Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка технологии клонального микроразмножения цветной капусты

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии клонального микроразмножения цветной капусты"

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР

На правах рукописи

ИБРАГИМОВ Ибрагим Арзуман оглы

УДК 635.35.581.143.6

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ЦВЕТНОЙ КАПУСТЫ

Специальность 06.01.05 — селекция и семеноводство

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1991

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур в 1987—1990 гг.

Научные руководители: доктор биологических наук

Заичкин Э. И., кандидат сельскохозяйственных наук Сычев С. И.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Лудилов В. А., кандидат биологических наук Артамонова Г. И. .

Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии (ВНИИСБ).

Защита диссертации состоится « У/ .» 1991 г.

в . час. на заседании специализированного совета

К 120.89.01 при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте селекции и семеноводства овощных культур по адресу: 143080 Московская

обл., Одинцовский р-н, п/о Лесной городок, п. ВНИИССОК.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ученый секретарь специализированного совета

А. С. Агапов

■ ОШАЯ ХЛРЛКТЕРИG'niKA РАБОТН

Значение цветной капуста как одной из важных прпдо?ольотяпчных культур хороко известно, Однаг.о, несмотря на определенные достижения селекции и разработки технологии ее янршпшшия, уровень производство далеко не полностью удовлетворяет потребностям населения. Причин здесь несколько, но see они вытекает из биологических особенностей культури, затрудняющих получение семпи. В оз»и с зтчп р»:туаль:шм в настоящее время являет->-• t поиск новчх поду од о в к рег:ем!ч: этой проблемы. Одним из них мп-гът йнтъ размножение посуточного материала через культуру тканей. Отот метод сможет найти пирокис применение в селекционной работе, у частности, при создания сортоо и гибридов, резистентных к заболеваниям, поддержании и размножении инцухт-линий без дальнейшего снижения их жизнеспособности, сохранении оригинального материала, представляющего селекционную ценность.

^ель работы заключалась в усовершенствовании технологических этапов клонального микрорпзмноже-кия цветной капусты с использованием культуры прифлорольных меристем головки. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- отработать эффективные условия стерилизации эксплзнтов цветной капусты; •

- оптимизировать спектр и концентрации фитогормонов в питательных средах для регенерации меристем;

- .оптимизировать состав сред и концентрации фитогормонов для укоренения ре ген ера ито d;

~ «жучлть зависимость морфогенеза регенерантов в проиесое регенерации растений из меристем от концентраций фмтогефионов в среде и ее фйзическогр состояния (твердая, жидкая);

- отработать условия и эффективные приемы адаптации рас'Рв— кий-регенерантов в нестерильных условиях;

- изучиоь возможность длительного хранения (депонирования)

меристем и побегов цветной капусты; •

- провести полевые исследоианий полученных раотений-регеие-рантои на однородность по морфологическим признакам.

Нз£чная_нсаизиа. В работе впервые в стране проведено систематическое изучение процесса клонального микроразмножения цветной капусты от этапа введения меристем головки в культуру до технически спелых растений в полевых условиях. Показана возможность длительного хранения (2*4 месяца и более) меристем цветной капусты 1ц у^го.

Практическая ценность работы. Проведенная работа может найти практическое применение в качестве основы для разработки про-киоленной технологии массового воспроизводства рассады цветной капусты. Кроме того, разработанную методику можно использовать для вегетативного размножения родительских инбредных линий в селекций цветной капусты на гетерозис (создание гибридов Рр, для разйкййе-ния оригинальных растения с целью .сохранения одного или ШШгекса признаков, представляющих интерео для селекции, . ■

В работе предложены простые /Методы депонирований Исходного материала (меристем головки), длительное йр'€йЯ подд'ерживающие его жизнеопособность и морфогенетические й*«!ВЙбО¥Ь«

Апробация работы. Было сделана стендовое сообщение на Международной конференции "Ейолх^йй культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск» 19Ё0 г*). Работа экопонировалаЬь на выставке ЙТТМ-1980, удостоена серебряной медали ВДНХ СССР. Материалы диссертации обсуждались на научных семинарах лаборатории биотехноло-

' • 3

гии ВШИ селекции и семеноводства овощных культур.

материала» исследований опубликовано 3 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текога, иллюстрируется /9 рисунками, 2^ таблицами; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, акта внедрения и документа о награждении серебряной медалью ВДНХ СССР. Список использованной литературы включает 20/ наименований, в том числе /5"4 зарубежных авторов.

Мат^иал^_^слови>2^^етодик^п£оведекия_исолелований. В работе использовали 3 сортообрззца из коллекции лаборатории селекции и семеноводства капусты ЭДИНСССК: СПЦ-2/87 (Аидео), СЛЦ—4/07 (Альфа Нарва), СПЦ-5/ЭТ (Алерт); один сортообразец из коллекции кафедры овощных культур ГСМ - $ 2193 и сорт МО ВИР-7 4. Сортообразец СПЦ-2/ет характеризуется хорошей выравненностью по морфологическим и хозяйственным признакам. 3 фазе товарной спелости головка плотная, белого цвета. Несколько позднеопелее сорт Ранняя грибов-ская 1355 (стандарт). СПЦ-^/б? и СПЦ-5/87 имеют высокую выравнен-ность. Урожайность и скороспелость на уровне стандарта. МОЗИР-74-

- сорт скороспелый, урожайный. Головки округло-плоские, средняя масоа 390-1380 г, плотность высокая. Окраска белая, реже бело-аел-товатая.

