Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии пре- и постнатальной диагностики группы синдромов, обусловленных микроделецией 22q11.2

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии пре- и постнатальной диагностики группы синдромов, обусловленных микроделецией 22q11.2"

На правах рукописи

КОЗЛОВА Юлия Олеговна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРЕ- И ПОСТНАТАЛЫЮЙ ДИАГНОСТИКИ ГРУППЫ СИНДРОМОВ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ МИКРОДЕЛЕЦИЕЙ 22qll.2

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

11 СЕН 2014

Москва-2014

005552398

005552398

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Золотухина Татьяна Владимировна

Официальные оппоненты:

Жученко Людмила Александровна, доктор медицинских наук,

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области

Московский областной НИИ акушерства и гинекологии, заведующая медико-генетическим отделением.

Демикова Наталия Сергеевна, доктор медицинских наук, Научно-исследовательский клинический институт педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирошва МЗ РФ, руководитель Центра мониторинга врожденных пороков развития.

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А. И. Евдокимова" Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 6 октября 2014 г. в 14 часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д.1; www.med-gen.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье,

Д.1.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание

ученой степени доктора наук, доктор медицинских наук, профессор

Зинченко Репа Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Хромосомные болезни занимают одно из ведущих мест в структуре врожденной и наследственной патологии человека. Спектр хромосомных аномалий (ХА), являющихся причиной наследственных синдромов, широк и представлен не только числовыми аберрациями, но и разнообразными структурными нарушениями хромосом, сопровождающимися дупликациями или делениями генетического материала. Классический цитогенетический анализ (G-band using Trypsin-Giemsa, GTG-метод) позволяет выявить все числовые ХА и те из структурных ХА, величина которых превышает 10 миллионов пар оснований. Значительная часть ХА представлена более мелкими аберрациями (микроделециями и микродупликациями), которые не могут быть выявлены при стандартном цитогенетическом анализе и требуют для диагностики использования современных молекулярно-цитогенетических или молекулярных методов исследования (Shaw СЛ., 2004; Lupski J.R., 2009).

Частота микроделеционных синдромов среди новорожденных достаточно высока (от 1:4000 до 1:30000). Многие известные на сегодняшний день синдромы (Ди Джорджи, Прадера-Вилли, Ангельмана, Смит-Магенис, «кошачьего крика», Миллера-Дикера, Вольфа-Хиршхорна, Вильямса) описаны задолго до того, как была установлена их этиология на молекулярном уровне.

Группа синдромов, обусловленных делецией 22qll.2, обозначаемая далее как синдром делеции 22ql 1.2 (Cfl22qll.2), включает в себя несколько синдромов с различными названиями и во многом перекрещивающимися клиническими признаками. Основными синдромами этой группы являются: вело-кардио-фациальный синдром, синдром конотрункальных и лицевых аномалий и синдром Ди Джорджи. В настоящее время СД22ц11.2 считается самым распространенным микроделеционным синдромом в популяции человека. Он встречается с частотой 1 на 4000 новорожденных и обозначается в зарубежной литературе как 22qll.2DS (22qll.2 Deletion Syndrome) (Goodship J. et al., 1998; Devriendt К. et al., 1998). Величина делеции 22qll.2, как правило, не превышает 3 миллионов пар оснований (м.п.о.), что не позволяет определять ее при стандартном кариотипировании, а требует использования молекулярных методов, в частности флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) или мультиплексной лигазной полимеразной цепной реакции (MLPA) (Gong W. et al., 1996).

Для пациентов с C,H22qll.2 наиболее характерны лицевые дизморфии, врожденные пороки сердца (ВПС) и магистральных сосудов, аномалии развития твердого и мягкого неба, патология мочевыделительной системы, снижение иммунитета, патология центральной нервной системы, психиатрические заболевания и умственная отсталость (McDonald-McGinn D. et al., 1997а; Sullivan К. et al., 1998). Выраженный клинический полиморфизм фенотипических проявлений также характерен для синдромов этой группы. Широкий спектр основных симптомов, формирующих группу СД22ц11.2, свидетельствует о сложности клинической

дифференциальной диагностики этих заболеваний и о необходимости анализа комплекса клинических признаков у пациентов с синдромом на репрезентативной выборке.

В настоящее время пренатальная диагностика (ПД) микроделеционных синдромов не имеет широкого распространения из-за сложности выявления группы риска среди беременных и специфики материала, полученного в ходе инвазивного вмешательства (Bretelle F. et al., 2010).

Разработка оптимального комплекса методических приемов с использованием современных молекулярных технологий в ранней (в том числе пренатальной) диагностике СД22ц11.2 актуальна как с научной, так и с практической точек зрения (Driscoll D. et al., 1993; Mosca-Boidron A.. et al. 2012).

Не менее актуально определение критериев отбора для формирования среди пациентов с подозрением на Cfl22ql 1.2, в т.ч. среди беременных женщин, группы риска для проведения комплекса лабораторных методов диагностики СД22ц11.2.

Цель исследования:

Целью работы является разработка подходов к пре- и постнатальной диагностике синдромов, обусловленных микроделецией 22qll.2, и оценка эффективности методов их лабораторной диагностики.

Задачи исследования:

1. Провести поиск эхографических маркеров C(Ht22ql 1.2 у плода, сформировать группу риска среди беременных, провести ПД синдрома методом FISH и оценить диагностическую эффективность предлагаемых маркеров.

2. Определить клинические критерии для формирования группы пациентов с подозрением на ÇQ22qll.2, на их основании создать карту-анкету и сформировать выборку для лабораторного обследования пациентов в постнатальном периоде.

3. Определить долю пациентов с микроделецией 22ql 1.2, выявленных молекулярно-цитогенетическим методом, среди пациентов постнатальной группы.

4. Провести сравнительный анализ фенотипических проявлений СД22д11.2 в подгруппах пациентов с подтвержденной делецией 22ql 1.2 и без нее.

5. Провести исследование ДНК пациентов постнатальной группы методом MLP А, определить размер делеции, провести поиск других делеций, формирующих у пациентов сходные с C,D22ql 1.2 фенотипические признаки.

6. Провести сравнительную оценку эффективности выявления микроделеции 22ql 1.2 методами FISH и MLP А.

7. Оценить вклад мутаций гена ТВХ1 в формирование фенотипа C,Z122ql 1.2 при отсутствии делеции 22ql 1.2.

Научная новизна

Определены клинические критерии формирования групп пациентов с подозрением на Cfl22qll.2 в постнатальном периоде с описанием четырех главных

компонентов синдромального фенотипа по признакам, характеризующим: 1) сердечно-сосудистую систему; 2) состояние тимуса и иммунитета; 3) лицевые дизморфии и расщелины; 4) другие микроаномалии развития. Использованные критерии клинического отбора пациентов с фенотипическими признаками C/I22ql 1.2 позволили оптимизировать диагностику C,H22qll.2 и выявить делецию 22ql 1.2 FISH-методом в 31% случаев. Показано, что подгруппы пациентов с подтвержденной делецией 22ql 1.2 и без делении различаются по частоте встречаемости некоторых признаков: у пациентов с делецией достоверно чаще наблюдались неконотрункальные ВПС, отдельные виды конотрункальных пороков (ОАС, ПДА, тип В), гипокальциемия, пороки развития МПС и совокупность четырех признаков, относящихся к лицевым дизморфиям и микроаномалиям развития. Впервые в выборке российских больных с C/122ql 1.2 методом MLPA определен размер делеции у пациентов и показано, что в исследованной выборке наиболее часто представлена делеция локуса LCR22-A-B-C (3 м.п.о.).

