Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генерация биологически-активных наноаэрозолей

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Генерация биологически-активных наноаэрозолей"

На правах рукописи

(Л.

Канев Игорь Леонидович

Генерация биологически-активных наноаэрозолей

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

005549558

Пущино — 2014

005549558

Работа выполнена в лаборатории наноструктур и нанотехнологий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук

Морозов Виктор Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Пашовкин Тимофей Николаевич

(зав. лаб. ИБК РАН, г. Пущино),

кандидат физико-математических наук Горелов Александр Владимирович (ст.н.с. лаборатории физической биохимии ИТЭБ РАН, г. Пущино)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, физический факультет

Защита состоится « 25 » июня 2014 г. в 13-30 на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, и на сайте ИТЭБ РАН: http://web.iteb.psn.ru.

Автореферат разослан « 21_» ОС 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.ф.-м.н. ^^¿¿с^ Ланина Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Наноаэрозоли в последнее время привлекают большое внимание в качестве перспективного средства доставки лекарственных средств в организм ввиду ряда преимуществ такого способа введения лекарств. Во-первых, применение наноаэрозолей обещает существенное снижение рабочих доз лекарств. Так, было показано, что противовоспалительные препараты, попадающие в организм мыши в виде наноаэрозоля, давали терапевтический эффект при дозах в миллионы раз меньших чем при пероральном введении. Это связано с тем, что при пероральном введении большая часть препарата разрушается сначала в ЖКТ, а затем при прохождении через печень, в то время как при легочном введении препарат попадает в кровь, минуя печень. Во-вторых, в отличие от микронных аэрозолей, генерируемых коммерчески доступными небулайзерами и оседающих преимущественно в трахеях и бронхах, наноаэрозоли проникают глубоко в легкие - в альвеолы, где становятся недоступными для удаления посредством мукоцилиарного транспорта. Это обеспечивает более длительное воздействие лекарства и более полное попадание распылённого вещества в кровь. В-третьих, в случае лёгочных заболеваний, использование аэрозолей позволяет доставлять лекарственное средство напрямую в пораженные ткани лёгких, причём, изменяя размер частиц аэрозоля, можно контролировать область его преимущественного осаждения в разных участках легкого.

Существует несколько способов получения наноаэрозолей: конденсация из пара, низкотемпературный пиролиз, распыление растворов с применением ультразвука или струи сжатого воздуха с последующим высушиванием микрокапель, Однако большинство из существующих методов не являются универсальными и плохо применимы для лекарственных субстанций, так как способны повреждать структуры сложных молекул распыляемого вещества при генерации аэрозоля и не обеспечивают создание достаточной концентрации наноаэрозольных частиц. Таким образом, поиск новых и улучшение существующих технологий генерации наноаэрозолей биологически активных веществ является перспективной и актуальной задачей.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлась разработка технологии, позволяющей получать аэрозоли биологически-активных веществ с сохранением структуры и функциональных свойств молекул и имеющие размер частиц, обеспечивающий доставку распыляемого вещества в периферийные отделы лёгких.

Основные задачи исследования:

1. Разработать метод, позволяющий получать наноаэрозоли стабильной концентрации в течение времени, достаточного для доставки терапевтической дозы лекарства в организм лабораторных животных.

2. Исследовать особенности генерации наноаэрозолей из веществ различной природы.

3. Определить степень воздействия на распыляемое вещество повреждающих факторов, возникающих при образовании аэрозоля, таких как окисление активными формами кислорода и нарушение структуры при электронейтрализациии.

4. Оценить возможную дозу лекарств, доставляемую в организм посредством вдыхания наноаэрозолей.

Научная новизна работы.

Создан прототип установки для генерации наноаэрозолей биологических веществ и проведены его испытания с целью установления оптимальных параметров функционирования прибора. Установлено, что сила электрического тока и скорость потока воздуха не оказывают существенного влияния на распределение размеров частиц генерируемого аэрозоля, но существенно влияют на его концентрацию. Продемонстрировано значительное влияние свойств распыляемого раствора (концентрации вещества в растворе и его электропроводности) на размер частиц и концентрацию наноаэрозоля.

Проведён анализ повреждающих факторов при электрораспылении и нейтрализации - ключевых процессах технологии. Методом молекулярной динамики показано, что наличие гидратной оболочки на поверхности белкового многозарядного макроиона в газовой фазе защищает белок от повреждений при электронейтрализации противоином, что делает присутствие влаги в атмосфере при генерации наноаэрозолей белков фактором, необходимым для сохранения их структуры и функциональной активности в наноаэрозолях.

В дополнение к анализу физических повреждающих факторов проведён анализ возможных повреждений распыляемых биомолекул химическими веществами генерируемыми в процессе электрораспыления (ЭР). Оценены выходы активных форм кислорода (АФК) при ЭР: пероксида водорода, озона, супероксид- и гидроксил-радикалов. Установлено, что при токах ЭР до 250 нА только пероксид водорода образуется в заметных количествах (до 3 молей на 1 моль электронов).

Разработаны подходы для оценки доз наноаэрозолей, с использованием неинвазийных и инвазийных методов. Проведены предварительные испытания генератора наноаэрозоля в опытах с лабораторными животными. С использованием суперпарамагнитных наночастиц как маркеров установлено,

2

что при использовании сконструированного нами прибора в оптимальном режиме генерации наноаэрозолей мыши могут получать в среднем 0,5 мкг распыляемого вещества в час.

Практическая значимость работы.