Выращивание растений проводилось во БНИИССОК в климатических камерах лаборатории биотехнологии, в теплице и в полевых условиях в 1967,,.1990 гг.

Лабораторная работа проводилась с поиошьо общепринятых методик и приемов культур клеток и тканей, подробно изложенных ранее (Бутенко, 1964).

Условия культивирования экзшттов: осаещенногть 5...7 тчс.лк.

температура 425^, фотопериод 16 часов.

і качестве эксплоитов использовали ткань центральной части головки цветной капусты в !азе товарной спелости. Скальпелем вычленялись фрагменты поверхностной части голоски с размерами сторон 1...2 ом, которые затем погружались на 2...3 секунды в 70,2 атилоиміі спирт и помещались ъ стеклянный стакан со стерилизующим раствором, іїо окончании срока стеріши<л(л»[ эксгигшты отмывались трехкратно в стерильной дистиллированной ьиде и помещались в стерильные чаики Петри, где вычленялись меристематические участки размером 2...3 мм, Эффективность стерилизации определялась по результатам приживаемости эксплантов и уровню их иіфіциоованносїи после ^-недельного культивирования.

Зксплинты »ир4аизи.ниоь ип ,'оку сствеяно’й питательной среде в стерильных условиях. 3 обдей сложности испытывались 25 вариантов питательных сред с минеральной основой по Мурасиге и Скугу (1962) с различным соотношением фитогормойов': ауксина - индолил-уксусной кислоты и цигокИмини -’кинетина. Содержание индолил-уксусной кислоты составляло 0-6-,0 мг/л, а кинетина - 0,(776-20,0 иг/л. Повторность киждого варианта 20-кратная.

Твердую питателЬйу» среду готовили с добавлением в жидкую среду агари из $ай^еТа 0,7# по массе. При культивировании меристем в стаЦИойарной жидкой культуре экспланты помещали на поверхность смачиваемых питательным раствором фильтровальных мостиков. Для работы с жидкой культурой на качалке использовали колби емкостью 250 мл, в которые заливали по 50 мл среды, вносили по

15..*20 эксплантов и инкубировали ткань при температуре +25°С и освещенности 5,..7 тыс. лк в термостатируемых качалках при скорости качания 110 об./мин.

Культивирование оксплантов, индуцированных адвентивных побе-

о тпі'Г'і? poifcc m онодили о 3-недельным циклом.

У r.wn к"..- *.vo ч". мсдт гультнпированил проводилась ккчсст-вєні:;;ч ■' гм--ticnivrs і'тгериала по критериям: числу ди£-

Й'С'І'УПЧру: ~'!l -;Я ї Гі;'КСГ>.Ч м ПОЙеГОЭ, ДЛИН Є Л (ГОТОВЫХ ППИИОрдИеВ И

'••.'Стгот', т»". ".v-r.i"",, урпд.’нч’ости £орми побегов, листьев, нскро-

?,} ткгигі'іі, р;г:г-::і;и га:'угор.. Нппм'.ільнче побеги пзреспжішали

1,,! ерзл,*- ~'г. >тчт.. тпп у ■■оронения вклвчал пересадку рзеепда

Г Лре,іппр-,г: ЗЛІ К' J ■> П ПК Л П ВИ р ОЭй 11 и ем грунт ИЛ И Г! р о -

’.■>юничИ керячз .г, і:г'?■ ■ v :л* торфяные горшочки к другие с'костн. Д ;ч предохранения •>••. i or гсодвпдвния нп решшх ота-’Vі.у. прижй&знил торфяные горпоч ;,: и. другие емкости о рассадой накрапали стеклянными колпаками ил и полиэтиленовой пленкой в течение І...2 недель, после чего их переносил'*’, j> теплицу или непосредственно в грунт (полевые условия).

3 экспериментах по хранению меристем цветной капусты Ift vitro и последующей регенерации побегов была использована следующая методика:

1. Меристемы сажали по 2 штуки в пробирки со средами для хранения, после чего одну часть материала помешали в холодильник в условия •»<♦..,-гб0С без подсветки, вторую часть (контроль) на стеллажи в климатическую камеру в стандартные условия (+?*♦.. ,+25°С, освещенность 5...7 тыс. лк, фотопериод 16 часов).

2. Через каждые 3 месяца хранения из каждой группы (.варианта хранения) отбирали по меристем и пересаживали на среду для регенерации !<С (с добавлением 0,6 мг/л КУК, 2,5 мг/л кинетина).

3. После пересадки провопили Ч цикла субкулътииирования побегов с предварительной их морфофизислогической оценкой.

’Ї. После укоренения растения-рогенеоанты пересаживали з полевые условия. Для контроле высаживали рассаду, полученную из семян

отих ке образцов.

