Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка водорастворимых нанофильтров для анализа аэрозолей биологического и технического происхождения

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка водорастворимых нанофильтров для анализа аэрозолей биологического и технического происхождения"

На правах рукописи

Михеев Андрей Юрьевич

Разработка водорастворимых нанофильтров для анализа аэрозолей биологического и технического происхождения.

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

С. !

2014

005549559

Пущино - 2014

005549559

Работа выполнена в лаборатории наноструктур и нанотехнологий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук

Морозов Виктор Николаевич

Официальные опионеиты: доктор биологических наук

Пашовкин Тимофей Николаевич

(зав.лаб. ИБК РАН, г. Пущино),

доктор физико-математических наук

Аграновский Игорь Евгеньевич

(в.н.с. НИФХИ им. Л.Я. Карпова, г. Москва)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, физический факультет

Защита состоится « 25 » июня 2014 г. в 15-30 на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, и на сайте ИТЭБ РАН: http://web.iteb.psn.ru.

Автореферат разослан « ¿1.» М^А 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ,

к.ф.-м.н. Ланина Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Биологический аэрозоль - дисперсная система, состоящая из взвешенных в газовой фазе частиц, имеющих биологическое происхождение. В естественных условиях такой аэрозоль может содержать аллергены, токсины и патогены, что представляет угрозу здоровью и жизни людей. Широко распространены нозокомиальные (внутребольничные) инфекции, где основным механизмом заражения является аэрозольное инфицирование. Известно, что наиболее эффективным способом применения биологического оружия является распыление бактерий, вирусов и токсинов в воздухе. Таким образом, разработка методов анализа биологических аэрозолей представляет собой актуальную проблему.

В дальнейшем мы будем использовать термин аэрозоли в широком смысле, и называть микронным аэрозолем аэрозоли с размером частиц более 1 микрона, субмикронным аэрозолем - с размером частиц в диапазоне 0.1-1 микрон, а аэрозоли меньшего размера - наноаэрозолем. В современных тест-системах на наличие патогенных микроорганизмов в воздухе используют инерционные средства сбора -импакторы и циклоны. Принцип работы таких устройств заключается в инерционном осаждении частиц на поверхность с последующим смыванием водой или буферным раствором. Циклоны и импакторы не могут улавливать частицы диаметром менее 300 нм и имеют низкую эффективность сбора микронного аэрозоля при высокой энергозатратности.

Использование более эффективных средств сбора - волокнистых аэрозольных аналитических фильтров (АФА) или стекловолокнистых фильтров (НЕРА) - имеет существенный недостаток. Эти фильтры нерастворимы в воде, а смывание с них биологического материала неизбежно влечет за собой его потерю. Такие фильтры используют для анализа бактериальных аэрозолей в сочетании с культуральными методами - фильтр с собранным материалом помещают в чашки Петри с необходимой питательной средой. Изучение вирусов, токсинов и аллергенов таким способом затруднено.

В лаборатории наноструктур и нанотехнологий ИТЭБ РАН был предложен метод сбора субмикронных и наноаэрозолей с помощью водорастворимых нанофильтров. Нанофильтры представляет собой мембраны из ультратонких волокон водорастворимого полимера (типа поливинилпирролидона или поливинилового спирта), которая формуется методом электропрядения с нейтрализацией нановолокон в газовой фазе противоионами, полученными при электрораспылении летучих растворителей. Такие водорастворимые нанофильтры позволяют с высокой эффективностью собирать аэрозоли всех размеров и концентрировать собранный материал в малом объеме буферного раствора. Полимерный материал фильтра достаточно инертен и не создает помех на всех этапах последующего анализа. В отличие от инерционных устройств, которые работают только с микронным аэрозолем, нанофильтры способны эффективно собирать и наноаэрозоли. Это позволяет использовать их для обнаружения вирусов и наноаэрозольных загрязнений

техногенного характера, таких как: углеродные наночастицы, образующиеся при работе двигателей, углеродные нанотрубки и другие продукты нанотехнологии. Отмеченные преимущества водорастворимых нанофильтров делают их разработку весьма актуальной задачей как для анализа биологических аэрозолей, так и для анализа техногенных загрязнений воздушной среды.

Цель н задачи исследования.

Целью работы являлась разработка технологии производства водорастворимых нанофильтров и методов сбора и анализа аэрозолей биологического и техногенного происхождения с использованием таких нанофильтров.

Основные задачи исследования:

1. Изучить особенности электроформования водорастворимых нанофильтров из растворов поливинилпирролидона в смесях различных растворителей с целью контроля толщины волокон.

2. Изучить влияние толщины волокон и плотности их упаковки на фильтрующие свойства изготовленных из них нанофильтров.

3. Исследовать механические свойства нанофильтров и определить эксплуатационные условия и границы их применимости.

4. Продемонстрировать возможности использования нанофильтров для сбора и анализа биологических аэрозолей.

Научная новизна.

Изучено влияние добавок растворителей на толщину волокон, образующихся при электроформовании из 6.5% растворов поливинилпирролидона в спирте.

Установлено, что изменение диаметра волокон ПВП при одинаковой концентрации полимера в изученных смесях растворителей не является следствием изменения в зацеплении полимерных молекул.

Впервые изучено поведение нанофильтров при сборе аэрозолей при высоких (до 13 м/с) линейных скоростях потока воздуха. Показано, что эффективность фильтрования микронного и субмикронного аэрозолей слабо меняется при увеличении скорости, а сбор наноаэрозолей значительно улучшается при увеличении скорости потока выше 5 м/сек. Это позволяет использовать аналитические нанофильтры для эффективного сбора наноаэрозолей при высоких линейных скоростях потока и собирать аэрозоли из большого объема воздуха за короткое время с использованием минимального количества полимерного материала фильтра.

Продемонстрирована возможность применения водорастворимых

нанофильтров для анализа искусственных аэрозолей и детекции патогенов в воздухе.

Практическая значимость работы. Разработанный в данной работе метод сбора аэрозолей с помощью нанофильтров позволяет за несколько минут с минимальными затратами энергии собирать в виде жидкой пробы как наноаэрозоли,

2

так и аэрозоли микронных размеров с концентрированием собираемого материала из воздуха более чем в 100 000 000 раз. Это позволяет вести быстрый мониторинг загрязнения воздуха следовыми количествами опасных патогенов без использования дорогостоящего и энергоемкого оборудования.