Мутации в гене ТВХ1 в обследованной группе пациентов с характерным для C,ZI22ql 1.2 фенотипом и отсутствием делеции 22qll.2, не вносят вклада в структуру причин синдрома.

Впервые определен комплекс эхографических маркеров C/122ql 1.2 у плода для формирования группы риска среди беременных.

Практическая значимость

Впервые предложен комплексный подход к диагностике СД22ц11.2, включающий отбор пациентов для лабораторного исследования по определенным клиническим критериям, цитогенетический (GTG-метод), молекулярно-цитогенетический (FISH) и молекулярные методы исследования (MLPA, секвенирование). Разработана карта-анкета расширенного описания фенотипа пациента, позволяющая оптимизировать лабораторную диагностику синдрома. Установлено, что чувствительность методов FISH и MLPA при диагностике делеции 22ql 1.2 одинакова, однако метод MLPA позволяет определить размер делеций и провести поиск делеций в локусах других хромосом.

Впервые на основании комплекса специфических эхографических признаков у плодов сформирована выборка беременных женщин с подозрением на делецию 22ql 1.2 у плода и проведена ПД СД22я11.2, делеция выявлена в 5% случаев.

Описание спектра клинических проявлений синдрома СД22ц11.2 как в пре-, так и в постнатальных периодах развития, выработка подхода к клинико-генетической диагностике синдрома с использованием современных молекулярных методов актуальны для врачей-генетиков, педиатров и врачей других специальностей, занимающихся дифференциальной диагностикой.

Положения, выносимые на защиту

1. Комплекс эхографических маркеров CJI22qll.2, включающий лимфатические образования в области шеи плода, пороки сердечно-сосудистой

системы, пороки развития МПС, гипо- и аплазию тимуса, является эффективным и позволяет выявить микроделецию 22ql 1.2 в 5% наблюдений пренатальной выборки.

2. Использование в качестве критериев отбора пациентов в постнатальном периоде для лабораторного обследования комплекса фенотипических признаков, включающего ВПС, нарушения иммунитета, гипокальциемию, пороки МПС, совокупность характерных лицевых дизморфий и микроаномалий развития, обоснованно, поскольку позволило сформировать выборку пациентов, частота выявления QZI22ql 1.2 в которой составила 31%.

3. Частоты отдельных фенотипических проявлениий в подгруппах пациентов с подтвержденной лабораторными методами делецией 22qll.2 и без нее достоверно различаются. Включение в карту-анкету гипокалыдаемии, пороков развития МПС и совокупности четырех признаков, относящихся к лицевым дизморфиям и микроаномалиям развития, позволяет повысить эффективность лабораторной диагностики.

4. Результаты выявления микроделеции 22qll.2, полученные FISH методом, полностью соответствуют результатам, полученным методом MLP А. Однако метод MLPA может являться предпочтительным, поскольку позволяет определить наличие делеции 22ql 1.2, ее размер, а также выявить делеции в локусах других хромосом, способных формировать схожие с Cfl22qll.2 фенотипические признаки.

5. В исследованной выборке мутации гена ТВХ1 не обнаружены и, следовательно, не вносят вклада в структуру причин Cfl22ql 1.

Апробация работы

Материалы диссертационного исследования неоднократно представлены в виде стендовых сообщений: на VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (г.Ростов-на-Дону, 2010 г.), на конгрессе Европейского общества генетики человека (г. Париж, 2013г.), на 9-ой конференции Европейского общества цитогенетиков (г. Дублин, 2013г.).; в виде устных сообщений на IX научной конференции «Генетика человека и патология: актуальные проблемы современной цитогенетики» (г.Томск, 2011 г.), на конференциях молодых ученых ФГБУ «МГНЦ» РАМН (г. Москва, 2012 и 2013г.). По результатам конкурсной конференции Молодых ученых ФГБУ «МГНЦ» РАМН за 2013г. представленная работа удостоена первой премии. Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара ФГБУ «МГНЦ» РАМН 19 февраля 2014 года.

Личный вклад автора в проведенные исследования

Определение направления работы, цели и задач исследования, разработка подходов к диагностике, оценка результатов исследования проводились автором совместно с научным руководителем д.б.н, профессором Золотухиной Т.В. Автором самостоятельно изучена отечественная и зарубежная литература по теме диссертации и лично написана рукопись настоящей работы. Основная часть экспериментальной

работы: составление карты-анкеты, анализ фенотипических признаков пациентов, формирование пре- и постнатальной выборки пациентов, молекулярно-цитогенетическое исследование, - выполнена автором самостоятельно. Часть исследования, относящаяся к секвенированию гена ТВХ1 и исследованию образцов методом MLPA, выполнена совместно с сотрудниками лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ «МГНЦ» РАМН. Сбор клинических данных осуществлен с помощью врачей-педиатров Городской клинической больницы № 67 им. JI. А. Ворохобова (г. Москва) и Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.И. Бакулева РАМН (г. Москва). Сбор клинических данных пренатальных наблюдений, эхографические исследования и инвазивные процедуры осуществлены врачами клинического родильного дома №27 г. Москвы.

Публикации

По теме и материалам диссертации опубликованы 23 печатные работы: 10 статей, в том числе 6 в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ и 13 тезисов,7 из них — в иностранных источниках.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 8 иллюстраций и состоит из разделов: оглавление, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, применение результатов и научных выводов, список условных сокращений, список работ, опубликованных автором по теме диссертации, список цитируемой литературы. Библиографический указатель включает 175 источников до 2014 года включительно, из них 9 отечественных и 166-зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Формирование и методы исследования пренатальной группы

При анализе отечественных и зарубежных литературных источников был определен перечень эхографических признаков для формирования группы риска среди плодов по наличию микроделеции 22ql 1.2.

Пренатальное исследование проведено в двух группах беременных женщин: 22 наблюдения в 1-м и 38 наблюдений во И-м триместре беременности. Показанием для направления на ПД СД22ц11.2 в I триместре являлось наличие у плода одного из следующих признаков: увеличенное воротниковое пространство (ВП), ВПС, лимфатические образования в области шеи. Во II триместре показанием к исследованию являлось наличие у плода одного из следующих признаков: ВПС, пороки мочеполовой системы (МПС), задержка внутриутробного развития плода (ЗВРП), аномалии развития неба, гиперэхогенные включения в желудочках сердца.

Цитогенетическое исследование в I триместре проводили на полупрямых препаратах ворсин хориона/плаценты, во II триместре - на препаратах из культуры

лимфоцитов пуповинной крови плодов (КЛПК), с использованием GTG-метода. Основным методом ПД C/I22ql 1.2 в исследовании являлся FISH-метод с локус-специфичным ДНК-зондом TUPLE1/ARSA (Abbott Molecular) на критический по данной микроделеции регион 22ql 1.2. Кариотипы всех плодов, отобранных для последующего исследования, определены как нормальные (GTG-методом).

Оценку толщины ВП проводили трансабдоминальным и/или трансвагинальным доступом с использованием ультразвуковых аппаратов среднего уровня, в интервале 1114 недель, при копчико-теменном размере плода 45-85 мм в строго саггитальной плоскости. Увеличенное ВП соответствовало превышениию 95-го процентиля нормативных для срока значений (под ред. Медведева М.В., 2002).