Полевые испытания_£астении-^егене^антов проводили по общепринятой методике закладки ролевих опитоа (Доспехов, 1979),

ОСТ 71-78. В последования бил включен сорт цветной капусти 140БІР-7і* из культуры меристем и .ЮЗЛР-74 из семян.

Зрок посева в теплице 10.05(1909-1990 гг.), висадка в открытии грунт 06.07 (1969-1990 гг.). Схема посадки 70x30 ом. Опит закладывали ни тщательно выровненном участке при своевременном проведении всех мероприятий по уходу за растениями. Площадь делянки о

10 мс. В качестве стандарта сил попользован сорт ЬіОШ1Р—7-ї из семян. Повторность -'(-кратная, размещение зориантов рендомизированное. Объем выборки во время технической спелости 60 растений с каждого варианта.

Математическая обработки акопериментальних данных выполнена методом дисперсионного анализа (доспехов, 1985). Ланине лабораторних опытов представлены в виде средних арифметических величин в выборке и средне-квадратичных ошибок этих величин.

Общая схема клонального микроразмножения цветной капусты представлена на рио. I. ■

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оптимизация условий клонального микроразннокения цветной капусты в культуре прифлооальных мериотем. Одним из аспектов введения зкеплантов цветной капусты в культуру Іп уііга был подбйр эффективного стерилизующего вещества. В проведенной нами работе сравнивались растворы трех традиционных для культуры клеток и тка- . ней веществ - хлорамина, гипохлорига’и сулемы. Выбор наиболее приемлемого стерилизующего агента осуществлялся по критериям, предложенным Р.Г. Бутенко (1964). Об эффективности стерилизующего действия судили по предотвращению инфицирования эксплантов в культуре

р,

I

I

1-і

uu

II этап

. 11 этап

.. 17 этап

Рис Л

f<J' ПсрПСТРМН K‘J їшотіюй капусти

(ЛОШІ. ІЛЗ.ЧІШЯ

Я’-:с ітлаїг.оі! (20 ;ч:п О, 5'’-

У

и

їпкультагтш.’Г э”пп Дп;тель:;ов ■xpai'cirrio мегшстом при +4... +6 С па плтатолыгсн’’. среде (от 3 с. го 2 лот)

;п

І<у,льтгш:роваі;ж кор;іс7о.ч із агаровой среде

і'і Кульягвирэвагтаа I I wcpnciav п іпідноП

С____\ питательной opens на

качалке (3 подоли)

Фор:жроваіше пойогоп п разшоаэпке мэротлонов (6 надель)

Укоренение побегов на творлоГ. питательной среда (7-Ю дім":)

Адаптация просрочите рлсгонпГ: П кестврікьнкх УС-ІОЕКЛХ с nuco;tofi глакиостьн ергди ( 1-2 недоли)

Ві;ра.";лоатае рагто-іп'М - погенерлнтод ка полз до узужной стагол

Схе;.га носледопательносгя зтапоз в расіото по исслодопанилм клзнашїого гк:фораз;г:то~!?нї?л цзоткой капусп: •'

после 8-недельного периода роста на агаризованной среде по прописи Мура сиге" и Скуга (1962) с добаллением фитогормонов.

Результаты опитов показали, что успех культивирования, роста и развития эксплантов зависит от концентрации стерилизующего вещества и продолжительности экспозиции эксплантов в растворе. Результаты экспериментов представлены в табл. I

, Таблица I

Инфицированность эксплантов цветной капусти в культуре

і и уіїго при разных способах стерилизации

Раствори стерилизующих веществ

Монцеи- !Ллите дь-

Ітрауип

і А

!ность

_ ^їкЯцЯ!і22.а!іїї°0Г!і£_'!_ меристем |регенерантоа

! !кн ! !

Хлорамин 10 20 м;:н. 0 25,0

Гипохлорит кальция 25 20 мин. 51,0 0

Сулема 0,5 20 мин.' 0 0

Хлорамин 1. • 16 час. 100 100 ■■

Гипохлорит кальция _ 2 16 час. 100 100

Сулема 0,01 16 час. 0 0

При снижении концентрации всех стерилизующих веществ потребовалось увеличение длительности экспозиции эксплантов. Однако, это не избавило их от. инфицирования. Лишь 16-часовая обработка эксплантов сулемой не дала позднего инфицирования, однако с точки зрения технологии такой срок обработки бил неприемлем. Раотвор хлорамина в концентрации 10? также эффективен при стерилизации, однако при регенерации побегов в этом случае проявилась латентная инфекция. По нашим данным, эффективным для стерилизации меристем цветной капусти является 0,5? раствор сулемы. Зремя экспозиции 20 кинут.

Простерилизованные меристемы высаживали на искусственную питательную среду Мурасиге и Скуга (1962). Для'выявления оптималь-

ных концентраций ^итогормоноз и их соотношения нами били проведены специальные опыты.

Результаты этих опытов свидетельствуют о том, что рост листовых примордиев у образцов ^ПЦ-?/87 был максимальным при концентрации кинетина в интервале от 2 до 10 мгу'л и индолилукоусной кислоты менее ** мг/л. При увеличении содержания И УК и кинетина отмечена тенденция к подавлению роста листовых примордиев и корнеобразо-вания. Наиболее успешным вариантом следует" считать для эксплантов СГЩ-2/87 оледующиМ: концентрация индолилуксусной кислоты I мг/л, кинетина 2,5 мг/л.

