Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции для изучения гостальной персистенции лептоспир и диагностики лептоспирозов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции для изучения гостальной персистенции лептоспир и диагностики лептоспирозов"

РГб од

4 л ЛПР 1ЧЧ1

, |i М>1>

А')сс.1^;кл я акалкуия ч::х н и?

научно-исследовалльск/и ордк.;1а трудэзтд) шяяэ ЗМЧЕНП ЯПШТГТ 3!КПЕ!ЯТСОГКЯ 1« МИКРОБИОЛОГ«*

ИШШ ПОЧЕТНОГО AKAJIF.'-OKA П. Р.ГАШЛЕ'А

На правах рукописи

САМС0Н9ВА Анна Петровна

РАЗРАБОТКА ТШ-СЙСТБЫЫ НА ОСНОВЕ П0ШБРАЗН0Я

iraihob и: «да для изучения и-стальпо2 персистенцяй лептосир я диапюстш лелтоспирозов

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1995

Работа виполнена в научно-исследовательской институте эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи

Научные руководители: доктор медицинских наук Ю.В.Ананьина доктор биологических наук А.Л.Гинцбург

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Н^!Г.Костакова доктор медицинских наук,

профессор Е.Г.Золина

Ведущая организация - Российский Государственный медицинский университет иы.Н.И.Пирогова

Защита диссертации состоится ъиг Р/_1995г.

в часов на заседании Специализированного совета

К 001.07.01. в НШЗД им.Н.Ф.Гамалеи РАМН по адресу: 123098, г.Москва, ул.Гамалеи, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЗД им.Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан ¿И-С^А^'Ъ 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного

совета, доктор медицинских наук Е.И.Коптелова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акй'.уальноот*. прошлом'.'. Л с ¡г; сспирозьг относятся к группе наг'.-а-яее распространенных ч соцкзлыхо аначиных природкоочвговых зоокозоь. о последние годы на территории Российской Ссдерации отпечена тенденция к росту заболеваемости этими-инфекциями среди людей. По тяжести кл:::шческаго течения и показателям детальности, достигающий в отдельных регионах ехрани 30%, они занимают одно из „л МК1!т. »

МНфСКЦИОЯип» :;м1яи Г>.в., 1550). С од-

ипп сгс>-п«, это обусловлено возрастании этиологической роди наиболее вирулентных лептоспир серогррп ХаАатЪьеаог&г&ля: ¡1 Овт1оо1а , с другой - отсутствием эффективных аетодов ранней экспресс-диагностики.

В литературе имеются сообщения о развитии отдаленных клинических, в частности неврологических, последствий у людей, перебсчевших иеиингоэнцефалитаыи лептоспирсзной этиологии (заоии. , 1982). Получены экспериментальные доказательства возможности персистенция лептоспир в тканях центральной нервной системы млекопитающих (Ананьина В., 1988, 1993). Однако эткопатогенез этих процессов практически на изучен из-за отсутствия эффективных методов индикации перс/.сти-руючих возбудителей.

Чувствительность разработанных к настоящему времени методов индикации лептоспир (микроскопические, иммунологические, иолекулярно-

^ 7

гонсхические) довольно низка: от ПК до 10 клеток в I шт. Эффективность ранее.использованного для изучения феномена гостальной персястекцта бактериологического метода ограничена ввиду широкого спектра питательных потребностей лептоспир, наличия среди них труднонультивируемих штаммов, а также действия компонентов тканей оргаиизиа-хозявна на их рост 1а.тзлго

Более перспективным в этом отношении представляется метод поли-ыеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на амплификации in vitro специфических последовательностей ДНК и отличающийся высокой чувствительностью и специфичностью (ИиШ«. , заш , 1985-1988).

Ранее разработанные за рубежом высокочувствительные тест-системы на основе ПЦР для индикации лептоспир ( ns Еу» , 1989; orere-ьшр , I990;Hooicey , 1992; Marian , 1992; Peroiat ,1993) обладают родовой, либо серогрупповой специфичностью. Это обстоятельство ограничивает возможности их использования в политипичных очагах лептоспирозов. Более того, они применялись исключительно в диагностических целях и не предпринималось попыток их использования дан решения научных проблем, в частности, для изучения феномена персистенции лептоспир. Поэтому представляется актуальной разработка тест-системы ПЦР, специфичной для всех патогенных лептоспир вида Leptospira interrogans и применение ее в целях ранней экспресс-диагностики лептоспирозов и изучения феномена гостальной персистенции лептоспир.

