих черт с защитными реакциями беспозвоночных [Фонталин, 1998].

Приобретенная составляющая иммунной системы позвоночных, или антигенраспознающая система, уникальна тем, что формирование этой системы происходит в течение всей жизни организма в результате контакта с различными агентами — чужеродными или измененными собственными субстанциями, вызывающими в организме развитие специфических иммунных реакций. Эти реакции направлены только против агента, который активировал каскад иммунного ответа, поэтому приобретенную составляющую иммунной системы называют еще адаптивной. Основой ее являются лимфоциты, несущие на своей поверхности уникальные рецепторы, распознающие антиген и способные взаимодействовать с другими молекулами и клетками иммунной системы. Разнообразие этих рецепторов создается в результате действия генетических и отборочных механизмов, максимизирующих репертуар рецепторов, распознающих антиген, и одновременно минимизирующих риск реагирования на собственные нормальные антигены организма. Система приобретенного иммунитета позвоночных животных способна узнать чужеродный агент или собственные измененные клетки и макромолекулы, избирательно уничтожить их или нейтрализовать. Одновременно осуществляется запоминание этого агента, формируется специфическая иммунологическая память, и при повторном контакте с ним адаптивные механизмы реагируют более быстро, эффективно и продолжительно.

При развитии иммунного ответа составляющие иммунной системы позвоночных животных— клетки и гуморальные факторы естественного иммунитета и антигенраспознающей системы — действуют взаимосвязанно.

Организация иммунной системы большинства рыб уже во многом предвосхищает организацию иммунной системы высших позвоночных, и рыбы способны к проявлению всех форм иммунного ответа, свойственных млекопитающим. Однако иммунная система рыб более лабильна и восприимчива к изменению внешних условий. С одной стороны, это приводит к тому, что в неблагоприятных условиях у рыб снижается устойчивость к условно-патогенным и непатогенным симбионтам и появляется риск заболевания инфекционными и инвазионными болезнями, вызванными этими организмами [Бауер и др., 1981; Юнчис, 2000]. С другой стороны, такая чувствительность иммунной системы рыб дает возможность разработки новых, более точных, быстрых и недорогих методов определения состояния среды обитания водных животных, воздействия техногенных факторов на живые организмы и характера их ответа [Криксунов и др., 1999; Смуров, 2000]. Иммунная система как система защиты организма от чужеродного воздействия является чрезвычайно чувствительной к токсическому действию химических веществ, присутствующих в очень низких концентрациях, которые не приводят к привычному «очевидно» вредному эффекту. Сегодня в результате экспансии человеческой деятельности практически на все природные зоны и нерационального отношения человека к окружающей природе многие иммунологические параметры рыб стали использоваться как биомаркеры для мониторинга иммунотоксичности химических загрязнителей сред обитания диких видов и для предсказания токсикологического риска, связанного с загрязнением водных сред. Таким образом, исследование показателей иммунной системы рыб не только представляет материал для выявления новых филогенетических связей между различными группами животных, но и служит решению практических задач, таких как эффективное промышленное разведение рыб, экологическое моделирование и достоверное предсказание изменений экологической обстановки биогеоценозов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Иммунная система рыб представляет собой совокупность гуморальных факторов защиты и продуцирующих их клеточных элементов, которые могут составлять рециркулирующую популяцию клеток крови или быть организованными в тканевые и органные структуры.

Заключение Диссертация по теме "Ихтиология", Киташова, Александра Анатольевна

7. ВЫВОДЫ

1. Лечение радужной форели, заболевшей энтеритом, лекарственными препаратами приводит к улучшению внешнего вида рыб, состояния кишечника и печени, уменьшению вплоть до нормы патогенных бактерий (Alcaligenes sp. и Citrobacter freundii) в кишечнике рыб и паразитов на поверхности кожи рыб (Argulus sp. и Diplostomum sp.), уменьшению скорости оседания эритроцитов, изменению белкового состава сыворотки крови и повышению концентрации гемоглобина и лизоцима в крови рыб. Наибольший положительный эффект в лечении энтерита рыб проявляют комплексный препарат нифулин в дозе 1 кг/т корма и антибиотик группы тетрациклинов биовит-80 в дозе 12,5 кг/т корма. Названные лекарственные препараты можно рекомендовать для лечения энтерита при разведении рыб в рыбных хозяйствах.

2. Заражение наваги и трески Белого моря скребнем Echinorhynchus gadi вызывает уменьшение содержания в крови форменных элементов и гемоглобина, повышение концентрации в сыворотке крови белка и лизоцима, появление в сыворотке новых фракций белка.

3. Оптимизирован метод твердофазного иммуноферментного анализа для определения специфического взаимодействия сывороток рыб с возбудителями заболеваний (подобраны концентрации антигена, антител и меченого конъюгата). На основе твердофазного иммуноферментного анализа экспериментально разработана и апробирована тест-система для диагностики заболевания рыб. Охарактеризован специфический иммунитет радужной форели к баетериям Alcaligenes sp. и Citrobacter freundii. Регистрируемое с помощью разработанной тест-системы увеличение в сыворотке крови рыб титра антител к микроорганизмам флоры кишечника позволяет определять патогены рыб.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные данные об иммунитете рыб подтверждают присутствие у рыб, как и у высших позвоночных, развитой иммунной системы, способной адекватно реагировать на нарушение гомеостаза организма рыб и противостоять внешней агрессии и внутренним нарушениям на молекулярном, надмолекулярном и клеточном уровне. Однако противоречивость накопленных данных, обусловленная значительными различиями между классами и группами рыб, лабильностью их иммунитета и его чувствительностью к изменениям условий среды обитания, а также отсутствием системного подхода к изучению иммунных механизмов рыб, не позволяет создать целостную картину организации и функционирования иммунной системы этих животных. Необходимы дальнейшие исследования, которые могли бы дополнить имеющиеся данные. Полученные в работе результаты показывают участие врожденной составляющей иммунной системы в противоинфекционных и противоинваз ионных реакциях организма рыб и наличие специфического иммунного ответа на условно-патогенную микрофлору кишечника, вызвавшую заболевание рыб в стрессовой ситуации.

В первой части диссертационной работы предпринято исследование показателей врожденного иммунитета рыб в зависимости от инфекции и зараженности паразитами. Иммунные реакции при бактериальной инфекции изучены у радужной форели, содержавшейся в условиях прудового хозяйства. Согласно данным литературы, промышленно разводимые рыбы характеризуются низкой зараженностью паразитами, но у них часты бактериальные инфекции. Исследуемые рыбы содержались при повышенной температуре и недостаточности естественных кормов, кроме того, подверглись стрессу при перевозке из одного рыбного хозяйства в другое. У них был ослаблен иммунитет, в кишечнике размножились условно-патогенные сапрофитные микроорганизмы (Alcaligenes sp. и Citrobacter freundii), и рыбы, в обычных условиях устойчивые к этим симбионтам, заболели энтеритом. Инфицирование вызвало активацию механизмов врожденного иммунитета: изменился белковый состав сыворотки крови заболевших рыб, повысилась концентрация лизоцима. Возросла скорость оседания эритроцитов, в крови уменьшилась концентрация гемоглобина. При лечении использовали четыре лекарственных препарата различных классов. Показано, что терапия приводит к улучшению состояния рыб (нормализации внешнего вида, кишечника, печени, уменьшению количества возбудителей заболевания или их исчезновению, улучшению биохимических показателей сыворотки крови), однако эффективность терапевтических агентов различна: наибольший положительный эффект при лечении энтерита рыб проявили комплексный препарат нифулин и антибиотик тетрациклинового ряда биовит-80.

Врожденную иммунореактивность при паразитарной инвазии наблюдали у морских рыб в естественных условия обитания (наваги и трески Белого моря). В этом случае инфекционные заболевания редки, однако паразиты являются характерными симбионтами морских рыб. Исследуемые рыбы являются основными дефинитивными хозяевами скребня Echinorhynchus gadi. Обнаружено, что у зараженных скребнем рыб уменьшилось содержание в крови форменных элементов, гемоглобина, снизилась скорость оседания эритроцитов. Установлено, что у зараженных паразитами наваги и трески в естественных условиях обитания изменились показатели врожденного гуморального иммунитета: на электрофореграмме сыворотки крови выявлены новые фракции белка, в сыворотке увеличилась общая концентрация белка и возрос уровень лизоцима.

Сравнение комплексных данных, полученных в первой части работы, показало, что факторы врожденного иммунитета являются надежными и достоверными показателями состояния иммунитета рыб. Нарушение целостности внутренней среды организма рыб вследствие внешней агрессии стимулирует повышение концентрации белка, лизоцима в сыворотке крови рыб и появление новых белков. Отклонение этих показателей от нормы свидетельствует о патологическом состоянии животных. Увеличение содержания лизоцима при паразитарной инвазии позволяет предположить существование новых, неизученных свойств этого белка.