Формирование и методы исследования постнатальной группы

В результате анализа отечественных и зарубежных литературных источников был определен перечень фенотипических признаков, наиболее характерных для C/I22ql 1.2. Определены 10 клинических признаков, которые вошли в карту-анкету, использованную при формировании групп с подозрением на Cfl22qll.2 и направлении пациентов на исследование в постнатальном периоде. Пациентов из педиатрических отделений различного профиля (кардиологического, иммунологического, хирургического) направляли на диагностику микроделеции 22qll.2 при наличии и/или сочетании следующих фенотипических признаков: ВПС с указанием формы порока, характерные черепно-лицевые дизморфии (большой нос с узким основанием крыльев, узкие глазные щели, маленькая нижняя челюсть, расщелины неба и/или губы), микроаномалии развития (аномалии ушных раковин, длинные тонкие пальцы рук). Дополнительно, по возможности, в анкете указывали уровень кальция в крови ребенка, иммунологические показатели и состояние тимуса.

За период с 2010 по 2012 гг. включительно обследовано 140 пациентов с фенотипом, характерным для СД22ц11.2. Обследованная выборка по полу включала 62 мальчика и 78 девочек. Возраст пациентов варьировал от нескольких дней до 15 лет (большинство в возрасте до 1 года - 129 пациентов, 7 пациентов в возрасте от 1 года до 7 лет и 4 пациента в возрасте от 7 до 15 лет).

Цитогенегическое исследование. Во всех случаях проведено стандартное цитогенетическое исследование на препаратах из культуры лимфоцитов периферической крови при использовании GTG-метода на уровне 500-550 бэндов.

Молекулярно-цитогенетическое исследование. FISH-исследование проведено в 138 наблюдениях у пациентов с нормальным кариотипом на препаратах из культур лимфоцитов периферической крови с локус-специфичным ДНК-зондом TUPLE 1/ARSA (Abbott Molecular) в соответствии с протоколом фирмы-производителя (Рис. 1).

22qll

Рис. 1. Слева - схематическое изображение делеции 22ql 1.2 (один из гомологов делегирован по району 22qll.2; два нормальных гомолога хромосомы 22); справа - FISH на препарате из культуры лимфоцитов периферической крови с ДНК-зондом TUPLE 1 /ARS A (Abbott Molecular), локус TUPLE 1 мечен красным флуорохромом, контрольный локус ARS А - зеленым флуорохромом. Делеция локуса TUPLE 1 на метафазной пластинке и в интерфазном ядре.

Мультиплексная лигазная полпмеразная цепная реакция (MLPA). Для

расширения диагностических возможностей, при наличии доступного для исследования материала, параллельно с FISH-исследованием использован метод MLPA (п=77). Материалом для исследования служили образцы ДНК из лимфоцитов периферической крови пациентов и из взвесей клеток культуры лимфоцитов, зафиксированных в фиксаторе Карнуа. В исследовании методом MLPA для выявления аберраций в локусе 22q 11.2 использовали набор Р250-В1 DiGeorge Syndrome (MRC-Holland). Кроме 29 проб, маркирующих типично делетируемый регион 22q 11.2, в набор Р250-В1 включены ДНК-пробы на локусы других хромосом: ÎОр 14, 4q34-qter, 8р23, 17р13.3, 9q34.3, 22ql3. Делеции в этих локусах обусловливают фенотипические признаки, схожие с таковыми при QQ22ql 1.2.

Секвенирование гена ТВХ1. Поиск мутаций в гене ТВХ1 осуществляли методом прямого автоматического секвенирования по Сенгеру. В качестве матрицы для секвенирования использовали фрагменты ДНК, полученные после проведения ПЦР с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров, которые синтезировались в ЗАО «Евроген». Анализ результатов секвенирования осуществлялся с использованием программ Chromas и BLAST (http://www.ncbi.nim.nih.gov/blast).

Статистические методы. Статистическую обработку фенотипических данных пациентов постнатальной группы проводили с использованием программы Microsoft Excel. Для оценки достоверности различий между группами использован критерий ■£. Различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Результаты исследования пренатальной группы

В ранние сроки беременности обнаружение у плода фенотипических признаков, характерных для того или иного генетического синдрома, бывает затруднено. Ультразвуковое исследование (УЗИ) - единственный информативный метод исследования фенотипа плода. В большинстве случаев при УЗИ у плода выявляют как «грубые», так и «мягкие» эхографические маркеры, которые могут указывать на наличие числовых и мелких структурных ХА у плода. Часто «классический» GTG-метод может быть недостаточным для постановки точного диагноза, а заранее спланировать расширенное молекулярно-цитогенетическое исследование мелких структурных ХА у плода сложно, т.к. всегда имеется ограниченное количество биологического материала плода, полученного инвазивными методами. Совершенствование техники эхографических исследований, повышение мотивации и квалификации врачей ультразвуковой диагностики способствуют выявлению и описанию необычных пренатальных фенотипов, требующих дополнительных лабораторных исследований для раннего выявления генетических нарушений у плода Поиск дополнительных эхографических маркеров, способных отражать полиморфную клиническую картину, присущую микроделеционным синдромам, является новым актуальным аспектом ПД.

В данной работе представлены результаты пренатального исследования и диагностики СД22ц11.2 у 60 плодов с различными эхографическими маркерами в I и во II триместрах беременности (22 наблюдения - в I и 38 во II триместре) и нормальным кариотипом при GTG-исследовании для исключения из дальнейших молекулярных исследований случаев частых ХА.

ПД микроделеции 22ql 1.2 методом FISH в I триместре проводили, если у плода имелся один из следующих эхографических маркеров: увеличенное ВП, анэхогенные образования в области шеи плода, а также наличие изолированного ВПС или сочетания его с ВП.

В I триместре FISH-методом исследовано 22 образца ворсин хориона, где стандартным «полупрямым» методом определен нормальный кариотип. В этой группе микроделеция 22ql 1.2 диагностирована в одном наблюдении с показанием: анэхогенное включение в области шеи плода (Табл. 1). Увеличенное ВП является полипотенциальным фактором риска, маркирующим не только возможные ХА, но и пороки развития, в частности сердечно-сосудистой системы различной этиологии (Simpson L. et al., 2007; Westin M. et al., 2006; Makrydimas G. et al., 2003).

Во II триместре исследовано 38 образцов КЛПК. Основным показанием для направления на Р18Н-исследование являлось наличие у плодов с нормальным кариотипом ВПС, таких как транспозиция магистральных сосудов, тетрада Фалло, прерванная дуга аорты, атрио-вентрикулярный канал; гиперэхогенного фокуса в желудочках сердца плода, а также пороков развития МПС (пиелоэктазия, мегалоуретер), расщелин неба и/или губы, ЗВРП, аплазии тимуса, многоводия и их сочетаний. Микроделеция 22qll.2 в этой группе обнаружена у двух плодов (Табл.1). ВПС является основным показанием для ПД CД22qll.2, поскольку при таких пороках сердца, как дефект межжелудочковой перегородки, тетрада Фалло, атрезия легочной артерии, прерванная дуга аорты, общий артериальный ствол, праволежащая дуга аорты делеция 22qlt.2 обнаруживают у 20% пациентов (ВоифетНпе У. е! а1., 2001).

Сложностью цитогенетической ПД CД22qll.2 является ограниченность материала, полученного в ходе инвазивного вмешательства. Разработана тактика сохранения образцов клеток плодов с эхографическими маркерами для расширенного исследования.

Таблица 1. Результаты молекулярно-цитогенетической диагностики делеции 22qll.2 у плодов в I и во II триместрах беременности.