Цель исследования. В связи с изложенным целью работы явилась разработка высокочувствительного и видоспецифичного метода индикации Leptospira interrogans на оснозе полииеразной цепной реакции для изучения феномена гостальной персистенции лептоспир и диагностики лептоспирозов.

Основные задачи исследования:

1. Подобрать оптимальные' условия постановки ПЦР, обеспечивающие таксономическую специфичность тест-сиотеыы; определить ее чувствительность па препаратах очищенной ДНК и лизатах клеток чистых культур лептоспир.

2. Разработать епт,шальные способа подготовки проб гапптчсско-

го а патологического материала для исследования в НЦР.

3« Определить чувствительност» тест-састеыы ПЦР при глд-кау. кеп'/оспяр т, клянкческоа я патологическом материале на «оделышх образцах.

'+. Оценить сравнительную »$*е:ггазшость ПЦ?, бакте; яологкческо-го и макроскопического методов индикации при эксперимента?->ной острой лепгоспирозной инфекции и персястенпич ^„„и » "p-t

И»Ч1>л ~zzr...„а.

5. дать оценку эффективности тест-системы ПЦР при диагностике лептоспирозов у больных на различных стадиях заболевания.

Научная новизна. Разработана тест-система на основе ПЦР, обладающая бысокой чувствительностью, таксономической специфичностью и позволяющая в короткие сроки проводить индикации патогенних лептоспир большинства эпидемически значила: серогрупп. Б экспериментах на лабораторных животных и модельных системах ш vitro показана более высокая диагностическая эффективность ПЦР по сравнению с традиционными методами индикации лептоспир в тканях организма-хозяина на разных стадиях инфекционного процесса. Впервые метод ПЦР был применен с целы) изучения госталькоЯ персистепции лептоспир, что позволило расширить спектр сероваров лептоспир, для которых устг-яовлена способность перемстировать в тканях центральной нервной зистемы млекопитающих: выявлена дер^лстенция низковирулентных и груднокультивируемых лептоспир серовара екловът«. в тканях голов-wго мозга золотистых хомячков. С помощью ПЦР получены такие новые данные о продолжительности персистенцяи и локализации в различных ¡труктурах головного мозга хомячков лептоспир сероваров сорвпьа^еш,

lajioeblng, mozdok.

Практическая значимость работы. Показана принципиальная воз-

ыоккость использования разработанной аыплификационной тест-система л целях экспресс-диагностики лептоспирозов людей как на ранних стадия;; заболевания (включая серонегативные случаи), так и при отдаленных клинических последствиях. Полученные в работе данные используются при чтении лекций для врачей-бактериологов и эпидемиологов в Информационной Центре Госсанэпиднадзора РФ и Российской Медицинской Академии последипломного обучения.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены ка совместной конференции отдела инфекций с природной очаговостью и лаборатории генной инженерии патогенных ыикроорганизиов ШИЗУ им. • Н.Ф.Гамалеи РАМН 10 ноября 1994г., на заседании сектора инфектоло-гии отделения профилактической медицины РАШ (октябрь 1992г.) и на 71 Международной Европейской конференции по зоонозам в Словакии (октябрь 1993г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 3 тезисов в отечественной и зарубеяной печати.

Структура и обтем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка литературы, вклэтавдего 390 работ (из них на русском языке - 189, на иностранных языках - 201 > Работа изложена на 189 страницах машинописи, иллюстрирована 18 таб» лицами и 8 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали 28 штаммов лептоспир из коллекции лаборатории лептоспирозов Н'ЛИЗЛ км.Н.Ф.Гаи алей РАМН, представляющие различные таксоны 1ерг02р1га . Итаымк и ДНК других видов бактерий, использованные для проверки таксономической специфичности тест-системы ПЦР, ¿ыли любезно предоставлены сотрудниками НИИЭМ им.Н.Ф.