Во второй части работы экспериментально разработана тест-система на основе метода твердофазного ИФА, позволяющая определить наличие специфических антител в сыворотках рыб и диагностировать возбудителя заболевания. Тест-система апробирована для обнаружения специфических антител у радужной форели, заболевшей энтеритом, вызванной условно-патогенными сапрофитными бактериями Alcaligenes sp. и Citrobacter freundii. Из литературы известно, что не всегда в ходе иммунного ответа вырабатываются специфические антитела, однако полученные в работе результаты показывают, что в сыворотке радужной форели присутствуют антитела, специфические к возбудителям заболеваний.

Таким образом, в работе охарактеризованы параметры врожденного и приобретенного иммунитета радужной форели. Эти данные, а также обсуждаемые в литературе механизмы иммунной защиты у рыб, свидетельства их лабильности и зависимости от условий среды обитания позволяют предложить схему использования показателей иммунной системы рыб (содержание в сыворотке белковых фракций, лизоцима, антител) как в естественных условиях обитания, так и в аквакулыуре, в качестве биомаркеров для определения состояния здоровья животных и диагностирования заболевания, а также для оценки на основе этих данных качества среды обитания, проведения биотестирования и биомониторинга техногенного воздействия на среду обитания диких видов, разработки рекомендаций для рыбоводческих хозяйств (рис. 21). белковые фракции

Внешнее воздействие Д

РЫБА

Сыворотка лизоцим антитела оценка иммунного статуса организма рыб диагностирование заболевания оценка здоровья животных оценка качества среды обитания биотестирование и биомониторинг техногенного воздействия на среду обитания диких видов рекомендации для рыбоводческих хозяйств

Рис. 21. Схема использования показателей врожденного и приобретенного гуморального иммунитета рыб для оценки внешнего воздействия

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Киташова, Александра Анатольевна, Москва

1. Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны в ветеринарии. Справочник / Сост.: В.Ф. Ковалев, И.Б. Волков, Б.В. Виолин и др. М.: Агропромиздат, 1989.

2. Балахнин И.А. 1986. Частота встречаемости естественных антител у карпа и определение иммунологической зрелости сеголетков. Доклады АН УССР, серия Б, 6:62-64.

3. Балахнин И.А., Томиленко В.Г., Темниханов Ю.Д., Козиненко И.И., Литвиненко В.В., Мазъяр М.И., Компанеец Э.В. 1989. Иммунологические и биологические характеристики украинских линий Cyprinus carpió. Вопросы ихтиологии, 29:650-655.

4. Балахнин И.А., Лукьяненко В.И. 1991. Активация неспецифических факторов защиты рыб углеводами. Доклады АН СССР, 318:1254-1256.

5. Балахнин И.А., Неборачин И.С. 1991. Трансплантационные реакции у рыб. Критический анализ. Доклады АН СССР, 318:62-66.

6. Балахнин И.А. 1992. Дискуссионные вопросы иммунологии рыб. 8-я научная конференция по экологической физиологии и биохимии рыб, 30 сент.-З окт. 1992 г. Тезисы докладов, 1:16-17.

7. Бауер О.Н., Мусселиус В.А., Стрелков Ю.А. 1981. Болезни прудовых рыб / Изд. 2-е, переработанное и дополненное. М.: Легкая и пищевая промышленность.

8. Безгачина Т.В. 2000. Международный ихтиопатологический рейс судна «Вальтер Хервиг III» в Балтийском море. Паразиты и болезни рыб: сборник научных трудов. М: ВНИРО, с. 16-19.

9. Быховская-Павловская И.Е. 1985. Паразиты рыб. Руководство по изучению. Л.: Наука.

10. Васильков Г.В. 1999. Паразитарные болезни рыб и санитарная оценка рыбной продукции. М: ВНИРО.

11. Вихман A.A. 1984. Иммунопрофилактика болезней рыб. Биологические ресурсы гидросферы и их использование. Биологические основы рыбоводства: паразиты и болезни рыб. М.: Наука.

12. Галактионов В.Г. 1998. Иммунология. М.: МГУ.

13. Гиченок Л.А. 1996. Паразитарная система Echinorhynchus gadi в условиях беломорской сублиторали. Тезисы IV Всероссийского симпозиума по популяционной биологии паразитов, 27-28.

14. Говядинова A.A. 1998. Исследование локализации и особенностей строения кроветворной ткани у осетровых рыб. Автореф. дис. . канд. биол. н. М., 24 с.

15. Говядинова A.A., Ланге М.А., Хрущов Н.Г. 2000. Гемопоэтические органы уникальной локализации у осетровых рыб. Онтогенез, 31:440-445.

16. Гревати А.Д. 1991. Электронномикроскопическое исследование клеток крови и кроветворных органов зеркального карпа. Автореф. дис. . канд. биол. н. М., 24 с.

17. Добринская J1.A. 1973. Иммунологическая дифференциация видов и популяций рыб. Труды Ин-та экологии растений и животных Уральского филиала АН СССР, 86:95-106.

18. Егоров Н.С. 1994. Основы учения об антибиотиках. М: МГУ.

19. Золотова Т.Е. 1989. Экспериментальное исследование кроветворения у рыб. Автореф. дис. . канд. биол. н. М., 24 с.

20. Иванова Н.Т. 1983. Атлас клеток крови рыб. М.: Легкая и пищевая промышленность.

21. Исаева Н.М., Козиненко И.И. 1992. Влияние химических соединений на иммунный статус рыб в аквакультуре. Вопросы ихтиологии, 32:157-167.

22. Исаева Н.М., Козиненко И.И., Балахнин И.А. 1992. Перспективные способы оздоравливания рыб в аквакультуре: обзор. Вопросы ихтиологии, 32:140-147.

23. Калашников Г.Н. 1939. Состав крови рыб. Уч. зап. МГУ, сер. гидробиол., вып. 33.

24. Калашникова З.М. 1976. О классификации морфологических элементов крови рыб. Вопросы ихтиологии, 16:510-525.

25. Клаус Дж. (ред.) 1990. Лимфоциты: методы. М.: Мир.

26. Кокряков В.Н. 1999. Биология антибиотиков животного происхождения. С.-П.: Наука.

27. Компанеец Э.В., Темниханов Ю.Д., Просяная В.В. 1990. Иммунологические показатели у карпа при экспериментальном вирусном и бактериальном заражении. Рыбное хозяйство, 44:61-64.

28. Кондратьева И.А., Воробьева Н.В., Буракова О.В., Фрезе К.В., Егорова С.Г., Мойсенович М.М., Киркин А.Ф., Пинегин Б.В., Симонова А.В., Киташов А.В., Рокк Ф. Практикум по иммунологии / Под ред. И.А. Кондратьевой, В.Д. Самуилова. М.: МГУ, 2001.

29. Кондратьева И. А., Киташова А.А., Наумова А.Ю. 2002. Действие лекарственных препаратов на молодь радужной форели Oncorhynchus mykiss Richardson. Вопросы рыболовства, №5 (9), т. 3 (в печати).

30. Кулинич Н.Н., Галатюк А.Е. 1986. Определение Т- и В-лимфоцитов в периферической крови карпа. Ветеринария, 11:28-29.

31. Купер Э. 1980. Сравнительная иммунология. М.: Мир.

32. Кэтти Д. (ред.) 1991. Антитела: Методы. В 2 т. М.: Мир.

33. Лабинская A.C. 1978. Микробиология с техникой микробиологическихисследований. М.: Медицина.

34. Лакин Г.Ф. 1990. Биометрия / Изд. 4-е, переработанное и дополненное. М.: Высш. шк.

35. Ланге М.А., Потапина Н.В., Хрущов Н.Г. 1987. Морфологическое и авторадиографическое исследование крови личинки ручьевой миноги (пескоройки) Lampetra planeri Bloch, в норме и в условиях воспалительного процесса. Ж. Общ. Биол., 48:411-416.

36. Ланге М.А., Потапина Н.В., Хрущов Н.Г. 1990. Морфологическое и авторадиографическое исследование кроветворных органов личинок ручьевой миноги {Lampetraplaneri) разного возраста. Ж. Общ. Биол., 51:796-808.

37. Лукьяненко В.И. 1989. Иммунобиология рыб. Врожденный иммунитет. 2-е изд., перераб и доп. М.: Агропромиздат.

38. Медников Б.М., Попов Л.С., Антонов A.C. 1973. Характеристики первичной структуры ДНК как критерии для построения естественной системы рыб. Ж. Общ. Биол., 34:516-529.

39. Микитюк П.В. 1984. Справочник по болезням прудовых рыб. М.: Урожай.

40. Определитель бактерий Берджи. В 2 т. / Дж. Хоулт, Н. Криг. М.: Мир, 1997.

41. Сильченко Г.Ф., Попов A.A. 1992. Влияние экологических факторов на распространение лигулеза леща Куйбышевского водохранилища. Экология, 6:51-56.

