Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реакции изотопного обмена кислорода в АТФазных системах различного функционального назначения

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Реакции изотопного обмена кислорода в АТФазных системах различного функционального назначения"

ргв пд

2 0 ноя 7ГПП

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

СКВОРЦЕВИЧ Евгений Георгиевич

РЕАКЦИИ ИЗОТОПНОГО ОБМЕНА КИСЛОРОДА В АТФазиых СИСТЕМАХ РАЗЛИЧНОГО ФУНКЦИОНАЛЬНОГО НАЗНАЧЕНИЯ К+-АТФаза, Са2+-АТФаза,.нитрогеназа/.

03.00.04 - биохимия 03.00.02- биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт- Петербург 2000 г.

Работа выполнена на кафедре биохимии Санкт-Петербургского государственного

университета

Официальные оппоненты

Ведущее учреждение

доктор биологических наук профессор Г.П-Пинаев

доктор медицинских наук профессор ДЛМатюшкин

доктор биологических наук профессор Е.В.Розенгарт

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино

Защита состоится «14 ».Д&'С&ВР рч_2000 года в I 0» ч.

На заседании Диссертационного совета Д.063.57.50 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб.,д.7/9,ауд.90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « Ч » ко ЯБРЯ_2000 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук З.И.Крутецкая

ЕоШ,0

£ //У/. //У/ П

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Центральными биохимическими процессами в живой клетке, обеспечивающими трансформацию конвертируемых форм энергии, являются синтез и распад аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Реакционные последовательности этих процессов, связанные с превращением энергии, представляют собой реакции переноса фосфорила от доноров фосфорильных групп на акцептор - аденозиндифосфорную кислоту (АДФ) в случае синтеза АТФ и воду - в случае гидролитического распада. Таким образом, понимание молекулярных механизмов трансформации энергии в живых организмах связано с расшифровкой механизма реакций фосфорила в ферментативных системах, связанных с превращением АТФ.

Превращение АТФ в таких системах осуществляется молекулярным блоком, содержащим АТФазный центр. Особенностью каталитического механизма биологических трансформаторов энергии является образование ферментных фосфоршшрованных интермедиатов, отличающихся структурой переходного состояния, лигандным окружением фосфорила и способом связи с эффекторной частью молекулярной системы.

Тестировать'реакции с участием фосфорила в активном центре фермента необычайно трудно в виду малого времени жизни фосфорилированных интермедиатов. В этой ситуации практически единственным подходом, позволяющим наблюдать реакции фосфорила в активном центре ферментов, являются методы, основанные на регистрации изотопного обмена, происходящего в продуктах и субстратах ферментативной реакции.

В биохимических реакциях фосфор редко меняет своЬ лигандное окружение, чаще всего это атомы кислорода, которые претерпевают обмен с кислородными атомами, входящими в состав молекулярных групп активного центра. Этот вид обмена тестируется с помощью изотопной метки - "О, включающейся в продукт АТФазной реакции - неорганический фосфат (Р„).

Таким образом по включению изотопной метки в продукты и субстраты ферментативной реакции можно получить информацию о каталитическом механизме гидролиза АТФ в активном центре АТФазных систем.

Цель исследования. Основной целью данного исследования явилось обнаружение с помощью реакций изотопного обмена кислорода ферментных интермедиатов в АТФазных системах различного происхождения и исследование их свойств. Выяснение роли компонентов АТФазных систем в катализе изотопного обмена кислорода. Исследование связи реакций фосфор ила в сопряжении гидролиза АТФ с функциями аденозинтрифосфатаз.

Задачи исследования. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать распределение 180 в продуктах ферментативного гидролиза АТФ.

2. Идентифицировать реакции изотопного обмена кислорода между Р„и Н20 в АТФазных системах различного функционального назначения.

3. Изучить ферментативные свойства изотопного обмена кислорода в различных АТФазных системах.

4. Изучить роль компонентов АТФаз в катализе изотопного обмена кислорода.

5. Исследовать роль реакций переноса фосфорила в сопряжении гидролиза АТФ с функциями АТФаз.

Основные положения, выносимые на защиту:

1 .Изотопный обмен кислорода между водой и неорганическим фосфатом происходит в ферментативной системе фосфогидролазы, осуществляющей отрыв фосфорильного остатка.

2.Активный центр, осуществляющий изотопный обмен кислорода в неорганическом фосфате, локализован в центре гидролиза АТФ. "

3.Механизм гидролиза АТФ в АТФазных системах контролируется компонентами АТФазного центра и эффекторной частью АТФазного комплекса.

4.Агенты, разобщающие структурно-функциональную связь в АТФазной системе между АТФазным центром и эффекторным компонентом, вызывают лесопряженный гидролиз АТФ.

Научная новизна. Впервые исследованы с применением 180 ряд АТФазных систем. В АТФазных системах различного функционального назначения и происхождения (№*,К+-АТФаза, Са2+-АТФаза и Ндарогеназа) обнаружены реакции изотопного обмена кислорода, протекающие на промежуточных стадиях гидролиза АТФ. Изучена позиционная специфичность АТФаз. Показано, что все изученные АТФазные системы катализируют расщепление Р-0 связи у у-фосфата АТФ с отщеплением фосфорильного остатка. Позиция разрыва Р-0 связи коррелировала с наличием реакций изотопного обмена кислорода в неорганическом фосфате. Для транспортных АТФаз Р-типа и нитрогеназы впервые показана зависимость реакций изотопного обмена кислорода от компонентов реакционной системы, обеспечивающих ферментативную реакцию.

Изучена локализация активного центра изотопного обмена кислорода. Показано, что последний идентичен гцдролазному центру. Изотопный обмен кислорода связан с обратимым фосфорилированием активного центра и отражает промежуточные этапы гидролиза АТФ. Показано разобщение АТФазной реакции и изотопного обмена кислорода. Это свойство может быть использовано для тестирования АТФазного центра в неполной системе в отсутствиие АТФазной реакции.

Исследована роль структурных компонентов АТФаз в модификации механизма гидролиза.

Изучена связь реакций изотопного обмена кислорода с функциональными параметрами АТФаз. Впервые показана зависимость ,80-обмена от степени сопряжения гидролиза АТФ с транспортом ионов для ионтранспортирующих АТФаз и с транспортом электронов - для нитрогеназы.

Сравнительно-биохимические исследования АТФаз различной структурной организации и биологической функции позволили выдвинуть концепцию единого

энергетического блока в АТФазных системах. Сформулировано представление о механизме разобщения гидролиза АТФ с функцией АТФазной системы. Практическая значимость работы.

Исследования механизмов гидролиза АТФ в системах трансформации энергии вносят вклад в понимание принципов генерации и использовании химической энергии на биологическую работу в живых организмах. Результаты по изучению ферментных интермедиатов с помощью реакций изотопного обмена расширяют представления о функциональной организации биологических трансформаторов энергии. Изотопный обмен кислорода позволяет исследовать состояние активного центра АТФаз, не вызывая модификацию ферментативной системы. В работе разработаны подходы для адаптации аналитических и препаративных методов этимологического исследования, включая масс-спетрометрию, для решения задач применения реакций изотопного обмена кислорода в биохимических исследованиях.

Результаты работ использованы в курсах лекций Биохимия и Энзимология, осуществляемых на Биолого-почвенном факультете Санкт-Петербургского университета и при реализации магистерской программы «Функциональная биохимия». Результаты разработок были использованы при выполнении выпускных студенческих работ и диссертаций.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзных конференциях по транспортным АТФазам (Алма-Ата 1979, Тарту 1980, Коктебель 1981), на Всесоюзных биохимических съездах (Рига 1974, Ленинград 1979, Киев 1986), на Всесоюзных биофизических съездах (Москва 1982, Москва 1999), на Всесоюзных конференциях по биологической подвижности (Ленинград 1978, Тбилиси 1987), на IX международном биохимическом съезде, (Тронто 1979), на съездах Федерации биохимических обществ Европы (Будапешт 1974, Париж 1975, Копенгаген 1977, Эдинбург 1981, Москва 1984), на IV международном симпозиуме по гомогенному катализу, (Ленинград 1984), на Советско-американских симпозиумах по метаболизму миокарда (Вирджиния 1977, Ташкент 1979 , Бетезда 1980, Баку 1984).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 34 научных работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,обзора литературы, экспериментальной части ( методы и материалы, результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка литературы (ссылок). В работе представлено 57 рисунков и 46 таблиц, Объем работы составляет 207 страниц машинописного текста. Методы исследования.

Препараты. В работе использованы следующие ферментативные системы: аденозинтрифосфатазы Я\*а+,К+-АТФаза из почек морской свинки, мозга быка, Са2*-АТФаза сарколазматического ретикулума кролика, нитрогеназа из Azotobacter Vinelandii/. Мембранные ферменты выделяли методом дифференциального центрифугирования. В опытах использовали ферментные препараты различного уровня организации /везикулярные, мембранные различной степени очистки и солюбилизированные/. Кроме того были использованы реконструированные системы. Для оценки функциональных свойств компонентов ферментативных систем использовали модифицированные и мутантные белки.

Мембранную М§2+-зависпмую, Na+ и К+ активируемую аденозинтрифосфатазу из коркового слоя почек морской свинки получали по методу Поста и Сена /Post , Sen,1967/ в модификации Л. Н. Писаревой /Писарева, 1968/.Препараты АТФазы обладали 70-90% АТФазной активностью, подавляемой оуабаином. Их удельная активность варьировала от 40 доЮО мк моль Рн мг1 белка'час"1. Препараты Na, К-АТРазы из серого вещества мозга быка получали по методу /Klodos, Ottolenghi, Boldyrev, 1975/. Удельная активность фермента составляла 200— 250 мкмоль Рн/мг белка за 1 ч. Активность полностью подавлялась оуабаином. Везикулы CP выделяли из белых скелетных мышц задних конечностей кролика по методу/Ритов, 1977/ и хранили в среде, содержащей I М сахарозу и 25. Ю'3 имидазол рН 7,0, при —20°С. Удельную активность Са2+- АТФазы CP и величину Са2+-АТФ определяли с помощью метода рН-метрии /Болдырев , 1977/. Концентрацию белка

s

определяли по методу Лоури /Lowry et al., 1951/. Однородность препаратов СР анализировали при помощи электронной микроскопии и SDS-электрофореза в ПААГ. Протеолипосомы получали по методу /Meisner G., Fleisher S., 1984/, который заключался в получении солюбилизированной фракции мембран СР и их реконструкции путем диализа. Солюбилизацию проводили дезоксихолатом, суспензию центрифугировали при 14000 g 75 мин. Для реконструкции мембран супернатант диализовали при 20 °С в течение 22 ч против буферного раствора (соотношение 1 : ] ООО), содержащего 8 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазинсульфоновую кислоту, 0,25 M сахарозу, 0,4 M KCl, 1 мМ ЭДТА, 1,5 мМ Mg2*, 0,1 мМ Ca2+-, pH 7.25. Время диализа и оценку оставшегося детергента в мембранах определяли с помощью микрокалориметра.

Препараты нитрогеназы, выделяли из микробной массы Azotobacter Vineiandii , штамм ОР и штамм UW-45, методом Л.А.Сырцовой и соавторов /Сырцова и др., 1977/. Препараты компонентов нитрогеназы /Fe- и MoFe-бглков/ получали методом Шаха и Брилла /Shah,Brifl , 1973/ с некоторыми модификациями /Сырцова с соавт.,1977/. Нитрогеназа и ее компоненты крайне чувствительны к воздействию кислорода, поэтому процедуры очистки, определения активности и изотопного обмена кислорода проводили в строго анаэробных условиях в атмосфере аргона. Хранили фермент при температуре жидкого азота.

Fe Мо-кофактор нитрогеназы получали из кристаллического MoFe-белка методом Шаха и Брилла /Shah, Brill ,1977/ в модификации Сырцовой и сотрудников. Препараты нитрогеназы и её компонентов характеризовали величинами СгНг-восстанавливающей и АТРазкой активностей, содержанием Mo и Fe, электрофорезом в полиакриламидном геле и аналитическим ультрацентрифугированием. Ферментативная активность нитрогеназы, определённая по восстановлению С2Н2 в С2Н4 методом газовой хроматографии, составляла 1 ООО нмоль С2Н2, восстановленного в I минуту на I мг белка. Удельная активность Mo Fe -белка, определённая в присутствии избытка Fe-белка, составляла 1440-1800 нмоль С2Н2, восстановленного в 1 минуту на i мг MoFe-

белка, Fe-бвлка - соответственно 2000. Каталитическую активность FeMo-кофактора проверяли введением препарата в дефектную нитрогеназу, не содержащую кофактора, выделенную из мутантного штамма Azotobacter Vmelandii UW -45. Активность составляла 300 нмоль C2H2 в I минуту на I нмоль Мо. АТАазная активность нитрогеназы .определённая методом /Узенская, Сырцова, 1984/ в среде, содержащей 5 мМ MgCI2, 5-10 мМ АТР, 100 мМ трис-HCl /рН 7,2/ и 29 мМ .Na2S204 состовляла, 300 нмоль Рн в I минуту на I мг белка

Методы исследования реакций изотопного обмена кислорода.

Исследование изотопного обмена кислорода в продуктах и субстратах аденозиатрифосфатаз проводили в средах, оптимальных для ферментативнрого гидролиза АТФ. Изотопную метку 180 вводили в виде H2lsO или НзР!804, нейтрализованную основаниями, содержащими необходимые катионы. Для исследования суммарного иО-обмена (Интермедиаркый ,!0-обмен плюс Прямой lsO-обмен) исходное положение метки находилось в меченой воде. Прямой |80-обмен измеряли в среде, исходно содержащей меченую ортофосфорную кислоту в виде солей. Параллельно ставили контроли на разведение метки примесными соединениями. За ходом реакции следили по приросту Р„. Неорганический фосфат определяли различными методами (/ Fiske , Subbarow ,1925, Rathdun , Betlach , ЕаЫ , Lands ,1969, Weil-Malherbe ,Green ,1951/. Выделение и очистку образцов ортофосфата для анализа на содержание ,sO проводили методами осаждения Mg, Ва и К солей, экстракцией в виде фосфомолебденового комплекса, методом перманганатного окисления и разделения с использованием активированного угля и ионообменников / Пантелеева, Скворцевич, 1977/. Для этих целей были использованы аналитические процедуры, модифицированные для полумикро-препаративных методов.