Для меристем сортообразца СЛЦ-4/87 дозовые зависимости роста листовых примордиев от содержания индолилуксусной кислоты имели иной характер. При концентрации индолилуксусной кислоты I чг/л дозовая зависимость роста примордиев от изменявшейся концентрации кинетина имело аналогичный характер о сортообразцом СПЦ-2/07. При увеличении концентрации индолилуксусной кислоты от 4 до G мг/л (при фиксированной содержании кинетина 0,6 кг/л) развитие листовых примордиев слабо увеличивалось, тогда как при фиксированном содержании кинетина 2,5 мг/л дозовая зависимость от содержания индолилуксусной кислоты носила слабовыраленный характер о максимумом при б мг/л индолилуксусной кислоты. Как и в случае с ОЛЦ—2/07 для ре-генерантов сортообразца ЗЛЦ-4/й7 оптимальным соотношением фитогормонов било содержание индолилуксусной кислоты I мг./л, кинетина 2#5 мг/л.

Для сортообразца СПЦ-5/87 такте как и у сортосбраэца CilU-V87 наблюдается аналогичный характер зависимостей роотовых характеристик от концентраций кинетика и нндол^луксуской кислоты, увеличение размера листовых гркмордиез при'увеличении концентрации индолилуксусной кислоты от Я да 8 кг/л. Также ка* и в предыдуямх двух олу-

чаях, оптимальным соотношением фитогормонов для всех показателей морфогенеза в наших опытах было: индолилуксусная кислота 0,8..,1,0 мг/л, кинетин 2,5 мг/л (табл. 2).

_5:Я-£^19-2._5.ЕЁ-5.®. •

Для выяснения оптимальных условий роста и микроразмножения была использована жидкая ореда. В результате установлено, что в стационарной ареде (на фильтровальных мостиках) .шрадивание эксплантоа менее благоприятно для роста меристем всех сортообразцов. Каких-либо значимых различий в ростовых характеристиках меристем между иосдедуемыни образцами не было выявлено. Более того, после 2 пао-сажа появились признаки витрификации, которые препятствовали дальнейшему развитию регенерантов.

Однако выращивание вксплантов на жидкой среде с ее активным переиешиваниен (на качалке) значительно увеличивает скорость их . роота и дифференцировки. .

Следующей задачей отработки зтой экспериментальной модели было изучение ростовых характеристик воех трех сортообразцов цветной капусты, а также оценка укореняемооти регенерантов на агаризо-яанной среде без кинетика после трех последовательных пассакей в жидкой среде ка качалке. Результаты опытов представлены в таблице 3.

Отмечена 100#-ная регенерация эксплантов и прогрессивный роот побегов у всех трех оортообразцов. А наилучшие результаты' морфогенеза и показателей микроразмножения были достигнуты в мари-отеме сортообразца СПЦ-5/87.

Таким образом, сравнение эффективности клонирования меристем цветной капусты от состояния среды дает преимущества жидкой среде с активным переиеаиваиием относительно твердой агаризованной н жидкой стационарной сред. .

Рост и развитие побегов цветной капусты сортообразца СПЦ-5/87 з зависимости от содернавия фитогормонов ка твердой питательной среде,(1937-196-3 гг.)

'Соотношение ! С Р е-!£ИТО ГС£М0 Н 0 В 1 ды { 1*7К I квдетин 1 Длина 3-недех.ь-ных листовых примордиев, ом ! Коэф’’ ициент размножения !Зысота ад- '.Укореняе |1 пз с сэ д""1л~па с са ж|ш~пя ссая]^® ^ е г о Х И0”"' '* ! ! ! ! ОМ !

т 0 0.6 2 I 0 1:3 У _

5 0 15 I 5|0,5 I 2 1:2 в _ -

5 0 2,5 0 9г0,2 I ? 1:3 1:2 2,1-0,б 0

4 0 10,0 0 ёоз I 2 У - —

5 0 20,0 0 £0,2 I 3 1:4 1:2 I,6-0,3 0

б Г,0 0,076 0 6*0 2 I I 1:1 1:1 4,5=0,4 100

7 1.0 0.8 I 0±0.4 I 4 у.в. -

8 1.С 2,5 I 7г0,4 I 2 1:4 1:2 4,2?0,5 100

9 15 0 I 9|0,3 I 2 1:4 1:2 8,211,1 0

10 1.0 17 5 I 5|0,5 I ? 1:4 1:2 ■ -

11 ■»,о 0.5 0 йоз I 3 1:2 1:3 4,510.9 100

12 6,0 0,6 I 0^0 5 т 0. I 1:3 у.н. _ -

13 &.0 0,6 I з*о,4 I 2 1:3 1:1 З.ЗЗД, 5 ■ 100

14 50 2,5 0 6x0.3 I 2 у.в. - —

15 6.0 2.5 I 7-0,7 I I У .В. _ — -

16 8,0 2,5 0 7±0,2 I 2 1:3 1:2 4,1-0,5 100

Примечание: - - росте побегов нет; н - некроз;

У - уродливые; в - эитрификация.