42. Скворцов А.К. 1947. О строении селезенки костистых рыб. ДАН СССР, 58:1159-1162.

43. Смуров A.B. 2000. Экологическая диагностика. Сер. Экологическая безопасность России. М., с. 391-404.

44. Соколов В.Д., Рабинович М.И., Горшков Г.И. и др. 2000. Фармакология / Под ред. В.Д. Соколова. 2-е изд., испр. и доп. М.: Колос.

45. Солдатов A.A. 1988. Эритропоэз и гемоглобиновая система у бычка Gobius batrachocephalus при температурной адаптации. Ж. эвол. биох. и физиол., 4:601-603.

46. Строев Е.А., Макарова В.Г. 1986. Практикум по биологической химии. М.: Высшая школа.

47. Суворов Е.К. 1948. Основы ихтиологии. Государственное издательство «Советская наука».

48. Фонталин J1.H. 1988. Проблема происхождения иммунной системы позвоночных животных. Иммунология, 3:5-20.

49. Фонталин Jl.H. 1998. Происхождение антигенраспознающей иммунной системы позвоночных. Молекулярно-биологические и иммунологические аспекты. Иммунология, 5:33-44.

50. Хрущов Н.Г., Ланге М.А., Золотова Т.Е., Бессонов А.В. 1993. Характеристика клеток эритроидного ростка у зеркального карпа (перспективы использования при оценке физиологического состояния рыб). Изв. АН, серия биол., 1:83-87.

51. Шульман С.С., Шульман-Альбова Р.Е. 1953. Паразиты рыб Белого моря. М.-Л.: АН СССР.

52. Юнчис О.Н. 2000. Паразиты как индикаторы состояния среды. Паразиты и болезни рыб: сборник научных трудов. М: ВНИРО, с. 146-152.

53. Ярилин А.А. 1999. Основы иммунологии. М.: Медицина.

54. Aaltonen T.V., Jokinen E.I., Salo Н.М., Markkula S.E., Lammi R. 2000. Modulation of immune parameters of roach, Rutilus rutilus, exposed to untreated ECF and TCF bleached pulp effluents. Aquat. Toxicol., 47:277-289.

55. Abelli L., Picchietti S., Romano N. Mastrola L., Scapigliati G. 1996. Immunocytochemical detection of thymocyte antigenic determinants in developing lymphoid organs of sea bass Dicentrarchus labrax (L.). Fish Shellfish Immunol., 6:493-505.

56. Abelli L., Picchietti S., Romano N., Mastrola L., Scapigliati G. 1997. Immunohistochemistry of gut-associated lymphoid tissue of the sea bass Dicentrarchus labrax (L.). Fish Shellfish Immunol., 7:235-246.

57. Abelli L., Baldassini M.R., Mastrolia L., Scapigliati G 1999. Immunodetection of lymphocyte subpopulations involved in allograft rejection in a teleost, Dicentrarchus labrax (L.). Cell. Immunol., 191:152-160.

58. Acton R.T., Weinheimer P.F., Hall S.J., Niedermeier W., Shelton E., Bennett J.C.1971. Tetrameric immune macroglobulins in three orders of bony fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68:107-111.

59. Acton R.T., Niedermeier W., Weinheimer P.F., Clem L.W., Leslie GA., Bennett J.C.1972. The carbohydrate composition of immunoglobulins from diverse species of vertebrates. J. Immunol., 109:371-381.

60. Agius C. 1981. Preliminary study on the ontogeny of the melano-macrophages of teleost haematopoietic tissues and age-related changes. Dev. Comp. Immunol., 5:597-606.

61. Alexander J.B., Ingram G.A. 1992. Noncellular nonspecific defense mechanisms of fish. Annu. Rev. Fish Dis., 2:249-279.

62. Al-Harbi A.H., Austin B. 1992. The immune response of turbot, Scophthalmus maximus (L.), to lipopolysaccharide from a fish-pathogenic Cytophaga-Yike bacterium. J. Fish Dis., 15:449-452.

63. Anderson D.P., Dixon O.W. 1989. Suppression of antibody-producing cells in rainbow trout spleen sections exposed to copper in vitro. J. Aquat. Anim. Health, 1:57-61.

64. Anderson D.P., Jeney G 1992. Immunostimulants added to injected Aeromonas salmonicida bacterin enhance the defense mechanism and protection in rainbow1. X .trout (Oncorhynchus mykiss). Vet. Immunol. Immunopathol., 34:379-389.

65. Angelidis P., Baudin-Laurencin F., Youinou P. 1991. Drug-indused modulation of immune function in the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Int. J. Immunopathol. Pharmacol., 4:163-171.

66. Avtalion R.R., Shahrabani R. 1975. Studies on phagocytosis in fish: in vitro uptake and killing of living Staphylococcus aureus by peripheral leucocytes of carp (Cyprinus carpió L.). Immunology, 29:1181-1187.

67. Baumann P.C. 1998. Epizootics of cancer in fish associated with genotoxins in sediment and water. Mutation Res., 411:227-233.

68. Beacham T.D., Evelyn T.P.T. 1992. Population variation in resisatance of pink salmon to vibriosis and furunculosis. J. Aquat. Anim. Health, 4:168-173.

69. Belov K., Harrison G.A., Miller R.D., Cooper D.W. 2001. Characterisation of the kappa light chain of the brushtail possum (Trichosurus vulpécula). Vet. Immunol. Immunopathol., 78:317-324.

70. Bengten E., Leanderson T., Pilstrom L. 1991. Immunoglobulin heavy chain cDNA from the teleost Atlantic cod (Gadus morhua L.): nucleotide sequences of secretoryand membrane form show un unusual splicing pattern. Eur. J. Immunol., 21:30273033.

71. Biggar W.D., Sturgess J.M. 1977. Role of lysozyme in the microbicidal activity of rat alveolar macrophages. Infect. Immun., 16:974-982.

72. Blazer V.S. 1992. Nutrition and disease resistance in fish. Annu. Rev. Fish Dis., 2:309-323.

73. Bloom W., Fawsett D.W. 1986. A text book of Histology. 11th ed., W.B. Saunders Company.

74. Bly J.E., Clem L.W. 1991. Temperature-mediated processes in teleost immunity: In vitro immunosuppression induced by in vivo low temperature in channel catfish. Vet. Immunol. Immunopathol., 28:365-377.

75. Bly J.E., Clem L.W. 1992. Temperature and teleost immune functions. Fish Shellfish Immunol., 2:159-172.

76. Botham J.W., Manning M.J. 1981. The histogenesis of the lymphoid organs in the carp Cyprinus carpio L. and the ontogenetic development of allograft reactivity. J. Fish Biol., 19:403-414.

77. Bowden T.J., Butler R., Bricknell I.R., Ellis A.E. 1997. Serum trypsin-inhibitory activity in five species of farmed fish. Fish Shellfish Immunol., 7:377-385.

78. Bower S.M., Evelyn T.RT. 1988. Acquired and innate resistance to the haemoflagellate Cryptobia salmosifica in sockeye salmon (Oncorhynchus nerka). Dev. Comp. Immunol., 12:749-760.

79. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72:248-254.

80. Brubacher J.L., Secombes C.J., Zou J., Bols N.C. 2000. Constitutive and LPS-induced gene expression in a macrophage-like cell line from the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Dev. Comp. Immunol., 24:565-574.

81. Bucke D., Dixon P.F., Feist S.W., Law R.J. 1989. The measurement of disease susceptibility in dab, Limanda limanda L., following long-term exposure to contaminated sediments: Preliminary studies. Resp. Mar. Org. Pollutants, 28:363367.

82. Buchmann K., Oestergaard L., Glammann J. 1992. Affinity purification of antigen-specific serum immunoglobulin from the European eel (Anguilla anguilla). Scand. J. Immunol., 36:89-97.

83. Buchmann K., Sigh J., Nielsen C.V., Dalgaard M. 2001. Host responses against the fish parasitizing ciliate Ichthyophthirius multifiliis. Vet. Parasitol., 100:105-116.

84. Buentello J.A., Gatlin D.M. III. 1999. Nitric oxide production in activated macrophages from channel catfish (Jctalurus punctatus): influence of dietary arginine and culture media. Aquaculture, 179:513-521.

85. Cadwell C.A., Hinshaw J.M., Kattesh H.G. 1990. Validation of a solid-phase enzyme immunoassay technique for the measure of plasma Cortisol in rainbow trout. J. Aquat. Anim. Health, 2:228-230.

86. Caspi R.R., Avtalion R.R. 1984. Evidence for the existence of an IL-2 like lymphocyte growth promoting factor in a bony fish Cyprinus carpio. Dev. Comp. Immunol., 8:51-60.

87. Chilmonczyk S. 1983. The thymus of the rainbow trout (Salmo gairdneri) light and electron microscopic study. Dev. Comp. Immunol., 7:59-68.