Анализ изотопного состава кислорода субстратов и продуктов АТФазной реакции проводили масс-спектрометрическим методом на масс-спезггрометрах отечественного производства МИ-1309 и МИ 1201с газовым источником ионов. Анализируемым веществом был газ / С02 /, для напуска которого в камеру масс-спектрометра была

использована специально разработанная и собранная в лаборатории отдела биохимии ФНИИ им. А.А.Ухтомского приставка, используемая и как система очистки / 180/-СС>2 и как система напуска. Кислород анализируемых соединений / 180/-Н20 и /180/-Рн переводили в Iй0/-С0г гуанидингидрохлоридным методом /Ильин, 1966/. Для определения содержания 180 в образцах /1!0/-С02 использовали ионыС!20"0)6 - и с массовыми числами 44 и 46 - соответственно. Калибровку масс-спектрометра осуществляли меченой солью КЦРО^, полученной из пятиокиси фосфора реакцией с меченой водой. Полученная соль разводилась в разных соотношениях немеченой солью с природным содержанием 180. Величину включения 180 в Рн рассчитывали в виде атомного процента избытка 180 в исследуемых образцах неорганического фосфата /Бродский, 1967/ .Изотопный обмен кислорода выражали в числе обменявшихся атомов |80 и мМ обменявшейся воды.

Методы исследования активного и пассивного транспорта Са3+ в везикулах СР. Для исследования активного и пассивного транспорта Са1+ в CP были использованы флуоресцентные зонды хлортетрациклин и Quin-2/. Для измерения флуоресценции был применен специальный спектрофлуориметр (разработка института Биофизики РАН)для регистрации флуоресценции оптическиплотных и рассеивающих сред (суспензии клеток, органелл, липосом, везикул). Во флуориметре применена темнопольная система возбуждения флуоресценции, которая позволяет регистрировать спектры флуоресценции без искажения. Влияние светорассеяния на флуоресцентный сигнал минимально, что позволяет работать с высокими концентрациями мембраны в суспензии /IvKova et al., 1982/. Флуоресценцию ХТ и Quin-2 возбуждали излучением ртутной лампы ДРШ-250-2 через интерференционные фильтры с длинами волн 450 нм для ХТ и 334 им для Quin-2 и регистрировали через монохроматор при ширине щелей 15 нм для ХТ и 10 нм для Quin-2 ,(Хрег.=530 нм для ХТ и Хрег.=478 нм для Quin-2). Все флуоресцентные и спектрофотометрические исследования проводили в среде, содержащей 10"4 М КС1, 5- 10'3М имидазол. 10"4М MgCI2, 20-Ю'6 М, Quin-2 и 20-10"6М

ХТ, 0,06—0.24 мг/мл Са2+- АТФазы СР, pH 7,05, при температуре поглощения Quin 2 снимался на спектрофотометре Specord UVVIS (ГДР).

Результаты и их обсуждение

1 .Реакции изотопного обмена кислорода в системе Na*.K*-АТФазы. Изотопный обмен кислорода был применён для исследования АТФаз в качестве теста на промежуточные стадии гидролиза АТФ. Идеология и методические подходы с использованием 180 изложены в работах: /Скворцевич и др., 1972; Пантелеева, 1975, Trentam ,1977, Воуег,1979/. Таблица 1

Распределение 180 в продуктах гидролиза АТФ, катализируемого АТФазами различного происхождения

Фермент Содержание isO в субстратах и продуктах реакции (ат. % избытка) Включение 180 в продукты реакции Атомы О на 1 молекулу Р„

Н218О а- и ß- а- и ß-

среды фосфаты Р„ фосфаты P«

АДФ АДФ

Na+, К* - АТФаза Нитрогеназа (АТФ- азный центр) Миозин /Clarke, Koshland, 1953/ 1,57 1,07 1,17 0,003 0 0,005 0,58 0,80 0,81 0,003 0 0,020 1,3 3,0 2,9

При проведении ферментативной реакции гидролиза АТФ в воде, обогащенной стабильным изотопом 180 метка включалась в отщепленный неорганический фосфат. В АДФ и АТФ метка практически не включалась. Данные эксперимента свидетельствовали об отрыве фосфорильного остатка от АТФ, который являлся переносимой группой. Включение 1!0 в количестве большим, чем один атом "О на молекулу ~Р„ /при теоретически ожидаемом включении, исходя из стехиометрии

11

36 °С.пектр

реакции гидролиза АТФ, одного атома 180 на молекулу РJ свидетельствовало о протекании изотопного обмена кислорода между Р„ и водой среды. Тот факт, что включение ,80 в неорганический фосфат из меченой воды было больше, чем потеря метки из меченого неорганического фосфата в среду свидетельствует о наличии двух видов реакций изотопного обмена (прямого 180-обмена между водой среды и Рн -продуктом реакции гидролиза АТФ и интермедиарного180-обмена в ходе реакции гидролиза АТФ до отщепления Рк в среду).Таким образом в опытах с меченым фосфатом фиксировался прямой обмен или обмен со средой. А в опытах с меченой водой - суммарный 180-обмен ( интермедиарный !80-обмен плюс прямой). Наличие прямого 180-обмена является свидетельством обратимости тех промежуточных стадий реакционного цикла гидролиза АТФ, которые связаны с отщеплением Рн в среду. Иными словами фосфорилкрованные интермедиаты могут образовываться при ферментативном гидролизе АТФ не только путем переноса фосфорила от АТФ на белок, но и путем включения Р„ среды в ферментативный комплекс. Таблица 2

Влияние состава инкубационной среды на 180-обменные реакции в ходе гидролиза АТФ, Ка+,К+-АТФазой из мозга быка__

Атомы '"Она 1 молекулу Рн

Состав среды % гидро- И-обмен П-обмек

мМ лиза /иО/-Н2ОоЕР /'80/-РиН>Н20

МёС12-1 57 1,8 0

М£С1г-5 79 1,3 0,25

МЙС12-25 48 3,2 0

ЫаС1/КС1 130/20 64 1,5 0,29

№С1/КС1 30/120 36 2,4 0,05

№С1/КС1 149/1 37 3,1 0

Оуабаин -0,001 19 1,3 0

Гидроксиламин -70 36 2,2 0,17

Ы-этилмалеимид-7 21 3,0 0,19

Возникает вопрос о природе обнаруживаемых интермедиатов и их функциональной роли в механизме гидролиза А'ГФ.

Ка-зависимая конформация фермента характеризовалась высоким И-обменом, тогда как К-зависимая форма - П-обменом (табл.2). Концентрации ингибиторов, вызывающие половинное снижение ативности фермента, вызывали снижение уровня конформеров фермента, ответственных за П-обмен, и повышение уровня конформеров, ответственных за И-обмен.

Прямой 180 - обмен (П-обмен') в системе Кта*К^-АТРазы.

Если связь интермедиарного обмена с АТФазной активностью очевидна (без гидролиза АТФ изотопный обмен нельзя наблюдать), то взаимосвязь прямого |80-обмена и Ыа,+К+-АТФазной активности необходимо доказывать, поскольку для осуществления П-обмена достаточно присутствия в среде одного из продуктов АТФазной реакции Рн и фермента.

Одной из первоочередных задач в исследовании свойств П-обмена являлось установление зависимости П-обмена от ионов —активаторов гидролиза АТФ в системе Ка+,К+' АТФазы. Зависимость прямого 180-обмена от ионов - компонентов транспортной системы и оуабаина свидетельствует о его принадлежности к К+-фосфатааной стадии реакционной последовательности гидролиза АТФ (табл.3). Кинетические характеристики П-обмена |7|80/-Рн<->Н20)

Оценка ряда кинетических параметров показывает, что последние близки к параметрам АТФазной активности. Зависимость 180-обмена от времени при температуре 37°С выражается прямой линией в интервале до четырех часов. Скорость включения метки 180 зависит от концентрации Р„. Км для Рн, рассчитанная аналитическим методом, составляет 2,9Т0'3М, для ионов и К+ равна соответственно 2,6 10"4 и 1,7-10'3 М. Эти данные убедительно свидетельствуют о протекании Прямого 180-обмена в активном центре АТФазы. Высокая чувствительность П-обмена к К* и

торможение ионами Ыа+ и оуабаином дают основание связывать П-обмен с Ег-формой

Таблица 3

Влияние ионного состава среды на П-обмен, катализируемый Ыа+,К+-АТФазой из коры почек морской свинки

№К» №№ Изменяемые компоненты Источ- "О - обмен

опы- проб среда ник

тов метки

Число мМ НгО

атомов 180 обменяв-

на молекулу шейся с Рк

Р.

1 1 Mg2+ K* Na+ Н2,80 2,83 47,4

2 Mg2+ K+ - 3,49 81,9

3 Mg2+ - Na+ 0,04 0,4

4 - r Na+ 0,03 0,3

2 1 Mg2+ K+ Na* НзР1804 2,49 38,7

2 Mg2+ - - 0,42 4,5

3 _ K+ 0,24 2,4

4 _ Na+ 0,07 0,8

5 _ 0,20 2Д

6 Mg2+ K+ Na+3ATA 0,12 1,2

7 Mg2+ - ,ЭДТА 0,09 0,9

8 _ K+ ,ЭДТА 0,03 0,3

9 Ыа+,ЭДТА 0,01 0,1

10 - - - .ЭДТА 0,01 0,1

3 1 Mgi+ K+ Na+ н3р18о4 1,88 12,6

2 Mg2+ K+ Ка+,оубаин 0,10 0,5

3 Mg2t K* - 2,14 15,2

4 Mg2+ K+ - .оубаин 0,14 0,8

фермента. АТФ, добавленная в реакционную среду, подавляла П-обмен, а ионы На+усиливали ингибиторный эффект АТФ.

Полученные данные прямо доказывают обратимость К+-зависимой стадии гидролиза АТФ, связанной с распадом фосфорилированного интермедиата и отщеплением Рн в реду. Эксперименты по влиянию функциональных аналогов иона К+ в системе Na+,K+-АТФазы, замещающих К+ ( Li+, NH/, R.b+, Cs+, Tl4), подтвердили вывод о связи П-обмена с К+-фосфатазной стадией гидролиза АТФ. Способность ионов одновалентных металлов поддерживать АТФазную реакцию тесно коррелирует с |80-обменной активностью. Если ионы расположить в порядке возрастания ионного радиуса, то можно отметить параллелизм между АТФазной активность и радиусом иона. Порядок действия ионов не менялся, если при расчетах учитывать размер гидратных оболочек ионов. Способность одновалентных ионов металлов к активации изотопного обмена можно выразить последовательностью (Rb+,> К+,> Li+>,Cs+). Действие ингибиторов и модификаторов наП-обмен.

Существенную информацию о локализации П-обмена в реакционной последовательности гидролиза АТФ Na+,K+ - АТФазой можно получить при использовании ингибиторов, блокирующих гидролиз АТФ на различных стадиях ферментативной реакции. Показано, что НЭМ препятствует переходу Е,-Р в Е2-Р форму фермента / Post et al., 1969/. При этом реагент не влияет на образование Ег формы фермента поскольку в присутствии НЭМ протекает /14С/ - АДФ V АТФ -изотопный обмен и даже усиливается. Обнаруженное нами подавление "О-обмена в присутствии НЭМ показывает, что указанный реагент уменьшает содержание Ег формы фермента. Анализ природы интермедиата, включенного в 180-обмен приводит к заключению, что таким продуктом является ацилфосфат. Специфическими реагентом на ацилфосфатную связь является гидроксиламин (NH2OH), который расщепляет ацилфосфатную связь по уравнению:

п О 0 0

I II i 1

но— Р —о-С-Е + NHjOH-► NHOH-С-Е ♦ НО— Р —ОН

* ¿н он

Следовательно, если 180-обмен обусловлен присоединением и отрывом фосфата от фермента, а именно карбоксильной группы, аминокислотных остатков дикарбоновых аминокислот, то блокирование гидроксиламином карбоксильной группы должно вызывать уменьшение 180-обмена. Как свидетельствуют данные эксперимента, гидроксиламин вызывает 50% снижение "О-обмена в концентрации 0,35 мМ.

Структурные модификаторы разнонаправлено действуют на прямой и интермедиарный обмены, что может свидетельствовать о том, что различные конформации фермента ответственны за эти виды обмена. Структурные модификаторы изменяют и соотношение 180-обмена и скорости АТФазной реакции, свидетельствуя об изменениях в механизме гидролиза АТФ (табл.4).

Детергенты обладают двухфазным эффектом на П-обмен и на АТФазную активность. Причем 180-обмен повышался при тех же концентрациях детергентов, при которых повышалась АТФазная активность. Эти эксперименты свидетельствовали, что обработка детергентами приводит либо к увеличению активных центров, экспонированных на наружной поверхности везикул, либо к увеличению проницаемости мембран для субстратов АТФазной системы. Таким образом, детергенты способны перестраивать мембрану и влиять на доступность ионов и субстратов АТФазной реакции к центрам связывания и кроме того влияют на механизм гидролиза АТФ. Соотношение 180-обмен (прямой обмен)/АТФазная активность является постоянным для данного препарата и способа получения фермента. Постоянное соотношение между Ыа\К -АТФазной активностью и О-обменом сохранялось и с ферментом, частично инактивированным нагреванием. Как следует из данных экспериментов с Ма+,К.+-АТФазой, работающей в режиме №+/К+ -обмена, отношение двух активностей 180-обмена/АТФазная активность для мембранных препаратов составляет 1.5. Повышение этого соотношения свидетельствует об увеличении времени жизни ферментного интермедиата и соответственно о блокировании, промежуточных этапов гидролиза АТФ. Напротив, уменьшение этого соотношения может свидетельствовать о

Таблица 4.