Гамалеи РАМН И.А.Шагиняном, Г.А.Марковой, А.А.Тереховым, К.В.Кал-пиннм, Л.Н.Нестеренко," С.В.Соловьевой, Н.Б.Гореловой.

Хептоспиры культивировали в среде Фервоорта-Вольфа при 29°С до 7 fi

плотности :5x10 -10° клеток s I мл. Плотность определяли подсчетом клеток в камере Петрова-Хауссера.

Для воспроизведения лептоспирозпой инфекции в качестве экспериментальной модели использовали 45 4-6-недельных сирийских золотио-тег ( ^T-yrxliiliii-iaiaàiii. ) ыаоодй 30-40г. Поел? предварительного контроля на спонтанное лептоспироносительство яивотных инфицировали внутрибрхшинным введением' 7-8-дневной культуры одного ИЗ следующих штаммов: I) 596 - серогруппа Ietorohaemorrhagiae. серовар eopenhageai , выделен от больного лептоспирозоы в 1990г.; 2) 232 - серогруппа я серовар te se; выделен от серой крысы С tu» norregieua ) в 1990г.; 3) 5IK - серогруппа sejroa: серовар e/sxkOifclng , выделен ОТ полевки-эконоыки ( Kierotua oeconoaus. ) В 1991г.; 48В - серогруппа дзоопа серовар noidok, выделен от обыкновенной полевки ( ".агтаНя ) в 1988г. ; 5; а.п. ♦ - серогруппа Рояюаа серовар Bonjator , выделен от серой крысы в 1989г.

При введении культур птаымов 596, 48В и н.п. * в дозах IO^-IO7 клеток у животных развивалась острая летальная инфекция; в более низких дозах (10*-1С? клеток) штаммы 596 и 48В вызывали хроническое почечное лептоспироносительство^ равно как и штаммы 232 и 5IK

о •»"

в максимальной дозе (1,2x10° клеток).

Хомячков, павших в острой стадии заболевания или забитых в различные сроки после заражения (os I суток до 4 месяцев), подвергали аутопсии в стерильных условиях; Препараты* из печени, почек и головного мозга исследовали на наличие лептоспир методами микроскопии в темном поле и посевом в питательную среду Фервоорта-Вольфа. Из ор-

ганов готовили суспензии в физиологическом растворе.

Было исследовано 73 сыворотки крови людей: 31 - от больных с клиническим диагнозом "лептоспироз" (21 - серопозитивные случаи, 10 - серонегативные), 20 — от больных заболеваниями неяептоспироз-ной этиологии (серозный менингит, вирусные гепатиты А и В, грипп) и 22 - от здоровых доноров. Образец спинномозговой жидкости для приготовления модельных проб получен от здорового донора.

До исследования в ПЦР все образцы хранились при -20°С.

Модельные образцы для определения чувствительности ПЦР при индикации лептоспир в тканях и клиническом материале готовили путем добавления известного количества клеток культуры штамма 596 к суспензиям тканей контрольных (неинфицированных) животных и к образцам сыворотки крови и спинномозговой жидкости здоровых доноров.

Выделение хромосомной ДНК лептоспир проводили по методу Мали» (1961) с модификациями';

Приготовление лизатов чистых культур лептоспир для использования в ПЦР осуществляли кипячением на водяной бане в течение 10-15 минут.

В предварительных опытах обработку суспензий тканей органов инфицированных кивотных, образцов клинического материала и модельных суспензий для исследования в ПЦР проводили несколькими методами и их модификациями {га.п Eye , IS89; Grayekamp ■ , 1990; Jackson , 1991; Gerritsen , 1991; Grinpei , 1991; Merien , 1992). В качестве оптимальной была выбрана методика, включающая в себя проведение лизиса с помощью протёиназы К и додецилсульфата натрия, экстракцию фенолом, феноп-хлороформом и хлороформ-изоаыиловьш спиртом,- осакде-ние этанолом. •

Прайыеры для 11ЦР оылн синтезированы сотрудниками лаборатории "

генной инженерна патогенных микроорганизмов ШшЗУ им.Н.Ф.Гамалек РАМН М.Ю.Аксеновым и Ю.С. Аляпняной фосфоаыидитныи методом на олг.-ГОНуКЛвОТИДНОМ синтезаторе Cene АявеаЫэг Пия (Швеция). Олцго-нуклеотидные последовательности праймеров были заимствованы из работы Ягатекяар (1990).