Преимуществом разработанных фильтров является возможность их растворения в воде и химическая инертность материала, из которого они изготовлены, что позволяет анализировать собранные пробы для выявления патогенов с использованием методов, работающих с водными растворами: ПЦР, иммунохимических и кулыуральных методов. В настоящее время уже продемонстрировано успешное использование нанофильтров для анализа нозокомиальных инфекций в стационаре клиники НИИ фтизиопульмонологии ММА им. Сеченова, где фильтры применяются для сбора ДНК, с последующей детекцией методом ПЦР (Vladimirsky М.А. et al., 44th Union World Conference on Lung Health, Paris, 2013). Нанофильтры были также использованы для гигиенического контроля содержания наночастиц в воздухе рабочей зоны при производстве силицидов металлов (О. П. Яворовський и др, "Журнал НАМИ Украши", 2012, 18, 1).

Водорастворимые нанофильтры из поливинилпирролидона и поливинилового спирта широко используются в дозиметрии наноаэрозолей, исследуемых в лаборатории наноструюур и нанотехнологий ИТЭБ РАН (Morozov V.N. et al, J Aerosol Sei, 2013).

Апробация диссертации. Результаты диссертации были представлены на 4 научных конференциях: The 44th Union World Conference on Lung Health, 2013; Nanomaterials: Application & Properties, 2013; VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2013; 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2012.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 82 страницах, с использованием 36 рисунков и 2 таблиц. Работа включает в себя: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение полученных результатов, заключение и выводы.

Список сокращений.

АСМ - атомно-силовая микроскопия;

АФА - аэрозольный фильтр аналитический;

ДМСО - диметилсульфоксид;

ДМФ -диметилформамид;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ПВП - поливинилпирролидон;

ПВС - поливиниловый спирт;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени;

BLAST - basic local alignment search tool;

HEPA - high efficiency particulate absorbing;

MALDI - matrix-assisted laser desorption/ionization;

SDS - sodium dodecyl sulfate.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Испытание влияния различных растворителей на характеристики нанофилыпров из ПВП

В литературе описано влияние растворителей на толщину волокон ПВП, в частности, показано, что 50% добавка диметилформамида к раствору ПВП в этаноле уменьшала диаметр волокон с 600 нм до 30 нм, (Q. Yang et al, J Polymer Sei Part В, 2004, 42, 20). Для выявления роли растворителя в электроформовании волокон поливинилпирролидона нами были приготовлены нанофильтры из растворов ПВП в концентрации 6.5 % в следующих смесях растворителей (указаны массовые доли): ацетон 20% - этанол 80%, вода 20% - этанол 80%, ДМФ 50% - этанол 50%. В последнем случае массовую долю растворителей взяли в соответствии с данными авторов (Q. Yang et al).

При электропрядении из растворов ПВП с добавлением ДМФ мы наблюдали формование очень тонких нанофибрилл, практически не рассеивающих свет (Рис.1).

Рис.1. Водорастворимые нанофильтры, изготовленные из растворов ПВП в смеси этанол-вода (слева) и этанол-ДМФ (справа) и задерживающие 99.9% аэрозоля 0.3-0.5 мкм

Результаты измерений с помощью АСМ показали, что средний диаметр ПВП волокон, сформированных из раствора в смеси ацетон-этанол, составлял 280 нм, вода-этанол - 150 нм, ДМФ-этанол - 20 нм (Рис.2). В последнем случае наблюдали формование толстых (до 1 мкм) веретеновидных образований на отдельных нитях (Рис. 2Б). Массовая доля таких образований по измерениям их объема на АСМ-изображениях составляла около 90 % от сухой массы распыленного полимера.

125 155 185 215 245 275

dp nm

В

df, nm

Up I

Рис.2. Распределение диаметров нановолокон, измеренных с помощью АСМ. А. Волокна, полученные электроформованием из раствора ПВП в смеси этанол-вода. Б. Волокна, полученные из раствора ПВП в смеси этанол-ДМФ В. Волокна, полученные из раствора ПВП в смеси этанол-ацетон. Длина масштабной линейки на изображениях: А. 5 мкм. Б. 1 мкм.

Мы изучили фильтрующие свойства нанофильтров, изготовленных из вышеописанных волокон различной толщины. Фильтрующие свойства характеризовали пропусканием К частиц размером 0.3-0.5 мкм. Пропускание аэрозоля оценивали как отношение частиц 7Уф, прошедших через фильтр, к общему числу частиц 7У0бщ:

К = ■

(1)

■чтеш

При одинаковом пропускании аэрозольных частиц фильтры, изготовленные электропрядением из раствора ПВП в смеси ДМФ-этанол, обладали существенно меньшим сопротивлением воздушному потоку и имели меньшую массу, чем фильтры, сформированные из растворов ПВП в других бинарных смесях, как видно из Рис.3.

Рис.3. А. Связь между проницаемостью фильтров для аэрозольных частиц 0.30.5 мкм (Ко.з_о.5) при скорости потока и = 35 см/с и коэффициентом Дарси (Ип). Б. Зависимость проницаемости фильтров (К0.з-о.5) от их поверхностной плотности (ш5 ) при скорости потока и = 35 см/с. На обоих графиках: серые квадраты - для фильтров, изготовленных из 6.5% раствора ГТВП в смеси этанол-ацетон, черные кружки - в смеси этанол-вода, белые кружки - в смеси этанол-ДМФ.

Для сравнения разных фильтров мы ввели два количественных критерия. Первый критерий учитывает соотношение качества фильтрования и сопротивления потоку воздуха:

у/„ = - (2)

Коэффициент Дарси Яв, характеризующий сопротивление фильтра газовому потоку, определяется как давление АР, возникающее по разные стороны фильтра площадью 5 при прохождении через него потока (), и находится по формуле:

Л^&ЮДО (3)

где // - динамическая вязкость газа.

В аналитических приложениях нанофильтров важен еще один количественный критерий, характеризующий качество фильтрования по отношению к количеству полимерного материала фильтра:

Ч'т = - ^К/т, (4)

Фильтры с максимальным значением этого критерия позволяют собирать аэрозоль в пробы с минимальным объемом жидкости и таким образом повысить концентрацию собираемого из воздуха материала в жидкой пробе.