Соотношение прямого и интермедиарного 180 - обмена в системе гидролиза АТФ К+ - АТФазой при воздействии некоторых модификаторов

№№ опытов Характер воздействия фермент на АТФазная активность мкмоль Р„ • мг"1 • час'1 Атомы '"О на молекулу Р„

И - обмен П - обмен

I Контроль 34 0,74 0,92

2 Мочевина (2М) 28 0,75 0,44

3 Тритон X - 100 28 0 1,28

4 (0,01%) 22 1,34 0,11

5 Ацетон (20 %) 23 1,05 0

Дезоксихолат

(0,04%)

разобщении гидролиза АТФ и транспорта ионов. Увеличение АТФазной активности относительно уровня 180-обмена может происходить только за счет появления дополнительной возможности распада фосфорилированного интермедиата, например, на уровне ЕГР.

Изотопный обмен кислорода в системе Са2+-АТФазы

Адекватной моделью для обнаружения связи изотопного обмена кислорода в Р„ с транспортом ионов являются везикулярные препараты, содержащие транспортную систему. Наиболее подходящей системой являются везикулы саркоплазматического ретикулума, содержащие Са2+-АТФазу.

Реакционный цикл гидролиза АТФ Са2+-АТФазой является сходным для Р-АТФаз. В ходе гидролиза АТФ образуются два фосфорилированных ковалентных ферментативных интермедиата Е1-Р и Ег-Р, различающихся своими конформационными параметрами.

Суспензия везикул СР, полученная методом дифференциального центрифугирования гомогената мышц кролика, содержала белок в концентрации 24 мг/мл. Са2+-АТФаза по данным электрофореза составляла основную массу белков. По данным электронной микроскопии мембранные препараты СР представляли собой замкнутые везикулы размером 20—100 нм. Контроль с аламицитином, антибиотиком, образующим в мембране неспецифическую пору, пропускающую АТФ, показал, что подавляющее число везикул, содержит Са2+-АТФазу, ориентированную активным центром наружу, т. е. аналогично ориентации фермента в мембранах СР. АТФазная активность, измеренная рН-статическим методом, равнялась 880-940 нмоль АТФ/мг белка-мин. Стехиометрия активного транспорта ионов Са2+ везикулами СР, измеренная как отношение связавшегося кальция с везикулами в присутствии оксалата к количеству расщепившейся АТФ (Саг7АТФ), составляла 1,8, что близко к теоретически рассчитанному коэффициенту — 2,0. Качество везикул как функциональных моделей определяли по транспортным характеристикам с помощью флюоресцентных зондов-хлортетрациклина (ХТ) и <ЗиЙ1-2. Опыты с ХТ и С>1пп-2 свидетельствовали, что везикулы СР способны к активному транспорту Са2+ и удерживанию градиента ионов кальция длительное время, в течение 30-40 мин. На основании калибровочных графиков была вычислена концентрация Са2+- после активного закачивания ионов в везикулы. Эта величина составляла 90 мМ при стартовой наружной концентрации- 12 мкМ и внутренней концентрации 300 мкМ. Начальная скорость транспорта Са2* составляла 40,0±0,8 мкмоль Са2+/мг-мин, средняя скорость пассивного выхода Са2+ составляла 1,3 ±0,14 нмольСа2+/мг-мин) при Зб°С. Прямой 18Р-обмен. катализируемый Са2*-АТФазой.

Кинетические исследования прямого180-обмена показали, что 180-обмен происходит в активном центре Са2+-АТФазы и подчиняется всем закономерностям ферментативного катализа. Он линейно зависел от содержания ферментного белка в инкубационной среде и тесно коррелировал с АТФазной активностью препаратов в условиях

функционального сопряжения гидролиза АТФ с активным транспортом ионов Са2+. 180-обмен показывал линейную зависимость от времени инкубации, имел температурный оптимум, общий с АТФазной реакцией. Оптимум ,80-обмена отличался от рН-оптимума АТФазной реакции (дгм 180-обмена он составлял 6,5, а для АТФазной активности—7,5).

Таблица 5

Зависимость 180 - изотопного обмена и соотнощения Е]/Е2 форм фермента от концентрации ионов Саив системе Са2+ - АТФазы СР

Са2+ ян, Га2* изр, 180-обмен, Содержание Содержание

мкМ мкМ ат. 180/мол, Е2 формы Ei формы

Рн фермента, % фермента, %

1 12 0' 3,40±0,05 100 0

■2 12 12 1,59±0,09 47 53

3 12 100 1,09±0,08 32 68

4 12 1000 0,86+0,07 25 75

5 12 3000 0,73±0,06 21 79

6 , 12 5000 0,66±0,05 19 81

По величине изотопного обмена, можно судить о доле конформеров Е./Ег- Такое заключение справедливо благодаря тому, что данная частная реакция протекает на уровне Е2 формы фермента и ингибируется ионами Ca2t, связывание которых с ферментом переводит форму Е2 в форму Еь не осуществляющую "О-изотопного обмена (табл 5).. Результаты, представленные в таблице б, показывают, что увеличение концентрации ионов Са2+внутри везикул приводит к понижению величины "О-обмена При этом происходит уменьшение содержания Е2-формы фермента. Полученные результаты демонстрируют, что интенсивность 180-обмена и соотношение Ej/E2 форм фермента зависят не только от наружной, но и внутривезикулярной концентрации ионов Са2+.

Таблица 6

Влияние внутривезикуяярнсй концентрации ионов Са2+ на иО - изотопный обмен и соотношение Е1/Б2 Форм фермента в системе Са2* - АТФазы СР

№№ Са1* вн, Са5+ V.« вар, '"О-обмен, Содер- Содер- Е,/Е2

мкМ мкМ ат. 180/мол. жание жание

К Е2 формы Е2 формы

фермента, фермента,

% %

1 12 12 1,59±0,09 47 53 1,13

2 ■ 300 12 0,83±0,03 59 41 0,69

Таблица 7

Исследование 180 - изотопного обмена, катализируемого Са2' СР, меченной Р1ТС

- зависимой АТФазой

№№ [Са2+] вн, [Са2+] нар, Ингиби- АТФазная 180 - обмен,

мкМ мкМ рование актив- %

Са2+-АТФазы ность,

НТС,% нмоль АТФ

мг • мин

1 300 12 0 1149±3б 100

2 300 12 60 574±28 30

3 300 12 100 0 0

Известно, что действие флуоресцеин 5'-изотиоцианата (ПТС) на Са2+-АТФазу приводит к необратимой потере АТФазной активности и способности фермента транспортировать ионы Са2+. Са2+-АТФаза, обработанный Р1ТС может фосфорилироваться Рв, однако неизвестно обратимым или нет является этот процесс. Как показали эксперименты (таблица 7) степень ингибирования |80-обмена коррелировала с падением АТФазной активности. Эти данные свидетельствовали о необратимом характере фосфорилирования ПТС меченой Са2+-АТФазы неорганическим фосфатом. Таким образом можно заключить, что Р1ТС блокирует АТФазу в конформации Е2.

Исследование 180-изотопного обмена в протеолипосомах.

Суспензия лилосом, полученная диализным методом, содержала белок в концентрации 1,4 мг/мл, удельная АТФазная активность препаратов составляла не менее 2000 нмоль АТФ/мг мин. Опыты с аломицитином показали, что 53% везикул содержали Са2*-АТФазу, ориентированную АТФазным центром наружу, и 47% везикул содержали АТФазу, обращенную активным центром внутрь везикул. Стехиометрия активного транспорта Са2+, оцененная по критерию Са/АТФ, была равна 0,41 ±0,05, рН 7,0. Снижение коэффициента Са/АТФ могло быть вызвано двумя причинами: I) высокой проницаемостью реконструированных мембран для ионов Саи и 2) модификацией ферментного белка Са2+-АТФазы. Исследования 180-изотопного обмена, катализируемого протеолипосомами, показали (табл. 8), что уровень изотопного обмена на единицу АТФазной активности почти в два раза ниже, чем в препаратах нативных мембран. Это обстоятельство свидетельствует, что произошла модификация фермента, Таблица 8

180-обмен в инкубационной среде, содержащей препараты везикул СР или протеолипосомы

Препарат Содержание белка, мг Удельная активность, нмоль АТФ/(мгмин) АТФазная активность в пробе, нмоль АТФ/(мгмин) 180-обмен, ат. 180/мол.Рн

Везикулы СР 4,76 9П±26 200 1,48±0,15

Протеолипосомы 0,70 2186±142 200 0.66±0,12

связанная с блокированием перехода Е1~Р в ЕгР. Вероятно, в этом состоит одна из причин разобщения гидролиза АТФ и транспорта Са2+, зарегистрированного как снижение коэффициента Са/АТФ.

Причиной модификации может служить наличие остатков детергента в препаратах мембран. Тот факт, что исследования транспорта Са2+ флюоресцентными зондами,в препаратах протеолипосом не продемонстрировали качественных различий по сравнению с нативными везикулами СР, дает основание полагать, что часть Са-насосов в случае разобщения работает в холостом режиме, осуществляя гидролиз АТФ, несопряженный с переносом ионов Са2+. В этом случае Са2+-АТФаза работает по механизму укорочения реакционной последовательности из-за блокирования переходя Е)~Р в Н2-Р. Гидролиз фосфофермента осуществляется на уровне Е!~Р по уравнению:

Е, + АТФ --~АДФ + £(— р + НгО + Е, * Рн

Одним из возможных механизмов модификаци АТФ азы под действием дезоксихолата являются разрыхление липопротеидных комплексов Са2+-АТФазы и как результат экспонирование участков далипептвдных цепей, содержащих фосфорилироваяные остатки аспарагиновой кислоты, на поверхности фермента. В этой ситуации ацилфосфатная связь становится доступной для молекул воды, что ведет к быстрому гидролизу фасфоаспарагиновой кислоты с отщеплением фосфорила: О

о—р—он

I

он нон

Основные итоги работ с Са2+-АТФазой сводятся к следующему. Было показано, что О-изотопный обмен, катализируемый Са2+-АТФазой СР, является функциональной характеристикой активного центра фермента. 180-обмен протекает на уровне Е2 формы фермента и является результатом обратимого фосфорилирования фермента неорганическим фосфатом. Прямой изотопный обмен кислорода между Рн и водой среды может использоваться в качестве теста на разобщение гидролиза АТФ и

транспортной функции. Процесс разобщения вызывает изменения в механизме гидролиза АТФ Са2+-АТФазой.

Теоретически возможны следующие режимы работы АТФазы в состоянии разобщения. 1 Блокированы АТФазный центр или работа блока «эффекторных» доменов. 2. АТФ азный центр работает в режиме несопряженного гидролиза и не влияет на работу «эффекторных» доменов. Варианты с разобщением центров могут быть вызваны химической модификацией ферментного белка, а также взаимодействием Са2*-АТФазы с эндогенными регуляторами.

Исследование реакций изотопного обмена кислорода в системе нитрогеназы из Аго1оЬас(ег Л1пе1япс1 ¡¡/

Нитрогеназа/азот: акцептор оксидоредуктаза, КФ 1.7.99.2/ катализирует восстановление азота до аммиака, участвуя таким образом в фиксации атмосферного азота.

Особенность нитрогеназы состоит в том, что помимо оксидо-редуктазной активности фермент проявляет АТФазные свойства, гидролизуя АТФ до АДФ и неорганического фосфата.

Одной из центральных проблем исследования механизма действия нитрогеназы является изучение роли АТФ в восстановлении азота. Согласно гипотезе Г.И.Лихтенштейна и А.Я.Шилова /Лихтенштейн, Шилов, 1976/ АТФ необходим для неравновесного протонирования некоторых групп белка. Принудительное протонирование Ге-в-кластера, являющегося переносчиком электронов, необходимо для осуществления многоэлекгронной атаки на молекулу азота в активном центре фермента /Лихтенштейн и др.,1979/.В связи с исследованием роли АТФ возникает вопрос о локализации АТФазного центра, судьбе продуктов расщепления молекулы АТФ и роли белковых компонентов нитрогеназы в АТФазной реакции. Изучение распределения метки в продуктах гидролиза АТФ показало, что метка из воды включается только в отщепившийся Р„, в АДФ метки не обнаружили. Данные

эксперимента свидетельствовали об отрыве фосфорила от АТФ в ходе гидролиза, аналогично ситуации с другими исследованными АТФазам. Прямой 180-обмен. катализируемый нитрогеназой.

Инкубация нитрогеназы с меченым Р„, в отсутствие АТФ не приводит к 180-обмену. Однако, добавление в инкубационную среду АТФ /10 мМ/ вызывает появление 180-обмена /табл. 16/. Добавление -Ыа^О* приводит к усилению гидролиза АТФ и одновременно к снижению 180-обмена. о-Фенантролин -комплексообразующий агент, связывающий ионы железа в составе Ре-в-кластера. ингибирует АТФазную активность, восстановление субстрата и, как нами было показано, 180-обмен. Диэтилпирокарбонат и о-фталевый ангидрид, как предполагают, способны модифицировать гистидиновые остатки белков /НаЬееЬ, А1азз1, 1970; Пантелеева, 1975/. Степень ингибирования АТФазной и СгН:-восстанавливающей активностей этими реагентами совпадала.

р-Нитротиофенол, который использовали в качестве реагента на ацилфосфатную связь /КиЬо е1.а1.Д96б/, ингибировал АТФазную и СзНг-восстанавливающую активности в одинаковой степени, а кроме того, подавлял обмен. Это позволяет предположить,что в активном центре гидролиза АТФ нитрогеназы присутствуют имидазольная и карбоксильная группы и 180-обмен осуществляется на уровне образующегося в ходе гидролиза АТФ ацилфосфата. В реакционной системе, содержащей МоБе-белок обнаружен 180-обмен в присутствии Р„ .который значительно тормозился как АТФ, так и N28204. АДФ и АМФ также тормозили 180-обмен в присутствии МоРе-белка. Ре-белок не катализировал 180-обмена /табл.9/.