Регенерация побегов и корнеобразование цветной капусты в жидкой культуре на качалке при субкультивировании (1938-1989 гг.)

! 1 субкультивиро-1 п субкульти- ! Е субкультивиро-} Кв

иортооорвзцы I дание _____________{ вирование___________________I ванне_\ _ . сРеде укоренения

; длине !коэффи-! высота !коэ?фи-[высота Ьсоэффи-

; листовых !циент ! побе- !циент ;побегов, !циент

I примор- !раэнно-1 гов, !размно-; см {размно-

; диев, см (жения | ск |жения' \ |*ения

высоте . .

побегов, !во листь-!корней,

см

|ев, ЕТ.

см

ОЩ-5/87 1,9*0,6 ІгЗ 3,3-0,4 її* 4,5*0,4 1:3 4,7*0,4 4,1*0,3 г,7*0,3

СВД-4/87 1г8*0,2 Іг2 2,8-0,2 1:3 ‘4,0*0,3 1:3 4Д*и,3 3,4*0,5 2,7*0,3

СЩ-2/ЄГ7 І,5*0.І 1:2 г,з*о,г 1:3 3,9*0,4 1:3 4,1*0,4 3,5*0,5 г,5*0,4

п.. 20

Опти м и з а ци я_^сло вий укоренения и акклиматизации растении - -

гене£3нтон• Эта стадия технологии клонального размножения цветной капуоты в наших опытах состояла из 2 этапов:

1 - индукция корней у побегов в агаре;

2 - адаптация рассади в грунте.

При разработке первого этапа были проведены специальные опиты по определению необходимого уровня индолилуксусноИ кислоты в среде для эффективного укоренения. Данные опытов показаны в таблице 4.

. Таблица 4

Формирование корней у мериклонов цветной капусты в . эависимооти от количества индолилуксуоной кислоты в среде (1980 г.)

Генотип

8,0 ! 4,0 | 0,8 ! 0

3,5*0,9 з,1±1.о 3,1*0,8 3,1*0,8

32,5 49,0 95,0 90,1

3,2*0,8 З.Э^О.Э 3,3*0,9 З.ЗЮ.В

30,4 49,7 75,0 65,0

3,3*0,9 3,4*0,9 3,4*0,9 3,4*0,9

35,1 50.1 75,2 80,1

СПЦ-5/87

Длина выоажвнных ' побегов, см

' Укореняемость, $

_ СП1-И/87 .

Длина высаженных побегов, си

. Укореняенооть, %

СЛЦ-2/87

Длина зисаженних побегов, см

Укореняемооть, %

(Г-То :

Основной эффект наблюдений при данных условиях - минимальные значения содержания индолилуксусноИ кислоты ~ 0,8 мг/л в ореде для достижения максимального корнеобраэозания. При увеличении концен?-рации индолилуксусноИ кислоты в среде отмечено зависимое от доз

ингибирование корнеобразования для всех трех зон сортообразцов.

При более тщательном изучении процессов укоренения побегов на среде с оптимизированной концентрацией ИУК установлена зависимость эффективного укоренения побегов от их длины (табл. 5),

Таблица 5

Эффективность укоренения побегов цветной капуст в зависимости от длины высаженных побегов (1966-1989 гг.)

Показатели |_ j 1 1 1 1 1 &« 1 1 Варианты Т п** г £***”

Сортообразец СЛЦ-5/87

длина высаженных побегов, см 2,2*0,2 Э,1*о,0 *»,7±0,4

количество высаженных побегов, ИТ. . 20 80 30

укореняемость, % 90,0 95,1 100

Сортообразец СПЦ-Ч/87

длина высаженных побегов, см 2,0*0,2 3,3-0,9 ^,1-0,3

количество высаженных побегов, шт. 20 20 30

укореняемость, % '40,1 75,5 100

Сортообразец ^ПЦ-2/87

длина высаженных побегов, см 2,0*0,2 ЗУ-0.9 м*0,*

количество высаженных побегов, шт. 20 20 30

укореняемость, % 55,5 75,1 100

Примечание: х - длина высаженных побегов 2 см;

хх - длина высаженных побегов 3 см; ххх - длина высаженных побегов 4 см.

Таким образом, для всех генотипов установлено, что увеличение длины высаженных побегов повышает их укореняемость.

Зависимость клонального никроразмнокения цветной капусты от продолжительности фотопериода. В процессе проведенных опытов е регенерантами цветной капусты гортсобразцз # 2193, пораженного ели-

зистым бактериозом, было обращено внимание на чувствительность регенерантов к режимам оовещения, в частности, продолжительности Фотопериодн.

, Результаты опытов представлены в таблице б. В группе регенз-рантов с 16-часовим фотопериодои после третьего 3-недельного субкультивирования у 20* регенерантов появлялись цветоносные побеги, а после '(-го субкультивирования - у 30/2. В то же время з группе о 12-часовым периодом цветоносные побеги появлялиоь лишь на 4-м субкультивировании у % регенерантов. Основная же часть их образовывала вегетативные почки и побеги, создавая тем самим условия для размножения растений этого генотипа. Кроме того, в отой группе были лучшие показатели длины листовых примордиев, коэффициента размножения и другие.