ПЦР проводили по одной из стандартных программ, разработанных в лаборатории генной инженерии патог*-и»'~ - „оинг"»"::^^ им.и "M'ücwiыя auiinw^rn-ojiá »арки Secta« гас.

гегясзрацию результатов ПЦР осуществляли путем исследования продуктов реакций методом электрофореза в агарозном геле и последующей окраской бромистым этидием.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка тест-системы для индикации лептоспир методом поли-ыеразной цепной реакции.

На первом этапе работы проводили подбор оптимальных условий приготовления лнзатов клнток чистой культуры лептоспир. Кале показали результаты сравнения ряда методов, обработка клеток кипячением на водяной бане имеет ряд преимуществ: простота я быстрота проведения процедура, исключение потерь ДНК в процессе депротеини-зации и моментальная гибель лрпюспчр, что немаловаяно в обеспечения бактериологической безопасности при работе с инфекционным материалом.

Следующий этап работы заключался в подборе таких условий прове_ депип ЯЦР. при которых обеспечивалась бы видоспецифичность реакции. При сохранении постоянными температур денатурации ДНК и элонгации lien;! ыы изменяли температуру отжига праймеров от 50 до 64°С.

При температуре отхига праймеров 50°С происходила амплификация Фрагмента ДНК всех исследованных штаммов лептоспир и ДНК эукариот (человека и быка), а ДНК микроорганизмов других таксономических групп при данных условиях не амплифицировались. При исследовании как препаратов очицешюй ДНК, так и лизатов клеток чистых культур лептоспир получены идентичные результаты. В основном наши данные совпали с приведенными в работе Сгатеьгшр в* &1. (1990). Однако, в этой работе отмечается отсутствие амплификации ДНК эукариот (без указания видовой принадлежности). В то ке время в наших исследованиях при практически идентичных условиях проведения ПДР наблюдалась амплификация фрагмента ДНК эукариот,.что исключает возможность использования этой тест-системы при исследовании клинического материала. Кроме того, наличие амплификации ДНК ь.ьипеха. , 1.1111-п1 , ь.рагта затрудняет индикацию ь.1пг»Еговопв в объектах окружающей среды.'

В этой связи мы предприняли попытку повысить специфичность ПЦР путем повышения температуры отвига праймеров, так как наличие псь-добного аффекта известно из данных литературы ( Беды. , 1988). В . дальнейших экспериментах мы изменяли температуру отжига праймеров от 52 до 64-°С. Остальные условия проведения ПЦР не изменялись.

Исследование продуктов ПЦР, полученных при температуре отайга праймеров 55°С, показало отсутствие амплифицированных фрагментов ДНК Хг.^вгховапя СврОГруПП Супоргвг1 , Аи-ЦвюаИв , АиэЬъИ» При наличии фрагментов ДНК Ь.ЫПеха , Ь.11Пп1 , Х.рагга и ДНК человека и быка. При температуре отжига праймеров от 57 до 62°С в продуктах ПЦР обнаруживали только амплифицированные фрагменты ДНК

Ь.1п1;сгго££Ша СерОГруПП 1^ого1гаешоггЬг1е?яа, Дауап1са, Сап1са1а, Еа11ип, Руто-еепез, Ропоил, Ее^гое, Тагаззот! . При ПОВЫШеШШ температуры ОТКИ-

га прайыероз до 63-64°С продукты ПЦР з геле не выявлялись ( табл:1.-цп I).