Можно было предполагать, что те же функциональные группы, которые, вероятно, причастны к реакции 180-обмена в нитрогеназном комплексе, учасвуют в этой реакции и в МоРе-белке. Диэтилпирокарбонат - реагент на имидазольную группу, р-нитротиофенол - на карбоксильную группу и о-фенантролин, воздействующий на ионы железа, тормозили 180-обмен в присутствии Море-белка. Можно предположить, что в катализе реакций 180-обмена МоИе-белком прямо или косвенно участвуют

карбоксильная и имидазольная группы и необходим ненарушенный РеЭ-кластер. Эти данные подтверждаются экспериментами по инактивации иО-обмена СО и 02.

Таблица 9

"О-обмен в присутствии компонентов нитрогеназы /Ре- и МоРе-белков/

Компоненты среды Прирост Р„ мкмоль на пробу Содержание ат. % избытка 1!0 в Р„ 180-обмен, атомы 180 на

начальное конечное I молекулу Р„

Море-белок - 4,16 1,16 2,9 ± 0,30

- 4.34 1,18 3.0 ±0.30

Море-белок, АТФ 0,2 3,87 3,40 0,4 ± 0,04

0.8 3,93 3,52 0.4 ± 0.04

Море-белок, АТФ 1,2 4,20 4,02 0

1.4 4,15 4.00 0

Ыа^гО, 0,6 1,99 1,72 0,5 ± 0,05

1.8 1,73 1.74 0

МоРе-белок, АДФ 0,6 3,30 3,20 0,1 ±0,01

1.2 3,26 3.02 0.3 ± 0,03

Море-белок, АМФ - 4,38 4,38 0

- 4.43 4.37 0

Ре -белок, АТФ 0,2 4,43 4,37 0

0.5 4,28 4,25 0

Низкомолекулярный БеМо-кофактор нитрогеназы, не содержащий аминокислот и не обладающий АТФазными свойствами, катализирует в присутствии Р„ 180-обмен, который тормозится АТФ /табл.10/. Таким образом свойства 180-обмена, катализируемого МоРе-белком и РеМо-кофактором, сходны.

Исследование 180-обмена в присутствии апофермента нитрогеназы из штамма и\У-45, дефектного по гену синтеза ГеМо-кофактора, которая не обладала ферментативной активностью, но реактивировалась добавлением кофактора, выделенного из нормального штамма, показало, что дефектная нитрогеназа катализирует |80-обмен в

Таблица 10

180-обмен в присутствии РеМо-кофактора нитрогеназы.

Компоненты среды Прирост Содержание 180 в Р„, 180-обмен,

Рн мкмоль ат. % избытка 180 атомы "О на мол

на пробу Р.

Начальное Конечное

БеМо-Кофактор - 2,84 1,99 1,2 ±0,10

препарат № I, - 2,90 2,05 1,2 ±0,10

содержание Мо 0,4

мкг/мл

РеМо-кофактор - 3,85 3,13 0,6 ± 0,06

препарат №2, 3,50 3,10 0,6 ± 0,06

содержание Мо 0,33

мкг/мл

РеМо-кофактор 0 2,93 2,73 0,2 ± 0,02

препарат № 2, 0 2,54 2,64 0,2 ± 0,02

АТФ

присутствии Рн, на который не оказывает влияния АТФ /табл. 11/.

Обнаружение нами прямого 1аО-обмена, катализируемого нитрогеназой, позволяет заключить, что в процессе гидролиза АГФ присходит промежуточное фосфорилирование фермента. Исследование свойств изотопного обмена позволило сформулировать гипотезу, согласно которой Таблица 11

180-обмен в присутствии нитрогеназы из мутантного штамма из АгойэЬа^ег уше!ап<Ш

ЦУМ5.

Компоненты среды Прирост Р„ мкмоль на пробу Содержание 180 в Рн ат. % избытка 180 180-обмен, атомы !80 на I молекулу Ры

Начальное Конечное

Нитрогеназа 1ЛУ-45. АТФ 00 2,56 2,81 1,71 1,97 1,2 ±0,10 1.2 ±0.10

Нитрогеназа 1Г\У-45 0 0 3.83 3.84 2,65 2,75 1,2 ±0,10 1,2 ±0.10

!

связывание фосфата с карбоксильной группой АТФазного центра вызывает перенос протона в район Ре-Б-кластера нитрогеназы при участии системы эстафетной передачи заряда. Протонированный Ре-8-кластер способен принять дополнительный электрон и переходит в сверхвосстановленное состояние. Наблюдаемый !80-обмен и его свойства являются отражением состояния АТФазного центра, а именно состояния сопряжения или отсутствия сопряжения АТФазного и субстратвосстанавливающего центров.

На основании исследования способности компонентов нитрогеназы катализировать обмен, можно предполагать, что АТРазный центр или его участок, ответственный за фосфорилирование, расположен на МоБе-белке.

Различия в свойствах 180-обмена, вызываемого МоРе-белком и кофактором дает основание предполагать существование в нитрогеназе двух АТФ-азных центров с различными функциями и различными видами иО-обмена. Второй центр, возможно, расположен между Бе- и МоБе-белками и осуществляет механохимическую функцию, регулируя контакт между компонентами и предотвращая обратный переход электрона на Ре-белок. Функция основного АТФазного центра на МоИе-белке, вероятно, состоит в принудительном протонировании Ре-в-кластера.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных исследований можно сделать следующее заключение. Все исследованные АТФазные системы гвдролизуют АТФ по механизмам, имеющим общие черты, заключающиеся в высокой позиционной специфичности разрыва О-Р связи в молекуле АТФ / отщепляемым продуктом является фосфорил/. Последний образует ферментные интермедиа™ с функциональными группами активного центра и способен участвовать в реакциях изотопного обмена кислорода, которые являются тестом на такие интермедиа™, причем как оказалось вне зависимости от того ковалентным или нековалентным яаляется фосфорилированный посредник по своей природе, ¿остояние ферментных интермедиатов, тестируемое по реакциям изотопного

обмена кислорода, отражает функциональные свойства ферментативной системы и может служить показателем сопряженности гидролитической функции с биологической работой. Разобщение в механизме гидролиза АТФ может быть вызвано различными экзо- и эндогенными модификаторами ферментативной системы. В случае такого разобщения энергия АТФ не используется, на биологическую работу, а рассеивается в виде тепла.

В живой клетке разобщение возможно вызывается эндогенными клеточными факторами, которые приводят к изменению механизма гидролиза АТФ. Логично предполагать, что разобщенный гидролиз АТФ является одним из основных механизмов биологической теплопродукции. ВЫВОДЫ

1. Показано, что гидролиз АТФ в системах аденизинтрифосфатаз /Ка+,К+-АТФАза, К+-АТФаза, Са3+-АТФаза, нитрогеназа/ сопровождается экстравключением меченого кислорода ( ,!0) в неорганический фосфат свыше одного атома на молекулу Р„, ожидаемого по стехиометрии реакции гидролиза. В негидролизованном АТФ и АДФ метка не обнаруживалась.

2. Для изученных АТФаз установлена высокая специфичность позиции разрыва Р-0 связи. Позиционная специфичность связана с расщеплением связи у у-атома фосфора таким образом ,что уходящей группой является фосфорил.

3. Показано, что отщепление фосфорила сопровождается его включением в фосфорилированные интермедиаты АТФаз. Данный процесс является обратимым и может быть тестирован по реакциям изотопного обмена. Зависимость интенсивности изотопного обмена кислорода от субстратов и ингибиторов гидролазной реакции свидетельствует о локализации 180-обмена в АТФазном центре фермента.

4. В АТФазных системах обнаружены реакции изотопного обмена двух типов. Обмен с продуктами реакции после их отщепления в среду и реакции изотопного обмена на промежуточных стадиях, до отщепления продуктов в среду. Показано, что изотопный обмен (,80-обмен) с освобожденными продуктами (прямой обмен) может происходить

в неполной АТФазной системе с отдельными белковыми компонентами. Последнее позволяет тестировать активный центр АТФаз в отсутствие образования продуктов реакции гидролиза, используя реакции изотопного обмена кислорода.

5. С помощью реакций изотопного обмена кислорода (интермедиарный 180-обмен) показана возможность ресинтеза АТФ в активном центре АТФаз, а также включения неорганического фосфата в ферментные интермедиаты. Эти процессы зависят от компонентов системы (белковых компонентов, а также субстратов, кофакторов и продуктов гидролитической реакции) и требуют функционапьноактивных конформаций ферментного белка.

6. Показано, что структурные модификаторы, а также химические аналоги функциональных компонентов АТФазных систем приводят к изменениям в механизме гидролиза АТФ, тестируемыми с помощью реакций изотопного обмена кислорода. Различия в свойствах изотопного обмена кислорода, позволяют анализировать.и характеризовать АТФазные центры в многокомпонентных системах.

7. Предложена концепция разобщения гидролиза АТФ с физиологическими функциями АТФазных систем по принципу изменения механизма гидролиза АТФ на уровне переходного-состояния. Предложены механизмы биологического контроля работы АТФазной системы путем модификации структуры гидролазного центра.

Список основных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Скворцевич Е.Г., Пантелеева Н.С., Писарева Л.Н. Реакции изотопного обмена кислорода в системе ИаД-зависимой АТФазы //Докл.АН СССР .-1972-Т. 206, -С. 240244.

2. Скворцевич Е.Г., Пантелеева Н.С.,Исследование некоторых свойств 180-обмена, катализируемого Ка,К-зависимой АТФазой из коры почек морской свинки.// Вест.

' ЛГУ,-1972. Сер. биол.,№3, - С.87-96.

3. Скворцевич Е.Г., Пантелеева Н.С. Исследование промежуточных стадий гидролиза АТФ Ка+,К+-АТФазон с применением ,80.// Биофизика мембран, Каунас,1973. С.574-580.

4. Скворцевич Е.Г., Применение тяжелого изотопа180 для изучения механизма гидролиза АТФ мембранными АТФазами..//Тр.Лен.общ естествоисп-1974- Т.- 96, вып. 1.-С. 83-89.

5. Скворцевич Е.Г., Влияние ионов металлов на 180-обменную активность Na.K-АТФазы// Вест. ЛГУ-1974-, сер. биол.,№3,вып. 1. -С. 9-101.

6 Panteleeva N.S, Karandashov Е.А , Krasovskaya I.E., KulevaN.V., Skvortsevich E.G. The influence of myofibrillar and Na, K-dependent ATPases components interactions on 180-exchange properties of the ATPases//Abstr 9th FEBS Meet Budapest, 1974. -P.25.

7. Пантелеева H.C., Скворцевич Е.Г. Применение lsO для изучения свойств транспортных аденозинтрифосфатаз // Транспортные денозинтрифосфатазы. Под ред. А.А.Болдырева,- Москва, изд. МГУ,1976 .- С/ 101-114.

8. Panteleeva N.S., Karandashov Е.А., Biro N.A., Kuleva N.V., Skvortsevich E. G. 180-exchange catalyzed by myosin, heavy meromyosm subfiagment 1 and their complexes with actin //Acta Biochim Biophys Acad Sci Hung .-1977. -V.12(l),- P.37-44.

9. Смирнова И.Н., Скворцевич Е.Г., Болдырев A.A., Пантелеева Н.С.180-обмен в ходе гидролиза АТФ и р-нитрофенилфосфата Ка,К-АТФазой из мозга быка // Биохимия. -1977 -Т. 42, вып! 1. -С. 2035-2038

10. PanteleevaN.S., Boldirev А.А., Kuleva N.V., Krasovskaya I.E., KudinovIA., Skvortsevich E.G., Smirnova I.E. lsO-exchange reactions catalyzed transport membrane ATPase preparations //Abstr.of XI FEBS meeting, Copenhagen, 1977.

11. Panteleeva N.S., Karandashov E.A., Krasovskaya I.E., Kuleva N.V., Skvortsevich E G. Comparative analysis of lsO-exchange reactions catalyzed of ATPases muscular and nonmuscular origin.// Proc. Third US-USSR joint Simp.on miocar dial metabolism. Virginia ,1977.- P.179-193.

12. Пателеева H.C., Карандашов - Э.А., Кулева H.B., Красовская И.Е., Скворцевич Е.Г. Сравнительный анализ промежуточных стадий гидролиза АТФ в механо химических системах транспорта ионов через биологические мембраны//Труды.111 Всес. конф.по биохимии мышц, Ленинград, Наука. 1978, - С. 12-13.

13 Пантелеева Н.С., Скворцевич Е.Г., Болдырев А.А., Кулева Н.В., Смирнова JI.A. ,80-обменные реакции в транспортных АТФазах мозга //Нервная система Вып 19 Л. Изд ЛГУ , 1978,- С. 136-145.

14. Скворцевич Е.Г., Сырцова Л.А., Узенская A.M., Тертышная Н.И., Пателеева Н.С., Изотопный обмен кислорода /1!0-Рн = Нг О / в системе нитрогеназы // Докл. АН СССР - 1979.-Т.4,-С. 241-244.

15. Лихтенштейн Г.И., Пантелеева Н.С.,Скворцевич Е.Г., Сырцова Л.А., Узенская A.M. О роли АТФ в функционировании нитрогеназы //Мол.биология. -1980. -Т. 14, №1, -С.147-156.

15. Азимова A.M., Берман. А.Л., Скворцевич Е.Г., Матвеев М.Г., Гасанов Г.Г., Агаев Т.М., Этингоф Р.Н. Изменение активности №,К-АТФазы фракции фоторецепторов сетчатки позвоночных при освещении : возможный механизм // Биохимия. - 1980.-Т.45,вып.4, - С.704-709.

16. Скворцевич Е.Г. Распределение изотопной метки "О в продуктах АГФазной и полинуклеотидфосфорилазной реакции // В сб. Нервная система, биохические основы метаболизма.- 1980. вып.21,.-С. 91-98.