Разработана технология и приборы, позволяющие непрерывно генерировать наноаэрозоль со стабильной концентрацией и неизменным распределением размеров частиц в течение не менее 6 часов и непрерывно контролировать работу генератора. Продемонстрирована применимость технологии для генерации наноаэрозолей из широкого круга субстанций (органических нелетучих веществ, антибиотиков, белков) и водных суспензий наночастиц. Получены и охарактеризованы наноаэрозоли ферментов, антибиотиков, латексных и магнитных наночастиц. Продемонстрирована возможность генерации наноаэрозолей белков с полным сохранением их структуры и функциональной активности. Это позволяет значительно расширить спектр лекарственных субстанций, перспективных для применения в наноаэрозольной форме. Разработаны подходы к дозиметрии наноаэрозолей, делающие возможной оценку количества лекарственного вещества, доставляемого в легкие. В настоящее время разработанная технология используется в совместном российско-американском проекте, направленном на разработку новых методов лечения и профилактики лёгочной формы туляремии с использованием наноаэрозольных форм антибиотиков, вакцин и специфических антител.

Апробация диссертации. Результаты диссертации были представлены на 4 научных конференциях: Nanomaterials: Application & Properties, 2013; 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2012; IV Съезд биофизиков России; Симпозиум I «Физико-химические основы

функционирования биополимеров и клеток» 2012; ASM Biodefense and Emerging Diseases Research Meeting, 2012.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 84 страницах, с использованием 22 рисунков и 5 таблиц. Работа включает в себя: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение полученных результатов, заключение, выводы и список литературы. Список сокращений. АФК - активные формы кислорода БСА - бычий сывороточный альбумин ВАХ - вольт-амперная характеристика ДМСО - диметилсульфоксид ФЭУ - фотоэлектронный умножитель ЭР - электрораспыление

з

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Определение повреждающих факторов в процессе генерации наноаэрозоля.

В основе разрабатываемой технологии лежит метод электрогидродинамического распыления растворов веществ с нейтрализацией образовавшихся сильно заряженных продуктов в газовой фазе противоионами, также получаемыми методом ЭР. Ранее было показано, что таким способом можно получать наноаэрозоли из белковых молекул и других веществ (Morozov V.N. J Aerosol Sei. 2001 v.42 р. 342-354). Преимуществами данного метода являются отсутствие прямого термического и ультразвукового воздействия на распыляемое вещество и возможность перевода в наноаэрозольную форму любой нелетучей субстанции, которую можно растворить или превратить в суспензию наноразмерных частиц. Однако, как процесс ЭР, так и процесс нейтрализации в газовой фазе являются высокоэнергетическими процессами, при которых биологические молекулы могут быть повреждены. Одна из задач работы состояла в выяснении повреждающих факторов процесса электрораспыления-нейтрализации и определении условий, способствующих получению аэрозольных продуктов с максимальным сохранением функциональной активности белковых и других биологических молекул.

1.1.Компьютерное моделирование процесса газофазной электронейтрализации.

Компьютерное моделирование было использовано для выяснения того, насколько опасен для белка процесс столкновения противоиона с сильно заряженным белковым ионом, созданным в процессе ЭР. Исследование было выполнено совместно с ИМПБ РАН (лаб. Н.К. Балабаева). Расчёты произведены в программном пакете PUMA. Анализ вторичной структуры белковой молекулы осуществлён с помощью программы YASARA. Для оценки интенсивности физического воздействия на молекулу белка кинетическую энергию атомов белкового макроиона пересчитывали в аналог температуры. Моделировалось столкновение нитрат- и гидроксид-анионов с положительно заряженной молекулой лизоцима яичного белка. Молекулярно-динамическое моделирование процесса нейтрализации показало, что при столкновении противоиона с сухой положительно заряженной (+18е) глобулой лизоцима выделяется энергия в несколько электрон-вольт, за счет чего происходит локальное нагревание нескольких атомов белка в месте удара до температуры, превышающей 1000 К. Эта избыточная кинетическая энергия далее рассеивается по всей молекуле белка в течение 1-5 пикосекунд (Рис. 1). Было показано, что несмотря на малое время жизни, такое возбуждение способно приводить к значительному повреждению вторичной структуры лизоцима: доля аминокислотных остатков, входящих в состав a-спиралей, снизилась с 33% в нативном лизоциме до 12% в макроионе лизоцима после соударения (Рис. 2)

'УИКЙУ-

ш:..

* й'и'-г

Рисунок 1. Динамика распределения энергии при столкновении гидроксид-аниона (изображен зелёным) с безводным положительно заряженного макроионом лизоцима. Цвет атомов белковой глобулы определяется мгновенной температурой: красный - более 1000К, оранжевый - 900 - 1000К, жёлтый - 800 - 900К. Под изображениями указано время, прошедшее после столкновения ионов.

безводная молекула +300 молекул воды

Рисунок 2. Влияние водной оболочки на сохранение вторичной структуры белка при столкновении с противоионом. А - температура белковой глобулы, треугольными маркерами указаны моменты столкновений с противоионами, В - доля остатков, входящих в а -спирали.

В противоположность вышеизложенному, картина существенно меняется при столкновении гидратированного (10 молекул воды на ион) противоиона с гидратированной (ЗООмолекул воды) глобулой лизоцима. Теперь в столкновении участвуют, в основном, атомы молекул воды, а не атомы белковой глобулы, и молекулы воды поглощают и диссипируют энергию удара. Это приводит к уменьшению температуры локального нагревания до 800 Кик

локализации нагрева в области гидратного слоя, без нагревания белковых атомов. В результате доля остатков, участвующих в образовании а - спиралей в гидратированном макроионе, меняется в результате столкновения значительно меньше, чем в сухом макроионе лизоцима, как видно из Рис. 2.

Таким образом установлено, что гидратная оболочка способна защитить биологические молекулы от повреждений при газофазной нейтрализации, перераспределяя энергию столкновения ионов. Этот фактор следует учитывать, избегая слишком обезвоженной атмосферы при генерации наноаэрозолей методом электрораспыления-нейтрализации.

1.2.Определение условий возникновения коронного разряда при электрораспылении.