88. Clem L.W., Sizemoro R.C., Ellsaesser C.F., Miller N.W. 1985. Monocytes as accessory cells in fish immune responses. Dev. Comp. Immunol., 9:803-809.

89. Clerton R, Troutaud D., Verlhac V., Gabaudan J., Deschaux R 2001. Dietary vitamin E and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) phagocyte functions: effect on gut and on head kidney leucocytes. Fish Shellfish Immunol., 11:1-13.

90. Dethloff G.M., Bailey H.C., Maier K.J. 2001. Effects of dissolved copper on select hematological, biochemical, and immunological parameters of wild rainbow trout {Oncorhynchus mykiss). Arch. Environ. Contam. Toxicol., 40:371-380.

91. Dixon B., Shum B.R, Adams E.J., Magor K.E., Parham P. 1997. Isolation of a beta-chemokine like cDNA from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Dev. Comp. Immunol., 21:187.

92. Douglas S.E., Gallant J.W., Gong Z., Hew C. 2001. Cloning and developmental expression of a family of pleurocidin-like antimicrobial peptides from winter flounder, Pleuronectes americanus (Walbaum). Dev. Comp. Immunol., 25:137-147.

93. Dustin L.B., Shea C.M., Soberman R.J., Lu C.Y. 1990. Docosahexaenoic acid, a constituent of rodent fetal serum and fish oil diets, inhibits acquisition of macrophage tumoricidal function. J. Immunol., 144:4888-4897.

94. Ellis A.E. 1977. The leucocytes offish: a review. J. Fish Biol., 11:435-491.

95. Ellis A.E. 1980. Antigen trapping in the spleen and kidney of the plaice Pleuronectesplatessa L. J. Fish Dis., 3:413-426.

96. Ellis A.E. 1986. The function of teleost fish lymphocytes in relation to inflammation. Int. J. Tissue React., 8:263-270.

97. Ellis A.E. 1987. Inhibition of the Aeromonas salmonicida extracellular protease by a2-macroglobulin in the serum of rainbow trout. Microb. Pathog., 3:167-177.

98. Espelid S., Lokken G.B., Steiro K., Bogwald J. 1996. Effects of Cortisol and stress on the immune system in Atlantic salmon {Salmo salar L.). Fish Shellfish Immunol., 6:95-110.

99. Estepa A., Frias D., Coll J.M. 1992. Susceptibility of trout kidney macrophages to viral haemorrhagic septicemia virus. Viral Immunol., 5:283-292.

100. Estevez J., Leiro J., Santamarina M.T., Ubeira F.M. 1995. A sandwich immunoassay to quantify low levels of turbot {Scophthalmus maximus) immunoglobulins. Vet. Immunol. Immunopathol., 45:165-174.

101. Evans D.L., Jaso-Friedmann L. 1992. Nonspecific cytotoxic cells as effectors of immunity in fish. Annu. Rev. Fish Dis., 2:109-121.

102. Faisal M., Huggett R.J. 1993. Effects of polycyclic aromatic hydrocarbons on the activity of lymphocytes of the spot Leiostomus xanthurus. Mar. Environ. Res., 35:121-124.

103. Fange R. 1986. Lymphoid organs in sturgeons (Acipenseridae). Vet. Immunol. Immunopathol., 12:153-161.

104. FichteliusK.E., Finstad J., Good R.A. 1968. Bursa equivalent of bursaless vertebrates. Lab. Invest., 19:339-351.

105. Flajnik M.F., Ohta Y., Namikawa-Yamada C., Nonaka M. 1999. Insight into the primordial MHC from studies in ectothermic vertebrates. Immunol. Rev., 167:59-67.

106. Fletcher T.C., White A. 1973. Antibody production in the plaice Pleuronectes platessa, after oral and parenteral immunization with Vibrio anguillarum antigens. Aquaculture, 1:417-428.

107. Fletcher T.C., White A. 1973. Lysozyme activity in plaice {Pleuronectes platessa L.). Experientia, 29:1283-1285.

108. Fock W.L., Chen C.L., Lam T.J., Sin Y.M. 2001. Roles of an endogenous serum lectin in the immune protection of blue gourami, Trichogaster trichopterus (Pallus) against Aeromonas hydrophila. Fish Shellfish Immunol., 11:101-113.

109. Fonge R., Lundblad G., Lind J. 1976. Lysozyme and chitinase in blood and lymphomyeloid tissues of marine fish. Marine Biol., 36:277-282.

110. Ford L.A., Thune R.L. 1992. Immunisation of channel catfish with a crude, acid-extracted preparation of motile aeromonad S-layer protein. Biomed. Lett., 47:355362.

111. Francis C.H., Ellis A.E. 1994. Production of a lymphokine (macrophage activating factor) by salmon (Salmo salar) leukocytes stimulated with outer membrane protein antigens of Aeromonas salmonicida. Fish Shellfish Immunol., 4:489-497.

112. Glynn P.J., Pulsford A.L. 1993. Tryptic digestion of serum immunoglobulin of the flounder, Platichthysflesus. J. Mar. Biol. Assoc. UK, 73:425-436.

113. Graham S., Secombes C.J. 1990. Cellular requirements for lymphokine secretion by rainbow trout, Salmo gairdnery. Dev. Comp. Immunol., 5:75-83.

114. Graves S.S., Evans D.L., Cobb D., Dawe D.L. 1984. Nonspecific cytotoxic cells in fish (Ictalurus punctatus). I. Optimum requirements for target cell lysis. Dev. Comp. Immunol., 8:293-302.

115. Graves S.S., Evans D.L., Dawe D.L. 1985. Antiprotozoan activity of nonspecific cytotoxic cells (NCC) from the channel catfish (Ictalurus punctatus). J. Immunol., 134:78-85.

116. Grinde B. 1989. Lysozyme from rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, as an antibacterial agent against fish pathogens. J. Fish Dis., 12:95-104.

117. Grinde B., Lie O., Poppe T., Salte R. 1988. Species and individual variation in lysozyme activity in fish of interest in aquaculture. Aquaculture, 68:299-304.

118. Grizzle J.M., Schweldler A.L., Scott A.L. 1981. Papillomas of black bullheads, Ictalurus melas (Rafinesque), living in a chlorinated sewage pond. J. Fish Dis., 4:345-351.

119. Haas R. 1982. Transplantation reactions in the African lungfish, Protopterus amphibius. Transplantation, 33:249-253.

120. Hajji N., Sugita H., Ishii S., Takahashi J., Deguchi Y. 1989. Serum bactericidal activity of natural and cultured carp (Cyprinus carpio). In: Program of the First IMBC'89, p. 45.

121. Hardie L.J., Fletcher T.C., Secombes C.J. 1990. The effects of vitamin E on the immune response of Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture, 87:1-13.

122. Hardie L.J., Fletcher T.C., Secombes C.J. 1991. The effects of dietary vitamin C on the immune response of Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture, 95:201-214.

123. Hart S., WrathmellA.B., Harris J.E., Grayson T.H. 1998. Gut immunology in fish: a review. Dev. Comp. Immunol., 12:453-480.

124. Hashimoto K., Nakanishi T., Kurosawa Y. 1990. Isolation of carp genes encoding major histocompatibility complex antigenes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:68636867.

125. Hastings T.S., Ellis A.E. 1990. Detection of antibodies indused in rainbow trout by different Aeromonas salmonicida vaccine preparations. J. Aquat. Anim. Health, 2:135-140.

126. Hjelmeland K. 1983. Proteinase inhibitors in the muscle and serum of cod (Gadus morhua). Isolation and characterization. Comp. Biochem. Physiol., 76B:365-372.

127. Hjeltnes B., Andersen K., Ellingsen H.M. 1989. Vaccination against Vibrio salmoncida. The effect of different routes of administration and of revaccination. Aquaculture, 83:1-6.

128. Hoeglund J., Thuvander A. 1990. Indications of non-specific protective mechanisms in rainbow trout Oncorhynchus mykiss with diplostomosis. Dis. Aquat. Org., 8:9197.

129. Hoeglund J., Andersson J., Haerdig J. 1992. Haematological responses in the European eel, Anguilla anguilla L., to sublethal infestation by Anguillicola crassus in a thermal effluent of the Swedish Baltic. J. Fish Dis., 15:507-514.

130. Holladay S.D., Smith S.A., El-Habback H., Caceci C. 1996. The influence of chlorpyrifos, an organophosphate insecticide, on the immune system of tilapia (Oreochromis niloticus). J. Aquat. Anim. Health, 8:104-110.

131. Hordvik I., Voie A.M., Glette J., Male R., Endresen C. 1992. Cloning and sequence analysis of two isotypic IgM heavy chain genes from Atlantic salmon, Salmo salar L. Eur. J. Immunol., 22:2957-2962.