Показание для направления на ИвН-диагностику Количество Делеция Делеция не

наблюдений выявлена выявлена

I триместр (п=22)

Увеличенное ВП 17 0 17

Лимфатическое образование в области шен плода 3 1 2

ВПС + расширенное ВП 2 0 2

II триместр (п=38)

ВПС 20 0 20

ВПС + аплазия тимуса 1 1 0

ВПС + ВЗРП 2 0 2

Гиперэхогенный фокус в желудочках сердца 10 0 10

Аномалии ВПС + МПС 1 0 1

Аномалии развития неба + ВЗРП 1 0 1

Аномалии развития неба 1 0 1

Аномалии МПС 2 1 1

В данном исследовании плодов I триместра, когда структуры сердца и сосудов еще недостаточно сформированы, и поэтому трудно различимы при эхографии, отмечены лишь увеличенное ВП, анэхогенные образования в области шеи плода (лимфодема шейного отдела) и, реже, ВПС. Во II триместре, когда дефекты развития внутренних органов более различимы, лучшими эхографическими критериями при подозрении на CД22qll.2 у плода считаются ВПС и конотрункальные аномалии (ВоифетНпе У. е1 а1., 2001). В данном исследовании среди 38 наблюдений плодов II триместра делеция 22ql 1.2 выявлена в двух случаях: у плода с комбинированным ВПС (прерывание душ аорты, атриовентрикулярный канал) и с аплазией тимуса и у плода с аномалией МПС (двусторонняя пиелоэктазия, мегалоуретер и многоводие).

В связи с высокой распространенностью СД22ц11.2 и вариабельностью клинических проявлений этого синдрома при формировании группы беременных женщин с подозрением на СД22я11.2 у плода, в выборку во II триместре беременности включены случаи не только с пороками сердца плода, но и с аномалиями развития МПС, неба, тимуса, ЗВРП, гиперэхогенным фокусом в области сердца. В I триместре кроме случаев с увеличенным ВП, учитывали наличие ВПС и анэхогенных образований в области шеи плода.

К сожалению, детальное эхографическое исследование сердечно-сосудистых структур и тимуса плода редко проводят в раннем П триместре. Тем не менее, выявление сочетаний пороков сердца, в т.ч. конотрункальных, с гипоплазией/аплазией тимуса является прямым показанием для молекулярно-цитогенетического исследования C,H22ql 1.2 (Chaoui R. et al., 2002). В одном из представленных наблюдений микроделеция 22qll.2 выявлена у плода именно по этим показаниям. Атипичные для C,H22qll.2 проявления, представленные двусторонней пиелоэктазией и мегалоуретером в сочетании с многоводием, выявлены у другого плода с микроделецией 22qll.2. Так, в выборке плодов I и II триместров беременности, сформированной по выбранным эхографическим критериям, частота выявления Cfl22ql 1.2 составила 5% (3 из 60), что сопоставимо с данными зарубежных авторов (Bretelle F. et al., 2010).

Полученные результаты подтверждают мнение о том, что поиск информативных эхографических маркеров и сочетаний признаков для пренатального выявления Cfl22ql 1.2 должен быть продолжен. Описание фенотипических признаков всех случаев выявления микроделеции 22qll.2 у плодов крайне важно для оптимального формирования группы риска и повышения эффективности ПД синдрома, что также подтверждается результатами крупного мультицентрового исследования, проведенного во Франции (Besseau-Ayasse J. et al., 2014).

Многие из нарушений, характерных для СД22ц\ 1.2 в постиатальном периоде, могут быть распознаны уже пренатально при высоком уровне качества эхографического исследования и достаточной компетенции врачей УЗ-диагностики. Ранняя, в том числе ПД микроделеции 22qll.2 очень важна, т.к. у носителей этой делеции в постнатальном периоде наиболее частыми проявлениями являются ВПС, гипокальциемия, иммунодефицитные состояния, аспирационный синдром и другие патологические состояния и признаки. Это позволяет предусмотреть индивидуальный подход к обследованию и лечению таких пациентов как в перинатальный период, так и после рождения, обеспечить специализированную медицинскую помощь с учетом возможных проявлений заболевания со стороны различных органов и систем и провести дальнейшее медико-генетическое консультирование семьи.

Результаты исследования постнатальной группы

Результаты диагностики делеции 22qll.2 FISH-методом и анализ фенотипических данных пробандов

Проведено цитогенетическое исследование GTG-методом 140 пациентов с направительным клиническим диагнозом СД22с[11.2, имевших указанные в карте-анкете фенотипические признаки этого синдрома. При схожей клинической картине у пациентов в двух наблюдениях диагностированы мозаицизм по половым хромосомам mos 45,Х[42]/47,ХХХ[8] и тетрасомия по хромосоме X - 48.ХХХХ. Эти случаи исключены из выборки и их молекулярно-цитогенетическое исследование в дальнейшем не проводили. Кариотипы остальных 138 пациентов исследованной выборки, определенные GTG-методом, были нормальными. Всем пациентам с нормальным кариотипом проведено молекулярно-цитогенетическое исследование с ДНК- зондом TUPLE1/ARSA (Abbott Molecular).

FISH-методом делеция 22ql 1.2 выявлена в 43 из 138 наблюдений (31%). У 9 пациентов FISH-методом обследованы родители. Делеции 22ql 1.2 ни у одного из родителей пациентов не обнаружено, следовательно, во всех доступных для исследования случаях делеция 22ql 1.2 возникла de novo.

На сегодняшний день FISH-метод является самым доступным и наиболее часто используемым методом для идентификации делеции 22qll.2. Однако, несмотря на высокую чувствительность и специфичность FISH-метод не позволяет выявлять атипичные делеции и оценить размер делетированного участка хромосомы.

Фенотипические признаки, характерные для QQ22ql 1.2, перекрываются с клиническими проявлениями других синдромов (с. Смит-Магенис, с. Нунан, с. Вильямса, с. Шерешевского-Тернера, ассоциацией CHARGE и др.). Так, при дальнейших молекулярных исследованиях пациентов из группы без делеции 22qll.2 и с нормальным кариотипом у двух пациентов выявлен синдром Смит-Магенис и у одного пациента синдром Алажиля. Эти три наблюдения, так же как и два наблюдения пациентов с числовыми ХА, исключены из дальнейшего исследования. Полученные результаты свидетельствуют о невозможности точной постановки диагноза Cfl22qll.2, основанного только на фенотипических проявлениях у пациентов.

Для анализа фенотипических данных по наличию или отсутствию делеции согласно результатам FISH-анализа вся выборка пациентов с направительным диагнозом СД22ц11.2 и нормальным кариотипом разделена на две подгруппы пациентов: 43 наблюдения с делецией 22ql 1.2 и 92 наблюдения без этой делеции.

Большинство пациентов обеих подгрупп имели ВПС, в том числе конотрункальные аномалии, и те или иные характерные для QH22ql 1.2 лицевые дизморфии. К конотрункальным порокам сердца относятся различные варианты транспозиции магистральных артерий (ТМС), общий артериальный ствол (ОАС), атрезия легочной артерии (АЛА), перерыв дуги аорты, тип В (ПДА, тип В), двойное отхождение сосудов от правого желудочка (ДОС от ПЖ), тетрада Фалло (ТФ), стеноз

легочной артерии (СЛА) и другие аномалии, связанные с дефектами развития конотрункуса.

Структура и встречаемость ВПС у пациентов в исследованных подгруппах с делецией и без нее представлены в табл. 2. В большинстве случаев ВПС имели многокомпонентный характер, т.е. представлены различными формами порока у одного и того же пациента. Конотрункальные ВПС в таблице выделены.

Как следует из данных, представленных в табл. 2, у пациентов в обеих подгруппах наблюдались все виды пороков. Неконотрункальные пороки встречались почти в два раза чаще в подгруппе пациентов с делецией 22я11.2. Из неконотрункальных пороков наиболее часто в обеих подгруппах встречался ДМЖП. Такие конотрункальные пороки, как ОАС и ПДА, тип В чаще отмечены у пациентов с делецией, а ТФ чаще у пациентов без делеции 22ц11.2.