Другим важным потенциальным повреждающим фактором при ЭР является химическое воздействие на распыляемое вещество озона, гидроксильных радикалов и других АФК, образующихся как побочные продукты электрораспыления при зажигании коронного разряда на вершине конуса Тэйлора. Наличие короны при ЭР было продемонстрировано в ряде работ по масс-спектрометрии, где были обнаружены фрагменты пептидов и продукты окисления белков, ионизованных методом ЭР. Однако указанные явления были выявлены при ЭР с использованием значительно больших напряжений и токов, чем в нашей технологии. Ввиду того, что потенциал, необходимый для начала коронного разряда, сильно варьирует в зависимости от состава газовой среды, типа и размеров капилляра, а также от состава распыляемого раствора, важными являются вопросы: всегда ли коронный разряд сопровождает ЭР, по каким признакам можно определить присутствие коронного разряда и насколько велико влияние АФК, образующихся в результате такого разряда. Для ответа на эти вопросы было предпринято специальное исследование, в котором регистрировали сверхслабое свечение, сопровождающее ЭР и провели измерение выходов ряда АФК.

Электрораспыление 96% -ного этанола производили из капилляров различного диаметра на металлический противоэлектрод, расположенный на расстоянии 5-10 мм от конца капилляра. Свечение регистрировали по току на аноде фотоумножителя ФЭУ-35. В ходе экспериментов изменяли напряжение, подаваемое на капилляр, измеряя ток между капилляром и подложкой. Результаты представленые на Рис. ЗА и ЗБ, демонстрируют, что свечение возникает при любом знаке потенциала, когда потенциал на капилляре достигает определенного значения.

Рисунок 3. Зависимость силы тока и интенсивности свечения от напряжения при ЭР этанола.

Из данных Рис. 3 видно, что в положительной моде (положительный потенциал на капилляре) первый излом на вольт-амперной характеристике (ВАХ) не сопровождается появлением свечения. Поэтому наличие излома не может быть признаком зажигания коронного разряда. Второй излом на ВАХ в точности соответствует току и напряжению, при котором ФЭУ регистрирует появление заметного свечения. При этом ЭР не прекращается, и коронный разряд идет параллельно ЭР, внося свой независимый вклад в ток, что объясняет наличие излома на ВАХ. Было отмечено также, что, однажды возникнув, коронный разряд не исчезает при понижении потенциала ниже порогового значения и ВАХ носит гистерезисный характер. При токах менее чем ~ 100 нА свечение, свидетельствующее о наличии коронного разряда при положительном потенциале, отсутствует. Это согласуется с литературными данными, где наблюдалось заметное снижение активности фермента только при электронапылении с использованием токов, превышающих 100 нА. Распыление в отрицательной моде имеет некоторые отличия: ЭР начинается при более низком напряжении на капилляре, а коронный разряд, регистрируемый по светоиспусканию, зажигается при более низком значении тока, чем при распылении в положительной моде.

На рисунке 4 представлены зависимости потенциалов, необходимых для начала ЭР и коронного разряда, от диаметра капилляра. Видно, что диапазон значений потенциалов, при которых ЭР не сопровождается коронным разрядом, расширяется с увеличением диаметра капилляра. Значение потенциала, необходимого для начала ЭР, слабо зависит от диаметра капилляра. Это можно объяснить тем, что ЭР происходит с конуса Тейлора на конце капилляра, и электрические условия на вершине конуса слабо зависят от диаметра капилляра. Коронный разряд начинается при меньшем значении потенциала, если скорость подачи жидкости в капилляр ограничена диаметром капилляра или приложением отрицательного давления к жидкости в капилляре. Другим важным фактором является форма конца капилляра: было замечено, что наличие острых выступающих сколов на торце капилляра способствует возникновению коронного разряда при меньшем потенциале.

Диаметр капилляра, мкм

Рисунок 4. Зависимость параметров ЭР от диаметра капилляра.

Показано, что существует предельное значение силы тока, протекающего через капилляр, при превышении которого процесс генерации аэрозоля начинает сопровождаться коронным разрядом на конце капилляра. Это значение зависит от природы распыляемого раствора и полярности электрода, а также от диаметра и формы острия капилляра. Чтобы минимизировать ожидаемое влияние продуктов коронного разряда на распыляемое вещество, требуется проводить процесс при напряжениях ниже предела возникновения коронного разряда.

1.3. Исследование возможности генерации активных форм кислорода при электрораспылении.

Для выяснения возможного повреждения распыляемого вещества химическими продуктами коронного разряда, был проведен количественный анализ ряда АФК, образование которых возможно при протекании коронного разряда в воздухе в присутствии паров воды.

Рисунок 5. Схема установки для измерения пероксида водорода и озона в продуктах ЭР.

Пероксид водорода определяли в пробе воды, через которую длительное время барботировали воздух, проходящий через камеру, в которой происходило ЭР этанола, как схематически показано на Рис 5. Концентрацию Н2О2 определяли спектрофотометрически по изменению интенсивности окраски красителя Amplex Red при его окислении пероксидом водорода, катализируемом пероксидазой хрена.

Для определения озона производили барботирование продуктов ЭР в воздухе через раствор индигокармина, изменение окраски которого в результате реакции с озоном определяли спектрофотометрически.

В отличие от Н2О2 и Оз, при определении супероксид-радикалов вместо барботирования, учитывая их чрезвычайно короткое время жизни, специфический реагент (тетранитротетразолевый синий) добавляли прямо в раствор, который распыляли в каплю ДМСО. Концентрацию супероксид-радикалов определяли спектрофотометрически по количеству образующегося полуформазана. Аналогично, гидроксил-радикалы определяли в продуктах электрораспыления раствора кумарин-3-карбоновой кислоты по флуоресценции образующегося продукта. В Таблице 1 суммированы данные по выходу разных форм АФК, образующихся при электрораспылении этанола в молях вещества на один моль электронов, прошедший через капилляр.