17. Panteleeva N.S., Karandashov Е.А., Krasovskaya I.E., Kuleva N.V., Skvortsevich E.G., Syrtsova L.A. Similarity of elementary stages of AT hydrolysis in vanous ATPase systems // Energy transport, protein synthes.and neuronal control of heart metabolism IV USA - USSR Joint Symp Metabolism of Myocardia Tashkent, 14-16 Sept 1979 Bethesda, USA, 1980. - P. 247-256.

18. Василенко Т.Ф., Писарева Л.Н., Скворцевич Е.Г. Влияние поверхностно активных веществ на №,К-АТФазу из почек морской свинки // Цитология,- 1980. Т. 22, №1, -С.44-51.

19. Скворцевич Е.Г., Тертышная Н.И.,Сырцова Л.А. Исследование локализации центра гидролиза АТФ в нитрогеназе из Asotobacter Vinelandii // 6-я конф.Биохимиков Прибалт респ.,Белорусской ССР и Ленинграда,1981.-С. 233.

20. Пантелеева Н.С., Карандашов Э.А., Кулева Н.В., Красовская И.Е., Скворцевич Е.Г. Сходство элементарных стадий гидролиза АТФ в АТФазных системах различной природы // Метаболизм миокарда / Ред. И Е Чазов, X Е Морган М. Медицина, 1981. -С. 135 -142.

21. Panteleeva N S , Karandashov Е А , Kuleva N V, Krasovskaya I Е Skvortsevich Е G An application of oxygen isotope exchange in testing < ATPases systems of different origin Biochem Soc Transact, Abstracts ofXII FEBS Meet, Edinburg ,1981. -P. 332.

22. Василенко Т.Ф., Писарева Л.Н., Скворцевич Е.Г. Влияние рН на АТФазную активность и |80-обмен катализируемые, мембранными препаратами Ыа,К-АТФазы из почек морской свинки // Цитология. - 1982. -Т. 24, - С. 492-497.

23. Влияние ионов таллия на соотношение гидролиза АТФ и 180-обмена в системе Na.K-АТФазы // Сб.Биохимические и физиологические основы процессов обучения, 1982. Вып.23.-С. 95-99.

24. Скворцевич Е.Г., Сырцова Л.А., Пантелеева Н.С., Тертышная Н.И., Узенская A.M. Изотопный обмен кислорода- тест на АТФазный центр нитрогеназы // Тр. 1 Всес.Биофиз съезд,Москва, 1982. -С.664.

25. Скворцевич Е.Г., Сырцова Л.А., Тертышная Н.И..Пантелеева Н.С. Сравнительный анализ реакций изотопного обмена кислорода, катализируемых аденозинтрифосфатазами различного происхождения // Сб. Сравнительная биохимия позвоночных Л.: Наука,1983.-С. 32-34.

26. Аваева С.М., Банков А.А., Кашо В.Н., Пантелеева Н.С., Скворцевич Е.Г.Изучение реакций обмена 180, катализируемых димерной и мономерной ормами пирофосфазы // Биоорганическая химия - 1983. Т.9, №7, -С.908-913.

27. Скворцевич Е.Г., Палладина Т.А. Изотопный обмен кислорода/180/-Рн" = Н20, катализируемый К-стимулируемой АТФазой плазматических мембран проростков корней кукурузы // Биологич мембраны. - 1984.Т. 1, - С. 5-9.

28. Skvortsevich E.G., Syrtsova L.A.,Tertyshnaya N.I.., Usenskaya A.M., Panteleeva N.S. Catalysis of isotope exchange reaction by nitrogenase from Azotobacter VLnelandii // Abstr.lVIn. Congr.horaogenious catalyzis, Leningrad,! 984.- C. 135.

29. Panteleeva N.S., Karandashov E.A., Kuleva N.V., Krasovskaya J.E., Skvortsevich E.G. Oxygen isotope exchange reactions in ATPase systems of different function // The metabolism of myocardium / Eds. I.E.Chazov, Smirnov, Gordon & Brich. New York, 1986. -P.139 -145.

30. Пантелеева H.C., Скворцевич Е.Г, Кулева H.B., Красовская И.Е., Карандашов Э.А. Механизмы гидролиза АТФ в биологических системах различной природы // Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии / Ред. С.Г.Инге-Вечтомов. Л.: Наука, 1986. С.196-208.

31.Скворцевич Е.Г., Пантелеева Н.С. Карандашов Э.А. Красовская И.Е. Кулева Н.В. Роль компонентов нитрогеназы в катализе изотопного обмена кислорода II Тр. Всесоюзного биохимического съезда, Киев, 1986.

32. Печатникова Е.В., Скворцевич Е.Г., Пантелеева Н.С. Влияние градиента концентрации Са на 180-обмен, катализируемый Са-зависимой АТФазой саркоплазмагического ретикулума // Te3.VIII Всес симп.,Пушино, Биофизика и биохимия биол.подвижности, 1987. -С. 57-58.

33. Syrtsova L.A., Skvortsevich E.G., Usenskaya A.M., Panteleeva N.S. Intermediates of the Nitrogenase ATPase Reaction II Biochemistry. - 1995. №2. -P. 179-183.

34. Скворцевич Е.Г., Печатникова E.B. Изотопный обмен кислорода /180/-Pi = Н2О, катализируемый мембранными препаратами Са1+-АТФазы саркоплазматического ретикулума и реконструированными протеолипосомами // Вестн. СПБГУ. - 1996. Сер.З, вып.4, -С. 89-99.

35. Скворцевич Е.Г. АТР-зависимые ферменты // Вестн. СПБГУ. - 1998.Сер.З, вып. 4, -С.22-29.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Скворцевич, Евгений Георгиевич

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Фосфор в живых организмах.

2.1.1. Фосфаты.

2.1.2. Органические фосфаты.

2.1.3. Макроэргические фосфаты.

2.1.4. Биохимическая модификация биологически активных соединений фосфорилированием.

2.2. Биохимические реакции фосфорилирования и дефосфорилирования.

2.2.1. Перенос фосфорила и фосфорсодержащих остатков.

2.3. Аденозинтрифосфатазы (АТРазы).

2.3.1. Функциональные системы клетки, связанные с превращениями АТФ.

2.3.2. АТР-зависимые ферменты.

2.3.3. Классификация АТФаз.

2.3.4. Молекулярная организация АТФаз.

2.3.4.1. Структура активного центра.

2.3.4.2. Механизм гидролиза АТФ.

2.3.5. Реакции изотопного обмена как отражение промежуточных этапов ферментативных процессов.

2.3.5.1. 180 в биохимических исследованиях.

2.3.5.2. Изотопный обмен и ферментные интермедиаты.

2.3.5.3. Неферментативный гидролиз АТФ.

3. Экспериментальная часть.

3.1 Распределение 180 в продуктах ферментативного гидролиза АТФ.

3.2. 180-обменные реакции в системах транспортных АТФаз.,

3.2.1. №+,К+-АТФаза.

3.2.1.1. Молекулярная организация №+,К+-АТФазы.

3.2.1.2. Ферментативные функции На+,К+-АТФазы.

3.2.2. Исследование распределения 180 в продуктах АТРазной реакции, катализируемой Ка+,К+-АТФазой.

3.2.2.1. Проведение гидролиза АТР в тяжелокислородной воде (/ О/-Н20).

3.2.2.2. Изотопный обмен кислорода 180-обмен) в системе Na+,K+-АТФазы.

3.2.3. Интермедиарный 180-обмен в системе Na+,K+ - АТФазы.

3.2.4. Прямой 180 - обмен в системе Na+К+-АТРазы.

3.2.4.1. Кинетические характеристики О-обмена.

3.2.4.2. Влияние двухвалентных ионов на прямой О-обмен в системе Na+,K+АТФазы.

3.2.4.S, Действие ингибиторов и модификаторов на П- О-обмен.

3.2.4.4. Взаимосвязь прямого 180-обмена и Na,+ К+ -АТРазной активности.

3.2.5. Взаимоотношение Ыа+,К+-АТФазы с функциональными системами фоторецепции.

3.3. Реакции изотопного обмена кислорода в системе Са2+-АТФазы.

3.3.1. Биохимические характеристики Са -АТФазы.

3.3.1.1. Молекулярная организация Са - АТФазы.

3.3.1.2. Механизм действия Са2+-АТФазы.

3.3.2. Исследование активного и пассивного транспорта ионов Са" в везикулах CP.

3.3.2.1. Материалы и методы.

3.3.2.2. Исследования транспорта С а с помощью флюоресцентного зонда хлортетрациклина.

3.3.3. Характеристика 18 О-изотопного обмена, катализируемого Са^ -зависимой АТФазой.

3.3.3.1. Зависимость прямого 180-обмена от условий проведения фермнтативной реакции.

3.3.3.2. Зависимость 180-обмена и соотношения Е]/Е2 форм фермента.

3.3.3.3. Исследование 180-изотопного обмена в протеолипосомах.

3.4. Нитрогеназа.

3.4.1. Физико-химические и биохимические свойства нитрогеназы и ее компонентов.

3.4.1.1. Молекулярная организация нитрогеназы.

3.4.1.2. Механизм действия нитрогеназы.

3.4.1.3. Частные реакции нитрогеназы.

3.4.1.4. Реакция гидролиза АТФ.

3.4.1.5. Ингибиторы нитрогеназы.

3.4.2. Исследование реакций изотопного обмена кислорода в системе нитрогеназы из Аго1оЬас1ег уте1апс1п.

3.4.2.1. Получение и характеристика ферментативных моделей нитрогеназы.

3.4.2.2. Проведение гидролиза АТФ в тяжелокислородной .воде

Н2180.

3.4.2.3. Исследование суммарного включения ОвРн.

3.4.2.4. Прямой 180-обмен, катализируемый нитрогеназой.

3.4.2.5. Прямой 180-обмен в присутствии компонентов нитрогеназы.

4. Обсуждение результатов/заключение/.

5. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Реакции изотопного обмена кислорода в АТФазных системах различного функционального назначения"

Актуальность проблемы. Живая клетка способна поддерживать свою организацию в результате постоянного поступления энергии извне. Как автотрофы, так и гетеротрофы преобразуют полученную энергию а другие виды, которые могут быть использованы организмом для совершения биологической работы.

Центральными биохимическими процессами в живой клетке, обеспечивающими трансформацию конвертируемых форм энергии, является синтез и распад аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Реакционные последовательности этих процессов в той части, которая связана с превращением энергии, представляют собой реакции переноса фосфорила от доноров фосфорильных групп, которыми являются т.н. макроэргические соединения на акцептор - аденозиндифосфорную кислоту (АДФ) в случае синтеза АТФ и воду в случае гдролитического распада. Причем связывание и распад АТФ в активном центре АТФаз представляет собой главную часть механизма, обеспечивающего превращение химической энергии АТФ в биологическую работу /4/.

Таким образом, понимание молекулярных механизмов трансформации энергии в живых организмах связано с расшифровкой механизма реакций фосфорила в ферментативных системах, связанных с превращением АТР.

Превращение АТР в таких системах осуществляется молекулярным блоком, содержащим АТРазный центр. Отличительной чертой каталитического механизма биологических трансформаторов энергии является образование ферментных фосфорилированных интермедиатов, различающихся структурой переходного состояния, лигандным окружением фосфорила и способом связи с эффекторной частью молекулярной системы.

Таким образом, судьба фосфорила в ферментативной системе связана с субстратными и продуктными интермедиатами, образованными переносимыми группами и аминокислотными радикалами активного центра.

Тестировать реакции с участием фосфорила в активном центре фермента необычайно трудно в виду малого времени жизни фосфорилированных интермедиатов. Редко удается найти биохимическую систему и условия реакции, чтобы получить устойчивые фосфорилированные интермедиаты, имеющие непосредственное отношение к трансформации энергии АТФ. В этой ситуации практически единственным подходом, позволяющим наблюдать реакции фосфорила в активном центре ферментов, являются методы, основанные на регистрации изотопного обмена, происходящего в продуктах и субстратах ферментативной реакции.

В биохимических реакциях фосфор редко меняет свое элементное химическое окружение, чаще всего это атомы кислорода, которые претерпевают обмен с кислородными атомами, входящими в состав молекулярных групп активного центра. Этот вид обмена тестируется с помощью изотопной метки -О18, включающейся в продукт АТРазной реакции - неорганический фосфат( Рн).

Таким образом по включению изотопной метки в продукты и субстраты ферментативной реакции можно получить информацию о каталитическом механизме гидролиза АТР в активном центре АТРазных систем.

Цель исследования. Основной целью данного исследования явилось обнаружение с помощью реакций изотопного обмена кислорода ферментных интермедиатов в АТРазных системах различного происхождения и исследование их свойств. Выяснение роли компонентов АТРазных систем в катализе изотопного обмена кислорода. Исследование связи реакций фосфорила в сопряжении гидролиза АТР с функциями аденозинтрифосфатаз.

Задачи исследования. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать распределение О18 в продуктах ферментативного гидролиза АТФ.

2. Идентифицировать реакции изотопного обмена кислорода между Фн и Н20 в АТФазных системах различного функционального назначения.

3. Изучить ферментативные свойства изотопного обмена кислорода в различных АТФазных системах.

4. Изучить роль компонентов АТФаз в катализе изотопного обмена кислорода.

5. Исследовать роль реакций переноса фосфорила в сопряжении гидролиза АТР с функциями АТФаз.

2 Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Скворцевич, Евгений Георгиевич

4. Выводы

1. Показано, что гидролиз АТФ в системах адензинтрифосфатаз / №+,К+-АТФаза, К+-АТФаза, Са2+-АТФаза, нитрогеназа /сопровождается экстра включением меченого кислорода (180) в неорганический фосфат свыше одного атома на молекулу Рн, ожидаемого по стехиометрии реакции гидролиза. В негидролизованном АТФ и АДФ метка не обнаруживалась.