132. Houghton G., Wiergertjes G.F., Groeneveld A., Van Muiswinkel W.B. 1991. Differences in resistance of carp, Cyprinus carpio L., to atipical Aeromonas salmonicida. Bact. Dis. Fish, 14:333-341.

133. Hutchinson T.H., Manning M.J. 1996. Seasonal trends in serum lysozyme activity and total protein concentration in dab (Limanda limanda L.) sampled from Lyme Bay, UK. Fish Shellfish Immunol., 6:473-482.

134. Irwin M.J., Kaattari S.L. 1986. Salmonid B lymphocytes demonstrate organ dependent functional heterogeneity. Vet. Immunol. Immunopathol., 12:39-45.

135. Ishiguro H., Kobayashi K., Suzuki M., Titani K., Tomonaga S., Kurosawa Y. 1992. Isolation of a hagfish gene that encodes a complement component. EMBO J., 11:829-837.

136. Islam A.K.M.N., Woo P.T.K. 1991. Trypanosoma danilewskyi in Carassius auratus: The nature of protective immunity in recovered goldfish. J. Parasitol., 77:258-262.

137. Jokinen E.I., Salo H.M., Markkula S.E., Aaltonen T.M., Immonen A.K. 2000. Effects of ultraviolet light on immune parameters of the roach. Toxicol. Lett., 112113:303-310.

138. Jokinen E.I., Salo H.M., Markkula S.E., Immonen A.K., Aaltonen T.M. 2001. Ultraviolet B irradiation modulates the immune system of fish (Rutilus rutilus, Cyprinidae). Part III: Lymphocytes. Photochem. Photobiol., 73:505-512.t

139. Jolles P., Jolles J. 1984. What's new in lysozyme research? Mol. Cell. Biochem., 63:165-189.

140. Jones S.R. 2001. The occurrence and mechanisms of innate immunity against parasites in fish. Dev. Comp. Immunol., 25:841-852.

141. Jorgensen J.B., Sharp G.J.E., Secombes C.J., Robertsen B. 1993. Effect of yeast-cell-wall glucan on the bactericidal activity of rainbow trout macrophages. Fish Shellfish Immunol., 3:51-58.

142. Jorgensen J.B., Johansen A., Stenersen B., Sommer A.I. 2001. CpG oligodeoxynucleotides and plasmid DNA stimulate Atlantic salmon (Salmo salar L.) leucocytes to produce supernatants with antiviral activity. Dev. Comp. Immunol., 25:313-321.

143. Junqueira L.C., Carneiro J., Kelley R.O. 1995. Basic Histology. Appleton & Lange, Stamford, Connecticut.

144. Kajita Y., Sakai M., Atsuta S., Kobayashi M. 1990. The immunomodulatory effects of levamisole on rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Fish Pathol., 25:93-98.

145. Karunasagar I., Rosalind G., Karunasagar I. 1991. Immunological response of the Indian major carps to Aeromonas hydrophila vaccine. Bact. Dis. Fish, 14:413-417.

146. Kasahara M., Vazquez M., Sato K., McKinney E.C., Flajnik M.F. 1992. Evolution of the major histocompatibility complex: isolation of class II A cDNA clones from the cartilaginous fish. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6688-6692.

147. Kitao T., Eshima T., Yoshida T. 1991. Analysis of protective mechanisms in cultured ayu, Plecoglossus altivelis Temminck and Schlegel, administered Vibrio vaccine by the immersion method. Bact. Dis. Fish, 14:372-381.

148. Kobayashi K., Hara A., Takano K., Hirai H. 1982. Studies on subunit components of immunoglobulin M from a bony fish, the chum salmon (Oncorhynchus keta). Mol. Immunol., 19:95-103.

149. Kobayashi K., Tomonaga S., Hadiwara K. 1985. Isolation and characterization of immunoglobulin of hagfish, Eptatretus burgeri, a primitive vertebrate. Mol. Immunol., 22:1091-1097.

150. Kobayashi K., Tomonaga S. 1988. The second immunoglobulin class is commonly present in cartilaginous fish belonging to the order rajiformes. Mol. Immunol., 25:115-120.

151. Kodama H., Yamada F., Murai T., Nakanishi J., Mikami T., Izava H. 1989. Activation of trout macrophages and production of CRP after immunization with Vibrio anguillarum. Dev. Comp. Immunol., 13:123-132.

152. Kokoshis P.L., Di Luzio N.R. 1979. Serum lysozyme: an index of macrophage function. J. Reticuloendothelial Society, 25:85-99.

153. Koumans-van Diepen J.C.E., Taverne-Thiele J.J., van Rens B.T.T.M., Rombout J.H.W.M. 1994a. Immunocytochemical and flow cytometric analysis of B cells and plasma cells in carp (Cyprinus carpio L.): an ontogenic study. Fish Shellfish Immunol., 4:19-28.

154. Koumans-van Diepen J.C.E., van de Lisdonk M.H.M., Taverne-Thiele A.J.L., Verburg-van-Kemenade B.M., Rombout J.H.W.M. 1994b. Characterization of immunoglobulin-binding leukocytes in carp (Cyprinus carpio L.). Dev. Comp. Immunol., 18:45-56.

155. Koumans-van Diepen J.C.E., Egberts E., Peixoto B.R., Taverne N., Rombout J.H.W.M. 1995. B cell and immunoglobulin heterogeneity in carp (Cyprinus carpio L.): an immuno(cyto)chemical study. Dev. Comp. Immunol., 19:97-108.

156. Kuby J. 1992. Immunology. W.H. Freeman & Company, New York.

157. Laing K.J., Wang T., Zou J., Holland J., Hong S., Bols N., Hirono I., Aoki T., Secombes C.J. 2001. Cloning and expression analysis of rainbow trout Oncorhynchus my kiss tumour necrosis factor-alpha. Eur. J. Biochem., 268:13151322.

158. Lamers C.H.J., De Haas M.J.H., Van Muiswinkel W.B. 1985. Humoral response and memory formation in Carp after injection of Aeromonas hydrophila bacterin. Dev. Comp. Immunol., 9:65-75.

159. Lamers C.H.J., Parmentier H.K. 1985. The fate of intraperitoneally injected carbon particles in cyprinid fish. Cell Tissue Res., 242:499-503.

160. Landolt M.L. 1989. The relationship between diet and the immune response of fish. Aquaculture, 79:193-206.

161. Lavelle E.C., Harris J.E. 1997. The processing of an orally administered protein in the digestive tract of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Comp. Biochem. Physiol., 117A:263-275.

162. Law W.Y., Chen W.H., Song Y.L., Dufour S., Chang C.F. 2001. Differential in vitro suppressive effects of steroids on leukocyte phagocytosis in two teleosts, tilapia and common carp. Gen. Comp. Endocrinol., 121:163-172.

163. Lehrer R.I., Ganz T. 1996. Endogenous vertebrate antibiotics. Defensins, protegrins and other cysteine-rich antimicrobial peptides. Ann. N.-Y. Acad. Sci., 797:228-239.

164. Lie O., Evensen O., Sorensen A., Froysadal E. 1989. Study on lysozyme activity in some fish species. Dis. Aquat. Org., 6:1-5.

165. Lillehaug A. 1989a. A survey on different procedures used for vaccinating salmonids against vibriosis in Norwegian fish-farming. Aquaculture, 83:217-226.

166. Lillehaug A. 1989b. A cost-effectiveness study of three different methods of vaccinating against vibriosis in salmonids. Aquaculture, 83:227-236.

167. Lillehaug A., Sevatdal S., Endal T. 1996. Passive transfer of specific maternal immunity does not protect Atlantic salmon (Salmo salar L.) fry against yersiniosis. Fish Shellfish Immunol., 6:521-535.

168. Lobb C.J., Clem L.W. 1981a. Phytogeny of immunoglobulin structure and function XI. Secretory immunoglobulins in the cutaneous mucus of the sheepshead Archosargusprobotocephalus. Dev. Comp. Immunol., 5:587-596.

169. Lobb C.J., Clem L.W. 1981b. Phylogeny of immunoglobulin structure and function XII. Secretory immunoglobulins in the bile of the marine teleost Archosargusprobatocephalus. Mol. Immunol., 18:615-619.

170. Lobb C.J., Olson M.O.J., Clem L.W. 1984. Immunoglobulin light chain classes in a teleost fish. J. Immunol., 132:1917-1923.

171. Lobb C.J., Olson M.O.J. 1988. Immunoglobulin heavy H chain isotypes in a teleost fish. J. Immunol., 141:1236-1245.

172. Logtenberg T. 1990. Properties of polyreactive natural antibodies to self and foreign antigenes. J. Clin. Immunol., 10:137-140.

173. Lund V., Olafsen J.A. 1998. A comparative study of pentraxin-like proteins in different fish species. Dev. Comp. Immunol., 22:185-194.