Таблица 1. Выходы активных форм кислорода при электрораспылении.

Измеряемый продукт Ток электрораспыления, нА

+150 -150

н2о2 0.5-1 1.5-3

ОН* <0.01 0.006

о2 <0.01 0.008

Оз <0.3 <0.3

Из данных Таблицы 1 видно, что даже при токах, превышающих порог возникновения коронного разряда в данной системе, единственным продуктом, генерируемым в измеримом количестве является пероксид водорода. При генерации наноаэрозоля в стандартных условиях концентрация пероксида водорода в воздухе не превышает 0,2 нмоль/л или 2 ррЬ.

2. Определение влияния параметров распыления и свойств распыляемого

раствора на концентрацию и спектр размеров получаемого аэрозоля. 2.1. Краткое описание конструкции наногенератора.

Генератор наноаэрозоля (Рис. 6.) представляет собой две пластиковые камеры, разделённые заземлённой металлической сеткой. В каждой из камер электрораспыление производится из стеклянного капилляра заполненного распыляемым раствором и присоединённого к независимому источнику высокого напряжения, снабжённому стабилизатором тока. Воздух подается в камеру через отверстия, расположенные коаксиально каждому из капилляров. Смешение продуктов ЭР и их взаимная нейтрализация происходят вблизи

центральной сетки, откуда образующийся нейтральный наноаэрозоль удаляется через выходную трубку, расположенную вблизи сетки.

Рисунок 6. Изображение(А), схема генератора наноаэрозоля(Б) и вид типичного спектра(В), полученного на установке (1% глюкоза, спектр усреднен по 10 спектрам)

2.2. Определение оптимальных значений электрических параметров.

Влияние силы тока на процесс электрораспыления.

Для оптимизации значений силы тока, протекающих через капилляры при электрораспылении, производили измерение спектра размеров и концентрации наноаэрозоля, генерируемого электрораспылением 1%-ного раствора глюкозы из карилляра под положительным потенциалом и 96%-ного этанола, распыляемого в отрицательной моде. В ходе опыта ток через один из капилляров оставляли постоянным, а ток через второй изменяли до тех пор, пока не прекращалось электрораспыление. На Рис. 7 представлены зависимости концентрации получаемого аэрозоля от приложенного тока. Видно, что от токов зависит как общая концентрация аэрозолей так и характер спектров. При увеличении тока через положительно заряженный капилляр выше 50 нА появляются частицы с размерами, превышающими 300 нм, в то время как при увеличении тока выше 60 нА через отрицательно заряженный капилляр они исчезают. Значения тока 90 нА через положительный капилляр и 40 нА через отрицательный капилляр соответствуют режиму, в котором генерируется

максимальная концентрация наноаэрозоля при сохранении стабильности электрораспыления.

Ток электрораспыления. нА

юооооо 100000 10000 1000 100 10 1 0.1 0.01

Э 20 40 60 80 100 Ток элекрораспыления, нА

юооооо 100000 юооо 1000 100 10

0.1 0.01

20 40 60 80 100 120

Рисунок 7. Зависимость концентрации генерируемого аэрозоля от токов. А. По абсциссе отложен ток через капилляр с глюкозой под положительным потенциалом. Ток через капилляр с этанолом — 20 нА. Б — то же для изменений тока через капилляр, заполненный этанолом, распыляемым из отрицательного потенциала при постоянном токе через капилляр с глюкозой - 90 нА. Заполненные значки для размеров частиц 7-300 нм, пустые для размеров 300500 нм. Скорость потока воздуха - 2 л/мин.

2.3. Влияние скорости потока воздуха на процесс электрораспыления.

Сравнение спектров и измерение концентрации наноаэрозолей из 1% водного раствора глюкозы как функции скорости потока воздуха через камеру производили, изменяя скорость подачи воздуха от 0 до 8 л/мин через один вход при постоянном потоке со скоростью 1 л/мин через другой. На Рис. 8 представлена зависимость концентрации наноаэрозоля от потока воздуха через отверстие вокруг капилляра с глюкозой (А) и вокруг капилляра с этанолом (Б). Видно, что изменение концентрации частиц с ростом скорости потока существенно отличается от расчетного разбавления аэрозоля, основанного на предположении, что одинаковое число наноаэрозольных частиц генерируется в единицу времени. Реальная скорость генерации при подаче воздуха по каналу вокруг капилляра с глюкозой увеличивается в 12 раз при увеличении потока от О до 8 л/мин, при этом объемная концентрация изменяется менее чем в два раза. Другая картина наблюдается при увеличении скорости по каналу, коаксиальному капилляру с этанолом (отрицательная мода). В этом случае скорость генерации частиц возрастает только в два раза при скорости 4 мин, а при дальнейшем увеличении скорости происходит затруднение процесса электрораспыления раствора с положительной моды и прекращение генерации наноаэрозоля. Сравнение рисунков 8А и 8Б показывает, что оптимальным направлением для ввода потока воздуха является параллельное капилляру с водным раствором (положительная мода). Таким образом, метод позволяет генерировать аэрозоль при скорости потока до 9 л/мин. Изменение скорости потока воздуха мало влияет на распределение размеров частиц наноаэрозоля.

Рисунок 8. Зависимость концентрации наноаэрозоля от скорости потока воздуха. Заполненными значками показаны экспериментальный данные, пустыми - теоретическая зависимость, получаемая в том случае, если концентрация аэрозоля изменяется только за счет разбавления. А - зависимость от потока с положительной моды, Б - с отрицательной.

2.4. Влияние электропроводности раствора на процесс электрораспыления.

Для определения влияния электропроводности раствора на процесс электрораспыления-ренейтрализации были получены наноаэрозоли 1%-ного раствора глюкозы, 1%-ного раствора БСА, а также 1%-ного раствора глюкозы с добавкой хлорида калия. На Рис. 9 представлены спектры полученных наноаэрозолей.