Разумеется, эти критерии применимы для сравнения качества разных фильтров только при измерениях в идентичных условиях: при одной и той же скорости потока воздуха и одинаковых размерах аэрозольных частиц.

В Табл.1 приведены значения 1//в и у/т, для нанофильтров, изготовленных нами из 6.5% растворов ПВП в различных растворителях. Как видно из таблицы, фильтры,

сформированные из раствора ПВП в смеси ДМФ-этанол, при одинаковом удерживании аэрозольных частиц примерно в 2.5 лучше фильтров, полученных из раствора в смеси этанол-вода, как по сопротивлению потоку, так и по количеству полимерного материала, и в 5 раз лучше по последнему критерию, чем фильтры, изготовленные из раствора ПВП в смеси ацетон-этанол.

Таблица 1. Критерии качества фильтров, изготовленных из 6.5% растворов ПВП в различных растворителях.

Смеси растворителей (w/w) (м) х10"8 ут (см2/мг)

ДМФ-этанол (50/50) 6.4 24.9

Вода-этанол (20/80) 2.6 10.1

Ацетон-этанол (20/80) 2.3 5.2

2. Исследование зацепления ПВП молекул растворенных в смеси разных растворителей

Известно, что электроформование начинается при концентрации полимера, при которой происходит взаимное зацепление молекул полимера в растворе (De Gennes P. G., Cornell University Press, Ithaca, N. Y., 1979). Мы предположили, что различие в диаметре формируемых волокон могут быть связаны с разной степенью зацепления молекул ПВП в разных растворителях. Основанием для такого предположения послужило обнаруженное нелинейное падение вязкости раствора ПВП при увеличении доли ДМФ в смеси с этанолом (Q.Yang et al). Данную гипотезу проверяли определением критической концентрации начала зацепления по точке излома концентрационной зависимости приведенной вязкости растворов ПВП в разных растворителях. Для ПВП с молекулярным весом 360 кДа критическая концентрация оказалась одинаковой для всех исследованных смесей растворителей, как видно из Рис.4А, и составила 6.5%. Таким образом, различие в диаметре волокон не определяется различием в зацеплении полимерных молекул в этих растворителях. Специально проведенные эксперименты показали, что при высыхании растворители гораздо медленнее уходят из 6.5% раствора ПВП в смеси этанол-ДМФ, чем из исследуемых растворов в других смесях растворителей (Рис.4Б). Существенное уменьшение диаметра волокон при электропрядении из растворов ПВП в смеси этанол-ДМФ, по нашему мнению, происходит за счет меньшей скорости испарения растворителя с поверхности струи полимерного раствора, а, следовательно, большего времени, за которое струя может вытянуться в более тонкое волокно.

4

3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

-

ОДМФА/Экшол 1 о

(50%/50%) /л

о Этанол/вода

(80%/20%) |

»Вода 1 /

\/1/у ОДМСО __ ^ 1

0,5 1§СШ

£

"¡а

1,5

Рис.4. А. Зависимость логарифма приведенной вязкости растворов ГТВП в различных растворителях от логарифма концентрации. Б. Относительное изменение массы растворов с течением времени при высыхании, серые квадраты - раствор ПВП в смеси этанол-ацетон, черные кружки - раствор ПВП в смеси этанол-вода, белые кружки - раствор ПВП в смеси этанол-ДМФ

3. Поведение нанофильтров при больших скоростях фильтрования

При использовании водорастворимых нанофильтров из ПВП в аналитических целях помимо эффективности сбора и минимального количества полимерного материала важным качеством фильтра является возможность его использования при больших скоростях потока воздуха. Это позволяет собирать аэрозоль быстро и из большого объема воздуха. Мы исследовали эффективность сбора субмикронного (Рис. 5А) и наноаэрозоля (Рис. 5Б) нанофильтрами в широком диапазоне линейных скоростей потока.

3

2,5

2

с**

№ д 1,5

й 1

0,5

9

/о

у

10

и, м/с

15

Рис. 5. А. Изменение проницаемости фильтров для частиц 0.3-0.5 мкм с увеличением линейной скорости потока. Б. Изменение проницаемости фильтров для

частиц 0.05 мкм с увеличением линейной скорости потока. Для обоих графиков: черные кружки для фильтра, изготовленного из раствора ПВП в смеси этанол-вода, белые кружки - для фильтра из раствора ПВП в смеси этанол-ДМФ.

Из графика на Рис. 5А видно, что как для фильтра со средним диаметром волокон 20 нм (изготовленного из раствора ПВП в смеси ДМФ-этанол), так и для фильтра с диаметром волокон 150 нм (изготовленного из раствора ПВП в 80%-ном этаноле) эффективность фильтрования аэрозоля с размерами 0.3-0.5 мкм слабо зависит от скорости потока в диапазоне 0-10 м/сек, что позволяет быстро фильтровать большие объемы воздуха при сравнительно малых размерах фильтра.

В случае фильтрования наноаэрозоля с размером частиц 50 нм проницаемость фильтров, см. Рис. 5Б, носит сложный характер. Как видно из рисунка, проницаемость для наноаэрозоля сначала растет в области малых скоростей, как и ожидается по диффузионному механизму фильтрования частиц, но затем начинает заметно падать с ростом скорости потока выше 5 м/сек. Такое уменьшение проницаемости фильтров для наночастиц может объясняться тем фактом, что рост скорости потока через мембрану приводит к росту давления на ней, которое сжимает нанофильтр и уменьшает среднее расстояние между волокнами фильтра (рис.8Б). Фильтрация частиц по ситовому механизму задерживания не зависит от скорости потока, но зависит от расстояния между волокнами, поэтому мы полагаем, что наблюдаемое уменьшение проницаемости связано с деформацией фильтра в направлении, перпендикулярном его плоскости.

200

150

100

50

5 10

U, м/с

15

Рис.6. А. Проницаемость фильтра для частиц в зависимости от их диаметра при различных линейных скоростях фильтрации. Б. Изменение диаметра частиц, при котором начинается их пропускание фильтром, в зависимости от скорости потока.