Таблица 2. Структура и частота встречаемости различных ВПС и аномалий

сосудов в подгруппах пациентов с делецией 22ц\ 1.2 (п=43) и без делеции (п=92).

Форма ВПС Пациенты с делецией Пациенты без делеции

Количество (%) Количество (%)

Дефект межжелудочковой перегородки 30 (69,8%) 30 (32,6%)

Дефект межпредсердной перегородки 12 (27,9%) 11(12%)

Межпредсердное сообщение 11(25,6%) 12 (13%)

Открытый артериальный проток 11 (25,6%) 14 (15,3%)

Общий артериальный ствол 9 (20,9%) 5 (5,4%)

Атрезия легочной артерии 8 (18,6%) 12 (13%)

Стеноз легочной артерии 7 (163%) 17 (18,5%)

Перерыв дуги аорты, тип В 6 (13,9%) 4 (4,4%)

Тетрада Фалло 5 (11,6%) 19 (20,6%)

Открытое овальное окно 5(11,6%) 2 (2,2%)

Двойное отхояадение сосудов от правого желудочка 4 (93%) 7 (7,6%)

Без ВПС 1 (2,3%) 7 (7,6%)

Кроме того у отдельных пациентов с делецией наблюдались такие дефекты, как сосудистое кольцо, аневризма межпредсердной перегородки, открытое овальное окно, аномалии аорты и клапана аорты, которые сочетались с лицевыми дизморфиями, микроаномалиями развития и иммунодефицитом

У пациентов без делеции 22qll.2 (п=92) также встречались разнообразные пороки сердечно-сосудистой системы, не представленные в табл. 2., такие как: коарктация аорты, транспозиция магистральных сосудов, атрио- вентрикулярный канал, гипоплазия левых отделов сердца.

В одном случае у пациента с подтвержденной делецией 22ql 1.2 ВПС не выявлен. У него отмечен острый иммунодефицит, гипокальциемия и типичные черепно-лицевые дизморфии. В семи случаях (7,6%) у пациентов без делеции и с отсутствием пороков сердечно-сосудистой системы отмечены лицевые дизморфии, нарушение иммунного

статуса, расщелины неба и/или губы, характерные микроаномалии развития и сочетания этих признаков.

При анализе клинических проявлений у пациентов учтены и другие признаки, относящиеся к различным органам и системам. Анализ этих признаков и пороков развития, встретившихся у пациентов с делецией 22ц 11.2 и без делеции, представлены в табл. 3.

Таблица 3. Структура и частота встречаемости характерных пороков и признаков в двух подгруппах пациентов - с делецией (п=43) и без делеции (п=92) 22ql 1.2.

Признак Пациенты с делецией Пациенты без делеции

Количество (%) Количество (%)

Гипокальциемия 12 (27,9%) 4 (4,4%)

Задержка психомоторного, речевого и полового развития 8 (18,6%) 12 (13%)

Расщелина неба и/или губы, небная недостаточность 7 (16,3%) 17 (18,5%)

Снижение иммунитета 6 (14%) 9 (9,8%)

Пороки развития мочеполовой системы 5(11,6%) 3 (33%)

Аномалии развития тимуса 2 (4.7%) 3 (3,3%)

Как видно из табл. 3, гипокальциемия и пороки развития МПС выявлены чаще у пациентов с делецией 22qll.2, чем у пациентов без делеции (р<0,001). Аномалии развития МПС, таким образом, могут быть дополнительным признаком, рекомендованным к включению в карту-анкету для направления пациентов на диагностику СД22ц11.2.

Кроме оценки патологии сердечно-сосудистой системы, особое внимание уделялось микроаномалиям развития лица и головы. Спектр лицевых дизморфий и других характерных для CД22qll.2 микроаномалий развития в подгруппах пациентов с делецией 22ql 1.2 и без делеции продемонстрированы на рис. 2.

В карту-анкету для направления пациентов на диагностику CД22qll.2 были включены четыре признака, относящиеся к лицевым дизморфиям и микроаномалиям развития: большой нос с узким основанием крыльев, аномалии расположения и строения ушных раковин, узкие глазные щели, а также длинные тонкие пальцы рук. Эти фенотипические проявления оценивались врачами-педиатрами и вносились в карту-анкету при направлении на молекулярно-цитогенетическое исследование пациентов.

Как следует из рис. 2, совокупность всех четырех признаков встречалась в обеих группах с разной частотой: в двенадцати случаях в группе пациентов с подтвержденной делецией 22qll.2, что составило 27,9% и лишь в семи случаях в группе пациентов без делеции, что составило 7,6% (р<0,01).

а

Тонкие длинные пальцы рук - 18

Узкие глазные щели - 17

Аномалии ушных -31

Нос+глаза - О Уши+пальцы - О

Большой нос с узким основанием крыльев — 19

Совокупность всех четырех признаков

27,9%

Тонкие длинные пальцы рук - 29

Узкие глазные щели - 20

Рис. 2 (а, б) Сочетание лицевых дизморфий и микроаномалий развития, характерных для СД22ц11.2 в двух подгруппах, а. Пациенты с подтвержденной делецией 22ql 1.2, абсолютное количество случаев описания признака в подгруппе, б. Пациенты без делеции 22ql 1.2, абсолютное количество случаев описания признака в подгруппе.

Для выяснения различий по структуре и частоте основных признаков синдрома: конотрункальных, неконотрункальных ВПС, лицевых и других аномалий, встретившихся у пациентов с делецией и без нее, проведена статистическая обработка описанных признаков (Рис. 3). Определено, что конотрункальные пороки сердца, также как лицевые дизморфии, выявлены с одинаковой частотой в обеих

Большой нос с узким основанием крыльев -23

б

Аномалии ушных раковин - 48

Совокупность всех четырех признаков -7,6%

Нос+пальцы - 1 Уши+глаза - 2

подгруппах - с делецией и без таковой. Тогда как встречаемость неконотрункальных ВПС выше в группе пациентов с делецией (р<0,03).

100% ■ ......................

80%-

60%-

40%—

20%..............

0% 1->

Конотрункальные Неконслрункальные Лицевые дисморфин Другие аномалии ВПС ВПС

•t del- « del+

Рис. 3. Основные клинические проявления в группах с делецией 22ql 1.2 и без делеции.

Полученные результаты свидетельствуют о высоком полиморфизме клинических признаков СД22ц11.2, затрудняющем его диагностику. Согласно литературным данным частота выявления микроделеции в группе пациентов с клиническими проявлениями C,H22qll.2 варьирует от 1 до 75% в зависимости от критериев, принятых при формировании исследуемых групп (Monteiro F. et al., 2013). В данном исследовании группы из 138 пациентов, сформированной по единой карте-анкете, включающей характерные клинические критерии, делеция была обнаружена у 31% пациентов (у 43 из 138). При использовании ограниченного перечня критериев для отбора пациентов на диагностику C,H22qll.2, например, только наиболее характерных видов ВПС, выявлено было бы меньшее число пациентов с микроделецией 22ql 1.2: только 28 из 43. Гипокальциемия как второй наиболее характерный для CJ\22<\\ 1.2 признак, позволила выявить еще 4 случая синдрома. Включение в перечень клинических признаков лицевых дизморфий и микроаномалий развития позволило диагностировать микроделецию еще в 11 случаях.