Диаметр частиц, нм

Рисунок 9. Сравнение спектров аэрозолей из растворов с разной электропроводностью.

Показано, что изменение электропроводности раствора при той же массовой концентрации растворённого вещества приводит к значительному изменению распределения размеров наночастиц аэрозоля. Так, растворы с разной электропроводностью, 1% раствор глюкозы (16 мкСм/см) и 1% раствор

БСА (60 мкСм/см), имеют сильно отличающиеся спектры при одинаковой массовой концентрации.

Однако, после добавления к раствору глюкозы хлорида калия до достижения электропроводности сравнимой с раствором БСА (80мкСм/см), спектр полученного аэрозоля становится близким к спектру БСА. Таким образом продемонстрировано, что электропроводность является одним из главных факторов, позволяющих контролировать размер генерированного наноаэрозоля

3. Применение метода электрораспыления с газофазной нейтрализацией для генерации наноаэрозолей ферментов с последующим измерением их специфической активности.

Экспериментальное исследование повреждающих факторов проводилось с использованием удельной ферментативной активности как меры повреждения. Генерировали наноаэрозоль фермента (щелочной фосфатазы), после чего аэрозоль собирали на водорастворимый фильтр из поливинилпирролидона, изготовленный по технологии электропрядения. Далее фильтр растворяли в воде. Ферментативная активность полученного раствора сравнивалась с активностью контроля, содержащего такое же количество фермента. Для определения эффективности электрораспыления в раствор фермента был добавлен свидетель - БСА, содержащий флуоресцентную метку. Сравнение флуоресценции растворенного фильтра с флуоресценцией исходного распыляемого раствора позволяло определить эффективность сбора аэрозоля. При электрораспылении щелочной фосфатазы при влажности воздуха 25% степень сохранения активности составляла 100% от исходной как при нейтрализации противоионами из этанола, так и при нейтрализации ионами воздуха, генерированными в коронном разряде. В то же время при 10 % влажности сохранялось только 57±3% исходной активности. Эти данные хорошо согласуются с результатами компьютерного моделирования процесса нейтрализации, приведенными выше, в соответствии с которыми уменьшение водной оболочки вокруг молекул белка при пониженной влажности, должно приводить к большему их повреждению при газофазной нейтрализации. Для оценки степени влияния образующихся АФК на распыляемое вещество была выбрана уреаза, так как ее молекула содержит большое количество легко окисляемых сульфогидрильных групп. Было проведено напыление в каплю воды раствора уреазы в концентрации 9 нМ при токе 200 нА в течение 40 мин. Распыляемый раствор уреазы содержал ЭДТА для предотвращения ингибирования фермента примесями тяжелых металлов. Измерение активности фермента показало, что даже при низких концентрациях уреазы и токах выше начала коронного разряда (150 - 200нА) не наблюдается изменения активности распыленного фермента. Это указывает на отсутствие заметных эффектов воздействия АФК на лекоокисляемые биологические молекулы.

4. Оценка эффективности процесса генерации наноаэрозоля и

определение дозы аэрозоля, оседающего в легких мышей.

Эффективность генерации наноаэрозоля для данной конструкции генератора оценивавась как отношение массы содержащегося в аэрозоле вещества к массе в распылённом объеме раствора. Распыляли 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина. Для генерации противоионов использовали 96%-ный этанол. Аэрозоль собирали на водорастворимый фильтр из поливинилпирролидона. Концентрацию БСА после растворения в воде фильтра с собранным аэрозолем определяли спектрофотометрическим методом. По результатам таких измерений средний выход БСА в форме аэрозоля составил 34±1% от количества распыленного белка.

Оценку максимальных доз лекарств, достижимых в наноаэрозольной форме с помощью нашего генератора, производили с использованием магнитных маркеров, присутствие которых в легких определяли на установке и по методике, разработанным в ИОФАН (г.Москва) П. И. Никитиным и М. П. Никитиным. Маркеры представляли собой покрытые декстраном наночастицы Ре304, имеющие средний размер частиц 70 нм. Для испытания на мышах генерировали аэрозоль из раствора 1% глюкозы с добавкой 0,2% магнитных наночастиц.

В экспериментах производилось экспонирование группы из 6 мышей в установке (Рис. 10А), обеспечивающей вдыхание аэрозоля через нос. Каждая мышь находилась в индивидуальной камере в фиксированном положении, что исключало слизывание аэрозоля с шерсти. В ходе опытов через 1ч, Зч и 5ч из группы отбирали по две мыши и усыпляли углекислым газом. Далее выделялись легкие, которые были высушены и гомогенизированы. В полученных образцах производилось измерение содержание магнитных частиц Ре304, результаты представлены на рисунке 1 ОБ.

Рисунок 10. Изображение установки для экспонирования мышей аэрозолем (А) и зависимость количества магнитных маркеров в лёгких мыши от времени (Б).

В результате проведенного предварительного исследования установлено, что разработанная нами установка позволяет в течение часа доставить в легкие мыши 0,5 мкг вещества при его распылении из 1%-го раствора.

ВЫВОДЫ

1. Создана конструкция генератора аэрозолей с независимыми источниками питания и дополнительным электродом в виде сетки, которая позволяет получать аэрозоли с размером частиц 10-300 нм и концентрацией до 0.4 мкг/л воздуха из растворимых в воде веществ при скорости потока воздуха до 9 л/мин.

2. Установлено влияние основных параметров распыления: силы тока, диаметра капилляра, скорости потока воздуха и свойств распыляемого раствора (концентрация и электропроводность) на размер частиц, форму спектра и концентрацию наноаэрозоля.