Таким образом, для обеспечения лидоспециличиости ПЦР оптимальной была признана температура отжига праймеров 60°С. При этих условиях определяли чувствительность тест-системы ПЦР с очищенной ДНХ и лиз атом клеток штамма 596 ( серо группа loterohneaorrhagine сeposар oopenhageni ). Показано, что чувствительность тест-системы пир

ПО да.4 '-I" 4 м пЛб-ХКЙМ - ¡.-Т») УЯЧНЫ. ~ T^ZZsi, ЧТО

соответствует 40-400 клеткам в I мл, так как объем реакционной смеси ПЦР в наших экспериментах - 25 ыкл.

Размер амплифицированного фрагмента ДНК составляет 210 нуклео-тидных пар (рисунок I).

Таким образом, нами разработана тест-система на основе ПЦР, обладающая высокой чувствительностью и видовой специфичностью. Ее использование дает возможность в короткие сроки (в течение первых суток) при относительно несложной методике обнаруживать наличие патогенных лептоспнр в исследуемои материале.

Разработанная тест-система на основе ПЦР имеет преимущества перед всеми известными методами индикации лептоегшр. Не уступая по чувствительности ранее предложенным за рубежом тест-системам ПЦР, она превосходит их по специфичности. Указанные тест-системы являются либо родо-, либо серогруппоспеци*ичными, в то время как разработанная нами обладает практически видовой специфичностью: позволяет выявлять ДНК ь.interrogans большинства эпидемически значимых серогрупп. При исследовании ДНК или лиэатов клеток лептоспир нескольких сероваров В пределах ОДНОЙ серогруппы ~ IcterohaemorrhaGlae ( серовары icterohaemorrhagiae » copenhageni ) < Javrmioa

^ pol f hanka ) f Pomona ( pamona , monjakor , oosdok ), Sejroe ( wolfiil ,

Таблица I. Результаты ПЦР с ДНК и лизатаыи лептоспир при различных температурах откига прайыеров.

Вид Серогруппа Серовар Результаты ПЦР пра

температуре мавга праЕаероЕ

52 55 57 60 62 64°С

1&1вГГО£КПС.

Ьср1;оар1ха Ъ1Г1еха Ьвр^оцева 1111п1 Ьер1ойр1т рагга

ДНК ет.иус! ДНК чолоьека

1с4егоЬаеаоггЬа£1а«. 1<гё«гаЬа«сюгтЬа£1л£ *

еор»аЬа£вп1 + + ♦ ■»V + -

1*твв1оо. ро1 + + + + + Щ»

+ ♦ + ♦ ♦ -

Сгш1оо1а. оааЮоХа + + + -

ТЗдПим соМаПпгИя + + + + ♦ -

Ругоевпев руговвпв». + + + + + -

Суюоргвг1 ЪоЪваЬо + - - - - -

Аи1члпа11в виЬлгпаИв +

Аив*;г»11а Ъго.и»1дта + - - - -

Рсиаока рсжош. + + + + -

иоп^ако-г + + + + + -

тоьйок + + + ♦ -

Ог1ррогурЬова 6г1рро*7рЬова. + + — - - -

Зе^гоа иоШИ + + + + + -

еайоеЫп^ + + + + + -

Вагат1ав + - — - -

Тагаваот1 + + + + -

Бсшагап^а раЪхт + + - - ' - -

БаЛгаса А11 Ьв1гшв а11 + + — — -

1111л± 11.11п1. 4- + - - - -

Ватта рапа + + - - - -

¡нка * + - - -

?зеу«ся I. 2явкгрофорврршяга яродриоз ПЦР при определений '•«¡гзстзигегшгосзя гвст-здястемы,

.1' - реотрикм ДНК бактериофага -л- ?гах : 2-9 - ДНК

?;«с*едоэв*ех:ьпнв десятикратные разведения 01 10 гк до Г 1С - .г.стсоп. без ДНЕ: П-15 -л;;за.- стачча 55-5, -^следовательные

десятикратные разаздонвя от ДО4 ю 10° чно-л^ 16 -

!;"51Т]Л>:!!> б;:? п;.;!^^!»;/,

вахкоемяе ) - происходила амплификация ДНК всех образцов, что свидетельствует оо отсутствии более узкой (серовариантной) специфичности предлагаемой нами тест-системы ПЦР.'