Наличие ситового механизма подтверждается данными, представленными на Рис. 6Б, где представлен график зависимости между пороговым размером пропускаемых частиц и скоростью потока. Как видно, с увеличением линейной скорости потока диаметр частиц, при котором начинается их пропускание, заметно

уменьшается. При этом такое уменьшение порогового размера пропускаемых частиц частично обратимо, как и частично обратимо сжатие фильтра в поперечном его плоскости направлении, (см. далее Рис.8).

4. Изучение физических свойств нанофилыпров

Изучение физических свойств нанофильтров, сформованных из растворов ПВП в смеси ДМФ-этанол, крайне затруднительно по причине их малой механической прочности, поэтому были изучены свойства нанофильтров, полученных из водно-спиртовых растворов ПВП. Механические характеристики изучали с помощью специально разработанных методов, позволяющих измерить деформацию фильтров вдоль и поперек плоскости фильтра и вычислить значения модуля Юнга в этих направлениях.

4.1. Измерение модуля Юнга нанофильтра из ПВП при нормальном сжатии

Для измерения модуля Юнга при сжатии в направлении, нормальном плоскости фильтра, мы разработали емкостный метод измерения толщины сжимаемой мембраны, показанный схематически на Рис.7. Нанофильтр (5) помещали на полированную поверхность алюминиевой подставки (6) и сверху накрывали тонкой алюминизированной полимерной плёнкой (4). Измеряли емкость получившегося конденсатора при различном давлении, которое создавали с помощью поршня (2) шприца (1) через резиновую прокладку (3).

Рис.7. Схематическое изображение установки для измерения модуля упругости при нормальном сжатии.

Для подачи на фильтр давления менее 1 кПа между резиновой прокладкой (3) и металлизированной плёнкой (4) помещали резиновый шар (7), накачиваемый воздухом с известным давлением.

'X

Толщину сжимаемой мембраны определяли по формуле:

к =

2 С.

Где С,- - емкость конденсатора, 5 - площадь мембраны, Л,- - толщина сжимаемой мембраны, зависящая от приложенного давления, /»„„■„ - толщина полностью сжатой мембраны, £„,, и - диэлектрические константы воздуха и поливинилпирролидона, соответственно. Толщину полностью сжатой мембраны определяли по массе наномата на единицу его площади:

(6)

где рРуР - массовая плотность ПВП, равная 1,2 г/см .

Измеренная таким образом зависимость толщины фильтра от давления представлена на Рис.8.

На графике видно, что первичная деформация является нелинейной и в значительной степени необратимой, однако, кривые декомпрессии и повторной деформации совпадают. На совпадающих кривых можно выделить линейные участки, которые указывают на упругую деформацию, и по которым можно рассчитать модуль Юнга. В области малых (0-1 кПа на рис.8А) давлений модуль Юнга составил Е~ 10 кПа и в области больших (10-50 кПа на Рис.8Б) давлений - Е-500 кПа.

0,4 0,8 Давление, кПа

20 40 Давление, кПа

Рис.8. А. Изменение толщины наномата в зависимости от приложенного малого давления (0-1 кПа), Б. То же для большого давления (10-50 кПа). На обоих графиках: черные кружки - первое сжатие, белые кружки - декомпрессия, черные квадраты -повторное сжатие.

4.2. Измерение модуля Юнга при латеральном растяжении

Для измерения модуля Юнга в латеральном направлении мы использовали измерение деформации прогиба свободной мембраны, закрепленной по краям и нагружаемой однородным давлением (Poilane С. et al, Thin Solid Films, 2000, 379). Нами было изготовлено простое устройство, схематически изображенное на Рис.9. Наномат с помощью резинового кольца с внутренним диаметром 5 мм прижимался к отверстию, через которое подавался воздух под давлением Р. Прогиб мембраны Н под давлением измеряли с помощью оптического микроскопа.

Резиновое кольцо Наномат

Рис.9. Схематическое изображение устройства для измерения прогиба мембраны под давлением воздуха.

Р,кПа

Рис.10. Зависимость прогиба и объемного расхода воздуха от давления. Белые кружки - зависимость прогиба от давления, серые - зависимость воздушного потока

от давления. Кривая, проведенная через белые кружки, аппроксимируется зависимостью Н = АР1/3.

При низких давлениях (до 2 кПа) мембрана растягивается обратимо и экспериментальные данные по прогибу мембраны соответствуют расчетам по теории упругости, в соответствии с которыми прогиб мембраны пропорционален Р1/3, как видно из Рис. 10. Согласно полученным данным в соответствии с теорией деформации мембран (РоПапе С. е1 а1) был рассчитан модуль Юнга мембраны при растяжении вдоль её плоскости, который составил Е= 1,5-2,5 МПа.

При дальнейшем растяжении мембрана деформируется необратимо, а при давлении 55-60 кПа она рвется. Наблюдаемое значительное различие модуля Юнга в вдоль и поперек плоскости мембраны объясняется различными механизмами деформации вдоль этих направлений. При нормальном сжатии деформация мембраны состоит в изменении расстояния между волокнами в слое и не включает в себя растяжение волокон, при латеральном растяжении деформация включает в себя и растяжение волокон, что делает мембрану более жесткой при растяжении вдоль её плоскости.

Как показывает анализ, максимально допустимое рабочее давление на нанофильтре обратно пропорционально размеру ячеек поддерживающей его сетки, поэтому из данных, приведенных на Рис. 10, можно оценить, что при уменьшении окна поддерживающей сетки с 5 мм до 100 микрон величина рабочего давления увеличится с 2 кПа до 100 кПа.

Если эту мембрану положить на сетку с ячейкой диаметром 0,1 мм, она выдерживает без повреждений давление до 100 кПа, как предсказывает теория.

4.3. Влияние влажности на водорастворимые фильтры из поливинилп иррол идо на

Влияние влажности воздуха на свойства нанофильтров изучалось в закрытом боксе, влажность в котором измеряли с помощью психрометрического гигрометра.

При влажности выше 75% наблюдалось резкое снижение эффективности задерживания частиц нанофильтрами, как демонстрирует Рис.11 Б, и резкое повышение их сопротивления воздушному потоку, которое характеризуется коэффициентом Дарси (Рис. 11 А).

Влажность, % Влажность, %

Рис.11. Изменение свойств нанофильтров из поливинилпирролидона при повышении относительной влажности воздуха: А. Зависимость коэффициента Дарси от влажности. Б. Зависимость эффективности улавливания фильтром частиц 0.3-0.5 мкм от влажности.