Результаты исследования делеции 22qll.2 методом MLPA

С целью улучшения диагностики Cfl22ql 1.2, поиска возможных других ХА, которые могли бы обусловливать развитие схожего фенотипа при отсутствии делеции 22ql 1.2, а также для определения величины выявленной методом FISH делеции в 77 наблюдениях пациентов проведена мультиплексная проба-зависимая лигазная реакция с последующей амплификацией (MLPA). Среди этих 77 образцов выявлены случаи как с делецией 22ql 1.2 (п=28), так и без нее (п=49). Метод MLPA

при использовании набора Р250-В1 DiGeorge Syndrome (MRC-Holland) позволяет в одной реакции не только выявить делецию и определить её размер. В этот набор также включены ДНК-пробы на локусы других хромосом, аберрации в которых способны вызывать сходные с СД22ц11.2 клинические проявления, в частности, различные виды ВПС (10р14, 4q34-qter, 8р23, 17р13.3, 9q34.3, 22ql3).

Результаты диагностики делеции 22ql 1.2 методом MLPA полностью совпали с результатами, полученными при FISH-исследовании. Делеция 22ql 1.2 подтверждена во всех 28 случаях и не выявлена в 49 образцах ни FISH, ни MLPA-методами.

Кроме подтверждения наличия или отсутствия делеции в ДНК исследованных пациентов, метод MLPA позволил установить размеры всех выявленных делеций (табл.

4).

Таблица 4. Результаты исследования методом MLPA анализируемой выборки.

Наличие и размер делеции Количество пациентов Доля различных вариантов делеций региона 1Х1К22 среди пациентов с подтвержденным диагнозом СД22ц11.2 (п=28)

Нет делеции 49

Делеция LCR22-A 1 3,5%

Делеция LCR22-A-B 4 14%

Делеция LCR22-A-B-C 22 79%

Делеция LCR22-A-B-C-D 1 3,5%

Всего 77

Как видно из результатов, представленных в табл. 4, среди 28 наблюдений, где делеция подтверждена и измерена методом MLPA, в подавляющем большинстве случаев - в 22 наблюдениях (79%), ее размер составлял 3 м.п.о. (локус LCR22-A-B-C). В 4 наблюдениях (14%) делеция затрагивала регион LCR22-A-B и составляла 2 м.п.о., и по одному наблюдению (по 3,5%) встретилась делеция размером в 3,5 м.п.о. (локус LCR22-A-B-C-D), и делеция размером в 1,5 м.п.о (локус LCR22-A). В исследованной выборке пациентов с CJ\22q\ 1.2 частота встречаемости делеций различного размера, в т.ч. типичного (3 м.п.о.), соответствует литературным данным (Shaikh Т.Н. et al., 2000).

На рис. 4 представлены делеции всех четырех размеров, встретившихся у пациентов выборки. Все они содержали регион LCR22-A, что позволило диагностировать все эти делеции FISH-методом. Связь между размером делеции и тяжестью фенотипических проявлений до настоящего времени не установлена (Carlson С. et al., 1997; Kerstjens-Frederikse W. et al., 1999).

а в

eye"

б Г

Рис. 4. Примеры результатов анализа MLPA-методом пациентов из выборки с делециями различного размера, "cat eye" - регион синдрома "кошачьего глаза", а - анализ доз генов для пациента В., выявлена делеция региона LCR22-A размером 1.5 м.п.о.; б - анализ доз генов для пациента Ф., выявлена делеция региона LCR22-A-B размером 2 м.п.о.; в - анализ доз генов для пациента Л., выявлена делеция региона LCR22-A-B-C размером 3 м.п.о.; г - анализ доз генов для пациента С., выявлена делеция региона LCR22-A-B-C-D размером 3.5 м.п.о. По горизонтали - участки исследуемых регионов и референсные пробы. По вертикали - условное обозначение числа копий анализируемого фрагмента, где 1.0- две копии фрагмента на геном.

Преимуществами метода MLPA являются высокая точность, относительная дешевизна анализа, возможность проведения анализа ДНК с малой концентрацией, а также возможность установления размера делеции (Vorstman J. et al., 2006).

Учитывая то, что подавляющее большинство делеций в районе 22qll.2 (более 90%) сопровождается потерей локусов HIRA и ТВХ1, FISH-метод с соответствующими локус-специфичными ДНК-зондами позволяет выявлять эти делеции. Однако, учитывая тот факт, что в 2-5% случаев могут встречаться атипичные, дистальные делеции (LCR22-B-C), более информативным является метод MLPA, особенно в тех случаях, когда делеции FISH-методом не диагностированы. В проведенном исследовании атипичные делеции не обнаружены. С другой стороны, у пациентов с типичной клинической картиной, где делеции не обнаружены, можно предположить наличие иесиндромальных пороков развития, возможно ассоциированных с другими генными нарушениями и требующих применения диагностических методов с более высоким разрешением.

Таким образом, для оптимальной и достоверной диагностики СД22ц11.2 в лабораторной практике необходимо использование современных лабораторных методов исследования, таких как FISH и MLPA. Причем метод MLPA может являться предпочтительным, поскольку позволяет в одной реакции не только определить наличие делеции 22ql 1.2 различного размера и локализации, но и выявить делении в локусах других хромосом, способных формировать схожие с QQ22qll.2 фенотипические признаки.

Результаты секвенирования гена ТВХ1

В группе пациентов, у которых делеция 22ql 1.2 не выявлена FISH и MLPA методами, происхождение клинических признаков синдрома QQ22qll.2 оставалось неясным. Фенотипические признаки нескольких микроделеционных синдромах связаны с мутацией в одном гене. К ним относятся синдром Рубинштейна-Тейби, синдром Ангельмана и синдром Алажиля. Принимая во внимание, что причиной некоторых генетических заболеваний может служить не только протяженная микроделеция (или микродупликация), захватывающая локус с несколькими генами, но и мутация в одном гене, предпринята попытка поиска мутаций в гене ТВХ1, который в настоящее время считается ответственным за формирование большинства фенотипических признаков, характерных для QQ22ql 1.2 (Jerome L. et al., 2001).

Для поиска мутаций в гене TBXJ отобраны образцы ДНК одиннадцати доступных для исследования пациентов с наиболее характерными фенотипическими признаками C^22qll.2, но без делеции. Для анализа гена синтезированы праймеры, соответствующие последовательности альтернативного транскрипта гена ТВХ1 — TBXJC, который согласно литературным данным является основным и в настоящее время наиболее изученным геном, ответственным за формирование характерного для C^22qll.2 фенотипа (Jerome L. et al., 2001). В результате исследования изменений нуклеотидной последовательности, имеющих клиническую значимость, не выявлено. Зарегистрировано несколько частых полиморфизмов. Представленные полиморфизмы являются нейтральными и не связаны с фенотипическими признаками у данных пациентов. Полиморфизмы проверяли по базе SNP (NCBI) www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе представлены результаты клинико-лабораторного исследования, направленного на разработку технологии выявления пациентов с СД22ц\ 1.2 при проведении пре- и постнатальной диагностики. Несмотря на высокую частоту СД22с] 1 1.2 в популяции, молекулярную диагностику синдрома проводят нечасто. Зачастую врачи разного профиля, наблюдая пациентов с отдельными признаками или комплексом признаков, характерным для Cfl22qll.2, ставят диагноз на основании только клинических проявлений. Однако, по сути, пациенты с такими признаками формируют лишь группу риска. В результате такого подхода к диагностике многим

пациентам диагноз поставлен необоснованно, а другие пациенты остаются вообще без точного диагноза, что затрудняет медико-генетическое консультирование семей, прогноз потомства, комплексное обследование и лечение пациентов с CД22qll.2. Клинический полиморфизм CД22qll.2 затрудняет прямую клиническую диагностику, обусловливая необходимость уточняющей диагностики с применением современных лабораторных технологий.