2. Для изученных АТФаз установлена высокая специфичность позиции разрыва Р-0 связи. Позиционная специфичность связана с расщеплением связи у у-атома фосфора таким образом ,что уходящей группой является фосфорил.

3. Показано, что отщепление фосфорила сопровождается его включением в фосфорилированные интермедиаты реакций АТФаз.

Данный процесс является обратимым и может быть тестирован по реакциям изотопного обмена. Зависимость интенсивности изотопного обмена кислорода от субстратов и ингибиторов гидролазной реакции

18 свидетельствует о локализации О-обмена в АТФазном центре фермента. АТФазные системы, образующие и необразующие ковалентные фосфорилированные интермедиаты, обладают способностью к катализу изотопного обмена кислорода между неорганическим фосфатом и водой.

4. В АТФазных системах обнаружены реакции изотопного обмена двух типов.

Обмен с продуктами реакции после их отщепления в среду и реакции изотопного обмена на промежуточных стадиях, до отщепления

1 о продуктов в среду. Показано, что изотопный обмен ( О-обмен) с освобожденными продуктами (прямой обмен) может происходить в неполной АТФазной системе с отдельными белковыми компонентами. Последнее позволяет тестировать активный центр АТФаз в отсутствие

188 образования продуктов реакции гидролиза, используя реакции изотопного обмена кислорода.

5. С помощью реакций изотопного обмена кислорода (интермедиарный 180-обмен) показана возможность ресинтеза АТФ в активном центре АТФаз, а также включения неорганического фосфата в ферментные интермедиаты. Эти процессы зависят от функциональных компонентов системы (белковых компонентов, а также субстратов, кофакторов и продуктов в гидролитической реакции) и требуют функционально - активных конформаций ферментного белка.

6. Показано, что структурные модификаторы, а также химические аналоги функциональных компонентов АТФазных систем приводят к изменениям в механизме гидролиза АТФ, тестируемыми с помощью реакций изотопного обмена кислорода. Различия в свойствах изотопного обмена кислорода, позволяют анализировать и характеризовать АТФазные центры в многокомпонентных системах.

7. Предложена концепция разобщения гидролиза АТФ с физиологическими функциями АТФазных систем по принципу изменения механизма гидролиза АТФ на уровне переходного состояния. Предложены механизмы биологического контроля работы АТФазной системы путем модификации структуры гидролазного центра.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Скворцевич, Евгений Георгиевич, Санкт-Петербург

1. Аваева С.М., Байков A.A., Кашо В.Н., Пантелеева Н.С., Скворцевич Е.Г. Изучение реакций обмена 180, катализируемых димерной и мономерной формами пирофосфазы // Биоорганическая химия 1983. Т.9, №7, -С.908-913.

2. Азимова A.M., Берман. A.JL, Скворцевич Е.Г., Матвеев М.Г., Гасанов Г.Г., Агаев Т.М., Этингоф Р.Н. Изменение активности Na,K-АТФазы фракции фоторецепторов сетчатки позвоночных при освещении: возможный механизм // Биохимия. 1980.- Т.45,вып.4, -С.704-709.

3. Берман А.Л., Матвеев И.Г., Скворцевич Е.Г., Азимова A.A., Этингоф Р.Н. Транспортные АТФазы в фоторецепторах сетчатки: свойства,влияние освещения ,локализация в клетке // В кн. Транс портные АТФ азы,Тбилиси, 1978.-С. 7-8.

4. Бойер П. Новые представления о синтезе АТФ в митохондриях сердца//Метаболизм миокарда. М.1979. - С.242-247.

5. Болдырев A.A. Потенциометрический метод определения активности АТФаз // Транспортные аденозинтрифосфатазы. М. - 1977. -С. 69-78.

6. Болдырев А. А., Мельгунов В. И. Транспортные АТФазы // ВИНИТИ. Сер. Биофизика. М., 1985. С. 121—222.

7. Болдырев A.A., Лопина О.Д., Свинухова И.А. Роль структуры субстрата в функционировании Na,К-АТФазы // Биохимия. 1989. -Т.54. - С.895-907.

8. Бродский А.И. Химия изотопов М. АН СССР. 1957. - 594с.

9. Василенко Т.Ф., Писарева Л.Н., Скворцевич Е.Г. Влияние поверхностно активных веществ на №,К-АТФазу из почек морской свинки//Цитология.- 1980. Т. 22, №1, -С.44-51.

10. Ю.Василенко Т.Ф., Писарева Л.Н., Скворцевич Е.Г. Влияние рН на АТФазную активность и 180-обмен катализируемые, мембранными препаратами №,К-АТФазы из почек морской свинки // Цитология. -1982.-Т. 24, -С. 492-497.

11. Дюга Г., Пенни К. Биоорганическая химия. М.,1983. - ,512 с

12. Иващенко А.Т. Анионные аденозинтрифосфатазы. Алма-Ата, 1982.-.138.с.

13. З.Ильин Л.А., Пантелеева Н.С. Изотопный обмен кислорода1 омежду Н20 и неорганическим фосфатом в присутствии актомиозина и миозина // Цитология 1967. - Т.9. - С.553-560.

14. Ильин Л. А. Гуанидингидрохлоридный методпревращениякислорода воды и ортофосфата в двуокись углерода для масс18спектрального анализа на содержание О // Вестн.ЛГУ сер. биол. -1966. С.85-91.

15. Классификация ферментов. М.ВИНИТИ, 1979 - 320с.

16. Корбридж Д. Фосфор: основы химии, биохимии, технологии. -М.:Мир, 1982. 680 с.

17. П.Лихтенштейн Г.И., Пантелеева Н.С.,Скворцевич Е.Г., Сырцова Л.А., Узенская A.M. О роли АТФ в функционировании нитрогеназы //Мол.биология. -1980. -Т. 14, №1, -С.147-156.

18. Лихтенштейн Г.И.,ГвоздевР.И.,Левченко Л.А.,Сырцова Л.А. Строение и механизм каталитического действия активных центров нитрогеназы // Известия Академии наук СССР .- 1978. Сер биол. №2 -С. 165-185.

19. Лихтенштейн Г.И.,Шилов А.Е. О химическом механизме сопряжения при гидролизе и образовании макроэргической связи АТФ // Известия Академии наук СССР .- 1979. Сер биол. №3 С. 374-379.

20. Лопина О.Д.Ка+,К+-АТРаза: структура, механизм и регуляция активности // Биологические мембраны. 1999. - Т. 16. - С.564-603.

21. Оценка расстояния между АТФазными центрами и субстрат-связывающими центрами в нитрогеназе методом ЯМР- Н./Сырцова Л.А., Лихтенштейн Г.И., Писарская Т.Н. и др. // Мол.Биол. 1974. -Вып. 6. - С.824-831.

22. Пантелеева Н.С., Скворцевич Е.Г, Кулева Н.В., Красовская И.Е., Карандашов Э.А. Механизмы гидролиза АТФ в биологических системах различной природы // Молекулярные и клеточные аспектыбиотехнологии / Ред. С.Г.Инге-Вечтомов. Л.: Наука, 1986. С. 196 208.18

23. Пантелеева Н.С., Скворцевич Е.Г. Применение О для изучения свойств транспортных аденозинтрифосфатаз // Транспортные денозинтрифосфатазы. Под ред. А.А.Болдырева,- Москва, изд. МГУ,1976 .-С 101-114.

24. Пантелеева Н.С, Скворцевич Е.Г, Болдырев А А, Кулева Н.В1 й

25. Смирнова Л.А. О-обменные реакции в транспортных АТФазах мозга //Нервная система Вып 19 Л. Изд ЛГУ , 1978.- С. 136-145.

26. Печатникова Е.В. Исследование активного и пассивного транспорта ионов Са2+ в везикулах саркоплазматического ретикулума с помощью флуоресцентных зондов хлортетрациклина и С)шп-2 // Вестн. Ленингр. ун-га, 1988. Сер. 3. Вып. 2 - С.66—73.

27. Писарева Л.Н. Итоги работ по очистке Ка,К-АТФазы// Транспортные аденозинтрифосфатазы. М. 1977. С.51-57.

28. Проблемы фиксации азота// Ред.Харди Р,Боттомли Ф.,Берне Р.- М.:Мир 1982.-734 с.

29. Ритов В.Б. Молекулярная организация и механизм функционирования Са -АТФазы саркоплазматического ретикулума // ВИНИТИ Сер. Биохимия, М., 1977. Т. 2. С. 5—77.

30. Ритов В.Б., Щербакова Н.С. Транспорт Са2+ мембраносвязанной мономерной формой Са -АТФазысаркоплазматического ретикулума // Бюлл.экспер.биол.мед. 1982. -Т.93. - С.21-23.

31. Скворцевич Е.Г., Пантелеева Н.С., Писарева J1.H. Реакции изотопного обмена кислорода в системе ЫаД-зависимой АТФазы // Докл. АН ССР 1972. - Т.206. - С. 240—242.

32. Скворцевич Е.Г. АТР-зависимые ферменты // Вестн. СПбГУ. -1998.Сер.3, вып. 4, -С.22-29.

33. Скворцевич Е.Г. Влияние ионов таллия на соотношение гидролиза АТФ и 180-обмена в системе Ка,К-АТФазы // Сб. Биохимические и физиологические основы процессов обучения, 1982. Bbin.23.-Cv 95-99.

34. Скворцевич Е.Г. Применение тяжелого изотопа кислорода 180для изучения механизма гидролиза АТР мембранными A TP азами.// Тр.

35. Лен.общ.естествоиспытателей. JL - Т.83.вып.1. - 1974. - С.96-102.18

36. Скворцевич Е.Г. Распределение изотопной метки О в продуктах АТФазной и полинуклеотид- фосфорилазной реакции //В сб. Нервная система,биохические основы метаболизма. 1980. вып.21,. - С. 91-98.18

37. Скворцевич Е.Г. Влияние ионов металлов на О-обменную активность ИаД-АТФазы// Вест.ЛГУ.-.1974. Сер. биол.,№3,вып.1. -С. 97-101.

38. Скворцевич Е.Г., Оксенкруг Г.Ф., Никитина Н.Ф., Макаров С.А. Роль Na,К,-АТФазы в транспорте серотонина через мембраны тромбоцитов человека // Нервная система,проблемы биохимии, вып. 19. 1978.-С. 145-150.

39. Скворцевич Е.Г., Палладина Т.А. Изотопный обмен кислорода/180-Рн = Н20/,катализируемый К-стимулируемой АТФазой плазматических мембран проростков корней кукурузы // Биология мембран. 1984. - Т.1, - С.5-9.

40. Скворцевич Е.Г., Пантелеева Н.С. Исследование промежуточных стадий гидролиза АТФ Иа+,К+-АТФазой с1Вприменением О.//Биофизика мембран, Каунас. 1973. - С.574-580.

41. Скворцевич Е.Г., Пантелеева Н.С., Писарева JI.H. Реакции изотопного обмена кислорода в системе №,К-зависимой АТФазы // Докл.АН СССР ,-1972-Т. 206, -С. 240- 244.

42. Скворцевич Е.Г., Пантелеева Н.С.,Исследование некоторых1 освойств О-обмена, катализируемого №,К-зависимой АТФазой из коры почек морской свинки.//Вест. ЛГУ. 1972. Сер. биол.,№3. - С.87-96.1 о

43. Скворцевич Е.Г., Применение тяжелого изотопа О для изучения механизма гидролиза АТФ мембранными АТФазами.//Тр.Лен.общ естествоисп. 1974. - Т.96. вып.1.-С. 83-89.

44. Скворцевич Е.Г., Сырцова Л.А., Тертышная Н.И., Пантелеева Н.С. Сравнительный анализ реакций изотопного обмена кислорода, катализируемых аденозинтрифосфатазами различного происхождения // Сравнительная биохимия позвоночных. Л. - 1983. - С.32-34.

45. Скворцевич Е.Г., Сырцова Л.А., Узенская A.M., Тертышная18

46. Н.И., Пателеева Н.С., Изотопный обмен кислорода / О-Рн = Н2 О / в системе нитрогеназы // Докл. АН СССР 1979. -Т.4, - С. 241-244.

47. Скворцевич Е.Г.,Печатникова Е.В. Изотопный обмен кислорода /180/-Pi = Н20, катализируемый мембранными препаратами Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума и реконструированными протеолипосомами // Вестн.СПБГУ. 1996. -Сер.З, вып.4. - С.89-99.

48. Смирнова И.Н., Скворцевич Е.Г.,Болдырев A.A., Пантелеева Н.С. 180-обмен в ходе гидролиза АТФ и р-нитрофенилфосфата Na,K-АТРазой из мозга быка // Биохимия. 1977. - Т.42. вып11. - С.2035-2038.

49. Сырцова JI.A.O механизме сопряжения в биологических системах трансформации энергии // Успехи биологической химии -М.гНаука. 1989. - Т.ЗО - С.130-153.

50. Сырцова Л.А., . Скворцевич Е.Г., Узенская A.M.,Пантелеева Н.С. Интермедиаты АТФазной реакции нитрогеназы//Биохимия. 1995.- Т.60. С.179-183.

51. Сырцова Л.А., Писарская Т.Р., Назарова И.И., Узенская A.M., Лихтенштейн Г.И. Сопряжение АТФазного и субстрат-связывающего центров в нитрогеназе // Биоорг.химия. 1977. - Т.З. - С.1251-1261.

52. Тертышная Н.И., Скворцевич Е.Г., Сырцова Л.А., Узенская A.M., Пантелеева Н.С.Исследование локализации АТФазного центра нитрогеназы с помощью изотопного обмена кислорода/180/-Pi<-»H20 // Биохимия 1982. - Т.45. - С. 29-37.

53. ШиловА.Е., Лихтенштейн Г.И. Биологическая фиксация молекулярного азота и ее химическое моделирование // Изв.АН СССР сер биол.,- 1971, №4. С.518-537.