Мы считаем, что по достижению указанной влажности ПВП волокна адсорбируют достаточное количество воды, чтобы обеспечить подвижность полимерных цепей, в результате чего исходно вытянутые молекулы полимера стремятся увеличить энтропию за счет перехода вытянутой цепи в клубок с потерей целостности волокон.

Таким образом, нанофильтры из ПВП могут использоваться только при относительной влажности воздуха не превышающей 75%.

5. Разработка метода детекции патогенов в воздухе с помощью водорастворимых нанофилыпров и ПЦР-РВ

Целью данного этапа работы была демонстрация работоспособности разработанных нами водорастворимых нанофильтров для анализа биологических микро- и наноаэрозолей и возможности исследования полученных проб стандартными методами определения патогенов.

5.1. Поиск видоспецифичных последовательностей ДНК бактерий Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis для ПЦР-анализа.

Многие бактерии рода Staphylococcus, такие как Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, являются опасными нозокомиальными инфекциями. Детекция этих патогенов в воздухе больничных палат представляет собой актуальную задачу.

Гомология ДНК видов Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis затрудняет поиск видоспецифичных последовательностей для их детекции методом ПЦР.

14

т

С помощью компьютерной программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov') нами были сравнены геномы этих бактерий и выбраны участки с наибольшим количеством делений. На этих участках были выбраны фрагменты для амплификации и подобраны праймеры для них с помощью программы PrimerExpress:

Staphylococcus epidermidis

5' - GCATTCTTTTCGGTTGTTTGATTATGTAATGCTCGGGCACCTACATCAT CCATTTAGTATAAATAACTCTTTTATCAAATATAGCGGTTCGATTTTGCAA - 3'

Длина фрагмента 1-100 bp

Staphylococcus aureus

5'-

CTATATATTTCAGTATTTGGTGACGCTACATTTAAAATGCCGAATTGTTCT

TGACCCGATTTAAGTGGTAC CGTTGCATGATG-3'

Длина фрагмента 1=83 bp

Fwd 5" -CTATATATTTC AGTATTTGGTG ACGCT AC A-3'

Rev 5'-CATCATGCAACGGTACCACTTAA-3'

Зонд 5' -F AM*TT AA AATGCCG A ATTGTTCTTG ACCCG A* RTQ1 -3'

С помощью программы BLAST мы показали, что данные последовательности являются консервативными внутри видов.

5.2. Сбор патогенов в помещении

На предыдущих этапах работы было показано, что нанофильтры из волокон ПВП могут эффективно работать при высоких скоростях потока воздуха. С учетом этого нами было изготовлено и испытано простое устройство для сбора и последующего анализа аэрозоля в воздухе помещений, состоящее из пылесоса и специальной насадки-держателя для фильтров изображенной на Рис.12А. Было показано, что с помощью такого устройства можно с 99%-ной эффективностью собирать аэрозоль с размерами более 300 нм из воздуха при объемной скорости потока 0.6 м3/мин. Как видно из Рис.12Б, наличие аэрозоля в собранных пробах становится заметным невооруженным взглядом уже после 1 минуты сбора. Такое устройство может быть использовано также для прямого определения массового содержания аэрозолей в воздухе помещения посредством взвешивания нанофильтра вместе с держателем до и после сбора аэрозоля из определенного объема воздуха. Так, из данных на рис. 12С можно определить, что в 1 м3 лабораторного воздуха содержалось 30 мкг материала.

Fwd Rev Зонд

5'- GCATTCTTTTCGGTTGTTTGАТТА-3' 5' -TTGC A A AATCG A ACCGCTAT АТТ-3' 5~-ROX*AATGCTCGGGCACCTACATCATCCA * RTQ-2-3'

20 30 Время, мин

0 min 1min 3 min 5 min 10 min 15 min

Рис.12. А. Насадка на бытовой пылесос для сбора аэрозоля. Б. Фильтры с собранным материалом, растворенные в 20 мкл воды. В. Изменение массы фильтра в зависимости от времени сбора.

5.3. Использование водорастворимых нанофилыпров для анализа нозокомиальных инфекций в условиях клиники.

Весь материал, собранный на фильтре, как было показано в предыдущем разделе, можно проанализировать методом ПЦР на наличие патогенных микроорганизмов. Нанофильтры из ПВП были использованы для сбора ДНК Mycobacterium tuberculosis в больничных палатах НИИ фтизиопульмонологии Московской медицинской академии им И.М. Сеченова. В образцах, содержащих ДНК Mycobacterium tuberculosis, также определяли ДНК других инфекций -Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis. Аэрозоль собирали на ПВП-фильтры из 6 м3 воздуха, после чего фильтры растворяли, лизировали гуанидин изотиоцианатом, очищали силиконизированными магнитными частицами (Sileks, Россия) и элюировали дистиллированной водой в объеме 70 мкл. В реакционную смесь для ПЦР в реальном времени вносили по 2 мкл элюата.

Результаты анализов проб, собранных в палатах туберкулезной клиники приведены в Табл.2.

Таблица 2. Результаты ПЦР-РВ анализа аэрозоля, собранного в больничных палатах с помощью нанофильтров из ПВП на присутствие ДНК патогенных микроорганизмов (даны С,).

Образец Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis

Палата №1 - 27.4±0.4

Палата №2 36.0±0.8 33,2±0.5

Палата №3 34.1±0.6 30.2±0.5

Из результатов, представленных в таблице, следует, что ДНК определяемых патогенов обнаружена в воздухе всех палат, кроме Staphylococcus aureus, ДНК которого отсутствовала в воздухе палаты №1.

В оценке наших коллег из ММА по данным ПЦР-РВ анализа ДНК Mycobacterium tuberculosis в палатах туберкулезной клиники концентрация бактерий оценивается в 1 бактерию на 2 м3 воздуха. Таким образом, появляется возможность определить наличие нозокомиальных инфекций при их концентрации, значительно меньших той, что вызывает инфицирование.

Таким образом, была продемонстрирована а) возможность сбора нанофильтрами естественного аэрозоля, содержащего ДНК, и б) эффективная очистка ДНК магнитными частицами в присутствии ПВП для детекции следовых количеств патогенов.