174. Lunden T., Miettinen S., Lonnstrom L.G., Lilius E.-M., Bylund G. 1998. Influence of Oxytetracycline and oxolinic acid on the immune response of rainbow trout»

175. Oncorhynchus mykiss). Fish Shellfish Immunol., 3:217-230.

176. Macouzet M., Simpson B.K., Lee B.H. 1999. Cloning of fish enzymes and other fish protein genes. Crit. Rev. Biotechnol., 19:179-196.

177. Magnadottir B. 1990. Purification of immunoglobulin from the serum of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Buvisindi. Icel. Agr. Sei., 4:49-54.

178. Magnadottir B. 1998. Comparison of immunoglobulin (IgM) from four fish species. Buvisindi, Icel. Agr. Sei., 12:51-63.

179. Magnadottir B. 1999. Humoral immune parameters of teleost fish. Ph.D. Thesis. Keldur, Iceland.

180. Magnadottir B., Jonsdottir H., Helgason S., Bjornsson B., Solem S.T., Pilstrom L. 2001. Immune parameters of immunised cod (Gadus morhua L.). Fish Shellfish Immunol., 11:75-89.

181. Mahajan C.L., Dheer T.R. 1982. Regenerative capacity of the spleen in a splenectomized fish, Channa punctatus Bloch., with related investigations into changes in peripheral blood and haematopoietic tissues. J. Fish Biol., 20:657-666.

182. Marchalons J.J. 1971. Isolation and partial characterization of immunoglobulins of goldfish (Carassius auratus) and carp (Cyprinus carpio). J. Immunol., 20:161-174.

183. Marchalonis J.J., Schluter S.F., Yang H.Y., McGee K., Yeaton L. 1992. Antigenic cross-reactions among immunoglobulin of diverse vertebrates (elasmobranchs to man) detected using xenoantisera. Comp. Biochem. Physiol., 101A:675-687.

184. Matsunaga T., Rahman A. 1998. What brought the adaptive immune system to vertebrates? — The jaw hypothesis and the seahorse. Immunol. Rev., 166:177-186.

185. Matsunaga T., Rahman A. 2001. In search of the origin of the thymus: the thymus and GALT may be evolutionary related. Scand. J. Immunol., 53:1-6.

186. Maule A.G., Schreck C.B., Sharpe C. 1993. Seasonal changes in Cortisol sensitivity and glucocorticoid receptor affinity and number in leukocytes of coho salmon. Fish Physiol. Biochem., 10:497-506.

187. Melingen G.O., Steffanson S.O., Berg A., Wergeland h.I. 1995. Changes in serum protein and IgM concentration during smoking and early post-smolt period invaccinated and unvaccinated Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish Shellfish Immunol., 5:211-221.

188. Miller N.W., Sizemore R.C., Clem L.W. 1985. Phylogeny of lymphocyte heterogenity: the cellular requirements for in vitro antibody responses of channel catfish leucocytes. J. Immunol., 134:2884-2888.

189. Moody C.E., Serreze D.V., Reno P.W. 1985. Non-specific cytotoxic activity of teleost leukocytes. Dev. Comp. Immunol., 9:51-64.

190. Moore A.A., Eimers M.E., Cardella M.A. 1990. Attempt to control Flexibacter columnaris epizootics in pond-reared channel catfish by vaccination. J. Aquat. Anim. Health, 2:109-111.

191. Moore J.D., Ototake M., Nakanishi T. 1998. Particulate antigen uptake during immersion immunization of fish: the effectiveness of prolonged exposure and the roles of skin and gill. Fish Shellfish Immunol., 8:393-407.

192. Mor A., Avtalion A.A. 1990. Transfer of antibody activity from immunized mother to embrio in tilapias. J. Fish Biol., 37:249-255.

193. Morita N., Sano T. 1990. Regression effect of carp, Cyprinus carpio L., peripheral blood lymphocytes on CHV-induced carp papilloma. J. Fish Biol., 13:505-511.

194. Moyner K., Roed K.H., Sevatdal S., heum M. 1993. Changes in non-specific immune parameters in Atlantic salmon, Salmo salar L., induced by Aeromonas salmonicida infection. Fish Shellfish Immunol., 3:253-265.

195. Murai T., Kodama H., Naiki M., Mikami T., Izawa H. 1990. Isolation and characterization of rainbow trout C-reactive protein. Dev. Comp. Immunol., 14:4958.

196. Nakanishi T., Aoyagi K., Xia C., Dijkstra J.M., Ototake M. 1999. Specific cellmediated immunity in fish. Vet. Immunol. Immunopathol., 72:101-109.

197. Nakanishi T., Ototake M. 1999. The graft-versus-host reaction (GVHR) in the ginbuna crucian carp, Carassius auratus langsdorfii. Dev. Comp. Immunol., 23:1526.

198. Nakao M., Yano T. 1998. Structural and functional identification of complement components of the bony fish, carp (Cyprinus carpió). Immunol. Rev., 166:27-38.

199. Navarre O., Halver J.E. 1989. Disease resistance and humoral antibody production in rainbow trout fed high levels of vitamin C. Aquaculture, 79:207-221.

200. Nikl L., Albright L.J., Evelyn T.RT. 1991. Influence of seven immunostimulants on the immune response of coho salmon to Aeromonas salmonicida. Dis. Aquat. Org., 12:7-12.

201. Nonaka M., Yamaguchi N. Natsume-Sakai S., Takahashi M. 1981a. The complement system of rainbow trout {Salmo gairdnery). I. Identification of the serum lytic system homologous to mammalian complement. J. Immunol., 126:14891494.

202. Nonaka M., Natsume-Sakai S., Takahashi M. 1981b. The complement system of rainbow trout {Salmo gairdnery). II. Purification and characterization of the fifth component (C5). J. Immunol., 126:1495-1498.

203. Nonaka M., Fujii T., Kaidoh T., Natsume-Sakai S., Nonaka M., Yamaguchi N., Takahashi M. 1984. Purification of lamprey complement protein homologous to the third component of the mammalian complement system. J. Immunol., 133:32423249.

204. Obach A., Laurencin F.B. 1991. Vaccination of rainbow trout Oncorynchus mykiss against the visceral form of coldwater disease. Dis. Aquat. Org., 12:13-15.

205. Obach A., Laurencin F.B. 1992. Effects of dietary oxidized fish oil and deficiency of anti-oxidants on the immune response of turbot, Scophthalamus maximus. PAMAQ IV: 4th Int. Colloquium on Patology in Marine Aquaculture, 107:221-228.

206. Obach A., Quentel C., Laurencin F.B. 1993. Effects of alfa-tocopherol and dietary oxidized fish oil on the immune response of sea bass Dicentrarchus labrax. Dis. Aquat. Org., 15:175-185.

207. O'Halloran K., Ahokas J.T., Wright P.F.A. 1998. Response offish immune cells to in vitro organotin exposures. Aquat. Toxicol., 40:141-156.

208. Ortuno J., Cuesta A., Angeles Esteban M., Meseguer J. 2001a. Effect of oral administration of high vitamin C and E dosages on the gilthead seabream (Sparus aurata L.) innate immune system. Vet. Immunol. Immunopathol., 79:167-180.

209. Ortuno J., Esteban M.A., Meseguer J. 2001b. Effects of short-term crowding stress on the gilthead seabream (Sparus aurata L) innate immune response. Fish Shellfish Immunol., 11:187-197.

210. Ototake M., Iwama G.K., Nakanishi T. 1996. The uptake of bovine serum albumin by the skin of bath-immunized trout Oncorhynchus mykiss. Fish Shellfish Immunol., 6:321-333.

211. Ottaviani E. 1991. Tissue distribution and levels of natural and induced serum lysozyme immunoreactive molecules in a freshwater snail. Tiss.Cell, 23:317-324.

212. Ourth D.D. 1980. Secretory IgM, lysozyme and lymphocytes in the skin mucus of the channel catfish, Ictaluruspunctatus. Dev. Comp. Immunol., 4:65-74.

213. Ourth D.D., Ratts V.D., Parker N.C. 1991. Bactericidal complement activity and concentration of immunoglobulin M, transferrin, and protein at different ages of channel catfish. J. Aquat. Anim. Health, 3:274-280.

214. Park I.Y., Park C.B., Kim M.S., Kim S.C. 1998. Parasin I, an antimicrobial peptide derived from histone H2A in the catfish, Parasilurus asotus. FEBS Letters, 437:258-262.

215. Partula S., de Guerra A., Fellah J.S., Charlemagne J. 1995. Structure and diversity of the T cell antigen receptor (3-chain in a teleost fish. J. Immunol., 155:699-706.

216. Paulsen S.M. 2000. Expression of lysozyme in Atlantic salmon (Salmo salar L.) — in vivo and in vitro studies. Ph.D. Thesis. Tromso, Norway.