Метод полиыеразной цепной реакции в изучении гостальной пер-систенции лептоспир.

Известно, что наличие ингибиторов ПЦР в биологических жидкостях и тканях монет явиться причиной ложноотрииательных результатов или резкого снижения чувствительности ПЦР. В этой связи на первом этапе данного раздела работы ми проводили подбор оптимального метода обработки суспензий из ряда методик, известных по данным литературы (см. "Материалы и методы").

Согласно результатам, полученным на модельных суспензиях печени , почек и головного мозга хомячков, содержащих известное число клеток культуры лептоспир, показатели чувствительности тест-систе-' мы ПЦР составляли для тканей почек и головного мозга 1-10 клеток в пробе, т.е. соответствовали таковой при исследовании лизатов клеток чистой культуры, а для тканей печени - 100-1000 клеток в пробе. Снижение чувствительности в последнем случае, вероятно, связано с высокой концентрацией ингибиторов ПЦР в печени.

При наличии лептоспир в модельных суспензиях и органах инфицированных животных амплифицированный фрагмент ДНК по размеру соответствовал фрагменту очищенной ДНК и лизата чистой культуры лептоспир.

Микроскопический, бактериологический и ПЦР-анализы контрольных проб из органов неинфицированных животных во всех случаях давгн ли отрицательные результаты.

Сравнительная оценка диагностической эффективности различных методов индикации лептссяир (тепнолольпая микроскопия, посез в пи-?с?сльцую сред? и ПЦР) покапала достоверно более гысокую диагноста, ческу?; эффективною» последнего при исследовании паренхиматозных ергапов яивотних как при острой, так и хронической форме лептоспг-розспй инфекции (таблица 2),

Нппбо^ге гырагсаньши оказались различия в результатах инднка-

. ИЗ ЗР.птлппп - Lu»"mii»i »"»"» С

микроскопическим и бактерггояоппеекпи методами наличие возбудителя было установлено только s I ( 4,'Щ) из 21 исследованной пробы, в то время как'с поыощьэ ПЦР - в 13 ( 61, (таблица Z). Методом ПЦР персистирукщке а мозговой и почечной тка«* нях возбудители обнаруживались в течение длительного срока наблюдения: лептссппры серо вопя —- SO суток, а серов&ра в-xtoc-bic£ - 120 суток.

Согласно излученным ранее даян:.?.*, способностью к перскстенции в центральной нервной системе млекопитающих обладают только зксохо-вирулектные ("летадышо") штаммы лептоспир (Ананьина й.З., 1938, 1989, 1993). В насей работе только при использовании ПЦР-анализа впервые удалось установить, что "ренальные" стаымы со сниженной вирулентностью, в данном случае r:epo?apa , ганле персис-

тируют в центрально!! нервной системе хомячков.

При исследовании головного мозга 13 животных суспензии готовили отдельно из стволовой частк-мозяечка и больших полупарий. Положительные результаты в пробах стволовой части-мозаечка получены у 5 хомячков, а в пробах больших полушарий - тольно у 2, причем в тканях полушарий головного ьозга лептоспиры обнаруживались

Таблица 2. Сравнительная диагностическая эффективность различных методов индикации лептоспир в органах хомячков при острой и хронической лептоспирозной инфекции.

.Форма инфекции ' > !исло иссле- Доля полоаителъннх проб ( в % )

аован-яых печень почки головной мозг

хомячков микроскопия посев ПЦР микроскопия посев ПЦР микроскопия посев ПЦР

Острая(летальная) 22 27,3 . 22,7 45,5 18,2 54,6 72,7 0 27,3 45,5

Хроническая (ренальная) 21 0 4,8 19,1 76,2 66,7 100 4,8 4,8 61,9

Обобщенные данные 43 14,0 14,0 32,6 46,5 60,5 '86,1 2,3 16,3 53,5

только в более поздние сроки с момента заражения (через 3-4- месяца). Следовательно, ПЦР-анализ в дальнейаеы может быть использозан для более детального анализа локализации лептоспир в мозговой ткани! "см более, что до с:га пор подобных исследований не проводилось.