3. Определены условия возникновения коронного разряда при электрораспылении, сопровождающегося появлением излома на ВАХ и испусканием светового излучения. Основным продуктом коронного разряда при используемых значениях силы тока является пероксид водорода, образующийся с выходом до 3 молекул Н2О2 на элементарный заряд.

4. Гидратная оболочка на поверхности белкового макроиона защищает его от повреждений при газофазной электронейтрализации.

5. Получены и охарактеризованы наноаэрозоли ферментов, антибиотиков, латексных и магнитных наночастиц. Показана возможность генерации наноаэрозолей белков с полным сохранением структуры и специфической активностиц.

6. Разработанный генератор создает наноаэрозоль, который оседает в лёгких мышей в количестве 0,5 мкг в час.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kanev I.L., Mikheev A.Y., Shlyapnikov Y.M., Shlyapnikova E.A., Morozova T.Ya., Morozov V.N. Are Reactive Oxygen Species Generated in Electrospray at Low Currents? //Anal. Chem., 2014, 86 (3), P. 1511-1517

2. Morozov V.N., Kanev I.L., Mikheev A.Y., Shlyapnikova E.A., Shlyapnikov Y.M., Nikitin M.P., Nikitin P.I., Nwabueze A.O., Van Hoek M.L. Generation and Delivery of Nanoaerosols from Biological and Biologically Active Substances // J. Aerosol Sci. - 2014 - V. 69, P. 48- 61

3. Kanev I.L., Balabaev N.K., Glyakina A.V., Morozov V.N. Computer Simulation of Gas-Phase Neutralization of Electrospray-Generated Protein Macroions. //J. Phys. Chem. В-2012- V.l 16, P.5872-5881.

4. Mikheev A.Y., Kanev I.L., Morozova T.Ya. Morozov V.N. Water-Soluble Filters from Ultra-Thin Polyvinylpirrolidone Nanofibers. // J. Membr. Sci. -2013.-V.448, P.151- 159.

5. Morozov V.N., Mikheev A.Y., Kanev I.L., Vladimirsky M.A. Generation and Collection of Biological Nanoaerosols. // Proc. Internat. Conference. Nanomaterials: Applications and Properties, 2013, vol 2, #1, 01001-1 - 010013.

6. Igor L. Kanev, Victor N. Morozov, Nikolay K. Balabaev, Anna V. Glyakina, Monique L. van Hoek. Effect of hydration in generation of biologically active nano-aerosol by an electrospray-neutralization. // ASM Biodefense and Emerging Diseases Research Meeting, February 26-29, 2012, Washington DC

7. Балабаев H.K., Канев И.Л., Глякина A.B., Морозов В.Н. Компьютерное моделирование процесса электронейтрализации белковых макроионов в газовой фазе. // IV Съезд биофизиков России. Симпозиум I «Физико-химические основы функционирования биополимеров и клеток». Нижний Новгород, 2012, с.33.

8. Канев И.Л., Глякина А.В., Балабаев Н.К., Морозов В.Н. Компьютерное моделирование процесса газофазной электронейтрализации белковых макроионов. // 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2012, стр.231

Подписано в печать 22.05.2014 Печать лазерная

Заказ № 3646 Тираж: 65 экз.

Типография «р1хРгшЪ> ИНН 503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 22 (4967) 75-97-84 www.fix-print.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Канев, Игорь Леонидович, Пущино

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

На правах рукописи

04201459784

Канев Игорь Леонидович

Генерация биологически-активных наноаэрозолей

Специальность 03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: д.ф.-м.н. Морозов В. Н.

1

Пущино - 2014

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................9

1.1. Способы получения наноаэрозолей...............................................................................................9

1.1.1 Получение наноаэрозолей методами испарения - конденсации............................................9

1.1.2 Распыление растворов................................................................................................................11

1.1.3 Электрогидродинамическое распыление растворов...............................................................13

1.1.4. Получение наноаэрозолей электрогидродинамическим методом с последующей нейтрализацией в газовой фазе...........................................................................................................14

1.2 Возможные источники повреждения структуры вещества при ЭР.............................................16

1.3 Процесс газофазной электронейтрализации................................................................................18

1.4 Наноаэрозоли как лекарственная форма......................................................................................21

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................................................................23

2.1 Испытания генератора наноаэрозолей. Дозиметрия аэрозолей................................................23

2.1.1 Конструкция генератора наноаэрозолей...................................................................................23

2.1.2 Получение спектров наноаэрозолей..........................................................................................26

2.1.3 Дозиметрия наноаэрозолей, основанная на водоростворимых нанофильтрах....................27

2.1.4 Кварцевый микробалансный монитор наноаэрозоля..............................................................27

2.1.5. Установка для ингалирования мышей......................................................................................30

2.1.6 Дозиметрия аэрозоля с использованием магнитных маркеров..............................................30

2.1.7 Измерение электропроводности растворов...........................................................:.................33

2.1.8 Определение эффективности работы генератора наноаэрозоля............................................33

2.2 Определение повреждающего действия процесса ЭР на распыляемое вещество..................33

2.2.1 Оптические измерения................................................................................................................33

2.2.2 Получение вольтамперной зависимости ЭР (ВАХ)...................................................................34

2.2.3 Измерение излучения света при ЭР...........................................................................................34

2.2.4 Сбор пероксида водорода путем барботирования...................................................................34

2.2.5 Измерение пероксида водорода в собранных пробах.............................................................35

2.2.6 Измерение концентрации озона................................................................................................36

2.2.7 Измерение выхода супероксид-радикалов при ЭР...................................................................36

2.2.8 Измерение выхода гидроксил-радикалов при ЭР.....................................................................37

2.2.9 Определение влияния ЭР на удельную ферментативную активность уреазы.......................38

2.2.10 Определение влияния ЭР на удельную ферментативную активность щелочной фосфатазы .................................................................................................................................................................38