При использовании комплекса современных методов исследования впервые в РФ представлены результаты и обсуждены особенности диагностики CД22qll.2 в пренатальном периоде развития. Частота выявления делеции 22qll.2 в пренатальной группе составила 5% (в 3 из 60 исследованных случаев). Отмечены сложности ПД синдрома, связанные с тем, что пренатальный фенотип формируется постепенно в процессе онтогенеза и признаки могут быть по-разному выражены в разные сроки беременности, а также недостатком сведений о комплексе эхографических маркеров, свидетельствующих о микрохромосомной патологии плода, что затрудняет формирование среди беременных женщин группы риска по этому синдрому у плода.

Формирование группы риска на основании оптимизированных критериев, включающих расширенный перечень клинических признаков, — это первая ступень диагностики. Вторая ступень — молекулярная диагностика генетической патологии с использованием современных высокотехнологичных методов, что позволяет поставить точный диагноз тех генетических синдромов, диагностика которых затруднена вследствие высокого клинического полиморфизма.

В результате проведенного анализа литературных данных с описанием фенотипических признаков, встречающихся при CД22qll.2, составлена карта-анкета для врачей, направляющих пациентов на диагностику в постнатальном периоде. Для оптимизации диагностики такого частого микроделеционного синдрома, как CД22qll.2, целесообразно уже на этапе формирования группы риска кроме главных признаков, которыми являются ВПС (особенно конотрункальные), использовать расширенный перечень клинических признаков. К таким признакам относятся: черепно-лицевые дизморфии (большой нос с узким основанием крыльев, узкие глазные щели, маленькая нижняя челюсть, расщелины неба и/или губы), микроаномалии развития (аномалии ушных раковин, длинные тонкие пальцы рук), гипокальциемия, иммунодефицит, гипо- и аплазия тимуса. Кроме того установлено, что пороки развития МПС являются значимыми среди пациентов с CД22qll.2 и рекомендованы для включения в карту-анкету для направления на молекулярную диагностику синдрома в пренатальном периоде.

В целях аргументированного направления беременных женщин на ПД CД22qll.2, определен расширенный перечень наиболее вероятных УЗ-маркеров, при которых можно ожидать обнаружение делеции 22ql 1.2 у плода.

На репрезентативной выборке плодов в пренатальном периоде и пациентов в постнатальном периоде развития продемонстрированы современные оптимизированные подходы к формированию клинической группы пациентов с подозрением на CД22qll.2

и методам диагностики этого синдрома. При постнатальном исследовании пациентов с направительным диагнозом СД22ц11.2 в работе использован комплексный подход, включающий клинический отбор, стандартный цитогенетический, молекулярно-цитогенетический и молекулярные методы исследования при диагностике синдрома. Для оптимальной и достоверной диагностики Cfl22qll.2 в лабораторной практике необходимо использование современных прямых лабораторных методов исследования, таких как FISH и MLP А. Причем метод MLPA может являться предпочтительным, поскольку позволяет в одной реакции не только определить наличие делении 22ql 1.2 различного размера, но и выявить делеции в локусах других хромосом, способных формировать схожие с C,H22qll.2 фенотипические признаки. Хотя в исследованной выборке мутации гена ТВХ1 не вносят вклада в структуру причин C/122ql 1.2, необходимы исследования в выборках большего размера для уточнения их роли в патогенезе синдрома.

ВЫВОДЫ

1. Использование расширенного спектра эхографических признаков, включающего лимфатические образования в области шеи плода, пороки сердечнососудистой системы, пороки развития МПС, гипо- и аплазию тимуса, при формировании группы риска для направления на ПД Cfl22ql 1.2 позволило выявить делецию 22ql 1.2 молекулярно-цитогенетическим методом в 5% наблюдений пренатальной группы.

2. Определены критерии для направления на диагностику, создана карта-анкета и сформирована выборка пациентов с подозрением на QZ[22qll.2, а именно: ВПС, нарушения иммунитета, гипокальциемия, совокупность характерных лицевых дизморфий и микроаномалий развития.

3. В группе из 140 пациентов делеция 22ql 1.2 выявлена в 31% случаев при использовании комплексного подхода к диагностике C/I22ql 1.2 в постнатальной группе, включающего фенотипические, стандартные цитогенетические, молекулярно-цитогенетические и молекулярные методы исследования. Показано полное совпадение результатов диагностики C/I22ql 1.2 методами FISH и MLPA в постнатальной группе пациентов.

4. Установлено, что в группе пациентов с делецией 22qll.2 по сравнению с группой пациентов, у которых делеция не была обнаружена, достоверно чаще наблюдались неконотрункальные ВПС, отдельные виды конотрункальных пороков сердца (ОАС, ПДА, тип В), гипокальциемия и пороки развития МПС (р<0,001). Совокупность четырех признаков, относящиеся к лицевым дизморфиям и микроаномалиям развития (большой нос с узким основанием крыльев, аномалии расположения и строения ушных раковин, узкие глазные щели, длинные тонкие пальцы рук), достоверно чаще встречалась в группе пациентов с подтвержденной делецией 22ql 1.2 (р<0,01).

5. Методом MLPA определен размер делеции у пациентов с диагнозом, подтвержденным методом FISH. В исследованной выборке наиболее часто представлена делеция локуса LCR22-A-B-C (3 м.п.о.) (в 22 случаях из 28), реже - деления локуса LCR22-A-B размером 2 м.п.о. (в 4 случаях). Делеции локусов LCR22-A-B-C-D (3,5 м.п.о.) и LCR22-A (1,5 м.п.о) встретились в единичных наблюдениях.

6. Показано, что в исследованной выборке мутации гена ТВХ1 не вносят вклада в структуру причин Cfl22ql 1.

ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Разработанная технология постнатальной диагностики C,Q22ql 1.2 включает клинический отбор пациентов согласно карте-анкете, цитогенетическое исследование, молекулярную или молекулярно-цитогенетическое исследование делеции 22ql 1.2.

2. Разработанная карта-анкета для направления пациентов на лабораторную диагностику СД22я11.2 внедрена в практику Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского». Карта-анкета рекомендована к использованию при медико-генетическом консультировании и в медицинских учреждениях, проводящих диагностику и лечение пациентов кардиологического, иммунологического и хирургического профилей.

3. Стратегия пренатального определения синдрома СД22ц11.2 опубликована в научно-практическом журнале «Пренатальная диагностика».

4. Диагностика Cfl22qll.2 может быть успешной при применении FISH и MLPA методов, выбор метода зависит от технического оснащения лаборатории.

5. Разработаны рекомендации по выявлению больных с Cfl22qll.2, опубликованные в журнале «Педиатрия».

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

22ql 1.2DS — 22ql 1.2 Deletion Syndrome GTG-метод - G-band using Trypsin-Giemsa FISH - флуоресцентная in situ гибридизация MLPA - мультиплексная лигазная полимеразная цепная реакция АЛА — атрезия легочной артерии ВП — воротниковое пространство ВПС - врожденный порок сердца

ДОС от ПЖ- двойное отхождение сосудов от правого желудочка ЗВРП - задержка внутриутробного развития плода КЛПК - культура лимфоцитов пуповинной крови плода МПС-пороки (развития) мочеполовой системы ОАС - общий артериальный ствол

ПД- пренатальная диагностика

ПДА, тип В - перерыв дуги аорты, тип В

Cfl22ql 1.2 - синдром делеции 22ql 1.2

СЛА — стеноз легочной артерии

ТМС - транспозиция магистральных артерий

ТФ — тетрада Фалло

УЗИ — ультразвуковое исследование

ХА — хромосомная аномалия

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК МОИ РФ

1. Золотухина Т.В., Шилова Н.В., Миньженкова М.Е., Козлова Ю.О., Цветкова Т.Г., Маркова Ж.Г., Антоненко В.Г. Использование FISH-метода для диагностики и характеристики конституциональных хромосомных аберраций И Медицинская генетика. — 2011. — №11. — С. 3-8.