Таблица б

Зависимость морфологических показателей в культуре и меристем сортообразца ж 2193 от длительности Фотопериода (1969 г.)

~~ Показатели ]---------

___________________________________]____12 час.______!___ !_6_чао._____

Рост и развитие листовых примо] после 3 недель культивирования длина, см

коэффициент размножения

Рост и развитие побегов после 6 недель культивирования длина побегов, см коэффициент размножения

Рост и развитие побегов поолв 9 недель культивирования . длина побегов, см количество листьев, шт. коэффициент размножения

Рост и развитие побегов пооле 12 недель культивирования длина побегов, ом количество листьев, ВТ. коэффициент размножения

Укореняемооть, %

Длина корней, см

Приживаемость, %

рдиев

1.7*0,4 1 : 2,3

I. (3*0.2

I : 5,2

2,910,5

1:2

5,3*0,7 7.3 *0|7 1:2,5

у 5< цветоносы

б,8*0,8 8,2*0,б III

100

3,7*0,5

89,1

2,4*0,*»

1:1,3

у 20$ цветоносы

3,6*0,5 4,2*0,б 1:1,2

у 30# цветоносы

3,6*0,5 4 2*0 5 1:1

43,3

2,0*0,6

51,0

размножаемого в_к£льт£-ре in. vitro . Результаты по хранению меристем цветной капусты сортообразцов СПЦ-Р/87 и СПЦ-5/87 при ороке хранения 9 месяцев на разных питательных средах представлены в таблицах 7 и 8.

Нпилучгаие результаты хранения меристем цветной капусты обоих генотипов получены на агаризованноЯ среде MS с полным составом минеральных солей. На этой среде меристемы сохраняли регенерационный потенциал и были способны к микроразмнокению и регенерации в полноценные растения (9 месяцев и более).

Менее подходящей оказалась среда для хранения с половинной • (1/2) концентрацией минеральных со.лей по прописи МС. Меристемы обоих образцов на этой основе сохраняли жизнеспособность и регенерационную активность только до 9 месяцев. Однако, менее благоприятные условия хранения при пониженной температуре были п жидких йредах. Уже после б месяцев хранения меристемы побурели, образующиеся в некоторых случаях побеги и листья приобретали стекловид-ность, уродливую форму и прекращали дифференцировку и рост.

Результаты опытов по хранению побегов цветной капусты и последующей регенерации из них растений приведены в таблице 9. Установлено, что в холодильнике при +^...+б°С на свету (группа Ш) побеги цветной капусты образца СПЦ-5/67 хранились максимально долго-

- 3 месяца с сохранением жизнеспособности и регенерационной активности. Менее эффективно хранились побеги в холодильнике э темноте. Максимальны» срок хранения, после которого побеги сохраняли жизнеспособность и регенерировали, составлял 2 месяца (группа П). После 2-х месяцев хранения побеги в этой группе, хотя и обладали жизнеспособностью и ростом, тем не менее ъ образующихся листьях не синтезировался хлорофилл, а затем они опадали. ■

Аналогичные сроки сохранения жтанеспособнозти побегов были в

Морфологические показатели меристем в культуре г.с с-' *■ 9 месяцев хранения. Сортообразец С1Щ-5/67 (1986-19Ь5 гг.)

.Вари- Размер меристем П пассаж ™ пассаж 5 1У лаос ил” * У пзссак

анты сседы - • перед хране- нием, см перед !через посадкой !1 мена среду !сяц регенерации !после см '.посадки, ! см высота !к побе- ! гов, ! см ! ( 1 •?* высота !к. р. побегов,! см ! г 1 | !высотз !к !побе- ! !гов, ! !см ! 1 | I 1 • р- р и СОТЗ побегов см количество листь-!ев, ит. клина корней, ! см

Д-а-1 0,4*0,1 0,4*0,I 0,9*0,^ I,6*0,3 2 2,3^0,2 I 2.6*0.3 2 3,7*0,3 4,0*0 3,4*0,5

Л-а-2 0,3*0,1 0,4*0,1 0,9*0,1 1,3*0,2 I 2,3*0,3 2 2,8*0,3 2 3,5*0,4 3.6*0,5 2.7*0,5

Д-а-3 0,3*0,I меристемы погибли

!-а-4 происходит стеблевание, меристемы нежизнеспособна

1 -а -5 0,3*0,1 происходит стеблевание, меристемы нежизнеспособны

Д-б-1 0,3*0 0,5*0,1 0,9*0,1 1,5*0,3 2 2,2*0,3 I 2,9±С,2 I 4,0—0,4 3,6*0.4 3,4*0,5

Д-б-2 о,з*ол 0,5*0,1 ' 0,9*0,1 1.6*0,2 I 2,3*0,3 I 3,1*0,3 3 4, 1*0,4 4,1*0,5 3,6*0,6

г-б-5 меристемы погибли

1-6-4 0,3-0,1 происходит стеблевание, меристемы нежизнеспособны

Д-б-5 0,3*0,1 происходит стеблевание, меристемы нежизнеспо собны

Таблица 8

Морфологические показатели меристем в культуре после 9 месяцев хранения. Сортообразец 0ПЦ-2/87 (1986-1969 гг.)