217. Paulsen S.M., Engstad R.F., Robertsen B. 2000. Enhanced lysozyme production in Atlantic salmon {Salmo salar L.) macrophages treated with yeast P-glucan and bacterial lipopolysaccharide. Fish Shellfish Immunol., 11:23-37.

218. Pellegrini A., Thomas U., von Fellenberg R., Wild P. 1992. Bactericidal activities of lysozyme and aprotinin against Gram-negative and Gram-positive bacteris related to their basic character. J. Applied Bacterid., 72:180-187.

219. Piacentini S.C., Rohovec J.S., Fryer J.L. 1991. Epizootiology of erythrocytic inclusion body syndrome. J. Aquat. Anim. Health, 1:173-179.

220. Picchietti S., Terribili F.R., Mastrola L., Scapigliati G. Abelli L. 1997. Expression of lymphocyte antigenic determinants in developing gut-associated lymphoid tissue of the sea bass Dicentrarchus labrax (L.). Anat. Embryol., 196:457-463.

221. Plumb J.A., Areechon N. 1990. Effects of malathion on humoral immune response of channel catfish. Dev. Com. Immunol., 14:355-358.

222. Rast J.P., Haire R.N., Litman R.T., Pross S., Litman G.W. 1995. Identification and characterization of T-cell antigen receptor-related genes in phylogenetically diverse vertebrate species. Immunogenetics, 42:204-212.

223. Rehulka J. 1993. Erythrodermatitis of carp, Cyprinus carpio (L.): an electrophoretic study of blood serum protein fraction levels. Acta vet. Brno, 60:187-197.

224. Ristow S.S., Deavila J.M., LaPatra S.E., Lauda K. 1993. Detection and characterization of rainbow trout antibody against infectious hematopoietic necrosis virus. Dis. Aquat. Org., 15:109-114.

225. Ristow S.S., Deavila J.M., Baldwin T.J., Wheeler P.A., Thorgaard G.H. 1996. Acceptance of skin grafts by isogenic rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Am. J. Vet. Res., 57:1576-1579.

226. Roberts M.L., Davies S.J., Pulsford A.L. 1995. The influence of ascorbic acid (vitamin C) on non-specific immunity in the turbot (Scophthalmus maximus L.). Fish Shellfish Immunol., 5:27-38.

227. Rockey D.D., Shook L.A., Fryer J.L., Rohovec J.S. 1989. Salmonid serum inhibits haemolytic of the secreted haemolysin of Aeromonas salmonicida. J. Aquat. Anim. Health., 1:263-268.

228. Rodgers C.J. 1991. The usage of vaccination and antimicrobial agents for control of Yersinia ruckeri. Bact. Dis. Fish, 14:291-301.

229. Roed K.H., Brun E., Larsen H.J., Refstie T. 1990. The genetic influence on serum haemolytic activity in rainbow trout. Genetics in Aquaculture-III, 85:109-117.

230. Roed K.H., Dehli A.K., Flengsrud R., Midthjell L., Rorvik K.A. 1995. Immunoassay and partial characterization of serum transferrin from Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish Shellfish Immunol., 5:71-80.

231. Romano N., Taverne-Thiele J.J., Maanen J.C., Rombout J.H.W.M. 1997a. Distribution of leukocyte subpopulations in developing carp (Cyprinus carpio L.): immunocytochemical studies. Fish Shellfish Immunol., 7:439-453.

232. Romano N., Abelli L., Mastrola L., Scapigliati G. 1997b. Immunocytochemical detection and cytomorphology of lymphocyte subpopulations in a teleost fish Dicentrarchus labrax (L.). Cell. Tissue Res., 289:163-171.

233. Rombout J.H.W.M., Taverne N., Van-De-Camp M., Taverne-Thiele A.J. 1993a. Differences in mucus and serum immunoglobulin of carp (Cyprinus carpio L.). Dev. Comp. Immunol., 17:309-317.

234. Rombout J.H.W.M., Taverne-Thiele J.J., Villena M.I. 1993b. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) of carp (Cyprinus carpio L.): an immunocytochemical study. Dev. Comp. Immunol., 17:55-66.

235. Rombout J.H.W.M., Van de Wal J.W., Companjen A., Taverne N., Taverne-Thiele J.J. 1997. Characterization of a T cell lineage marker in carp Cyprinus carpio L. Dev. Comp. Immunol., 21:35-46.

236. Rombout J.H.W.M., Joosten P.H.M., Engelsma M.Y., Vos N., Taverne N., TaverneThiele J.J. 1998. Indication of a distinct putative T cell population in mucosal tissue of carp. Dev. Comp. Immunol., 22:63-77.

237. Roubal F.R. 1986. Blood and other possible inflammatory cells in the sparid Acanthopagrus australis (Gunter). J. Fish Biol., 28:573-593.

238. Sakai M. 1999. Current research status of fish immunostimulants. Aquaculture, 172:63-92.

239. Sanchez C., Domínguez J. 1991. Trout immunoglobulin populations differing in light chains revealed by monoclonal antibodies. Mol. Immunol., 28:1271-1277.

240. Sanchez C., Lopez-Fierro P., Zapata A., Domínguez J. 1993. Characterization of monoclonal antibodies against heavy and light chains of trout immunoglobulins. Fish Shellfish Immunol., 3:237-251.

241. Sanchez C., Alvarez A., Castillo A., Zapata A., Villena A., Domínguez J. 1995. Two different subpopulations of Ig-bearing cells in lymphoid organs of rainbow trout. Dev. Comp. Immunol., 19:79-86.

242. Santos Y., Bandín I., Nunez S., Gravningen K., Toranzo A.E. 1991. Protection of turbot, Scophthalamus maximus (L.), and rainbow trout, Oncorhynchus mykiss

243. Richardson), against vibriosis using two different vaccines. Bact. Dis. Fish, 14:407411.

244. Scapigliati G., Romano N., Abelli L. 1999a. Monoclonal antibodies in fish immunology: identification, ontogeny and activity of T- and B-lymphocytes. Aquaculture, 172:3-28.

245. Scapigliati G., Scalia D., Marras A., Meloni S., Mazzini M. 1999b. Immunoglobulin levels in the teleost sea bass Dicentrarchus labrax (L.) in relation to age, season, and water oxygenation. Aquaculture, 174:207-212.

246. Schreck C.B., Maule, A.G., Slater, C.H. 1991. Stress affects the immune response and health of fish in aquacultural systems. In: Program and Abstracts of the Second IMBC'91, p. 58.

247. Sealey W.M., Lim C., Klesius P.H. 1997. Influence of the dietary level of iron from iron methionine and iron sulfate on immune response and resistance of channel catfish to Edwardsiella ictaluri. J. World Aquat. Soc. 28:142-149.

248. Secombes C.J., Manning M.J., Ellis A.E. 1982. The effect of primary and secondary immunization of the lymphoid tissues of the carp, Cyprinus carpio L. J. Exp. Zool., 220:277-287.

249. Secombes C.J., Hardie L.J., Daniels G.D. 1996. Cytokines in fish: an update. Fish Shellfish Immunol., 6:291-304.

250. Secombes C.J., Zou J., Hardie L.J., Laing K.J., Daniels G.D., Cunningham C. 1997. Rainbow trout cytokine genes. Dev. Comp. Immunol., 21:138.

251. Secombes C.J., Zou J., Laing K., Daniels G.D., Cunningham C. 1999. Cytokine genes in fish. Aquaculture, 172:93-102.

252. Seeley K.R., Weeks-Perkins B.A. 1991. Altered phagocytic activity of macrophages in oyster toadfish from a higly polluted subestuaiy. J. Aquat. Anim. Health, 3:224227.

253. Sheldon W.M.Jr., Blazer V.S.TI. 1991. Influence of dietary lipid and temperature on bactericidal activity of channel catfish macrophages. J. Aquat. Anim. Health, 3:8793.

254. Shelton E., Smith M. 1970. The ultrastructure of carp (Cyprinus carpio) immunoglobulin: a tetrameric macroglobulin. J. Mol. Biol., 54:615-617.

255. Sin Y.M., Ling K.H., Lam T.J. 1994. Passive transfer of protective immunity against ichthyopthiriasis from vaccinated mother to fry in tilapias, Oreochromas aureus. Aquaculture, 120:229-237.

256. Siwicki A.K. 1989. Immunostimulating influence of levamisole on nonspecific immunity in carp (Cyprinus carpio). Dev. Comp. Immunol., 13:87-91.

257. Siwicki A.K., Anderson D.P., Rumsey G.L. 1994. Dietary intake of immunostimulants by rainbow trout affects non-specific immunity and protection against furunculosis. Vet. Immunol. Immunopathol., 41:125-139.

258. Smith S.A., Gebhard D.H., Housman J.M., Levy M.G., Noga E.J. 1993. Isolation, purification, and molecular-weight determination of serum immunoglobulin from Oreochromis aureus. J. Aquat. Anim. Health, 5:23-25.