54. Abele U, Schulz G.E. High-resolution structures of adenylate kinase from yeast ligated with inhibitor Ap5A, showing the pathway of phosphoryl transfer // Protein Sci. 1995. - V.4. - P. 1262-1271.

55. Allan V.Role of motor proteins in organizing the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus // Semin Cell Dev Biol 1995, - P.21-40.

56. Andersen J.P, Sorensen T, Vilsen B. Site-directed mutagenesis analysis of the role of the M5S5 sector of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase // Ann N Y Acad Sci. 1997. - V.834. - P.333-338.

57. Andersen P.,Sorensen T.Sit-directed mutagenesis of energy coupling in the sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase // Biochim.Biophys.Acta.- 1996. V.1275.-P.118-122.

58. Ariki M, Boyer P.D. Characterization of medium inorganic phosphate-water exchange catalyzed by sarcoplasmic reticulum vesicles // Biochemistry. 1980. - V.19. - P.2001-2004.

59. Ball W.J Jr Uncoupling of ATP binding to Na+,K+-ATPase from its stimulation of ouabain binding: studies of the inhibition of Na+,K+-ATPase by a monoclonal antibody // Biochemistry. 1986. - V.25. - P.7155-7162.

60. Beguin P, Hasler U, Beggah A, Horisberger J.D, Geering K. Membrane integration of Na,K-ATPase alpha-subunits and beta-subunit assembly // J. Biol. Chem. 1998. - V.273. - P.24921-24931.

61. Boyer P.D./ GravesD.J., Sueltera C.H., Dempsy M.E. Simpl procedure for conversion of oxygen of ortophosphate or water to carbon dioxide for oxygen-18 determination // Anal.Chem. 1961. - V.33. -P.1906-1909.

62. Boyer P.D. ATP synthase-past and future // Biochem.Biophis.Acta 1998. - V.1365. - P3-9.

63. Boyer P.D. The binding change mechanism for ATP synthase -some probabilities and probabilities // Biochim.Biophys.Acta. 1993. -V.1140.-P.215-250.

64. Brandle C., Green N. Korczak B., MacLennan D. Two Ca2+-ATPase genes: homologies and implications of deduces amino acid sequences // Cell. 1986. Vol. 44. P. 597—607.

65. Campos M, Beauge L. Na(+)-ATPase activity of Na(+),K(+)-ATPase. Reactivity of the E2 form duringNa(+)-ATPase turnover // J Biol Chem. 1994. - V.269. - P. 18028-18036.

66. Cordewener J.,Kruse-Wolters M.,Wassink H.,Haaker H., Veeger C. The role of MgATP hydrolysis in nitrogenase catalysis // Eur J. Biochem. -1988. V.172. -P.739-745.

67. Carafoli E. Plasma membrane Ca2+-ATPase // FASEB. 1994. - P. 993—1002.

68. Chipman D.M, Jencks W.P. Specificity of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase at the hydrolysis step // Biochemistry. 1988. -V.27. - P.5707-5712.

69. Cleland W.W, Hengge A.C.Mechanisms of phosphoryl and acyl transfer // FASEB J. 1995. - V. 15. - P. 1585-94.

70. Cougnon M, Boyer P, Planelles G, Jaisser F Does the colonic H,K-ATPase also act as an Na,K-ATPase? // Proc Natl Acad Sei U S A 1998. -V.95. - P.6516-6524.

71. Dahms, A.S. and Boyer, P.D. Occurrence and characteristics of 180 exchange reactions catalyzed by sodium- and potassium-dependent adenosine triphosphatases // J. Biol. Chem. 1973. - V.248. - P.3155-3162.

72. Dahms, A.S., Kanazawa, T., and Boyer, P.D. Source of the oxygen in the C-O-P linkage of the acyi phosphate in transport adenosine triphosphatases // J. Biol. Chem. 1973. - V.248. - P.6592-6595.

73. Dempsey M.E., Boyer P.D., BensonT.S. Caracteristics of an orthophosphat oxygen exchange catalysed by myosin, actoveosin and mauscle fibers // J.Biol.Chem. 1963. - V.238. - P.2708-2715.

74. Dilworth M J, Fisher K, Kim C H, Newton W E. Effects on substrate reduction of substitution of histidine-195 by glutamine in the alpha-subunit of the MoFe protein of Azotobacter vinelandii nitrogenase // Biochemistry. 1998. - V.37. - P. 17495-505.

75. Eable H.J, Lands W.E. Anal.Biochem. 1969. - V.30. - P.51-57.

76. Elston T.,Wang H.,Oster G. Energy trasduction in ATPsynthase //Nature. 1998. - V.391. - P.510-513.

77. Elvir-Mairena J.R, Jovanovic A, Gomez L.A, Alekseev A.E, Terzic A. Reversal of the ATP-liganded state of ATP-sensitive K+ channels byadenylate kinase activity // J Biol Chem. 1996. - V.271. - P.31903-31908.18

78. Faller L.D, Elgavish G.A. Catalysis of oxygen-18 exchange between inorganic phosphate and water by the gastric H,K-ATPase // Biochemistry. 1984. - V.23. - P.6584-6590.

79. Fedelesova M, Dzurba A, Ziegelhoffer A. Kinetic studies on inhibition of dog heart Na+,K+-dependent ATPase by K+,Mg2+-aspartate: comparison with ouabain // Recent Adv Stud Cardiac Struct Metab. 1975. -V.5.-P.375-385.

80. Feng J, Lingrel J.B Functional consequences of substitutions of the carboxyl residue glutamate 779 of the Na,K-ATPase // Cell Mol Biol Res -1995. V.41. - P.29-37

81. Fiske C.H.,Subbarow The Colorimetric determination of phosphorus // J.Biol.Chem. 1925. - V. 66. - P.375-380.

82. Fround R., Lee A. A model for the phosphorylation of the Ca2+ + Mg2+-activated ATPase by phosphate // Biochem. J. 1986. - V.237. -P.207-215.

83. Fround R., Lee A. Conformational transitions in Ca2++Mg2+— activated ATPase and the binding of Ca ions // Biochem. J. 1986. -V.237. - P. 197-206.

84. Fukushima, Y., Yamada, S., and Nakao, M. ATP inactivates hydrolysis of the K+ -sensitive phosphoenzyme of kidney Na+K+transport ATPase and activates that of muscle sarcoplasmic reticulum Ca2+-transport ATPase // J. Biochem. 1984. - V.95. - P.359-368

85. Garnett C, Sumbilla C, Belda F.F, Chen L, Inesi G Energy transduction and kinetic regulation by the peptide segment connecting phosphorylation and cation binding domains in transport ATPases // Biochemistry 1996. - V.35. - P. 11019-11025.

86. Glynn, I.M. and Karlish, S.J.D. Occluded cations in active transport // Annu. Rev. Biochem. 1990. - V.59. - P.171-205.

87. Goldshleger R, Karlish SJ. Fe-catalyzed cleavage of the alpha subunit of Na,K-ATPase: evidence for conformation-sensitive interactions between cytoplasmic domains // Proc Natl Acad Sci U S A 1997. - V. 94. -P.9596-95601.

88. Goldshleger R, Karlish S.J. The Energy Transduction Mechanism of Na,K-ATPase Studied with Iron-catalyzed Oxidative Cleavage // J. Biol. Chem. 1999. - V.274. - P.16213-16221.

89. Goldshleger R,Tal D.M., Karlish S.J.D. Solubilization of Complex of Tryptic Fragments of Na,K-ATPase Containing Occluded Rb Ions and Bound Obabain// Biochemistry. 1996. - V.35. - P.6853-6864.

90. Grimaldi M.E, Adamo H.P, Rega A.F, Penniston J.T. Amino acid residues 18-75 are essential for expression of an active plasma membrane Ca2+ pump // Ann N Y Acad Sci. 1997. - V.834. - P.452-453.

91. Grisham C.M, Mildvan A.S. Magnetic resonance and kinetic studies of the mechanism of membrane-bound sodium and potassium ion-activated adenosine triphosphatase // J Supramol Struct. 1975. - V.3. -P.304-313.

92. Hackney D.D.,Stempel K.E., Boyer P. Oxygen-18 Probes of Enzymic Reactions of Phosphete Compounds //Methods in Enzymology 1980. - V.64.-P.60-83.

93. Hageman R.V, Burris R.H. Electron allocation to alternative substrates of Azotobacter nitrogenase is controlled by the electron flux through dinitrogenase // Biochim Biophys Acta. 1980. - V.591. - P.63-75.

94. Hageman R.V, Burris R.H. Kinetic studies on electron transfer and interaction between nitrogenase components from Azotobacter vinelandii // Biochemistry. 1978.-V. 17.-P.4117-4124.

95. Hansen O. The effect of sodium on inorganic phosphate- and p-nitrophenyl phosphate-facilitated ouabain binding to (Na+ + K+)-activated ATPase // Biochim Biophys Acta. 1978. - V.511. - P. 10-22.

96. Helmer M. Singular Take on molecules // Nature. 1999. -V.401. - P.225-226.

97. Helmich-de Jong M.L, van Emst-de Vries S.E, Swarts H.G, Schuurmans Stekhoven F.M, de Pont J.J. Presence of a low-affinity nucleotide binding site on the (K+ + H+)-ATPase phosphoenzyme //Biochim Biophys Acta. 1986. - V.860. - P.641-649.

98. Hibberd M.G, Webb M.R, Goldman Y.E, Trentham D.R. Oxygen exchange between phosphate and water accompanies calcium-regulated ATPase activity of skinned fibers from rabbit skeletal muscle. // J Biol Chem. 1985. - V.260. - P.3496-5300.

99. Hussain A, Inesi G. Involvement of Sarco-endoplasmic reticulum Ca(2+) ATPases in cell function and the cellular consequences of their inhibition // J Membr Biol. 1999. - V.172. - P.91-99.

100. Hutchings G.J., Banks B., Mruzck M.,Ridd J.H., VernonC.A. Mechanisms of Hydrolysis of 5-Triphosphate, Adenosine 5-Diphosphate, and Inorganic Pyrophosphate in Aqueous Perchloric Acid. // Biochemistry -1981,-V.20. P.5809-5815.

101. Hutton R.L.,Boyer P.D. Subunit interaction duringc catalysis // Biol.Chem. 1979. - V.254. - P.9990-9993.

102. Ivkova M. N, Ivkov V. G., Pechatnikov V. A. e. a. Distribution of potential-sensitive dis-Cs(5) in membrane suspensions // Gen. Physiol. Biophys. 1982.-V.l. -P 209—215.

103. Jencks W.P.How does a calcium pump pump calcium? // J Biol Chem. 198. - V.264. - P. 18855-18858.

104. Jensen J, Norby J.G Thallium binding to native and radiation-inactivated Na+/K+-ATPase // Biochim Biophys Acta 1989. -V.985. - P.248-254.

105. Jorgensen P.L, Nielsen J.M, Rasmussen J.H, Pedersen P.A Structure-function relationships based on ATP binding and cation occlusionat equilibrium in Na,K-ATPase // Acta Physiol Scand Suppl 1998. - V.643. - P.79-87.

106. Kanazava T., Boyer P. Occurence and characteristics of a rapid exchange of phosphate oxygens catalyzed by sarcoplasmic reticulum vesicles // J. Biol. Chem 1973. - V.248. - P.3163—3172.

107. Kasho V.N, Allison W.S, Boyer P.D. Study of the mechanism of MF1 ATPase inhibition by fluorosulfonylbenzoyl inosine,1 oquinacrine mustard, and efrapeptin using intermediate O exchange as a probe // Arch Biochem Biophys. 1993. - V.300. - P.293-301.

108. Kasho V.N, Stengelin M, Smirnova I.N, Faller L.D A proposal for the Mg2+ binding site of P-type ion motive ATPases and the mechanism of phosphoryl group transfer //Biochemistry 1997. - V.36. -P.8045-8052.

109. Kent H.M, Ioannidis I, Gormal C, Smith B.E, Buck M. Site-directed mutagenesis of the Klebsiella pneumoniae nitrogenase. Effects of modifying conserved cysteine residues in the alpha- and beta-subunits // Biochem J. 1989. - V.264. - P.257-264.

110. Kensal E.,van Holde Biochemistry at the Singl-molecule Level: Minireview Series//J.Biol.Chem. 1999. - V.274. - P.14515.

111. Kim C H, Newton W E, Dean D R.Role of the MoFe protein alpha-subunit histidine-195 residue in FeMo-cofactor binding and nitrogenase catalysis // Biochemistry. 1995. - V.34. - P.2798-2808.

112. Koji Yonekura, Stokes D.L., Sasabe H.,Toyoshima C. The ATP-Binding of Ca2+-ATPase Revealed by electron Image Analysis //Biophysical J. 1997. -V.72. -P.997-1005.

113. Kuntzweiler T.A, Wallick E.T, Johnson C.L, Lingrel J.B. Amino acid replacement of Asp369 in the sheep alpha 1 isoform eliminates ATP and phosphate stimulation of 3H.ouabain binding to the Na+, K(+)

114. ATPase without altering the cation binding properties of the enzyme // J Biol Chem. 1995. - V.270(. - P. 16206-16212.

115. Lee A.G, East J.M. The effects of phospholipid structure on the function of a calcium pump // Biochem Soc Trans. 1998. - V.26(. -P.359-365.

116. Lanzilota W.N., Ryle M.J., Seefeldt L.C. Nucleotide hydrolysis and protein conformational changes in Azotobacter vinelandii nitrogenase iron protein: defining the function of aspartate 129 // Biochemistry. 1995. - V.34. -P.10713-10723.

117. Leopoldo de Meis,Wolosker H.,Endelender S. Regulation of the channel function of Ca-ATPase // Biochim. Biophys.Acta. 1996. -V.1275. - P.105-110.