2.3 Компьютерное моделирование процесса газофазной электронейтрализации.......................39

2.3.1 Методика моделирования..........................................................................................................39

2.3.2 Подготовка отрелаксированных белковых макроионов.......................................д..................40

2.3.3 Моделирование столкновения ионов в ходе газофазной электронейтрализации...............41

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................................................44

3.1 Испытания генератора наноаэрозолей. Оптимизация условий получения наноаэрозолей. Дозиметрия аэрозолей.........................................................................................................................44

3.1.1 Совершенствование конструкции генератора наноаэрозолей................................................44

3.1.2 Испытания генератора для получения аэрозолей из различных веществ..............................46

3.1.3. Определение оптимальных значений электрических параметров. Влияние силы тока на процесс электрораспыления...........................................................................................................50

3.1.4 Зависимость спектра наноаэрозолей глюкозы в зависимости от концентрации распыляемого раствора........................................................................................................................52

3.1.5 Влияние электропроводности раствора на процесс ЭР...........................................................53

3.1.6 Влияние скорости потока воздуха на процесс электрораспыления........................................54

3.1.7 Стабильность и эффективность процесса генерации наноаэрозоля.......................................56

3.1.8 Определение дозы аэрозоля, оседающего в легких мышей...................................................59

3.2 Определение повреждающего действия процесса ЭР на распыляемое вещество..................62

3.2.1 Зависимость силы тока и эмиссии фотонов в зависимости от напряжения, приложенного к капилляру при ЭР...................................................................................................................................62

3.2.2 Локализация свечения, возникающего при ЭР..........................................................................67

3.2.3 Зависимость электрических параметров начала распыления и начала возникновения коронного разряда от диаметра и формы острия капилляра для ЭР...............................................68

3.2.4 Количественное измерение выхода пероксида водорода при ЭР..........................................69

3.2.5 Измерение выхода озона при ЭР................................................................................................70

3.2.6 Измерение выходов супероксид- и гидроксил- радикалов при проведении ЭР...................70

3.2.7 Измерение ферментативной активности уреазы после ЭР......................................................72

3.2.8 Влияние ЭР на ферментативную активность щелочной фосфатазы........................................73

3.3 Результаты компьютерного моделирования процесса газофазной электронейтрализации. .73

3.3.1 Зависимость стуктуры белкового макроиона от заряда и степени гидратации.....................74

3.3.2 Моделирование столкновения ионов........................................................................................78

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................................................................84

ВЫВОДЫ...................................................................................................................................................86

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................................87

Список публикаций по теме диссертации...........................................................................................99

ВВЕДЕНИЕ

Наноаэрозоли в последнее время привлекают большое внимание в качестве перспективного средства доставки лекарственных средств в организм ввиду ряда преимуществ такого способа введения лекарств. Во-первых, применение наноаэрозолей обещает существенное снижение рабочих доз лекарств. Так, было показано, что противовоспалительные препараты, попадающие в организм мыши в виде наноаэрозоля, давали терапевтический эффект при дозах в миллионы раз меньших чем при пероральном введении. Это связано с тем, что при пероральном введении большая часть препарата разрушается сначала в ЖКТ, а затем при прохождении через печень, в то время как при легочном введении препарат попадает в кровь, минуя печень. Во-вторых, в отличие от микронных аэрозолей, генерируемых коммерчески доступными небулайзерами и оседающих преимущественно в трахеях и бронхах, наноаэрозоли проникают глубоко в легкие - в альвеолы, где становятся недоступными для удаления посредством мукоцилиарного транспорта. Это обеспечивает более длительное воздействие лекарства и более полное попадание распылённого вещества в кровь. В-третьих, в случае лёгочных заболеваний, использование аэрозолей позволяет доставлять лекарственное средство напрямую в пораженные ткани лёгких, причём, изменяя размер частиц аэрозоля, можно контролировать область его преимущественного осаждения в разных участках легкого.

Существует несколько способов получения наноаэрозолей: конденсация из пара, низкотемпературный пиролиз, распыление растворов с применением ультразвука или струи сжатого воздуха с последующим высушиванием микрокапель. Однако большинство из существующих методов не являются универсальными и плохо применимы для лекарственных субстанций, так как способны повреждать структуры

сложных молекул распыляемого вещества при генерации аэрозоля и не обеспечивают создание достаточной концентрации наноаэрозольных частиц. Таким образом, поиск новых и улучшение существующих технологий генерации наноаэрозолей биологически активных веществ является перспективной и актуальной задачей.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлась разработка технологии, позволяющей получать аэрозоли биологически-активных веществ с сохранением структуры и функциональных свойств молекул и имеющие размер частиц, обеспечивающий доставку распыляемого вещества в периферийные отделы лёгких.

Основные задачи исследования:

1. Разработать метод, позволяющий получать наноаэрозоли стабильной концентрации в течение времени, достаточного для доставки терапевтической дозы лекарства в организм лабораторных животных.

2. Исследовать особенности генерации наноаэрозолей из веществ различной природы.

3. Определить степень воздействия на распыляемое вещество физических и химических повреждающих факторов, возникающих при образовании аэрозоля, таких как активные формы кислорода.

4. Оценить дозы лекарственных веществ, доставляемых в организм посредством вдыхания наноаэрозолей.

Научная новизна

Создан прототип установки для генерации наноаэрозолей биологических веществ и проведены его испытания с целью установления оптимальных параметров функционирования прибора. Установлено, что сила

электрического тока и скорость потока воздуха не оказывают существенного влияния на распределение размеров частиц генерируемого аэрозоля, но существенно влияют на его концентрацию. Продемонстрировано значительное влияние свойств распыляемого раствора (концентрации вещества в растворе и его электропроводности) на размер частиц и концентрацию наноаэрозоля.