Эффективность индикации лептоспир s органах хомячков в значительной степени определялась серогрупповой принадлежность» возбудителям Например, при инфицировании хомячков высоко

леитплппов"» ^yiii'M -__¿¿j.-iauñ*»

í^iümm эг-5; ::ЦР была единствеянш ыетодоц, позволившим обнаружить лептоспир в тканях печени з острой фазе заболевания на 4-6-е сутки о момента инфицирования^' Напротив', при инфицировании животных леотоспирами серогругаш гоооп». серовара ¡»«яок (штамм 43В) все 3 метода индикации оказались в равной степени эффективными на ракних стадиях заболевания". Указанный факт вполне согласуется о ранее по-лученншя данныаа о низкой концентрации лептоспир серовара оореаьа-з печени хомячков при остром экспериментальном яептоспирозе (2арозкоз Я.й.г IS87).

со'разо'Д; ?■ наших исследованиях впервые показана зозмог-чосгь использования ПЦР-анализ а для индикации патогенных лептоспир с органах и тканях экспериментальных яивотных, как при острой ин*-фекции, так и при персистенпйи возбудителей.1 Это свидетельствует о перспективности применения этого аетода в целях ранней экспресс-диагностики лептоспирозов людей, а также их отдаленных клинических последствий.

'использование полимеразной цепной реакции' з диагностике лепто-спирозоа людей.

Согласно результатам, полученным при исследовании-модельных образцов сыворотки крови и спинномозговой жидкости людей, показатели чувствительности составляли 1-10 микробных клеток в пробе, что соответствует таковым при исследовании лизатов клеток чистой культуры лептоспирТ В пересчете на I ил это составляет 40-400 клеток.

Так как средняя концентрация лептоспир в крови больных в пери-" од лептоспиремии в средней составляв! 2x10* клеток/мл, то чувствительность разработанной нами тест-системы на основе ОДР теоретически вполне достаточна для проведения индикации возбудителей леп* тоспирозов в клинических образцах.

Результаты исследования клинических образцов сывороток крови людей отражена в таблице 3.

Таблица 3. Результаты ПЦР-анализа клинических образцов сывороток крови.

Группа больных Число исследованных сывороток Число положительных результатов ПЦР

I 21 14

П 10 5

Ш 20 3

17 22 2

- х/ -

В I группу были включены образцы сызороток крови, полученные от больных лептоспирозани с 5-го по 30-й день с момента заболевания и содержащие антитела к 1лл1згЕ->сз.а«£ 1-5 серогрупл ( гач^»-

Ьг.ггя1гг}»£3чв, Сап1оо1а, йгаспа,

Во П группу гоили сыворотки, взятцз за •"4—8—й день с моиента заболевания от больше?, котори! дкагкоз "леятоспироз" был поставлен ка основании цинических симптомов, Резрьгага реакции микро-агглютинацап (РИА) этих образцов била - _

„„¡ют. «нип»""" ПС ПООТупаЛЯ*

13 группу составляла сыворотки, взятые от больных заболеваниями нелептоспирозной откология, 17 - от здоровых доноров}

Статистическая обработка результатов, представленных в таблице 3, при помощи критерия % показала^ что между образцами I группы, с одной стороны, и Ш и 1У групп -о другой, имеются статистически зпачтшз различия (р< 0,01): в I группе частота положительных результатов ПЦР выше, чем в Ш и 1У группах,

¿мплифицированный фрагмент ДНК," выявляемый в сыворотках крови больных ясглоспирозями, по размеру соответствовал фрагменту ДНК лизата чистой культуры лептоспир штамма 596.