118. Lerner R.A.,Tramontano A. Antibodies as enzymes.Trend biochem.Sci. 1987. Vol. 12.P.427-430.

119. Lingrel J.B, Kuntzweiler T. Na,K-ATPase // J Biol Chem -1994. V.269. - P.19659-19662

120. Longland C.L, Michelangeli F. The effect of mastoparan on the E2-E1 transition of the SR Ca(2+)-ATPase // Biochem Soc Trans. 1998. -V.26.-P.305. 307.

121. Lutsenko S., Kaplan J. Organization of P-Type ATPa-ses-Significance of structural diversity // Biochemistry. 1995. - V. 34. -P.15607— 15613.

122. MacLennan D.Y., Rict W.J., Green N.M. The Mechanism of Ca2+ Transport by Sarco(Endo)plasmic Reticulum Ca2+-ATPase // J.Biol.Chem. 1997. - V.272. - P.28815-28818.

123. Marin R, Hoffman J.F. Phosphate from the phosphointermediate (EP) of the human red blood cell Na,Kpump is coeffluxed with Na, in the absence of external K // J. Gen. Physiol. 1994. -V.104. - P.1-32 .

124. Martonosi A., Lagwinska E. Oliuer M. Elementary processes in the hydrolysis of ATP by sarcoplasmasmic reticulum membranes // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1985. - V.465. - P.327—329.

125. Matte A, Tari L.W, Delbaere L.T. How do kinases transfer phosphoryl groups? // Structure. 1998. - V.6. - P.413-419.

126. Mcintosh D.B, Davidson G.A Effects of nonsolubilizing and solubilizing concentrations of Triton X-100 on Ca2+ binding and Ca2+-ATPase activity of sarcoplasmic reticulum // Biochemistry 1984. - V.23. -P.1959-1965.

127. Mehta A.D., Rief M,. Spugich J.A. Biomechanics, one molecul at a time // J.Biol.Chem. 1999. -V.274. - P. 14517-14520.

128. Meissner G., Fleischner S. Dissociation and reconstitution of functional sarcoplasmic reticulum vesicles // J. Biol. Chem. 1984. - V.249. - P.302—309.

129. Mensink R.E, Haaker H. Temperature effects on the MgATP-induced electron transfer between the nitrogenase proteins from Azotobacter vinelandii // Eur J Biochem. 1992. - V.208. - P.295-299.

130. Miller R.W., Robson R.L.,Yates M.G., EadyR.R. Catalysis of exchange of terminal phosphate groups of ATP and ADP by purified nitrogenase proteins // Can.J.Biochem. 1980. - V.58. - P.542-548.

131. Mitidieri F., De Meis L.Realease and Heat Production by the Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase of Blood Plateletes // J.Biol. Chem. -1999. V.274. - P.28344-28350.

132. Mohraz M., Yee M., Smith P.R. Structural studies of Na,K-ATPase // Ann. N Y. Acad .Sci. 1986. - V.483. - P. 131-139 .

133. Moller J.V, Juul B, Falson P, Le Maire M. Probing of membrane topology and stability of sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase and Na+,K+ -ATPase with sequence-specific antibodies // Ann N Y Acad Sci. 1997. - V.834. - P.142-145.

134. Morrison J.F, Heyde E. Enzymic phosphoryl group transfer // Annu Rev Biochem. 1972. - V.41. -P.29-54.

135. Mortenson L.E., Thorneley N.F. Structure and function of nitrogenase //Ann.Rev.Biochem. 1979. - V.48. - P.387-418.

136. Nediani C, Marchetti E, Nassi P, Liguri G, Ramponi G. Hydrolysis by acylphosphatase of erythrocyte membrane Na+, K(+)-ATPase phosphorylated intermediate // Biochem Int 1991. - V.24. - P.959-68.

137. Nediani C., Fiorillo C., Marchetti E., Bandinelli R., Degl'Innocenti D., Nassi P. Acylphosphatase: a potential modulator of heart sarcolemma Na+,K+ pump // Biochemistry 1995. - V.34. - P.6668-6674.

138. Nielsen JM, Pedersen PA, Karlish SJ, Jorgensen PL: Importance of intramembrane carboxylic acids for occlusion of K+ ions at equilibrium in renal Na,K-ATPase // Biochemistry 1998. - V.37. - P. 19611968.

139. Ogawa H, Stokes D.L, Sasabe H, Toyoshima C. Structure of the Ca2+ pump of sarcoplasmic reticulum: a view along the lipid bilayer at 9-A resolution // Biophys J. 1998. - V.75. - P.41-52.

140. Pedemonte C.H, Beauge L. Inhibition of (Na+,K+)-ATPase by magnesium ions and inorganic phosphate and release of these ligands inthe cycles of ATP hydrolysis // Biochim Biophys Acta. 1983. - V.748. -P.245-253.

141. Pederson N.,Carafoli E. Ion motive ATPases.I Ubiquty, properties and significance to cell function // Trends Biochem.Sci. 1987. -V.12. - P.146-150.

142. Peters J.W, Fisher K, Dean D.R. Identification of a nitrogenase protein-protein interaction site defined by residues 59 through 67 within the Azotobacter vinelandii Fe protein // J Biol Chem. 1994. - V.269. - P.28076-28083.

143. Peters J.W, Fisher K, Dean D.R. Nitrogenase structure and function: a biochemical-genetic perspective. Annu Rev Microbiol. 1995;49:335-66.

144. Peterson C.L., Tamkun J.W. The SWI-SNF complex: a chromatin remodeling machine? // Trends Biochem. Sci. 1995. - V.20. -P.143-146.

145. Pick U., Karlish S. Regulation of the conformational transition in the Ca-ATPase from sarcoplasmic reticulum by pH,temperature, and calcium ions // J.Biol.Chem. 1982. - V.257. -P.6120-6126.

146. Pick U., Karlish S. Indications for an oligomeric structure and for conformational changes in sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase Labelled selectively with fluorescein // Biochim.Biophys.Acta. 1980. -V.626. - P.255-261.

147. Post, R.L. and Kume, S. Evidence for an aspartyl phosphate residue at the active site of sodium and potassium ion // J. Biol. Chem. -1973. V.248. - P. 6993-7001.

148. Repke, K.R.H. and Schon, R. Chemistry and energetics of transphosphorylations in the mechanism of Na+K+ -transporting ATPase: An attempt at a unifying model // Biochim. Biophys. Acta 1992. - V.1154. -P.l-16

149. Rathbun W.,Betlach V. Anal.Biochem. 1969. - V.28. -P.436-441.

150. Richards O.C., Boyer P.D. 180-labeling of deoxyribonucleic acid during sinthesis and stability of the label during replication // J.Med.Biol. 1966. - V.19. -P.109-116.

151. Robinson J.D. Interactions between K+ and ATP binding to the (Na+ + K+)-dependent ATPase // Biochim Biophys Acta. 1975. -V.397. - P.194-206.

152. Schatz G. The Protein Import System of Mitochondria. J Biol Chem. 1996.-V.271.-P. 31763-31766.

153. Scheiner-Bobis G, Antonipillai J, Farly R.A. Simultaneous binding of phosphate and TNP-ADP to FITC-modified Na+,K(+)-ATPase // Biochemistry. 1993. - V.32. - P.9592-9599.

154. Scheiner-Bobis G, Schneider H. Palytoxin-induced channel formation within the Na+/K+-ATPase does not require a catalytically active enzyme // Eur J Biochem. 1997. -V.248. -P.717-723.

155. Schneeberger A, Apell HJ. Ion selectivity of the cytoplasmic binding sites of the Na,K-ATPase: I. Sodium binding is associated with a conformational rearrangement // J Membr Biol. 1999. - V.168. - P.221-228.

156. Schulz GE, Elzinga M, Marx F, Schrimer RH. Three dimensional structure of adenyl kinase. Nature. 1974 Jul 12;250(462):120-3.

157. Schulz G.E. Mechanisms of enzyme catalysis from crystal structure analyses // Ciba Found Symp. -1991.-V.161.- P.8-22;

158. Scott DJ, May HD, Newton WE, Brigle KE, Dean DR. Role for the nitrogenase MoFe protein alpha-subunit in FeMo-cofactor binding and catalysis //Nature. 1990.-V.343. -P.l88-190.

159. Shah V.K.,Brill W.J. Isolationof iron-molybdenum cofactor from nitrogenase //Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1977. - V.74. - P.3249-3253.

160. Shani-Sekler M, Goldshleger R, Tal D.M, Karlish S.J Inactivation of Rb+ and Na+ occlusion on (Na+,K+)-ATPase by modification of carboxyl groups//J Biol Chem 1988. - V.263. - P. 19331-19341.

161. Skou, J.C. and Esmann, M. 1992. The Na,K-ATPase. J. Bioenerg. Biomembr. V.24. P. 249-261.

162. Smirnova IN, Kasho VN, Faller LD. Inferences about the catalytic domain of P-type ATPases from the tertiary structures of enzymes that catalyze the same elementary reaction. FEBS Lett. 1998 Jul 24;431(3):309-14.

163. Spee J.H., Arendsen A.F., Wassink H.,Marritt S.J.,Hagen W.R.,Haaker H. Redox properties and electron paramagnetic resonancespectroscopy of the transition state complex of Asotobacter vinelandii nitrogenase // FEBS Letters 1998. - V.432. - P.55-58.

164. Stokes DL, Zhang P, Toyoshima C, Yonekura K, Ogawa H, Lewis MR, Shi D. Cryoelectron microscopy of the calcium pump from sarcoplasmic reticulum: two crystal forms reveal two different conformations. Acta Physiol Scand Suppl. 1998 Aug;643:35-43.

165. Su Q., Klinman J.P. Probing the mechanismof proton coupled electron transfer to dioxygen: the oxidative half-reaction of bovine serum amine oxidase //Biochem. 1998. - V.37. - P. 12513-12525.

166. Szewczyk A.,Pikula S. Adenosin 5 triphosphate: an intracellular metabolic messenger // Biochim.Biophys.Acta. - 1998. -V.1365. -P 333-353.

167. Tanford C. Equilibrium state of ATP-driven ion pumps in relation to physiological ion concentration gradients // J Gen Physiol. 1981. - V.77. - P.223-229.

168. Therien AG, Goldshleger R, Karlish SJ, Blostein R. Tissue-specific distribution and modulatory role of the gamma subunit of the Na,K-ATPase J Biol Chem - 1997. - V.272. - P.32628-32634.

169. Tian G., Berry J.A., Klinman J.P. Oxygen-18 kinetic isotope effects in the dopamine beta-monooxygenase reaction: evidens for a new chemical mechanism in non-hem metallooxygenases //Biochem. 1994. -V.33. - P.226-234.

170. Tian R. Thermodynamic limitation for the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase contributes to impaired contractile reserve in hearts // Ann N Y Acad Sci. 1998. - V.853. - P.322-346.

171. Toyoshima C, Nakasako M, Nomura H, Ogawa H. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution // Nature. 2000. - V.405. - P.647-655.

172. Trentham D.R, Eccleston J.F, Bagshaw C.R. Kinetic analysis of ATPase mechanisms // Q Rev Biophys. 1976. - V.9. - P.217-281.

173. Tsien R.G., New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: desing, synthesis and properties of prototype structures // Biochemistry. 1980. - V.19. - P.2396-2403.

174. Tu Y P, Yang F Y. Transmembrane Ca2+ gradient-mediated modulation of sarcoplasmic reticulumCa(2+)-ATPase // Biochem Biophys Res Commun 1993. - V. 196. - P.561 -568 .

175. Ushimaru M.,Shinohara Y.,Fnkushima Y. Nonhydrated state of the acylphosphate group in the phosphorylated intermediate of Na,K,-ATPase // J.Biochem. 1997. - V. 112. - P.666-674.

176. Van Zutphen, Merola A.J., Brierley G.P., CornwellD.G. The Interaction of Nonionic Detergents with Lipid Bilayer Membranes// Archives Biochem. and Biophis. 1972. - V.152. - P.755-766.

177. Vilsen B, Ramlov D, Andersen JP. Functional consequences of mutations in the transmembrane coreregion for cation translocation and energy transduction in the Na+,K(+)-ATPase and the SR Ca(2+)-ATPase // Ann N Y Acad Sci. 1997. - V.834. - P.297-309.

178. Wang H., Jster G. Energy transduction in the F1 motor of ATP synthase // Nature 1998. - V.396. - P.279-282.

179. Wang C.,TsouC. Enzymes as chaperones and chaperones as enzymes//FEBS Letters. 1998. - V.425. - P.328-384.

180. Wang Z.C., Farley R.A. Valine 904, tyrosine 898, and cysteine 908 in Na,K-ATPase alpha subunits are important for assembly with beta subunits // J.Biol. Chem. 1998. - V.273. - P.29400-29405.

181. Wang Z.C, Watt G.D. H2-uptake activity of the MoFe protein component of Azotobacter vinelandii nitrogenase // Proc Natl Acad Sci U S A. 1984. - V.81. - P.376-379.

182. Watt G.D, Burns A, Tennent D.L. Stoichiometry and spectral properties of the MoFe cofactor and noncofactor redox centers in the MoFe protein of nitrogenase from Azotobacter vinelandii // Biochemistry. 1981. — V.20. - P.7272-7277.

183. Webb M, Lund J, Hunter J.L.,White D.C. Kinetics of ATP release and Pi binding duuring the ATPase cycle of lethocerus fligt mascl fibres, using phosphate-water oxygen exchange // J.Mascle Res. Ctll Motil. -1991. V.3. - P.254-261.

184. Weil-Malherbe H.,Green R.H // Biochem. -1951,- V.49. -P.286-293.

185. Willing A, Howard JB. Cross-linking site in Azotobacter vinelandii complex // J Biol Chem. 1990. - V.265. - P.6596-6599.

186. William L.D. Suares C.R. Binding activation and solubilization of the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum by nonionic detergents//Membr.Biochem. 1984. - V.5.-P. 181 -191.

187. Zeleznikar RJ, Goldberg N.D. Kinetics and compartmentation of energy metabolism in intact skeletal muscle determined from 180 labeling of metabolite phosphoryls // J Biol Chem. 1991.V.266. -P.15110-15109.