Зари-! Размео меристем П пассаж ! £ пасса* ! ІУ пассаж У пассаж

-"™к5 пеРе* '-веред “ * ; хране- тосадкой , нием, !на среду ; см !регенера-! !ции, см через I месяц ПОСЛЄ посадки, см высота побегов, см к.о.!высота !к.р.'.высота '.к-.в. ’ !по6егов,' ‘ !побегоз,! ‘ ! см ! ! см ! 1 II 1 '! II 1 высота побегоз, см количест-зо листьев, ст. длина коонел, см

Д-а-1

1-а-2

’-э-3

1-3-4

Л-3-5 Д-6-І д- 6-2

;.-б-з

2-6-5

О,4*0,ОН 0.4*0,02 0,9*0,I 0,3*0,! 0,4*0,04 0,9*0,1

0,36*0,07 0,42*0,06 0,8*0,! 0,36*0,05 0,56*0,04 0,9*0,!

I,6*0,3 2 2,3*0,2

1,3*0,2 I 2,3*0,3

меристемы погибли происходит стеблевзние происходит стеблевание 1,1-0,2 1 1,7*0,2 I 2

1,1*0,2 I I,7*0,2 Г 2

меристемы нежизнеспоссбни меристемы нежизнеспособны меристемы нежизнеспособны

2,8*0,2 2,6*0,2

■зі.’, о

3,7*0,3

4. С* О

2 3,5*0,4 3,6*0,5

Л,9-0,3

о Т + ^

3,^*0,5 2.7*0,5

. Таблица 9

Результаты хранения побегов цветной капусты сортоойрези^ ;ГЛ-5/£7 (1969 г.)

Зариан- ! До хранения I кесяц ! П ческа ! £ месяц

ты Высота побегов , см

!среда А ! среда Б среда А! соеда Б ! среде А ! соэдо Е ! сседа А ! среда ь

I 5,4*0,2 5,6*1,1 5,7*0,8 5,9*0,8 7,С*0,9 б,5^0,6 - -

П 5,8*1,1 . 5,4*1,1 5,8*1,9 5,5*1,1 6,0*0,8 , 6—1,0 — —

1 5,6*1,0 5,3 *1,0 5,7*1,0 5,4*1,0 5,7*1,0 5,5*1.0 5.8*1,! 5,6*1,0

и 5,6*1,1 5.5*1,! 8,1*1,! 7,9*0,9 - - - -

I - контроль, условия хранения: теипеоатура +24...+26°С, осэешенность 5-7 тыс. лк, фотопериод 16 час; ‘

П - хранение в холодильнике без света, температура -*4...+6°С;

Ш - хранение в холодильнике при свете;

ГУ - хранение в комнатных условиях, при рассеянном свете;

Среда А - но основе МС + ИУК 0,8 кг/л;

Среда Б - на основе НС без ИУК

го

группе, где побеги росли на стеллажах в стандартны-у условиях климатической ко мери (группа I). Наименьшая о-|ф'?кти!ш;".г< • лпнспия била в группе, где побеги росли при дневном ргк ‘г« -рс-с в условиях комнатной температуры (группа II'), Уяе поол.: i -янм хранения побеги формировали измельченные листья, к от о pm; бисц'о опадали. Таким образом, по эффективности хранен'*» иобегол и, сохранения регенерационной способности условия со,герА»пин пп тер «ала убивают в ряду в группах Ш, П, I, 1У.

02^£1^2_*1£™1?.5.!22_Е-01£11ий125.[1£.нсЕа!110!Ш52.Ш2г' капуст» чп однородность по морфологическим признакам. 3 птених у ал огнях проводилось сравнение по морфологическим признакам ристсний-нетонера нтои и растений, полученных из семян цветной кспуптн сорта МОВИР-74. '

В Г989...1990 гг. но основании разработанной методики был размножен в культуре )и vitro сорт цветной капусты МСЫ1Р-74. Полученные растения-регенеранты и растения, полученные из семян, высаживали а поле и выращивали до стадии технической спелости. Результаты проведенных опытов представлены в таблице 10.

Как видно из таблицы 10, растения из культуры меристем М0ВИР-74 к моменту анализа имели преимущественные показатели по морфологическим признакам в сравнении с контролем. Прежде всего это относится к таким, как диаметр головки и ее масса. Причем, вариабельность этих характеристик в опытной группе была на порядок меньше, чем в контрольной. Кроме того, они характеризуются более ранним созреванием по сравнению с контролем.

■ Б 1989 году были проведены полевые испытания регеиерантов, полученных из меристем, хранящихся длительное время (9 месяцев) при пониженной температуре на агаризозанноЯ среде НС с полной концентрацией минеральных солей. Полученные результаты свидетельству-

йчпучкт ! •^лина ! -^ика ! Ширина

Р ! стебля, ! листа, ! лгста.