Результаты, полученные при, исследовании сывороток I группы в ШТР, били проанализированы в зависимости от сроков с момента заболевания! Среди образцов, взятых с 5-го по 10-Я день включительно, только в одной случае результат ПЦР был отрицательный, в то время как в более поздние сроки (11-30-й день) лептоспиры не обнаруживались уде в 50/6 всех исследуемых образцов, что хорошо согласуется с известными данными о патогенезе лептоспирозовТ

С практической точки зрения особенно важными представляются

положительные результаты ПЦР у 50Jó больных П группы о- клиническим диагнозом "лептоспироз" при отрицательных результатах Шк на 4-8-й день заболевания. *

Таким образом, в наших исследованиях показана принципиальная возмогность применения тест-системы на основе ПЦР для экспресс-диагностики лептоспирозов^ Данные ПЦР-аналнза клинических образцов* сывороток крови хорошо согласуются с клиническими сведениями и результатами серологического теста - PUA. Особую значимость этот ме- * тод приобретает при диагностике серонегативных случаев лептоспиро-зов, а в перспективе - для разработки методов диагностики отдаленных клинических последствий! оценки эффективности лечения, прогноза заболевания и индикации лептоспир в объектах окружающей среды? ■>

ВЫВОДЫ '

1. На основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) разработана тест- ..система, позволяющая проводить индикацию патогенных лептоспир ( leptospira interrogans. ) большинства эпидемически значимых серогрупп И сероваров: Iaterohaenorrhagl&e (loterohaeioorrhaglae, oop«nhage-

ni), Javanioa ( pol, hacia), Canicola (canicola), Balluo (caetalionis), îyroge-nos (pyrogenes), Bocona (ровопа, monjaJcoT, mozdok), Sejroe (wolifii, eaackoeblng) ,

Tarassori (taroeson) . Показана зависимость таксономической специфичности этой тест-системы от температуры отжига праймеров."

2. Чувствительность тест-системы ПЦР при определении в препаратах очищенной ДНК составляет I-IO фг, в чистой культуре лептоспир и модельных системах (суспензиях тканей почек и головного мозга хомячков, сыворотке крови и спинномозговой жидкости людей) -

I-IO клеток, в суспензии печени хомячков - IOO-IOGQ клеток в г.роЗс»

3. Метод ПЦР впервые бил использован в целях индикации лслто-спир в органах нивотных при острой и хронической форме экспериментальной лептоспирозной инфекции (на модели сирийских золотистых хомячков); Показано, что его диагностическая эффективность превосходит таковую бактериологического п микроскопического методов, особенно при индикации персистирута, их лептоспир з тканях централь-

"»j1""»" яиьохаьис.

4. Впервые установлена способность слабовирулентных и трудко-культивируемых лептоспир серовара »«кмыля персистирозать в тканях головного мозга хомячков (до 120 суток - срок наблюдения),

5. Показана принципиальная возможность использования разработанной амплификационной тест-стсистемы в целях экспресс-диагностики лептоспирозов людей! как на ранних .стадиях заболевания (включая серонегативные случаи), так и при отдаленных клинических последствиях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Самсонова А.П., Ананьина Р.В., Гинцбург А.Л. Индикация Leptoepira interrogans в органах экспериментальных нивотных методом полимеразной цепной реакции // Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особоопасных инфекций.' Тезисы докладов. Ставрополь, 1993, с. 271-273.

2. Самсонова А.П., Аксенов M.ß., Ананьина Ю.В., Маркова Г.А., Гаровникова Ю.С., Гинцбург А.Л. Разработка тест-системы для

выявления Xaptoapin interrogana методом полимеразной цепной реакции // Молекулярная генетика, микробиология и рирусология, 1994, й I, с. 15-19.

о

57 Самсонова А.П., Ананьина D.B^, Аксенов И.Ю., Савельева О.В. Гинцбург А.Л. Метод полииерааной цепной реакции в изучении госталь-ной персистенции патогенных лептоспир // Там se, с. 19-23. •

4* Ananjina Tu.Т., Задсоаот». А.Р., ainabuxg А»Х» baptosplrs. lntexrogaaa p«ralet«na»' in boit tlsmnst poljmaraa« ahaln r«aatica eualjal» // XII International oonfarenoe on соодоааа. Abatraota. Plotauj, Olorak Eeputll«, 1995, p. 6* 5* Ananjrin». Tu»T., Заваопотг AA Xesloglaal dinar il ty wlttlit tte bapteapixs. gesuoi oaleaUra tropiaa.to beat tlaauaa // TlIItit Haating of" Europaac Icptoaslra workora. Abetracta, Analo (Bona), 1994, p. 55.