259. Somamoto T., Nakanishi T., Okamoto N. 2000. Specific cell-mediated cytotoxicity against a virus-infected syngeneic cell line in isogeneic ginbuna crucian carp. Dev. Comp. Immunol., 24:633-640.

260. Sonzogni W., Maack L., Gibson T., Degenhardt D., Anderson H., Fiore B. 1991. Polychlorinated biphenil congeners in blood of Wisconsin sport fish consumers. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 20:56-60.

261. Starkey P.M., Barrett A.J. 1982. Evolution of a2-macroglobulin. The structure of a protein homologous with human a2-macroglobulin from plaice (Pleuronectes platessa L.) plasma. Biochem. J., 205:105-115.

262. Stave J.W., Roberson B.S. 1985. Hydrocortisone suppresses the chemiluminescent response of striped bass phagocytes. Dev. Comp. Immunol., 9:77-84.

263. Stevens A., Lowe J. 1993. Histology. Mosby, London, England.

264. Stevenson R.M. 1997. Immunization with bacterial antigens: yersiniosis. Dev. Biol. Stand., 90:117-124.

265. Stuge T.B., Wilson M.R., Zhou H., Barker K.S., Bengten E., Chinchar G., Miller N.W., Clem L.W. 2000. Development and analysis of various clonal alloantigen-dependent cytotoxic cell lines from channel catfish. J. Immunol., 164:2971-2977.

266. Sunyer, J.O., Tort L. 1995. Natural hemolytic and bactericidal activities of sea bream Sparus aurata serum are effected by the alternative complement pathway. Vet. Immunol. Immunopathol., 45:333-345.

267. Sunyer, J.O., Tort L., Lambris J.D. 1997. Diversity of the third form of complement, C3, in fish: functional characterization of five forms of C3 in the diploid fish Sparus aurata. Biochem. J., 326:877-881.

268. Sunyer J.O., Zarkadis I.K., Lambris J.D. 1998. Complement diversity: a mechanism for generating immune diversity? Immunol. Today, 19:519-523.

269. Szalai A.J., Norcum M.T., Bly J.E., Clem L.W. 1992. Isolation of an acute-phase phosphorylcholine-reactive pentraxin from channel catfish (Ictalurus punctatus). Comp. Biochem. Physiol., 102B.535-543.

270. Takada K., Ohno N., Yadomae T. 1994. Detoxification of lipopolysaccharide (LPS) by egg white lysozyme. FEMS Immunol. Medical Microbiol., 9:255-263.

271. Tate H., Kodama H., Izawa H. 1990. Immunosuppressive effect of infectious pancreatic necrosis virus on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Jap. J. Vet. Sci., 52:931-937.

272. Tatner M.F. 1985. The migration of labelled thymocytes to the peripheral lymphoid organs in the rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson. Dev. Comp. Immunol., 9:85-91.

273. Tatner M.F. 1986. The ontogeny of humoral immunity in rainbow trout, Salmo gairdneri. Vet. Immunol. Immunopathol., 12:93-105.

274. Tatner M.F. 1990. Quantitative and qualitative differences in antibodies produced by immunosuppressed rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, to Aeromonas salmonicida. Aquaculture, 88:205-211.

275. Thiry M., Dheur I., Xhonneux F., Margineanu I., Dommes J., Vanderheijden N., Rossius M., Kinkelin P., Renard A. 1991. Vaccination against fish rhabdovirus: Recent advances. 2nd Int. Mar. Biotechnol. Conference IMBC'91, 56.

276. Thomas P.T., Woo P.T.K. 1990. Dietary modulation of humoral immune response and anaemia in rainbow trout, Oncorhynchus my kiss (Walbaum), infected with Cryptobia salmositica Katz, 1951. J. Fish Dis., 13:435-446.

277. Thuvander A. 1989. Cadmium exposure of rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson: Effects on immune functions. J. Fish Biol., 35:521-529.

278. Tsuda T., Nakanishi H., Aoki S., Takebayashi J. 1988. Bioconcentration and metabolism of butyltin compounds in carp. Water Res., 22:647-651.

279. Vallejo A.N., Miller N.W., Clem L.W. 1992. Antigen processing and presentation in teleost immune responses. Ann. Rev. Fish Dis., 2:73-89.

280. Van Ginkel F.W., Pascual D.W., Clem L.W. 1991. Proteolytic fragmentation of channel catfish antibodies. Dev. Comp. Immunol., 15:41-51.

281. Van Muiswinkel W.B., Lamers C.H.J., Rombout J.H.W.M. 1991. Structural and functional aspects of the spleen in bony fish. Res. Immunol., 142:362-366.

282. Velji M.I., Albright L.J., Evelyn T.P.T. 1990. Protective immunity in juvenile coho salmon Oncorhynchus kisutch following immunisation with Vibrio ordalii lipopolysacchride or from exposure to live V. ordalii cells. Dis. Aquat. Org., 9:2529.

283. Velji M.I., Evelyn T.P.T., Albright L.J. 1991. Nature of immune response in coho salmon Oncorhynchus kisutch following vaccination with Vibrio ordalii lipopolysacchride by two different routes. Dis. Aquat. Org., 11:79-84.

284. Verburg-van Kemenade L.B.M., Groeneveld A., Van Rens B.T.T.M., Rombout J.H.W.M. 1994. Characterization of macrophages and neutrophilic granulocytes from the pronephros of carp (Cyprinus carpio). J. Exp. Biol., 187:143-158.

285. Verburg-van Kemenade L.B.M., Weyts F.A.A., Debets R., Flik G. 1995. Carp macrophages and neutrophilic granulocytes secrete an interleukin-l-like factor. Dev. Comp. Immunol., 19:59-70.

286. Vinitnantharat S., Plumb J.A. 1992. Kinetics of the immune response of channel catfish to Edwardsiella ictaluri. J. Aquat. Anim. Health, 4:207-214.

287. Vinitnantharat S., Plumb J.A. 1993. Protection of channel catfish Jctalurus punctatus following natural exposure to Edwardsiella ictaluri and effects of feeding antigen on antibody titer. Dis. Aquat. Org., 15:31-34.

288. Voss E.W., Groberg W.J., Fryer J.L. 1980. Metabolism of Coho salmon Ig. Catabolic rate of Coho salmon tetrameric Ig in seru,. Mol. Immunol., 17:445-452.

289. Waterstrat PR., Ainsworth A.J., Capley G. 1991. In vitro responses of channel catfish, Ictalurus punctatus, neutrophils to Edwardsiella ictaluri. Dev. Comp. Immunol., 15:53-63.

290. Wilson R.P., Fowlkes P.L. 1976. Activity of glutamine synthetase in channel catfish tissues determined by an improved tissue assay method. Comp. Biochem. Physiol., 54B:365-368.

291. Wilson M., Bengten E., Miller N.W., Clem L.W., Du Pasquier L., Warr G.W. 1997. A novel chimeric Ig heavy chain from teleost fish shares similarities to IgD. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94:4593-4597.

292. Wilson M., Zhou H., Bengten E., Clem L.W., Stuge T.B., Warr G.W., Miller N.W. 1998. T-cell receptors in channel catfish: structure and expression of TCR a and P genes. Mol. Immunol., 25:545-557.

293. Woo P.T.K., Li Sen. 1990. In vitro attenuation of Cryptobia salmositica and its use as a live vaccine against cryptobiosis in Oncorhynchus mykiss. J. Parasitol., 76:750755.

294. Yada T., Azuma T., Takagi Y. 2001. Stimulation of non-specific immune functions in seawater-acclimated rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, with reference to the role of growth hormone. Comp. Biochem. Physiol.: B Biochem. Mol. Biol., 129:695701.

295. Yamamoto K., Mukamoto M., Watarai S., Kodama H., Nakayasu C., Okamoto N. 2001. Induction of specific cytotoxic T-cell activity against xenogeneic target cells in carp (Cyprinus carpio). Am. J. Vet. Res., 62:599-603.

296. Yano T., Matsuyama H., Mangindaan R.E.P. 1991. Polysaccharide-indused protection of carp, Cyprinus carpio L., against bacteria injection. J. Fish Dis., 14:577-582.

297. Zapata A. 1979. Ultrastructural study of the teleost fish kidney. Dev. Comp. Immunol., 3:55-65.

298. Zapata A. 1980. Ultrastructure of Elasmobranch lymphoid tissue. I. Thymus and spleen. Dev. Comp. Immunol., 4:459-472.

299. Zelicoff JT., Raymond A., Carlson E., Li Y., Beaman J.R., Anderson M. 2000. Biomarkers of immunotoxicity in fish: from the lab to the ocean. Toxicol. Lett., 112113:325-331.

Информация о работе

Киташова, Александра Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2002
ВАК 03.00.10

Диссертация

Реакции врожденного и приобретенного иммунитета у рыб в естественных и экспериментальных условиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы