Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии глубинного культивирования гриба Trichophyton verrucosum

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии глубинного культивирования гриба Trichophyton verrucosum"

На правах рукописи

ТИЩЕНКО Елена Викторовна

Разработка технологии глубинного культивирования гриба Trichophyton verrucosum

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2010

004603499

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

доктор биологических наук, профессор Мирзаев Микаиль Нурбагандович

доктор биологических наук, профессор Тихонов Игорь Владимирович

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный ветеринарный врач РФ Заерко Виктор Иванович

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности»

Защита состоится « Р» Ц/~с>/-0£ 2010 г. в на заседании

диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел.(495)377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан «_ 2010 года и размещен на сайте

http://mgavm.ru

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Несмотря на интенсивное развитие ветеринарной медицины и, в частности ветеринарной дерматологии, трихофития по-прежнему имеет значительный и стабильный удельный вес среди кожных болезней животных в большинстве стран мира.

Эта болезнь распространена повсеместно и наносит ощутимый экономический ущерб за счет снижения прироста живой массы и качества кожевенного сырья, увеличения затрат на проведение лечебно-оздоровительных мероприятий (Борисова Л.И., 1986; Поляков И.Д., Иванова Л.Г., 1994; Кухар Е.В., 2006).

Существующие технологии получения вакцин против микозов (Саркисов А.Х., Петрович С.В., Никифоров Л.В. и др., 1972; Летягин К.П., Саркисов К.А„ Панин А.Н., Манонян М.Г., 1997; Соловьев Н.П., 2004; Лазовский В.А., 2007) основаны на культивировании грибов только поверхностным способом. Однако, как известно, такой способ культивирования промышленных штаммов микроорганизмов по современным требованиям биотехнологии нельзя считать технологичным. При развитии на твердых средах и, особенно, при снятии с поверхности агаризованных сред споры возбудителей микозов могут загрязнять производственные помещения, а процесс культивирования целевых штаммов длительный (более 20 суток) и трудоемкий.

Анализ опубликованной информации показывает, что ранее проводились исследования по разработке технологии глубинного культивирования несовершенных грибов, к которым относится и Trichophyton verrucosum (Мирзаев М.Н., Кононова С.Ю., 1985; Баласова А.И., Бабаян Е.Ю., Булатова А.А. и др., 1985). Полученные авторами данные позволили заменить промышленную технологию культивирования гриба Beauveria bassiana поверхностным методом на глубинное при получении энтомопатогенного препарата боверин.

Известные работы по культивированию гриба Trichophyton verrucosum (= синоним Trichophyton faviforme) глубинным способом посвящены оценке динамики накопления массы (Кухар Е.В., 1999 г.; Кухар Е.В., 2002 г.; Кухар Е.В., 2006 г.) и показывают, что наибольший рост достигнут за 21 сутки.

Таким образом, из изложенного видно, что актуальной задачей современной биотехнологии является усовершенствование производства препаратов против трихофитии животных на основе интенсификации процесса глубинного культивирования гриба Trichophyton verrucosum.

Цель и задачи исследований. Целью исследований является разработка технологии культивирования гриба Trichophyton verrucosum в глубинных условиях на основе создания новой питательной среды и оптимизации условий развития.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: разработать сбалансированный компонентный состав питательной среды для глубинного способа выращивания гриба Trichophyton verrucosum;

определить основные технологические параметры культивирования Trichophyton verrucosum в жидкой питательной среде: аэрация, температура, инокулят;

исследовать влияние условий культивирования на динамику спорообразования гриба;

получить экспериментальные образцы глубинной биомассы гриба Trichophyton verrucosum и изучить их антигенные свойства на лабораторных животных;

- обосновать экономическую целесообразность внедрения в производство глубинного культивирования гриба Trichophyton verrucosum для получения соответствующей вакцины.

Научная новизна. Впервые разработана технологическая схема культивирования Trichophyton verrucosum в глубинных условиях на новой питательной среде, содержащей картофельный отвар и минеральные компоненты, оптимизированы основные параметры культивирования гриба

(аэрация, температура, инокулят). Впервые с помощью электронной и световой микроскопии проведен сравнительный анализ морфологических особенностей микроорганизма, выращенного на агаризованной и жидкой средах.

Практическая значимость работы. Разработаны питательная среда, а также параметры и режимы для глубинного культивирования Trichophyton verrucosum с целью получения биомассы гриба, являющейся основой иммунобиологического препарата. Практическая значимость разработанной технологической цепочки глубинного культивирования Trichophyton verrucosum подтверждена в условиях ФГУП «Покровский завод биопрепаратов» в аппарате-ферментере KHT-10, результаты производственных испытаний оформлены утвержденным актом испытаний. Результаты диссертации используются в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на научной конференции молодых ученых МГАВМиБ им. К.И.Скрябина, (2008)

Основные положения, выносимые на защиту:

- состав питательной среды для культивирования Trichophyton verrucosum;

- технологические режимы культивирования гриба;

- морфология мицелия гриба при развитии в глубинных и поверхностных условиях

- антигенные свойства биомассы гриба, полученной глубинным методом культивирования.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы, в том числе 2- в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, литературный обзор, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов,

рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы, включающий 156 источников, в т.ч. 56 иностранных, и приложение. Материалы диссертации иллюстрированы 19 рисунками и 17 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы методы

Диссертационная работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» в период с 2006 по 2009 год.

Объект исследований - штамм гриба Trichophyton verrucosum. Исследования проводили на жидких и агаризованных питательных средах, приготовленных и разработанных нами в ходе исследований.

Оптимизацию компонентного состава питательной среды и режимов культивирования (температура, аэрация, инокулят, pH и др.) проводили традиционными микробиологическими и биохимическими методами, основанными на законах, описывающих протекание фундаментальных процессов микробиосинтеза - накопление биомассы, изменение содержания компонентов питательной среды, прохождение физиологических фаз в периодической культуре.

Процесс спорообразования Trichophyton verrucosum контролировали методом подсчета клеток в камере Горяева.

Биомассу гриба в динамике развития определяли методом доведения до постоянного веса при 105°С.

Утилизацию углеводов в динамике развития гриба контролировали с помощью антронового метода, регистрируя оптическую плотность при 620625 нм на спектрофотометре PD-303UV.

Глубинное культивирование гриба на жидкой среде проводили в стандартных качалочных колбах на круговой микробиологической качалке Heidolph Unimax 2010 при вращении 220-240об/мин и температуре 28°С и в

ферментере КНТ-10 объемом Юл на ФГУП «Покровский завод биопрепаратов». Коэффициент заполнения аппарата - 0,7, т.е. в аппарат вносили 7л среды, число оборотов мешалки 290-320 об/мин.

Морфологическую картину мицелия в процессе развития микроорганизма исследовали методом световой и электронной микроскопии. Препарат просматривали в световом микроскопе Biolar и в электронном микроскопе Hitachi 800 со сканирующей приставкой.

Для получения экспериментального образца сухой биомассы, суспензию клеток гриба в асептических условиях разливали по флаконам, затем лиофильно высушивали по общепринятой методике.

Оценку антигенных свойств биомассы гриба проводили с помощью реакции агглютинации (РА) по методике, описанной в работе (Саркисов А.Х., Никифоров Л.И и др., 1972).

В качестве подопытных животных использованы кролики породы шиншилла массой 2,5-3,0 кг, биомассу вводили внутримышечно в дозе Змл.

Гематологические и биохимические показатели подопытных кроликов исследовали с помощью гемометра Сали и биохимических анализаторов Elan-160, Stat fax. Полученный цифровой материал обрабатывали статистически (Плохинский H.A., 1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Оптимизация состава питательной среды и параметров культивирования

В связи с тем, что до настоящего времени практически отсутствуют данные о глубинном культивировании гриба Trichophyton verrucosum, наши исследования были начаты с конструирования питательной среды, подбора режимов и параметров культивирования в жидкой питательной среде. При этом в качестве источников углерода и энергии были апробированы глюкоза, сахароза, крахмал, картофельный отвар. Варианты питательных сред готовили путем внесения в них разных количеств и сочетаний перечисленных углеводов, а их эффективность оценивали по интенсивности

развития гриба на них. В качестве минеральных компонентов среды апробированы разные соотношения ЫаИОз, N^804, СаСЬ2> КН2РО4. На основе этих предварительных экспериментов была подобрана питательная среда, содержащая следующие ингредиенты, г/л: №М03 - 9,0; 1^804 - 0,6; СаСЬ2 - 8,0; КН2РО4 - 1,6; глюкоза - 20,0 и 200 мл картофельного отвара. Как видно из представленного состава среды, она содержит повышенное количество кальция. Это связано с тем, что в свое время для культивирования несовершенных грибов и получения их споровой (конидиальной) биомассы, была предложена и апробирована аналогичная питательная среда для глубинного выращивания Веаотепа Ьазз1апа (М.Н.Мирзаев, С.Ю.Кононова, 1985; Малькова А.И, Бабаян Е.Ю. и др.,1985). Среда позволяла получать в глубинных условиях повышенное количество конидиоспор и это объяснялось тем, что на богатой углеводной среде на начальных этапах культивирования микроорганизм интенсивно накапливает мицелиальную массу, а затем переходит на спорообразование. А кальций, как известно, необходим для синтеза альфа-дипиколиновой кислоты, являющейся основным компонентом спор микроорганизмов. В дальнейшем все исследования были проведены с использованием этой среды с небольшими изменениями.

При отработке технологических параметров культивирования гриба была проведена работа по установлению оптимальных значений температуры, рН, аэрации и массообмена. Как известно, наиболее простым и доступным способом оценки влияния аэрации на развитие микроорганизмов является внесение в колбы разных объемов среды, регуляция подачи воздуха и вращения мешалки в ферментерах (или платформы качалок). В опытах по отработке режима аэрации, разные объемы (50-100мл) среды вносили в стандартные 750мл качалочные колбы, число оборотов качалки регулировали от 120 до 290об/мин, следили за ходом развития гриба. Температурный режим подбирали также экспериментальным путем, культивировали микроорганизм при 15°С, 28°С и 35°С.

Рис. 1 Культивирование в качалочных колбах на круговой микробиологической качалке Heidolph Unimax 2010

Как наиболее оптимальный выбран режим культивирования в качалочных колбах: рН 6,8-7,2; температура 27,5-28,5°С; скорость вращения качалки 240 оборотов/минуту (рис. 1); объем посевного материала 5-10 %.

Влияние углеводов на развитие культуры Trichophyton verrucosum

Углеводы, как известно, выполняют роль как источников энергии, так и строительного материала для клеток. При конструировании питательных сред для микроорганизмов исходят из имеющейся информации об их систематическом положении, наличии у них той или иной энзиматической системы. В биотехнологии обычно в качестве источника углеводов в питательные среды вносят отходы других производств (меласса, гидрол, патока, жом свекловичный и др.) и индивидуальные сахара (глюкоза, сахароза, лактоза и др.). В своих исследованиях мы изучали влияние наиболее доступных и относительно недорогих углеводов (глюкоза, сахароза и крахмал) на развитие культуры гриба. При этом в динамике контролировали общее количество углеводов спектрофотометрически с помощью заранее построенной калибровочной кривой. Из полученных данных следует, что максимальный выход биомассы наблюдается на среде с глюкозой - 6,67- 10,0 г/л. Интенсивность развития гриба зависит также от температуры культивирования и степени аэрации - при температуре 15°С выход сухой биомассы составляет 2,5±0,2г/л, а при 28°С и 35°С выход

биомассы практически одинаковый и составляет 6,67±0,5г/л и 6,13±0,4 г/л, соответственно (рис.2).

{■

04

8з

¥ к

1^=7!

ш

,5 28 35 _ смпсратура, С

I7

К

I3

I2

и1

120 240 280

Аэрация, об/мин

Рис.2 Влияние температуры и аэрации на развития гриба в жидкой

среде

В качалочных колбах, содержащих 100мл среды, оптимальным является режим аэрации 220-240 оборотов в минуту, что подтверждается тем, что при 110-120 об/мин выход биомассы составляет 4,2±0,6г/л, а повышение числа вращений до 280-290об/мин не дает существенного эффекта.

Одним из важнейших параметров биотехнологических процессов, основанных на культивировании микроорганизмов (особенно грибов и стрептомицетов), является инокулят, т.е. посевной материал. Оптимальный посевной материал обеспечивает сокращение лаг-фазы, увеличение выхода целевого продукта и сокращение времени ферментации. Поэтому представлялось необходимым провести работу по установлению характера влияния инокулята на развитие возбудителя трихофитии на жидкой питательной среде. Для получения относительно стандартного посевного материала суспензию спор гриба, выращенного на глюкозо-картофельном агаре, вносили в качалочные колбы с жидкой питательной средой. Колбы инкубировали в течение 36-40 часов, при 28°С и 240об/мин и получали вегетативный посевной материал (ВПМ), который использовали в дальнейших исследованиях. Данные, представленные на рис.3, свидетельствуют о наличии корреляции между количеством ВПМ и характером развития гриба.

10 20 30 40 50 60 70 80 90

BpeiКЕЯ Еультшзировзния, ч.

Рис. 3 Влияние посевного материала на кинетику развития гриба Trichophyton verrucosum

Д - объем посевного материала (ОПМ) 10%; □ - ОПМ 5%; О - ОПМ 1%.

При внесении ВПМ в количестве около 10% от объема среды лаг-фаза в данных условиях культивирования находится в пределах 20 часов. А количество ВПМ 5% удлиняет лаг-фазу на 10 часов. Из анализа представленных кинетических кривых видно также, что выход на стационарную фазу развития гриба при 10% ВПМ наступает гораздо раньше, чем при 5% ВПМ.

Рис.4 Скорость роста (а) и утилизации углеводов (b) Trichophyton verrucosum в глубинных условиях

Активное накопление биомассы в оптимальном режиме культивирования происходит до 60 часов роста, с 60 до 84 часов культура практически не растет (рис 4а). Это связано с утилизацией источников углеводов, накоплением собственных метаболитов, что является типичной

картиной, характерной для замкнутых периодических культур микроорганизмов.

Все сказанное о накоплении биомассы в периодической культуре, подтверждается данными по контролю скорости развития микроорганизма. Как видно из данных рис. 4а, максимальная скорость роста приходится на 3640 часов, а на 80 час скорость развития гриба практически прекращается.

Параллельно с накоплением биомассы идет утилизация углеводов, что видно из рис. 4Ь. Уже к 40 часам роста утилизировано приблизительно половина имеющегося сахара в питательной среде.

Как известно, любой биотехнологический процесс, основанный на культивировании микроорганизмов, в определенной мере может быть качественно оценен по экономическим коэффициентам, входящих в состав среды ингредиентов (Перт Дж, 1978.). Эти показатели дают информацию об эффективности использования компонентов среды. На основе изложенных выше данных рассчитан экономический коэффициент по углеводам: Yi= AXi/ASi=8,9/15,635=0,579, где AXi - количество накопленной биомассы; ASi - количество утилизированного углевода.

Это свидетельствует о том, что на единицу утилизированного углевода образуется 0,579 г биомассы.

Следующим этапом наших исследований была апробация полученных на качалочных колбах данных в ферментере, т.е проверка развития гриба на той же питательной среде и в тех же условиях только в ферментере. Культивирование Trichophyton verrucosum в ферментере проводили на Покровском заводе биопрепаратов. Схема проведения опыта заключалось в следующем: ВПМ, выращенный в колбах, вносили в ферментер КТН-10 со стерильной средой. В ферментер, содержащий 7л стерильной питательной среды, для аэрации автоматически через ротаметр подавался воздух в объеме 7 литров в минуту.

Полученные данные свидетельствуют о том, что гриб развивается в ферментере достаточно интенсивно. Максимальный выход сухой биомассы к

74 часам достигает 9 г/л. К этому времени основная масса углеводов из среды утилизировано. Спорообразование начинается примерно с 48 часов, когда накоплено достаточное количество мицелиальной массы, продолжается в течение всего периода культивирования (84 ч) и к концу ферментации количество спор составляет 80-100 млн/мл кулыуральной жидкости.

80 70 60 50

30 20 10 о

_32 24 3S 48 60 72 84 . !6 48 60 72 84

Время культивирования, ч Время культивировавши, ч

a b

Рис.6 Динамика накопления общей биомассы и количества спор в процессе развития гриба Trichophyton verrucosum в ферментере

а. □ - утилизация углеводов, г/л; о- накопление биомассы, г/л.

Из данных рис.6 видно, что фаза спорообразования совпадает с фазой замедления накопления общей биомассы гриба. Максимальная скорость выхода спор наблюдается к 60-70 часам роста, к этому времени культура находится на стационарной фазе развития. Экономический коэффициент по углеводам в ферментере составляет: Y2=AX2/AS2=9,42/14,85=0,63.

Таким образом, экономический коэффициент при культивировании в качалочных колбах и в аппарате ферментере имеет примерно одинаковое значение. Некоторое снижение этой величины в колбах, видимо, связано с тем, что количество аэрации и массообмена в колбах хуже, поэтому выход биомассы на единицу утилизированных углеводов ниже. На основе полученных результатов, предложена технологическая схема глубинного культивирования Trichophyton verrucosum и получения экспериментальных образцов лиофильно высушенной биомассы (рис.7).

1 2 3 4 5

Рис. 7 Технологическая схема получения лиофильно высушенной биомассы гриба Trichophyton verrucosum, выращенной глубинно

1 - исходная культура Trichophyton verrucosum, 2 - ВПМ (вегетативно посевной материал), 3 - рабочий аппарат-ферментер, 4 - розлив по флаконам, 5 - лиофильная сушка.

Культуру гриба, выращенную на скошенном агаре, добавляют в жидкую питательную среду, содержащую глюкозу, картофельный отвар и минеральные компоненты и выращивают в качалочных колбах для приготовления ВПМ. Далее ВПМ в стерильных условиях переносят в аппарат-ферментер и культивируют в течение 80-86 часов, разливают по флаконам и лиофильно высушивают.

Световая и сканирующая электронная микроскопия Trichophyton verrucosum при глубинном и поверхностном культивировании

Для сравнительного анализа морфологических особенностей гриба при развитии в глубинных и поверхностных условиях культивирования использовали метод традиционной световой и электронной микроскопии.

Конкретным материалом исследований служили колонии Trichophyton verrucosum, выросшие на глюкозо-картофельном агаре, а также мицелиальные шарики и отдельные гифы гриба, выросшего в глубинных условиях. Из полученных результатов следует, что микроорганизм сохраняет видовую идентичность при культивировании в глубинных условиях. Однако мицелий на жидкой питательной среде, более тонкий , длинный (рис. 8). В течение первых 40-48 часов отмечено начало образования спор (3-5 х 1-2 мкм), которые по мере дальнейшего развития гриба обнаруживаются в культуральной жидкости (рис. 8).

Рис.8 Формирование спор при развитии гриба на жидкой (слева) и твердой(справа) среде

При поверхностном культивировании гриба мицелий объемистый, ветвящийся, с большим количеством конидий, размером 4-7 х 2-3 мкм (рис. 8). Формирование конидиоспор наблюдается на 7-8 сутки, что существенно отличается от развития гриба в глубинных условиях

а b с

Рис. 9 «Мицелиальные шарики» гриба Trichophyton verrucosum: визуальный вид в качалочных колбах (а), световая (Ь, ув.хбО) и электронная микроскопия (с)

В отдельных случаях при культивировании гриба в жидкой питательной среде (28°-30°С, 220 об/мин) биомасса приобретает шаровидную форму и образуются так называемые «мицелиальные шарики», представляющие собой переплетение гифов на различных стадиях развития (рис. 9). Выявлены гифы, как с развивающимися конидиями, так и пустые чехлы. Следует отметить, что при исследовании гриба методом сканирующей электронной микроскопии нами подобраны оптимальные условия для

фиксации и обезвоживания Trichophyton verrucosum. Фиксацию поверхностной биомассы проводили в течение суток парами 25% глютарового альдегида, препарат обезвоживали пропиленоксидом, а глубинную биомассу фиксировали 4% глютаровым альдегидом на фосфатном буфере и обезвоживали этиловым спиртом разной концентрации (50-100%).Таким образом, видовая специфичность гриба и присущие ему свойства, такие как образование конидиоспор, сохраняются на жидкой среде.

Изучение антигенных свойств глубинной биомассы Trichophyton

verrucosum

Перспективной целью проводимых исследований является возможное использование глубинной биомассы возбудителя трихофитии для получения иммунобиологического препарата. Поэтому представлялось необходимым получить первичную информацию об антигенных свойствах биомассы гриба, полученной на жидкой среде. В качестве базовой методики использовали схему иммунизации, предложенную разработчиками препарата ЛТФ-130. Было сформировано 3 группы кроликов живой массой 2,5-3,0 кг породы шиншилла по 4 головы в каждой. Животным 1 группы вводили препарат ЛТФ-130 двукратно внутримышечно в дозе 3 мл с интервалом 7 дней, животным 2 группы - лиофильно высушенную биомассу гриба, полученную глубинно, 3 группа - контрольная, им вводился только изотонический раствор (0,85%) NaCl. Из серологических методов исследований использовали реакцию агглютинации (РА). В ходе исследований, отклонений от физиологических норм клинического состояния животных (температура, пульс, дыхание) не наблюдалось. Животные хорошо переносили «вакцинацию», охотно поедали корм. Установлено, что при введении живых антигенов гриба Trichophyton verrucosum у первых трех групп животных гематологические и биохимические показатели существенно не отличались друг от друга

(Р>0,05) и не превышали границ физиологической нормы во все сроки исследования.

Таблица 1

Действие антигенов Тг.уеггисовит на биохимические показатели крови _кроликов_

Показатели крови кролика" Время анализа

до введения антигена 14 день 30 день

1гр 2 гр Згр 1гр 2гр 3 гр 1 гр 2 гр Згр

Общий белок, г/л 64+ 1,53 70,2+ 1,21 67,+ 0,66 76,4+ 1,12* 76,7+ 1,14* 69,2+ 1,29 78,7+ 1,17* 79,4+ 1,12** 65,+ 1,25

Мочевина, мМ/л 4,43+ 0,12 4,45+ 0,1 4,37 +0,1 4,64+ 0,22 4,83+ 0,19 4,40+ 0,16 4,83+ 0,11 4,55+ 0,15 4,4+ 0,18

Общий билирубин, мкМ/л 3,22+ 0,13 3,0+ 0,16 3,1± 0,11 3,34+ 0,1 3,23+ 0,07 3,24+ 0,13 3,36+ 0,12 3,05+ 0,09 3,2+ 0,14

Кальций общий в сыворотке, мМ/л 2,43+ 0,07 2,67+ 0,08 2,4+ 0,08 2,14+ 0,05* 2,23+ 0,09 2,45+ 0,1 2,45+ 0,07 2,54+ 0,1 2,4+ 0,06

Фосфор неорганический, мМ/л 1,11+ 0,03 1,1± 0,04 1,0+ 0,03 0,97+ 0,05 0,86+ 0,08 1,10+ 0,03 1,09+ 0,06 1,01+ 0,04 1,1+ 0,05

*- р=0,95 при п=6; ** - р=0,99 при п=6;

"норма: общий белок - 60-82г/л, мочевина - 4,4-6,6 ммоль/л, общий билирубин - 0,17-3,42 мкмоль/л, кальций общий - 2,12-2,62 ммоль/л, фосфор неогрганический -0,81-1,13 ммоль/л

Как видно из данных таблицы 1, при введении препарата наблюдается достоверное повышение общего белка в крови кроликов. В первой и второй группах кроликов, на 14 день опыта увеличение белка составляет 20% и 9% соответственно, что, видимо, связано с возрастанием иммуноглобулиновых фракций сыворотки крови в ответ на введение антигена Trichophyton verrucosum. Остальные биохимические показатели изменились не достоверно. Данные таблицы 2 показывают также достоверное увеличение количества лейкоцитов к 14 дню опыта. Из лейкоцитарной формулы видно увеличение содержания палочкоядерных нейтрофилов и лимфоцитов. Количество эозинофилов остается без существенных изменений, т.е. антиген не обладает аллергенным действием. У иммунизированных

экспериментальными образцами высушенной биомассы кроликов на 14 день опыта в крови выявлены специфические агглютинины к антигенам Trichophyton verrucosum в титрах 1:40-1:60, на 30-й день опыта их количество увеличивается до 1:80-1:120.

Таблица 2

Действие антигенов Tr.verrucosum на гематологические

показатели кроликов

Показатели крови кролика" Время анализа

До анализа 14 день 30 день

1 гр 2 гр 3 гр 1 гр 2 гр 3 гр 1 гр 2 гр 3 гр

Лейкоциты, тыс/мкл; 10*9/л 6,9+ 0,26 6,7+ 0,21 6,9+ 0,20 7,8+ 0,30* 7,71+ 0,27* 6,87 + 0,35 7,1+ 0,3* 6,98+ 0,18* 7,0+ 0,21

Эритроциты, млн/мкл;10*12/л 4,7+ 0,45 4,9+ 0,27 4,8+ 0,34 4,94+ 0,23 5,2+ 0,29 4,7± 0,41 5,0+ 0,28 4,91+ 0,37 4,6+ 0,22

Эозинофилы, % 2,1± 0,18 2,2+ 0,12 1,9+ 0,11 1,91+ 0,11 2,13+ 0,138 1,7+ 0,1 2,0+ 0,13 2,19+ 0,112 1,8+ 0,114

я i * 3 § ■? г? П 6,6+ 0,03 6,8+ 0,14 7,0+ 0,14 7,87+ 0,103 *** 7,75+ 0,02* * ■ 7,1± 0,12 1 6,8+ 0,034 • 6,9+ 0,107 * 7,2+ 0,096

■е « к в !-ä С 35,5 + ЗД5 36,6 6+ 2,9 35,1 + ЗД1 33,2+ 2,3 36,0+ 1,06 35,3 + 1,66 34,9+ 1,07 36,51 + 1.1 35,6+ 1,024

е 1 3 Лимфоциты, % 54,1 + 0,91 52,5 + 1,11 7 54,0 + 0,78 55,84 + 0,81* 54,97 + 0,89* 53,7 + 1,09 54,2+ 0,64* 52,8+ 0,89* 53,3+1, 19

Моноциты, % 1-7± 0,71 1,84 + 0,69 2,0+ 0,87 1,18+ 0,97 1,41+ 0,038 2,2+ 0,3 2,1+ 0,03 1,6+ 0,041 2,1+ 0,37

* - р=0,95 при n= 15; ** - р=0,99 при п=15; *** - р=0,999 при п=15; "норма: лейкоциты - 6,5-9,5 тыс/мкл; 10*9/л, эритроциты-4,5-7,5 мли/мкл; 10*12/л, эозинофилы - 1-3 %, нейтрофилы палочкоядерные - 5-9%, нейтрофилы сегментоядерные - 33-39%, лимфоциты - 43-62%, моноциты -1-3%

В крови кроликов, которым вводили вакцину ЛТФ-130, появляются специфические агглютинины в титрах 1:80 - 1:320. В сыворотке неиммунизированных животных специфические антитела к антигенам Trichophyton verrucosum не выявлены.

Таким образом, биомасса гриба Trichophyton verrucosum, полученная глубинным способом культивирования, обладает антигенными свойствами и

это свидетельствует о перспективности исследований в плане дальнейшего совершенствования технологии получения биомассы на жидкой среде.

Экономические показатели технологии получения биомассы Trichophyton verrucosum в глубинных условиях

При глубинном культивировании выход спор составляет 100 млн/мл., т.е. в 1 мл содержится 20 доз. Для получения 300 тыс. доз (такая доза является средней для технологического цикла при производстве ЛТФ-130) необходимо - 15 л среды. Ферментация в небольшом 100 л аппарате, при коэффициенте заполнения ферментера 0,7, позволяет получать 1,4 млн. доз. Получение аналогичного количества доз поверхностным способом культивирования возможно при засеве 467 матрасов.

Стоимость 600 мл сусло-агара, вносимого в 1 матрас, составляет примерно 40 рублей, а стоимость среды для глубинного культивирования при получении тех же 3000 доз составляет 10 рублей.

Таким образом, эффективность технологии получения биомассы возбудителя трихофитии в глубинных условиях связана с тем, что стоимость только одной среды при поверхностном культивировании гриба для получения ЗООтыс доз составляет 4000руб, а стоимость жидкой среды -1000руб. Следует учесть и то, что время культивирования гриба на агаре 21 сутки, а на жидкой среде- 4 суток.

ВЫВОДЫ

1. Разработан сбалансированный компонентный состав питательной среды на основе картофельного отвара и минеральных солей для культивирования Trichophyton verrucosum в глубинных условиях.

2. При культивировании Trichophyton verrucosum в глубинных условиях в качестве инокулята предложено использовать вегетативный посевной материал, получаемый путем проращивания споровой массы гриба в течение 36-40 часов и вносимый в количестве 5-10% от объема среды

3. Установлено, что Trichophyton verrucosum развивается на жидкой питательной среде, подчиняясь общеизвестным закономерностям развития

микроорганизмов в периодической культуре: лаг-фаза длится до 30 часов, экспоненциальная фаза до 48-54 часов и далее гриб переходит в стационарную фазу. Максимальный выход спор наблюдается к 60-70 часам и составляет 100 млн/мл культуральной жидкости. Экономический коэффициент по углеводам находится в пределах 0,46-0,63.

4. Впервые с помощью электронной и световой микроскопии проведен сравнительный анализ морфологических особенностей Trichophyton verrucosum, выращенного на твердой и жидкой средах. Показано, что гифы мицелия в глубинных условиях более тонкие и длинные, выявлены гифы, как с развивающимися конидиями, так и пустые чехлы.

5. Установлено, что введенная подопытным лабораторным животным (кролики, порода шиншилла) лиофильно высушенная биомасса гриба Trichophyton verrucosum, не оказывает токсического или аллергенного действия. После иммунизации антигеном, ролики охотно поедали корм, отклонений клинических показателей (температура, пульс, дыхание) от физиологических норм не наблюдалась.

6. В экспериментах по иммунизации подопытных кроликов глубинной биомассой Trichophyton verrucosum установлено, что при культивировании в жидкой среде гриб Trichophyton verrucosum сохраняет антигенные свойства, в реакции агглютинации титр составляет 1:80-1:120

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

1. По результатам исследований составлен и утвержден в установленном порядке отчет «Создание иммунобиологических средств защиты животных на основе корпускулярных конъюгированных и субъединичных компонентов микроорганизмов возбудителей бактериальных и грибковых (Trichophyton) заболеваний» за 2007, 2008 г по хоз-договору №14-06.

2. В производственных условиях на ФГУП «Покровский завод биопрепаратов» использованы данные диссертации по отработке и

оптимизации технологии глубинного культивирования Trichophyton verrucosum, показано интенсивное развитие и накопление биомассы гриба, что подтверждено актом испытаний, утвержденным соответствующим образом. Методы получения глубинной биомассы используются в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе.

3. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО «МГАВМиБ» для студентов факультета ветеринарной медицины.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Полученные экспериментальные данные рекомендуются в качестве нового методического подхода при проведении исследований по получению иммунобиологических препаратов на основе глубинной биомассы возбудителя трихофитии.

2. Результаты исследований по глубинному культивированию Trichophyton verrucosum рекомендуются использовать в учебном процессе по курсу «Биотехнология» в сельскохозяйственных вузах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тищенко Е.В., Мирзаев М.Н., Девришов Д.А. Особенности

развития гриба Trichophyton faviforme / Объединенный научный журнал. -2008.-№6(212).-С. 63.

2. Тищенко Е.В., Мирзаев М.Н., Девришов Д.А. Технологические параметры Trichophyton faviforme при культивировании в биореакторах // Ветеринарная медицина. - 2009. - №1-2. - С. 20.

3. Тищенко Е.В. Световая и сканирующая электронная микроскопия гриба Trichophyton faviforme при глубинном и поверхностном культивировании // Ветеринарная медицина. - 2009. - №4. - С. 21.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ЦЦ № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 05.05.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тищенко, Елена Викторовна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Общее состояние проблемы микозов животных.

1.2 Культурально-морфологические свойства возбудителей дерматомикозов.

1.3 Микроскопия как важнейший метод изучения дерматомикозов.

1.4 Действие возбудителей микозов на иммунную систему макроорганизма.

1.5 Современные средства специфической защиты от микозов.

2. Собственные исследования.

2.1 Материалы и методы.

2.2 Результаты исследований.

2.2.1 Оптимизация состава питательной среды и параметров культивирования Trichophyton verrucosum.

2.2.1.1 Влияние углеводов на развитие культуры Trichophyton verrucosum.

2.2.1.2 Влияние аэрации и температуры на развитие Trichophyton verrucosum в глубинных условиях.

2.2.1.3 Развитие Trichophyton verrucosum при различных дозах инокулята (ВПМ).

2.2.1.4 Апробация культивирования Trichophyton verrucosum в производственных биореакторах.

2.2.2 Световая и сканирующая электронная микроскопия Trichophyton verrucosum при глубинном и поверхностном культивировании.

2.2.3 Изучение антигенных свойств глубинной биомассы Trichophyton verrucosum.

2.2.4 Экономические показатели технологии получения биомассы

Trichophyton verrucosum в глубинных условиях.

Обсуждение результатов исследований.

Выводы.

Практическое использование полученных научных результатов.

Рекомендации по использованию научных выводов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии глубинного культивирования гриба Trichophyton verrucosum"

Актуальность работы. Несмотря на интенсивное развитие ветеринарной медицины и, в частности ветеринарной дерматологии, трихофития по-прежнему имеет значительный и стабильный удельный вес среди кожных болезней животных в большинстве стран мира.

Эта болезнь распространена повсеместно и наносит ощутимый экономический ущерб за счет снижения прироста живой массы и качества кожевенного сырья, увеличения затрат на проведение лечебно-оздоровительных мероприятий (Борисова Л.И., 1986; Поляков И.Д., Иванова Л.Г., 1994; Кухар Е.В., 2006).

Существующие технологии получения вакцин против микозов (Саркисов А.Х., Петрович С.В., Никифоров Л.В. и др., 1972; Летягин К.П., Саркисов К.А., Панин А.Н., Маноян М.Г., 1997; Соловьев Н.П., 2004; Лазовский В.А., 2007) основаны на культивировании грибов только поверхностным способом. Однако, как известно, такой способ культивирования промышленных штаммов микроорганизмов по современным требованиям биотехнологии нельзя считать технологичным. При развитии на твердых средах и, особенно, при снятии с поверхности агаризованных сред споры возбудителей микозов могут загрязнять производственные помещения, а процесс культивирования целевых штаммов длительный (более 20 суток) и трудоемкий.

Анализ опубликованной информации показывает, что ранее проводились исследования по разработке технологии глубинного культивирования несовершенных грибов, к которым относится и Trichophyton verrucosum (Мирзаев М.Н., Кононова С.Ю., 1985; Баласова А.И., Бабаян Е.Ю., Булатова А.А. и др.,1985). Полученные авторами данные позволили заменить промышленную технологию культивирования гриба Beauveria bassiana поверхностным методом на глубинное культивирование при получении энтомопатогенного препарата боверина.

Известные работы по культивированию гриба Trichophyton verrucosum (= синоним Trichophyton faviforme) глубинным способом посвящены оценке динамики накопления биомассы (Кухар Е.В., 1999 г.; Кухар Е.В., 2002 г.; Кухар Е.В., 2006 г.) и показывают, что наибольший рост достигнут за 21 сутки.

Таким образом, из изложенного видно, что актуальной задачей современной биотехнологии является усовершенствование производства препаратов против трихофитии животных на основе интенсификации процесса глубинного культивирования гриба Trichophyton verrucosum.

Цель и задачи исследований. Целью исследований является разработка технологии культивирования гриба Trichophyton verrucosum в глубинных условиях на основе создания новой питательной среды и оптимизации условий развития.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: разработать сбалансированный компонентный состав питательной среды для глубинного способа выращивания гриба Trichophyton verrucosum; определить основные технологические параметры культивирования Trichophyton verrucosum в жидкой питательной среде: аэрация, температура, инокулят; исследовать влияние условий культивирования на динамику спорообразования гриба; получить экспериментальные образцы глубинной биомассы гриба Trichophyton verrucosum и изучить их антигенные свойства на лабораторных животных; обосновать экономическую целесообразность внедрения в производство глубинного культивирования гриба Trichophyton verrucosum для получения соответствующей вакцины.

Научная новизна. Впервые разработана технологическая схема культивирования Trichophyton verrucosum в глубинных условиях на новой питательной среде, содержащей картофельный отвар и минеральные компоненты, оптимизированы основные параметры культивирования гриба (аэрация, температура, инокулят). Впервые с помощью электронной и световой микроскопии проведен сравнительный анализ морфологических особенностей микроорганизма, выращенного на агаризованной и жидкой средах.

Практическая значимость работы. Разработаны питательная среда, а также параметры и режимы для глубинного культивирования Trichophyton verrucosum с целью получения биомассы гриба, являющейся основой иммунобиологического препарата. Практическая значимость разработанной технологической цепочки глубинного культивирования Trichophyton verrucosum подтверждена в условиях ФГУП «Покровский завод биопрепаратов» в аппарате-ферментере КНТ-10, результаты производственных испытаний оформлены утвержденным актом испытаний. Результаты диссертации используются в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на научной конференции молодых ученых МГАВМиБ им. К.И.Скрябина, (2008) Основные положения, выносимые на защиту:

- состав питательной среды для культивирования Trichophyton verrucosum;

- технологические режимы культивирования гриба;

- морфология мицелия гриба при развитии в глубинных и поверхностных условиях

- антигенные свойства биомассы гриба, полученной глубинным методом культивирования.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы, в том числе 2- в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, литературный обзор, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы, включающий 156 источников, в т.ч. 56 иностранных, и приложение. Материалы диссертации иллюстрированы 19 рисунками и 17 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Тищенко, Елена Викторовна

Выводы

1. Разработан сбалансированный компонентный состав питательной среды на основе картофельного отвара и минеральных солей для культивирования Trichophyton verrucosum в глубинных условиях.

2. При культивировании Trichophyton verrucosum в глубинных условиях в качестве инокулята предложено использовать вегетативный посевной материал, получаемый путем проращивания споровой массы гриба в течение 36-40 часов и вносимый в количестве 5-10% от объема среды

3. Установлено, что Trichophyton verrucosum развивается на жидкой питательной среде, подчиняясь общеизвестным закономерностям развития микроорганизмов в периодической культуре: лаг-фаза длится до 30 часов, экспоненциальная фаза до 48-54 часов и далее гриб переходит в стационарную фазу. Максимальный выход спор наблюдается к 60-70 часам и составляет 100 млн/мл культуральной жидкости. Экономический коэффициент по углеводам находится в пределах 0,46-0,63.

4. Впервые с помощью электронной и световой микроскопии проведен сравнительный анализ морфологических особенностей Trichophyton verrucosum, выращенного на твердой и жидкой средах. Показано, что гифы мицелия в глубинных условиях более тонкие и длинные, выявлены гифы, как с развивающимися конидиями, так и пустые чехлы.

5. Установлено, что введенная подопытным лабораторным животным (кролики, порода шиншилла) лиофильно высушенная биомасса гриба Trichophyton verrucosum, не оказывает токсического или аллергенного действия. После иммунизации антигеном, кролики охотно поедали корм, отклонений клинических показателей (температура, пульс, дыхание) от физиологических норм не наблюдалась.

6. В экспериментах по иммунизации подопытных кроликов глубинной биомассой Trichophyton verrucosum установлено, что при культивировании в жидкой среде гриб Trichophyton verrucosum сохраняет антигенные свойства, в реакции агглютинации титр составляет 1:80-1:120

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

1. По результатам исследований составлен и утвержден в установленном порядке отчет «Создание иммунобиологических средств защиты животных на основе корпускулярных конъюгированных и субъединичных компонентов микроорганизмов возбудителей бактериальных и грибковых (Trichophyton) заболеваний» за 2007, 2008 г по хоз. договору №14-06.

2. В производственных условиях на ФГУП «Покровский завод биопрепаратов» использованы данные диссертации по отработке и оптимизации технологии глубинного культивирования Trichophyton verrucosum, показано интенсивное развитие и накопление биомассы гриба, что подтверждено актом испытаний, утвержденным соответствующим образом. Методы получения глубинной биомассы используются в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе.

3. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГАВМиБ для студентов факультета ветеринарной медицины.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Полученные экспериментальные данные рекомендуются в качестве нового методического подхода при проведении исследований по получению иммунобиологических препаратов на основе глубинной биомассы возбудителя трихофитии.

2. Результаты исследований по глубинному культивированию Trichophyton verrucosum рекомендуются использовать в учебном процессе по курсу «Биотехнология» в сельскохозяйственных вузах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тищенко, Елена Викторовна, Москва

1. Азимов В.А., Мурадова Г.Р. Сравнительные методы лечения дерматомикозов собак // Сб. Науч. Раб. Дагестанского вет. института, 1970. С. 57.

2. Алешкевич В.Н., Красочко П.А. Трихофития крупного рогатого скота в республике Беларусь // Ветеринарная практика. — 2005. №1-2 (28-29). С. 4547.

3. Алешкевич В.Н., Красочко П. А. Факторы, способствующие возникновению трихофитии крупного рогатого скота // Ветеринарная медицина Беларуси. 2006. №2. С. 5-7.

4. Ахметова А.К. Клинико-иммунологическая характеристика микроспории и трихофитии: Автореф. дис. канд. мед. наук. Алматы, 1994. — С.25.

5. Барадиев Б.Н. Трихофития северных оленей / Бюлл. ВИЭВ. 1981. Вып.42. С. 8.

6. Бухтоярова И.И., Фомин К.Ф. Структура и динамика заболеваемости у детей по данным поликлиники // Вестник дерматологии.- 1973. №6. С. 50-53.

7. Васюков Л.И. К вопросу о стригущем лишае крупного рогатого скота в Псковской области // Труды научно производственной конференции. Псков, 1963. С. 17.

8. Веревкина М.Н. Влияние СРМ ТС-1 на накопление биомассы Trichophyton faviforme // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф. С.Н. Никольского. Ставрополь, 2003. С. 155-157.

9. Влияние комплексного сероорганического соединения на телят при трихофитии. Исмагилова А.Ф., Кирилов В.Г., Кузнецов С.В. и др. // Ветеринария. 2003. №2. С. 20-23.

10. Глотова Т.И. Дерматомикозы мелких домашних животных: распространение, клиническое проявление, диагностика // Сб. Науч. тр. / РАСХН. Сиб. отделение. ИЭВСиДВ. Новосибирск, 2000. С.259-261.

11. Головина Н.П. Биология возбудителя Trichophyton verrucosum var. autotrophicum и разработка вакцины против трихофитии овец: Автореф. дис. . докт. биол. наук: 16.00.24/ ВАСХНИЛ, ВИЭВ. М., 1991. 53 с.

12. Головина Н.П. Дифференциальная диагностика возбудителя трихофитии овец в лабораторных условиях // Бюллетень ВИЭВ. 1988. -Выпуск 65.-С. 58-60.

13. Головина Н.П., Саркисов К.А., Комова Л.Т. Дифференциальная диагностика культур родов трихофитон и микроспорум при посевах на различных питательных средах // Сб. Науч. Трудов. М., 1995. Том 57. С. 249-256.

14. Горячкина Г.И. Специфическая профилактика, терапия трихофитии и микроспории пушных зверей, кроликов, мелких домашних животных (видовой состав, биология возбуди гелей, сравнительная оценка иммуногенеза): Автореф. дис. канд. вет. наук. М., 1999.-c.24.

15. Диагностика грибных болезней животных. Саркисов А.Х, Королева В .П., Квашнина И.С. и др. М.: Колос., 1971. с. 144.

16. Докудовский Е.Г. О мерах борьбы с трихофитией// Ветеринария.-№1.-1962. С.51-54.

17. Ерошенко Л.К. Иммунитет при трихофитии у крупного рогатого скота. М.: Медгиз, 1965. 35 с.

18. Зверькова Ф.А., Корнишева В.Т., Оловяншпников О.В. Динамика заболеваемости дерматофитиями в Ленинградской области за 20 лет // Сб. работ, вып. 17. Горький., 1981. С. 81-85.

19. Иванова Л.Г. Возбудители дерматомикозов животных // Бюллетень ВИЭВ. 1984. Выпуск 54. С. 9-11.

20. Иванова Л.Г., Поляков И.Д. Сравнительная оценка антигенных препаратов их дерматофитов в реакции иммунодиффузии // Бюллетень ВИЭВ. 1985. Выпуск 57. С. 41-44.

21. Иванова Л.Г. Tr. Verrucosum Bodin 1902 возбудитель дерматомикоза северных оленей // Бюллетень ВИЭВ.- М., 1981. Выпуск 42. С.23.

22. Искандаров У.С. Влияние состава питательной среды и температуры на прорастание конидий и энтомогенную активность грибов Beauveria bassiana и Metarhizium anisopliae // Прикладная биохимия и микробиология. -2006. Том 42, №1.С. 81.

23. Исследования пригодности инактивированной вакцины Бовитриховак 2 в профилактике и лечении трихофитоза крупного рогатого скота / Рамиш А., Новосад Б., Мазурек Я. и др. // Новости ветеринарной фармации и медицины.- 1989. №2. С. 64-67.

24. Касаткина Н.В. Ультраструктура гриба Trichophyton mentagrophytes и патогенетические механизмы его взаимодействия с микроорганизмом: Автореф. Дис. . канд. Вет. Наук: 16.00.03 / ВИЭВ, ВАСХНИЛ. М., 1985. 25 с.

25. Касаткина Н.В. Факторы резистентности животных при дерматомкозах // Бюллетень ВИЭВ. 1984. Выпуск 54. С. 42-44.

26. Кашкин П.Н. Дерматомикозы. Ленинград. 1953. с.276.

27. Королева В.П., Иванова Л.Г. Возбудители дерматомикозов животных и их лабораторная диагностика / Ветеринарная микология и микробиология // Труды ВИЭВ. М. 1987. С.32-41.

28. Кухар Е.В. Антигенные свойства компонентов клеточной стенки возбудителя трихофитии и их использование в разработке иммуноферментной тест-системы // Вестник науки Казахского аграрного университета им. С. Сейфуллина. -2002. Том 3, №5. С. 75-81.

29. Кухар Е.В., Байдуйсенова А.У., Акимбаева А.К. Поверхностное культивирование дерматомицетов в целях лабораторной диагностики // Вестник науки Казахского аграрного университета им. С. Сейфуллина. -2006. №2 (41)/2006. С. 149-156.

30. Лазовский В.А. Живая сухая вакцина « Триховак-Стимул-1» против трихофитии крупного рогатого скота: Автореф. Дис. . канд. Вет. Наук: 16.00.03 / УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная Академия ветеринарной медицины». Минск, 2007. 21 с.

31. Лазовский В.А., Максимович В.В., Зайцев В.В. Иммунологическая эффективность опытной вакцины ТФ-130 (К) против трихофитии крупного рогатого // Сельское хозяйство- проблемы и перспективы: Сб. Научн. Трудов Гродно, 2005. Том 4, часть 2. С. 172-175.

32. Мадыбаев С.С., Демченко А.Г. Серологическая диагностика трихофитии верблюдов // Проблемы биологической и экологической безопасности: Сб. Мат. Межд. Научн. Конференции. Астана, 2000. С. 136137.

33. Маноян М.Г. Реакция коаглютинация для изучения антигенных связей возбудителей трихофитии животных // Сб. Науч. Трудов. М., 1995. Том 57. С. 236-243.

34. Медведева Е.А., Чистякова Э.В., Фахретдинова Х.С. Медико-географические аспекты распространения заболеваний, обусловленных зоофильными трихофитонами / Мат.9 конф. по медицинской географии. СПб., 1995, с. 130.

35. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник. Кондрахин И.П., Архипов А.В., Левченко В.И. и др. / Под Ред. Проф. И.П. Кондрахина. -М.: Колосс, 2004. С. 520.

36. Назаров С.Г. Опыт профилактики и терапии трихофитии крупного рогатого скота в Саратовском области // Проблемы ветсанитарии.- 1964. №2. с.15.

37. Насер А.А Дерматофитозы животных в Сирийской республике: Автореф. дис. канд. вет. Наук: 16.00.03 / ВИЭВ. М., 1992. С.24.

38. Насер А.А. Трихофития крупного рогатого скота в Сирийской Арабской Республике (САР) // Бюллетень ВИЭВ. 1991. Выпуск 75-76. С. 142-145.

39. Никитушкина Н.А. Видовой состав грибковой микрофлоры, персистирующей на коже животных с признаками дерматомикоза // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: Материалы Сиб. Междунар. Вет. конгр. / Новосиб. гос. аграр. ун-т. Новосибирск, 2005. С. 48.

40. Никифоров Л.И. Возбудитель дерматомикоза пушных зверей, кроликов и лабораторных животных // Ветеринария. 1980. №11. С. 39-40.

41. Никифоров Л.И., Чучина Т.В. Динамика видового состава возбудителей дерматофитозов пушных зверей и кроликов // Ветеринария. -1989. №1. С.38-40.

42. Никифоров Л.И. Трихофития серебристо-черных лисиц и песцов // Бюллетень ВИЭВ.- 1982. вып.32. С.48-53.

43. Новикова Т.В. Зоонозные дерматомикозы на территории Вологодской области // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: Материалы Сиб. Междунар. Вет. конгр. / Новосиб. гос. аграр. ун-т. — Новосибирск, 2005. С. 49.

44. Носков А.И., Докудовский Е.Г. Опыты по иммунитету при трихофитии крупного рогатого скота // Труды ВНИИВС. М., 1964. С.56.

45. Носок Т.П., Пархоменко М.Л., Киликеев А.А. Динамика заболеваемости дерматомикозами в Винницкой области на протяжении 19671978 гг. // Тезисы докладов 4-го республиканского съезда дерматовенерологов УССР. Харьков., 1980. С.73.

46. Обухова А.С. В кн.: Всесоюзный 6 съезд дерматовенерологов //Тезисы докладов. М., 1973. С. 1 70-171.

47. Овчинников Р.С. Изучение изменчивости морфологических характеристик дерматофитов // Вестник РАСХИ. 1999. №5. С.37-39.

48. Одноволик Ю.В. Оптимизация условий спорообразования вакцинных штаммов рода Trichophyton: Автореф. Дис. . канд. Вет. Наук: 16.00.03 / ВИЭВ.-М., 2001. 13 с.

49. Павлова И.Б., Ленченко Е.М., Д.А. Банникова. Атлас морфологии популяций патогенных бактерий. М., Колосс, 2007. 178 с.

50. Панкова Г.Е. Эффективность советских вакцин в борьбе с трихофитией / Животноводство и ветеринария. 1984. №11. С. 20-25.

51. Парманов М.П. Трихофития овец в Узбекистане / Бюллетень ВИЭВ, вып. 42. 1981. с. 11.

52. Парманов М.П. Вопросы эпизоотологии, патогенеза и иммунитета: Автореферат дисс. .канд. вет н.-Самарканд., 1972. с.23.

53. Парманов М.П., Саркисов К.А., Н.П.Головина Вспышка трихофитии у овец и эффективность вакцины триховис // Ветеринария.- 1993. №5. С.33-34.

54. Пестерев П.П. Эпидемиология, клиника, лечение и профилактика трихофитии, вызванной зоофильными грибами // Методические рекомендации. -М., 1976. с.24.

55. Пестерев П.П. Зооантропонозная трихофития человека, ее связь с природными очагами и профилактика: Автореферат дис. .д-ра мед.н.-М., 1980. с.37.

56. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / Под. Ред. И.Л. Работнова. М.: Мир, 1978. 330 с.

57. Плохинский Н.А. Биометрия. Новосибирск, 1987. с. 38-125.

58. Поляков И.Д. Антигенная структура возбудителей микроспории животных/ Ветеринарная микология и микробиология// Труды ВИЭВ. -1987. том 65. С.93-101.

59. Подвысоцкая О.П. Грибковые заболевания. Ленинград., 1925. с.54.

60. Профилактика и лечение дерматофитозов животных / Гусев А.А., Борзионов В.Д., Мищенко В.А. и др. // Проблемы патологии, санитарии и бесплодия в животноводстве: Мат. Межд. Научно-практической конфер. -Минск, 1998. С. 93-94.

61. Рейимкулыев Б. Р. Эпидемиология зооантропонозных дерматофитий в Туркменистане. Влияние климато-географических особенностей и организация социальной медицинской помощи: Автореф. дис. докт. мед. наук. М., 1997. с.25.

62. Саркисов А.Х., Никифоров Л.И. Вакцина Ментавак для специфической профилактики и терапии трихофитии пушных зверей и кроликов. М.: Медэкспорт, 1984. С. 24.

63. Саркисов А.Х., Поляков И.Д., Иванова Л.Г. Дерматофития верблюдов и биологические свойства возбудителя / Ветеринария. -1989. № 10. С.31 -34.

64. Саркисов А.Х. Иммунитет и специфическая профилактика дерматомикозов животных / Бюллетень ВИЭВ. 1984. Выпуск 54. С. 3-7.

65. Саркисов К.А., Кривошлык С.С. Опытная вакцина против трихофитии кроликов/ Аграрная наука.-2003. №11. С. 24-25.

66. Саркисов JI.X. Дерматомикозы животных и современные средства их профилактики// Бюллетень ВИЭВ М., 1981. Выпуск 42. С. 4.

67. Саттон Д., Фотергилх А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно-патогенных грибов / Под. Ред. И.Р. Доропековой М.: Мир, 2001, 468 с.

68. Соловьев Н.П. Подбор иммуногенных и продуктивных штаммов для вакцины Триховак-2 и ее применение в условиях Республики Саха (Якутия): Автореф. Дис. . канд. Вет. Наук: 16.00.03 / ВИЭВ, Якутская республ. Вет.-испыт. Лаб. М., 2004. 27 с.

69. Спорогенез дерматофитов на сусло-агаре. Летягин К.П., Мохина Т.Н., Яблочник Л.М. и др. // Докл. Всесоюзн. Орд. Ленина и орд. Труд. Знамени акад. с/х наук. 1986. №3. С. 32-35.

70. Степанищева З.Г. Актуальные вопросы патогенеза и терапии кожных и венерических заболеваний. М., 1965. с.274.

71. Тарабукина Н.П. Новые дезенфицирующие средства и методы исследования при трихофитии: Дис. . канд. вет. наук: 16.00.06 / Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии . М., 1983. 146 с.

72. Тищенко Е.В., Мирзаев М.Н., Девришов Д.А. Особенности развития гриба Trichophyton faviforme // Объединенный научный журнал. — 2008. №6 (212). С. 63.

73. Тишенко Е.В. Световая и сканирующая электронная микроскопия гриба Trichophyton faviforme при глубинном и поверхностном культивировании // Ветеринарная медицина. 2009. №4. С. 21.

74. Тищенко Е.В., Мирзаев М.Н., Девришов Д.А. Технологические параметры Trichophyton faviforme при культивировании в биореакторах // Ветеринарная медицина. 2009. №1-2. С. 20.

75. Толеутаева С.Т. Реакция коаглютинации при типизации возбудителя трихофитии верблюдов // Аграрная наука. 2003. №7. С. 28-29.

76. Устинцева Ю.Ю. Дерматомикозы мелких животных в Якутии // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: Материалы Сиб. Междунар. Вет. конгр. / Новосиб. гос. аграр. ун-т. Новосибирск, 2005. С. 60.

77. Фсйер Э., Олах Д. Медицинская микология и грибковые заболевания /АН Венгрия. Будапешт, 1966. 58 с.

78. Ханис А.О. Иммунизация животных антигенами, приготовленными из дерматофитов: Автореф. дис. канд. вет. наук. М., 1989. с. 24.

79. Яблочник JI.M. Серологические исследования при трихофитии крупного рогатого скота // Бюллетень ВИЭВ / М., 1972. С.31.

80. Яблочник Л.М., Баландина A.M., Дрождин O.JI. Вспышка трихофитии среди белых мышей // Ветеринария. 1986. №8. С.72.

81. Ячевский А.А. Основы микологии / Под ред. Н.А.Наумова M.-JI.: ОГИЗ, 1933. 136 с.

82. Aamodt О., Naes В., Sandvik О. Vaccination of Norwegin cattle against Ringworm. Lbe. Vet. Med., 1982. v. 29. N.6 P. 451-456.

83. Ajello L. Cultural methods for human pathogenic fungi // J. Chronic Diseases. N.5. P.5. 1989.

84. Alteras L, Avram JI. Грибковая флора Бухарской области// Вестник дерматовенерологии.-№2.- 1961 .-С.89.

85. Bloom B.R., Glade R.R. Методы изучения in vitro клеточного иммунитета ( перевод с англ.). М.: Медицина. 1974. С. 302.

86. Bourdgi-Hatjopoulou E. and Kontos B. Ringwarm in rabbits caused by trichophyton mentagrophytes. Bull Hellen. Veter. Med. Soc. 1983, V. 34. N.l. P. 72-77.

87. Braun W. New views on immunobiology in trichophytoses, Recent Advances of Human and Animal Mycology.- Bratislava.- 1967.- P. 301-303.

88. Brocker C.E. Ultrastructure of fungi. Anm. Rev. Phytopathol., 1967. N.3. P. 343.

89. Cafarchia C. The epidemiology of canine and feline dermatophyteses in southern/ C. Cafarchia, D. Romito, M. Sasanelli, R. Lia, G. Capelli and D. Otranto//Mycoses.-2004.-Vol.47.- P. 508-513.

90. Carman M.C. Dermatophytes isolated from damestic and Ferals animals // New. Zeland vet. J.-1979.- vol.27.- P. 143.

91. Chatteijee A., Sengupta D.N. Ringworm in domestic animals. Indian J. anim. Health. 1999. N. 18 (2). P. 37-46.

92. Chrol M. Badania nad swoista profilaktyka I leczeniem trychofytozy bydla, докторская диссертация Warszawa, 1977.

93. Clayton Y.M. Relevance of broad-spectrum and fungicidal activity of antifungals in the treatment of dermatomycoses// Br. J. Dermatol.-1994.-vol.30.-P.7-8.

94. Consales O.A., Victoria CO. Частота дерматофитозов и их возбудители в Мехико// Мед. Реферативный журнал.- раздел II.- 1975.-№7.- С.З.

95. Colombo S., Cornegliani L. Efficacy of itraconazole as a combined continuous/pulse therapy in feline dermatophytosis: preliminary results in nine cases// Vet. Dermatol.- 2001.- Dec. 12(6).-P.347-350.

96. Cook W. Western Fungil // Mycologia. 1956. Vol. 44. P. 245.

97. Dawson CO. Ringworm in animals// Rew.med. vet. Mycol.- №6.- 1968.-P.223-233.

98. Dvorak J., Otcenasek M. Mycological diagnosis of animal dermatophytes//Prague.- 1969.-p. 157.

99. Fargues J., Ouedradogo A., Goettel M.S. // J. Biocontol. Sci. Technol. 1997. V. 7 P. 345-356.

100. Georg L.K. Animal ringworn in public health// U.S.Dept. Realth Edication.-vol.74.-1960.-P. 14.

101. Georg L.K., La Verne B. Camp. Routine nutritional test for the identification of dermatophytes. J. of Bacteriology vol. 74, N.2, 1957, P. 113120.

102. Georg. I,. K. Routine nutritional tests for the idetification of dermatophytes// L.A. Ajcllo, A. Novick/J.Am.Vet. Med.- Vol. 143.-1963.-P.596.

103. Georg L.K. The relation of nutrition to the grouth and morphology of Trichophyton favifonne. Mycologia vol. XLII, N.6, 1950, P. 693-717.

104. Gootzi E.G., Scott W.A. Regulation of cellular activites by leicotriens and other lipoxygenase products of arachidonia acid // J. Allergy Clin. Immunol. 1981. Vol. 784. P. 309.

105. Grappel S.F. Comparative serological reactiwites of twenty seven polysaccarides from nine speciesw of Dermatophytes // Sabouraudia. 1970. P. 116125.

106. Gupta A.K. The use of intraconazole to treat cutaneous fungal infections in children // J. Dermatology. 1999. N. 3. P. 248.

107. Hajek A.E., Butla L., Walsh S.A. // J. Environ. Entomol. 1996. V. 25. P. 709 -721.

108. Hanifin J.N. Immunological reactiviti in dermatophytosis/ L.F. Ray, W.C. Lofits// British J. of Dermatology.- vol 90.- 1974.- № 1.- P. 1.

109. Hasegawa A. Dermatophytes from animals// Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi.- 2000.-41(1).- Books.

110. Hay R.J. Tinea capitis in 1-urope: new perspective on an old problem/ W.Robles, G.Midgley, M.K. Moore//.!. I-ur Acad Dermatol Venereol.- 2001.-vol.45.-P.45-57.

111. Hoerlein JI.B. Studies on Animal Dermatomycoses// Cornell vet.- 1945.-vol.2.- P.214.

112. Kuklova I., I., Kucerova II. Dermatophytoses in Prague, Czech Republic, between 1987and 1998//Mycose.-20() 1 .-44( 1 l-12).-P.493-496.

113. Lapinski H. Badania nad wystepowaniem allergii przy grzybicy skory bydla oraz stosowanie trychofityny w leczeniu I zapobieganiu tej chorobie. Lublin. 1976. P. 175.

114. Mackeusie D.W. Tr. mentagrophytes in mice infections of humans and incidiense laboratory animals//Sabouradia.- 1961.-P. 178-182.

115. Mantovani A., Ajello L., Nazzaro P. Epidemiologis delle mucosi. G. mal. Infect, e parassit., 1975. N. 8. P. 685-691.

116. Mantovani A., Morganti L. Dermatophytes// Veter. Ital.- 1971.- l/№9-10.-P. 460-471.

117. Miller E., Loeffler W., Mikologie/ Grundriss for Natur Wissenschafltler und Mediziner, 1992, Stuttgart-New York: Geord Thieme Verlag. Перевод на русский яз. K.J1. Тарасова, М/. Мир, 1995. - 344 с.

118. Moretti F., Boncio L., Pasquali P. Epidemiological aspects of dermatophyte infections in horses end cattle // J. veter. med. ser. b. 1998. Vol. 45, № 4. P. 204205.

119. Nakamura Y. Dermatomycosis in human and animals// S.Watanabe, A. Hasegawa/Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi.- 1999.- P.40-43.

120. Ока М., Azuma К. Isolation of Trichophyton verrucosum from bovine enzootic dermatomycosis in Japan // J. Animal Health. Japan, 1968, N.2. P. 64-73.

121. Okoahi S., Hasegawa A. Enzootic of bovine ringworm caused by Trichophyton verrucosum in Japan // J. veter. Sc. Japan, 1968, vol. 30, N.5, P. 9396.

122. Odds F. 5th Conference on Candida and Candidiasis, March 1-4, 1999 in Charleston, South Carolina.//Mycology Newsletter. 1999, N.l P.9-14.

123. Perhson B. Vaccination av Kalvar mot ringarm. Svensk Veter. Tidn. 1983. V. 35. N. 15. P. 171-172.

124. Pier A.C. Dermatophytoses due to domestic animals// Rev Med Brux.-2000.-№21 (4).-P.34-37.

125. Rabel G., Taplin D. Dermatophytes, the recognition identification. Florida, 1974. P. 124.

126. Rasmussen H. // Calcium and Cell Function / Ed. W.Y. Cheung. New York: Acad. Press., 1983. V.4. P. 1-61.

127. Ridley M.F. The occurrence of dermatophytes in queensland // Austral. J. Dermatology. 1961. P. 233-236.

128. Sabouraud R., Conant M. The dermatomicoses common to man and animals Brot. // Med. N.7. 1908. P. 1089-1094.

129. Scott D.B. A new variety of Trichophyton verrucosum. Transact of the British mycological society, vol. 67, part 2, 1976, P. 342-344.

130. Sissons J. Superantigenes and infectious disease // Lancet. 1993. T. 8861. P. 1627-1629.

131. Star R. Colony formation in algae // Cell. Interact. Berlin. 1984. P. 261 -282.

132. Takanashi S. An epidemiological, clinical and mycological study of human ringworm due to Trichophyton verrucosum in Japan/ S. Takanashi, J. Macino, G. Fukushi// J. derm.-1975.-№ 1 .-P.3-43.

133. Ultrastructure techniques for microorganisms // Edited by Henri C. Aldrich and Williams I. Todd. Plenum Press. New York and London, 1986.

134. Vozenilkova J., Kubin J. Ekonomicka efektivnost vakcinace proti trichofytoze skotu. Veterinarstvi, 1981. V.31. N.6. P. 259-261.

135. Vobeser G., Mitcham J., Sanders J. Dermatomycosis in mull deer. 1983. V.24. N.10. P. 316-317.

136. Woloszyn S. Бюллетень 3 съезда Польши. Общ. Вет. Наук. Люблин, 1966. 45 с.