Проведён анализ повреждающих факторов при электрораспылении и нейтрализации - ключевых процессах технологии. Методом молекулярной динамики показано, что наличие гидратной оболочки на поверхности белкового многозарядного макроиона в газовой фазе защищает белок от повреждений при электронейтрализации противоином, что делает присутствие влаги в атмосфере при генерации наноаэрозолей белков фактором, необходимым для сохранения их структуры и функциональной активности в наноаэрозолях.

В дополнение к анализу физических повреждающих факторов проведён анализ возможных повреждений распыляемых биомолекул химическими веществами генерируемыми в процессе электрораспыления. Оценены выходы активных форм кислорода: пероксида водорода, озона, супероксид- и гидроксил-радикалов. Установлено, что при токах ЭР до 250 нА только пероксид водорода образуется в заметных количествах (до 3 молей на 1 моль электронов).

Разработаны подходы для оценки доз наноаэрозолей, с использованием неинвазийных и инвазийных методов. Проведены предварительные испытания генератора наноаэрозоля в опытах с лабораторными животными.

С использованием суперпарамагнитных наночастиц как маркеров установлено, что при использовании сконструированного нами прибора мыши могут получать в среднем 0,5 мкг распыляемого вещества в час.

Практическая значимость работы

Разработана технология и приборы, позволяющие непрерывно генерировать наноаэрозоль со стабильной концентрацией и неизменным распределением размеров частиц в течение не менее 6 часов и непрерывно контролировать работу генератора. Продемонстрирована применимость технологии для генерации наноаэрозолей из широкого круга субстанций (органических нелетучих веществ, антибиотиков, белков) и водных суспензий наночастиц. Получены и охарактеризованы наноаэрозоли ферментов, антибиотиков, квантовых точек, латексных и магнитных наночастиц. Продемонстрирована возможность генерации наноаэрозолей белков с полным сохранением их структуры и функциональной активности. Это позволяет значительно расширить спектр лекарственных субстанций, перспективных для применения в наноаэрозольной форме. Разработаны подходы к дозиметрии наноаэрозолей, делающие возможной оценку количества лекарственного вещества, доставляемого в легкие.

В настоящее время разработанная технология используется в совместном российско-американском проекте, направленном на разработку новых методов лечения и профилактики лёгочной формы туляремии с использованием наноаэрозольных форм антибиотиков, вакцин и специфических антител.

Апробация диссертации

Результаты диссертации были представлены на 4 научных конференциях: Nanomaterials: Application Properties, 2013; 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2012; IV Съезд биофизиков России; Симпозиум I «Физико-химические основы функционирования биополимеров и клеток» 2012; ASM Biodefense and Emerging Diseases Research Meeting, 2012.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах.

Список сокращений

АФК - активные формы кислорода БСА - бычий сывороточный альбумин ВАХ - вольт-амперная характеристика ДМСО - диметилсульфоксид МД - молекулярная динамика ПВП - поливинилпирролидон ПВС - поливиниловый спирт ФЭУ - фотоэлектронный умножитель ЭР - электрораспыление

DMA - дифференциальный анализатор подвижности HEWL - лизоцим белка куриных яиц

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Способы получения наноаэрозолей.

Существует несколько принципиально отличных способов получения наноаэрозолей: конденсация паров, химические реакции в газовой фазе (горение), распыление вещества при искровом или дуговом разряде, распыление растворов с последующим испарением растворителя. Из всех перечисленных способов лишь немногие могут быть использованы для генерации биологических наноаэрозолей ввиду большой чувствительности биологических соединений к физическим и химическим воздействиям. Далее будет рассмотрен ряд таких методов.

1.1.1 Получение наноаэрозолей методами испарения -конденсации.

Испарение и последующая конденсация вещества в инертной атмосфере является широко распространенным подходом для получения аэрозольной формы многих субстанций. Преимуществами этого подхода являются высокая чистота и производительность. Кроме того, контролируя скорость охлаждения паров вещества, можно регулировать размер и морфологию образующихся частиц[1]. Существуют различные способы испарения вещества, отличающиеся используемыми источниками энергии: печи, искровой разряд, пламенные реакторы [2], плазменные [3,4] и лазерные генераторы [5]. Газофазный синтез лучше всего подходит для получения однокомпонентных частиц, так как при использовании многокомпонентных смесей различия в давлении паров могут приводить к образованию неоднородных аэрозолей [6].

Применение электрической печи для испарения вещества является одной

из наиболее простых методик получения высокочистых наноачастиц в

газовой фазе. Испарение материала происходит в трубке, через которую

протекает поток газа. Как правило это происходит при атмосферном

9

давлении. При дальнейшем охлаждении полученных паров образуются кластеры, содержащие несколько тысяч атомов или молекул, которые потом вырастают до наноразмеров путем коагуляции и конденсации [7,8]. Недостатком данного метода является нерегулярность размеров частиц при получении аэрозоля крупнее, чем несколько десятков нанометров, так как при высокой концентрации частиц происходит их быстрая агломерация. Еще одним недостатком данного метода является его пригодность для получения аэрозолей относительно летучих веществ, так как если температура кипения или сублимации вещества приближается к темпереатуре термического рпспада молекул - наноаэрозоли будут загрязнены продуктами распада .

Одним из самых универсальных способов получения наночастиц в газовой фазе является использование искрового разряда. Преимуществом данного метода являются дешевизна и возможность легкого масштабирования введением параллельных искровых промежутков [9,10]. Метод отличается высокой степенью чистоты получаемого аэрозоля. Он применим для распыления любого проводящего материала, включая полупроводники. Также возможно получение многокомпонентных частиц [12].

Метод конденсации успешно применялся для создания наноаэрозолей противовоспалительных лекарств, индометацина и ибупрофена [80,81]. В этих исследованиях указанные вещества подвергали нагреву в токе аргона с последующим охлаждением и смешиванием с воздухом. Таким �