2. Золотухина Т.В., Шилова Н.В., Юдина Е.В, Миньженкова М.Е., Козлова Ю.О. Пренатальная диагностика редких хромосомных аномалий // Медицинская генетика. - 2012. - Т. 21. - № 2. - С. 169-171.

3. Золотухина Т.В., Юдина Е.В, Шилова Н.В., Миньженкова М.Е., Козлова Ю.О., Маркова Ж.Г. Спектр хромосомных аномалий, выявленных пренатально у плодов с увеличенным воротниковым пространством // Журнал акушерства и женских болезней. - 2013. - Т. 62. - Вып. 2. - С. 88-92.

4. Козлова Ю.О., Забненкова В.В., Шилова Н.В., Миньженкова М.Е., Антоненко В.Г., Котлукова Н.П., Симонова Л.В., Казанцева И.А., Левченко Е.Г., Бомбардирова Т.Д., Золотухина Т.В., Поляков A.B. Клинико-генетическая характеристика синдромов делеции 22ql 1.2 // Генетика. - 2014. - Т. 50. - №5. - С. 602610.

5. Котлукова Н.П., Бомбардирова Т.Д., Козлова Ю.О., Казанцева И.А., Кисленко O.A., Симонова Л.В. Микроделеция хромосомы 22 у детей с врожденными пороками сердца: результаты поиска // принята к печати в журнале «Педиатрия». — 2014.-Т.93.-№1.

6. Yu. О. Kozlova, V. V. Zabnenkova, N. V. Shilova, М. Е. Min'zhenkova, V. G. Antonenko, N. P. Kotlukova, L. V. Simonova, I. A. Kazantseva, E. G. Levchenko, T. D. Bombardirova, Т. V. Zolotukhin, A. V. Polyakov. Clinical and Genetic Diagnosis of 22ql 1.2 Deletion Syndrome // Human Genetics. - 2014. - V.50. - N.5. - P.528-535.

Публикации в других изданиях

7. Козлова Ю.О., Шилова Н.В., Миньженкова М.Е., Золотухина Т.В. Цитогенетическое и молекулярно-цитогенетическое исследование при увеличенной толщине воротникового пространства и врожденных пороках сердца у плода // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. -2010. - С. 87.

8. Шилова Н.В., Миньженкова М.Е., Козлова Ю.О., Маркова Ж.Г., Золотухина Т.В. Использование различных вариантов FISH-метода в диагностике хромосомных болезней: выбор тактики исследования // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. —2010. — С. 196.

9. Zolotukhina Т., Shilova N., Antonenko V., Kotlukova N., Kozlova Y., Minzhenkova M., Yudina E. Results of cytogenetic studies in pre- and postnatal cases with complex congenital heart disease and dysmorphic features // Materials of 8^ European Cytogenetics Conference. Chromosome Research. - Vol. 19. -Suppl. 1.-2011.-S46.

10. Козлова Ю.О., Юдина E.B., Миньженкова M.E., Шилова Н.В., Золотухина Т.В. Комплексное обследование плодов с расширенным воротниковым пространством: первый опыт пренатальной диагностики микроделеционных синдромов 22ql 1.2 в клинической практике // Пренатальная диагностика. — 2011. — Т.10.-№1.-С. 47-55.

11. Золотухина Т.В., Шилова Н.В., Козлова Ю.О., Миньженкова М.Е., Борзова О.С. Пренатальная диагностика редких хромосомных синдромов // Материалы V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт — основа профилактической медицины в век нанотехнологий». — 2012. — С. 42.

12. Козлова Ю.О., Шилова Н.В., Юдина Е.В., Миньженкова М.Е., Золотухина Т.В. Пренатальная диагностика группы синдромов 22qll.2 // Материалы V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт — основа профилактической медицины в век нанотехнологий». -2012. С.-49.

13. Kozlova Y., Shilova N., Yudina E., Minzhenkova M., Zolotukhina T. Two cases of 22qll deletion syndrome prenatal detection // European Journal of Human Genetics. - 2012. - Vol. 20. - Supp.l. - P. 382.

14. Zolotukhina Т., Shilova N., Kozlova J., Minzhenkova M., Markova J. Structural chromosomal aberrations diagnosed by FISH // European Journal of Human Genetics. -2012.-Vol. 20. Supp.l.-P. 123.

15. Kozlova Y., Shilova N., Minzhenkova M., Antonenko V., Kotlukova N., Simonova L., Kazantseva I., Kislenko O. Study of 22qll.2 deletion on the group of patients of the first year of life within perinatal cardiological centre at MCH No 67, Moscow, Russian Federation // Materials of the International 22qll.2 Deletion Syndrome Consortium, Lake Buena Vista, Florida, USA.-2012.

16. Козлова Ю.О., Миньженкова M.E., Маркова Ж.Г., Золотухина Т.В. Использование интерфазной FISH при диагностике некоторых хромосомных

синдромов // Сборник научных трудов «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике». - 2012. - Вып. 18. — С. 26-34.

17. Антоненко В.Г., Козлова Ю.О., Левченко Е.Г., Карпова О.Я., Казанцева И.А., Шилова Н.В., Золотухина Т.В. Три случая синдрома микроделеции 22ql 1.2 у детей раннего возраста с различными клиническими проявлениями // Материалы П Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное». - 2012. - С. 225-226.

18. Козлова Ю.О., Забненкова В.В., Шилова Н.В., Миньженкова М.Е., Антоненко В.Г., Поляков А.В., Золотухина Т.В. Молекулярная диагностика синдромов, связанных с микроделецией 22q 11.2 // Архив клинической и экспериментальной медицины. - 2012. - Т. 21. - №2. - С. 169-171.

19. Козлова Ю.О., Шилова Н.В., Юдина Е.В., Миньженкова М.Е., Золотухина Т.В. Пренатальная диагностика микроделеции 22qll.2 // Пренатальная диагностика. - 2012. - Т. 11. - №4. - С. 311 -315.

20. Козлова Ю.О. Первый опыт диагностики делеции 22ql 1.2 в российской Федерации // Сборник тезисов Конференции молодых ученых ФГБУ «МГНЦ» РАМН. -2012.-С. 4.

21. Kozlova Y., Shilova N., Minzhenkova M., Antonenko V., Kotlukova N., Levchenko E., Zabnenkova V., Zolotukhina T. 22qll.2DS: MLPA and FISH results// Eur. J. Hum. Genet. - 2013. - Vol. 21. - Suppl 2. - P. 86.

22. Kozlova Yulia, Shilova Nadezda, Minzhenkova Marina, Antonenko Valentina, Kotlukova Natalia, Levchenko Elena, Zabnenkova Viktoria, Zolotukhina Tatjana. Results of 22qll.2DS pre- and postnatal diagnosis in Russian Federation // Materials of 9^ European Cytogenetics Conference. Chromosome Research. - 2013. - Vol 21. - Suppl. 1. - S41.

23. Zolotukhina Tatjana, Shilova Nadezda, Chirkova Elena, Judina Elena, Minzhenkova Marina, Kozlova Yulia. Molecular cytogenetic diagnosis of rare structural

chromosomal abnormalities on fetuses // Materials of European Cytogenetics Conference. -2013.-Vol 21.-Suppl. 1.-S137.

Подписано в печать:

26.08.2014

Заказ № 10168 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ni