выводы

1. Уменьшение диаметра волокон поливинилпирролидона при добавлении диметилформамида в раствор для элекгроформования определяется не изменением в зацеплении полимерных молекул в растворе, а скоростью испарения растворителя с поверхности струи, и, следовательно, временем, за которое струя вытягивается в волокно.

2. Разработана технология получения нанофильтров электроформованием из раствора ПВП в смеси диметилформамид-этанол, которые имеют в 2,5 раза меньшее сопротивление воздушному потоку и меньшую массу при той же самой эффективности фильтрования, чем нанофильтры, изготовленные из водно-спиртовых растворов ПВП.

3. Определены модули упругости нанофильтров из поливинилпирролидона под действием нормальной и латеральной нагрузки и максимально допустимые перепады давления для фильтров.

4. Эффективность фильтрации наноаэрозолей фильтрами из ПВП растет с увеличением скорости потока с 5 до 13 м/с вследствие уплотнения фильтра и уменьшения среднего расстояния между его волокнами.

5. Водорастворимые нанофильтры из ПВП позволяют собирать аэрозоли в воздухе с относительной влажностью не более 75% и при температуре до 50 °С.

6. Продемонстрирована возможность сбора ДНК нанофильтрами и эффективной очистки ДНК в присутствии ПВП магнитными частицами для детекции следовых количеств патогенов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Morozov, V.N., Mikheev. A.Y. Water-Soluble Polyvinylpyrrolidone Nanofilters Manufactured by Electrospray-Neutralization Technique. // J. Membr. Sci. -2012. - V.403-404, P.l 10-120.

2. Mikheev. A.Y.. Kanev, I.L., Morozova T.Ya. Morozov, V.N. Water-Soluble Filters from Ultra-Thin Polyvinylpirrolidone Nanofibers. // J. Membr. Sci. - 2013. - V.448, P.151- 159.

3. Kanev I.L., Mikheev A.Y.. Shlyapnikov Y.M., Shlyapnikova E.A., Morozova T.Ya., Morozov V.N. Are Reactive Oxygen Species Generated in Electrospray at Low Currents? // Anal. Chem. - 2014. - V.86, №3 - P. 1511-1517.

4. Morozov V.N., Kanev I.L., Mikheev A.Y., Shlyapnikova E.A., Shlyapnikov Y.M., Nikitin M.P., Nikitin P.I., Nwabueze A.O., Van Hoek M.L. Generation and Delivery of Nanoaerosols from Biological and Biologically Active Substances // J. Aerosol Sci. -2014.-V.69-P. 48-61

5. Morozov V.N., Mikheev A.Y.. Kanev I.L., Vladimirsky M.A. Generation and Collection of Biological Nanoaerosols. // Proc. Internat. Conference. Nanomaterials: Applications and Properties, 2013.

6. Vladimirsky M.A., Mikheev A.Y.. Shipina L., Morozov V.N. Application of water-soluble nanofilters for collection of airborne Mycobacterium tuberculosis in hospital ward. // 44th Union World Conference on Lung Health, Paris, 2013.

7. Михеев А.Ю.. Морозов B.H. Аналитические нанофильтры из водорастворимых полимеров. // VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2013, стр.123-124.

8. Михеев А.Ю.. Морозов В.Н. Водорастворимые нанофильтры из поливинилпирролидона, получаемые электроформованием с последующей нейтрализацией в газовой фазе. // 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2012, стр.237-238.

Подписано в печать 22.05.2014 Печать лазерная

Заказ № 3645 Тираж: 65 экз.

Типография «Р1хРгтЬ> ИНН 503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 22 (4967) 75-97-84 www.fix-print.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Михеев, Андрей Юрьевич, Пущино

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201459785

Михеев Андрей Юрьевич

Разработка водорастворимых нанофильтров для анализа аэрозолей биологического и технического происхождения.

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: д.ф.-м.н. Морозов В.Н.

Пущино - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................10

1.1. Сбор и анализ аэрозолей........................................................................................................10

1.1.1. Сбор биоаэрозолей с помощью инерционных устройств................10

1.1.2. Сбор биоаэрозолей с помощью фильтров......................................................13

1.2. Основы теории фильтрации аэрозолей..................................................................15

1.3. Электроформование..........................................................................................................................19

1.3.1. Основные стадии электроформования................................................................20

1.3.2. Электроформование с нейтрализацией в газовой фазе........................21

1.3.3. Диаметр волокон, получаемых при электроформовании......................23

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ........................................................................25

2.1. Измерение диаметра волокон методом АСМ................................................25

2.2. Изготовление нанофильтров..........................................................................................25

2.2.1. Изготовление нанофильтров электроформованием из водно-спиртовых и ацетон-спиртовых растворов ПВП..............................................................26

2.2.2. Изготовление нанофильтров электроформованием из растворов ПВП в смеси этанол-ДМФ..................................................................................................27

2.2.3. Изготовление нанофильтров из ПВС........................................................................................28

2.3. Методы изучения фильтрующих свойств нанофильтров..............28

2.4. Измерение механических характеристик нанофильтров........................29

2.4.1. Емкостный метод измерения модуля Юнга..................................................31

2.4.2. Метод выпячивания (bulging)......................................................................................33

2.5. Измерение сопротивления воздушному потоку....................................................35

2.6. Измерения вязкости растворов ПВП........................................................................36

2.7. Измерения эффективности генератора аэрозолей..................................................36

2.8. Использование ПВС нанофильтров для анализа фрагментации белков в процессе электрораспыления методом масс-спектрометрии........................................................................................................................................................................37

2.9. Детекция патогенов с помощью ПЦР-РВ..............................................................38

2.9.1. Общие сведения о ПЦР-РВ............................................................ 38

2.9.2. Дизайн праймеров для детекции патогенов рода Staphylococcus........................................................................................... 41

2.9.3. Пробоподготовка........................................................ 42

2.9.4. Проведение ПЦР-РВ для детекции патогенов рода Staphylococcus..................................................................... 43

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............ 45

3.1. Испытание различных растворителей для улучшения качества нанофильтров из ПВП............................................... 45

3.1.1. Влияние добавок растворителей на диаметр волокон ПВП при электроформовании............................................................... 45

3.1.2. Изучение фильтрующих свойств нанофильтров из волокон

ПВП различной толщины......................................................... 49

3.1.3. Исследование зацепления ПВП молекул в различных смесях растворителей.................................................................. 51

3.1.4. Роль скорости испарения растворителя в разных растворах

ПВП............................................................................................................ 52

3.2. Поведение нанофильтров при больших линейных скоростях фильтрования....................................................................... 53

3.3. Изучение механических свойств нанофильтров................... 59

3.3.1. Измерение модуля Юнга нанофильтра из ПВП при нормальном сжатии................................................................... 59

3.3.2. Модуль Юнга нанофильтра из ПВП при латеральном растяжении........................................................................ 60

3.4. Влияние влажности на водорастворимые фильтры из ПВП... 62

3.5. Применение водорастворимых нанофильтров из ПВП в определении эффективности генерации наноаэрозолей................ 63

3.6. Применение водорастворимых нанофильтров из ПВС в изучении повреждения биологических молекул при электрораспылении 64

3.7. Разработка метода детекции патогенов в воздухе с помощью водорастворимых нанофильтров и ПЦР-РВ..........................................................66

3.7.1. Разработка видоспецифичных праймеров для ПЦР-анализа Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis................................................67

3.7.2. Сбор патогенов в помещении........................................................................................68

3.7.3. Использование водорастворимых нанофильтров для анализа нозокомиальных инфекций в больничных палатах....................................................70

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................................................................72

ВЫВОДЫ....................................................................................................................................................................74

БЛАГОДАРНОСТИ......................................................................................................................................75

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................................................76

ВВЕДЕНИЕ

Биологический аэрозоль - дисперсная система, состоящая из взвешенных в газовой фазе частиц, имеющих биологическое происхождение. В естественных условиях такой аэрозоль может содержать аллергены, токсины и патогены, что представляет угрозу здоровью и жизни людей. Широко распространены нозокомиальные (внутребольничные) инфекции, где основным механизмом заражения является аэрозольное инфицирование [1-3]. Известно, что наиболее эффективным способом применения биологического оружия является распыление бактерий, вирусов и токсинов в воздухе [4,5]. Таким образом, разработка методов анализа биологических аэрозолей представляет собой актуальную проблему.

В дальнейшем мы будем использовать термин аэрозоли в широком смысле, и называть микронным аэрозолем аэрозоли с размером частиц более 1 микрона, субмикронным аэрозолем - с размером частиц в диапазоне 0.1-1 мкм, а аэрозоли меньшего размера - наноаэрозолем.

В современных тест-системах на наличие патогенных микроорганизмов в воздухе используют инерционные средства сбора -импакторы и циклоны. Принцип работы таких устройств заключается в инерционном осаждении частиц на поверхность с последующим смыванием водой или буферным раствором. Недостатком этих устройств является низкая эффективность сбора при высокой энергозатратности. Частицы диаметром менее 300 нм данные устройства улавливать не могут.

Использование более эффективных средств сбора - волокнистых аэрозольных аналитических фильтров (АФА) или стекловолокнистых фильтров (НЕРА) - имеет существенный недостаток. Эти фильтры нерастворимы в воде, а смывание с них биологического материала неизбежно влечет за собой его потерю. Такие фильтры используют для анализа бактериальных аэрозолей в сочетании с культуральными методами - фильтр с собранным материалом помещают в чашки Петри с необходимой

питательной средой. Изучение вирусов, токсинов и аллергенов таким способом затруднено.

В лаборатории наноструктур и нанотехнологий ИТЭБ РАН был предложен метод сбора субмикронных аэрозолей и наноаэрозолей с помощью водорастворимых нанофильтров. Нанофильтры представляет собой мембраны из ультратонких волокон водорастворимого полимера (типа поливинилпирролидона или поливинилового спирта), которые формуется методом электропрядения с нейтрализацией нановолокон в газовой фазе противоионами, полученными при электрораспылении летучих растворителей. Такие водорастворимые нанофильтры позволяют с высокой эффективностью собирать аэрозоли всех размеров и концентрировать собранный материал в малом объеме буферного раствора. Полимерный материал фильтра достаточно инертен и не создает помех на всех этапах последующего анализа. В отличие от инерционных устройств, которые работают только с микронным аэрозолем, нанофильтры способны эффективно собирать и наноаэрозоли. Это позволяет использовать их для обнаружения вирусов и наноаэрозольных загрязнений техногенного характера, таких как: углеродные наночастицы, образующиеся при работе двигателей, углеродные нанотрубки и другие продукты нанотехнологии. Отмеченные преимущества водорастворимых нанофильтров делают их разработку весьма актуальной задачей как для анализа биологических аэрозолей, так и для анализа техногенных загрязнений воздушной среды.

Целью работы являлась разработка технологии производства водорастворимых нанофильтров и методов сбора и анализа аэрозолей биологического и техногенного происхождения с использованием таких нанофильтров.

Основные задачи исследования:

1. Изучить особенности электроформования водорастворимых нанофильтров из растворов поливинилпирролидона в смесях

различных растворителей с целью контроля толщины волокон.

6

2. Изучить влияние толщины волокон и плотности их упаковки на фильтрующие свойства изготовленных из них нанофильтров.

3. Исследовать механические и фильтрующие свойства нанофильтров и определить эксплуатационные условия и границы их применимости.

4. Продемонстрировать возможности использования нанофильтров для сбора и анализа биологических аэрозолей.

Научная новизна

Изучено влияние добавок растворителей на толщину волокон, образующихся при электроформовании из 6.5% растворов поливинилпирролидона в спирте.

Установлено, что изменение диаметра волокон ПВП при одинаковой концентрации полимера в изученных смесях растворителей не является следствием изменения в зацеплении полимерных молекул.

Впервые изучено поведение нанофильтров при сборе аэрозолей при высоких (до 13 м/с) линейных скоростях потока воздуха. Показано, что эффективность фильтрования микронного и субмикронного аэрозолей слабо меняется при увеличении скорости, а сбор наноаэрозолей значительно улучшается при увеличении скорости потока выше 5 м/сек. Это позволяет использовать аналитические нанофильтры для эффективного сбора наноаэрозолей при высоких линейных скоростях потока и собирать аэрозоли из большого объема воздуха за короткое время с использованием минимального количества полимерного материала фильтра.

Продемонстрирована возможность применения водорастворимых нанофильтров для анализа искусственных аэрозолей и детекции патогенов в воздухе.

Практическая значимость работы

Разработанный в данной работе метод сбора аэрозолей с помощью

нанофильтров позволяет за несколько минут с минимальными затратами

энергии собирать в виде жидкой пробы как наноаэрозоли, так и аэрозоли

7

микронных размеров с концентрированием собираемого материала из воздуха более чем в 100 000 000 раз. Это позволяет вести быстрый мониторинг загрязнения воздуха следовыми количествами опасных патогенов без использования дорогостоящего и энергоемкого оборудования.

Преимуществом разработанных фильтров является возможность их растворения в воде и химическая инертность материала, из которого они изготовлены, что позволяет анализировать собранные пробы для выявления патогенов с использованием методов, работающих с водными растворами: ПЦР, иммунохимических и культуральных методов. В настоящее время уже продемонстрировано успешное использование нанофильтров для анализа нозокомиальных инфекций в стационаре клиники НИИ фтизиопульмонологии ММА им. Сеченова, где фильтры применяются для сбора ДНК, с последующей детекцией методом ПЦР (Vladimirsky М.А. et al., 44th Union World Conference on Lung Health, Paris, 2013). Нанофильтры были также использованы для гигиенического контроля содержания наночастиц в воздухе рабочей зоны при производстве силицидов металлов (О.П. Яворовський и др., "Журнал НАМН Укра'ши", 2012, 18, 1).

Водорастворимые нанофильтры из поливинилпирролидона и поливинилового спирта широко используются в дозиметрии наноаэрозолей, исследуемых в лаборатории наноструктур и нанотехнологий ИТЭБ РАН (Morozov V.N. et al, J Aerosol Sei, 2013).

Апробация диссертации

Результаты диссертации были представлены на 4 научных конференциях: The 44th Union World Conference on Lung Health, 2013; Nanomaterials: Application & Properties, 2013; VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2013; 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2012.

Публикации По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в

том числе 4 статьи в рецензируемых журналах.

8

Список сокращений.

ACM - атомно-силовая микроскопия;

АФА - аэрозольный фильтр аналитический;

ДМСО - диметилсульфоксид;

ДМФ -диметилформамид;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ПВП - поливини л пиррол ид он;

ПВС - поливиниловый спирт;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени;

BLAST - basic local alignment search tool;

HEPA - high efficiency particulate absorbing;

MALDI - matrix-assisted laser desorption/ionization;

SDS - sodium dodecyl sulfate.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Сбор и анализ биоаэрозолей

Биохимическому, генетическому и культуральному анализу биологических аэрозолей предшествует их сбор. Сбор аэрозолей осуществляется с использованием различных устройств, принцип работы которых основан на механизмах улавливания, описанных в § 1.2.

Гравитацинное осаждение биоаэрозолей

Седиментационный метод Коха [6] является полуколичественным методом определения микроорганизмов в воздухе и заключается в пассивном осаждении бактерий или спор грибов из воздуха в открытые чашки Петри с гелем, приготовленным на соответствующей среде. Количество микроорганизмов рассчитывается согласно правилу акад. В.Л. Омелянского [7]: на поверхность среды в чашке Петри площадью 100 см за 5 минут оседает микробный аэрозоль, содержащийся в 10 литрах воздуха.

Несмотря на неточность метод до сих пор является широко распространенным благодаря простоте и доступности.

1.1.1. Сбор биоаэрозолей с помощью инерционных устройств

Известны три типа устройств, принцип действия которых основан на инерционности аэрозольных частиц: импакторы, циклоны и импинджеры. На рис. 1 показана схема работы одностадийного импактора и работающий на этом принципе аппарат Андерсена, а на рис. 2 показана схема работы циклона, где частицы благодаря центробежным силам осаждаются на поверхность, и устройство - циклон SAS S 4100.

Данные методы используют инерционное улавливание аэрозольных

частиц, как показано схематически на рис. 1, и 2. Не успевающие за сменой

10

направления потока воздуха частицы осаждаются на поверхность, с которой затем смываются водой или буферным раствором [8].

IMPACTION PLATE

Рис. 1. Схема работы импактора и прибор Андерсена.

В других аналогичных устройствах аэрозоль осаждается по инерции из потока, непосредственно направленного на гель в чашке Петри (аппарат Кротова, аппарат Андерсена, и др., рис.1) [9,10].

PARTICLE TRAJECTORY

STREAMUNE

Рис.2. Схема работы циклона и циклон SASS 4100

Третьим распространенным типом устройств для сбора биоаэрозолей являются импинжеры. Их действие основано на инерционном улавливании частиц непосредственно на жидкую поверхность [11], что делает сбор более

Collection cup

Sample airflow

71

Inlet

Cap

exit tube

мягким для живых организмов, рис.3. Высокая жизнеспособность собранного биологического аэрозоля является главным преимуществом метода [12].

Важнейшей характеристикой инерционных устройств является диаметр частиц Дм, эффективность улавливания которых достигает 50%, или эффективный аэродинамический диаметр разделения. Например, в простейшем случае, когда ширина канала импактора на всем протяжении неизменна и канал изгибается под углом 90°, он рассчитывается по формуле

где St5Q - число Стокса, которое соответствует аэродинамическому диаметру частицы с эффективностью улавливания 50%, для большинства импакторов с круглой щелью оно составляет 0,24, для большинства импакторов с прямоугольной щелью - 0,59, - динамическая вязкость газа, W - ширина щели импактора, Сс - поправка Каннингема, учитывающая столкновения молекул газа с частицей, рр - плотность частицы, U - линейная скорость потока газа.

Рис. 3. Импинджер SKC BioSampler

[13]:

О)

Число Стокса St - безразмерный параметр, характеризующий инерционное осаждение частиц диаметром с1р на поверхность. Для простейшего импактора оно находится по формуле:

(2)

Существует критическое значение числа Стокса, ниже которого импактор не работает. Для импакторов с круглой щелью оно составляет 0,125, для импакторов с прямоугольной щелью - 0,25 [14,15].

Расчет по формуле (2) показывает, что инерционные средства собирают субмикронный аэрозоль с низкой эффективностью, а частицы диаметром менее 0.3 мкм не улавливаются ими вовсе.

1.1.2. Сбор биоаэрозолей с помощью фильтров

Эффективным способом сбора биолог