і

1989 год

Регенеранти 11,7^0,3 34,8^1,2 14, ££0,2

V, % -

Рассада, подучен- .

нал из семян 9,9-І,4 29,7-4,1 11,9-1,4

у. %

1990 год

Регенеранти. Л„2±0,5 27,8±0,8 Б,3±0,5

а

М>

асс ая

V, %

Рассада, полученная из семян 10,6-0,9 25,4-1,2 20,5-0,7

Tsojikl s' 10

-V. 1.; -7ч 2 :^£9-IS90 г Г -

! Кс.".;;ісстьо ! лиспе j, ! "т. ! Диаметр ! гплозк'и, ! си .ЧЗСС£ ГОЛОВКИ, г

27,3-0,6 IS,5^0,3 965-25

- 1.7 2,36

ІЄ,7±2,4 Iі»,0-2,7 465ІІ80

- 19,6 .39,0

гч ,2-і,о 16,3^0,8 95С±20

- 4.5 1.7

14.4^1,6 14,Oil.б 46СІІ25

- 11,6. 27. В

*jt о той, что хранящиеся длительное гремя меристемы способны не только регенерировать, но и давать полноценные раотения в полевых условиях. Кроне того, их основные морфологические признаки были более выравненными, а сформировавшиеся головки больше по размерам и массе, чем в контрольных группах, полученных из семян.

в а в о z а

1. Оптимальными условиями стерилизации эксплантов (прифлора-лышх меристем) цветной капусты является их обработка 0,5# раствором сулемы в течение 20 минут. При данном режиме стерилизации достигается полное подавление жизнедеятельности микроорганизмов,

а выживаемость обработанных эксплантов составляет 100#.

2. Оптимальной питательной средой для формирования побегов является среда с минеральным солевым составом по прописи Мурасиге и Скуга, дополненная фитогормонами - индолилуксусной кислотой в концентрации 0,8 кг/л и кинетином в концентрации 2,5 мг/л. Однако, культивирование эксплантов на жидкой питательной среде с активным перемешиванием на качалке по сравнение с культивированием их на плотной среде увеличивает коэффициент размножения в 3 раза.

3. Питательная среда на основе Мурасиге и Скуга с добавлением 0,8 мг/л индолилуксусной кислоты обеспечивает 95? укоренение побегов.

4. При хранении изолированных меристем на питательной среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов в темноте, при температуре +4... 4б°С практически полностьо сохраняется их способность к регенерации.

5. Рвстения-регенеранты были более однородными по морфологическим признакам по сравнении с контрольными растениями, взращенными из семян, и превосходили их по млссс головки э 2 раза.

РЕКОМЕНДАЦИЙ ПРОИЗЗОДСТЗУ

1. Для клонального мик^рйУМЙокёйия цветной капусты иополь-зовать прифлоральные меристемы» Стерилизацию эксплантоэ проводить

0,5? раствором сулемы в течение 20 минут или 10(2 раствором хлорамина 20 минут. В кйЧесТ&е-регенерационной среди применять состав ‘ по прописи МурасЙ^и £к^га (1962) с добавлением 0,8 мг/л индолил-уксусйой 'ккйдоты и 5,5 мг/л кинетика, Зкспланты культивировать в “ЮОДСой%питатёльиоЯ среде при непрерывном перемешивании (ПОоб/мин) Ка к'ачалках при температуре +25°С, освещенности 5-7 тыс. лк и фо-тбпериоде 16 часов.

Для корнеобразования у побегов использовать твердую среду (0,7#) агара) о исключением кинетика.

2. Для адаптации растений-регенерантов в нестерильных условиях рекомендуется пересакивать их в предварительно простерилизо-ванный грун/ и поддерживать высокую влал&ооть воздуха (85-95#) в течение 1-2 недель.

3. При длительной сохранности регенерационной способности меристем рекомендуется использовать среду по прописи Мурасиге и Скуга (1962) без фитогормонов. Меристемы хранить в темноте з холодильнике. .

‘ь Элементы разработанной методики клонального микрораэмно-жения мояно использовать для разработки промышленной технологии производства цветной капуста и в селекционном процессе.

Спиоок робот, опубликованных по материалам диссертации

I. Заичкин Э.И., Нелепова В.М., Ибрагимов i'.A Оптимизация питательных сред для клонального мнкроразмиомния шштноД капустн. Тезисы докладов Международной конференции "Ьиолигия к.ультивкруе-мых клеток и биотехнология", Новосибирск, i9i'6, с, 324.

?. Шелепова D.M., Ибрагимов И.Л., Заичкин о.П. Илипи«е условий культивирования на морфогенез различных экотипов цветной капусты в условиях in vitro . Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции "Онтогенетика высших ресгений". Кришне'1, "Штанина", 17-18 октября 1989 г.. с. ?5Г-?53.

3. Ибрагимов И.Л. Клональное микрорагчн<-->.Е!1!не цветной капуста in vitro . Тезиса докладов Всесоюзной научно-практической конференции молодях ученых Vi специалистов "Ссновние напрчлдения нзучно-техничеокого прогресса 5 картофелеводстве, плодоводство и овощеводстве”. БелССР, Самохваловичи, I9A9, с. IQ3.