Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка способов тестирования антител к VIF белку ВИЧ-1 с использованием рекомбинантного и синтетического антигенов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка способов тестирования антител к VIF белку ВИЧ-1 с использованием рекомбинантного и синтетического антигенов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ ИМЕНИ Д.И.ИВАНОВСКОГО

на правах рукописи

КАРАСЕВА Наталья Геннадьевна

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ТЕСТИРОВАНИЯ АНТИТЕЛ К VIF БЕЛКУ ВПЧ-1 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕКОМБИНАНТНОГО II СИНТЕТИЧЕСКОГО АНТИГЕНОВ

Специальность 03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994 г.

Работа выполнена в лаборатории гешю—инженерных препаратов НИИ вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор мсднщшских наук Р.А.П1БАДУЛИН

старший научный сотрудник Э.В.КАРАМОВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук А.Ф.БОБКОВ доктор медицинских тук. Г.А.ИГНАТБЕВА

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт зпнднмнолопш и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН

Защита состоится * 19 " ошо^^ 1994 г. в "_" часов

на заседания специалшироваГшого совета Д.001.20.01 при НИИ вирусологии нмекн Д.И.Ивановского РАМН по адресу: 123098, Москаа, ул.Гамалеи, 16

С диссертацией »охаю ознакомится в библиотеке НИИ впрусолопш имеии Д-И.Ииановского РАМН.

Автореферат разослан "_"_1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медшцпгаак наук,

старшин научный сотрудник А. М.Жуковский

Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является »тиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита(СПИД) — гяжелого расстройства иммунной системы, сопровождающегося развитием шпортунистаческих инфекций и неопластических образований, неизбежно приводящих : летальному исходу.

В настоящее время в число основных задач медицинской вирусологии входит >азрабопса эффективных подходов, позвалящих диагностировать и прогнозировать инамнку развития заболепания. Одним из аспектов этой проблемы является изучение шмунного ответа к регуляторным белкам ВИЧ-1. Появление или исчезновение антител : неструктурным белкам в сыворотках ВИЧ—инфицированных лиц может иметь ¡начение для прогнозирования развития заболевания. Эта проблема в настоящее время штенсивно исследуется. Детекция антител к VIF-белку, одному из регуляторных белков $ИЧ—1, является одним из направлений подобных исследований. Этот белок интересен ем, что по данным, полученным in vitro, усиливает инфехционность вируса в !екотормзс линиях лимфондных клеток, а таяка лимфоцитах периферической крови. Зтот факт, а тахже наличие открытой рамки считывания vif среди практически всех [ентивирусов животных дает возможность считать VIF—белок существенным для [нфекции in vivo.

Однако, уровень синтеза нативного VIF-беякз s инфицированных клетках райне низок, что делает невозможным использование его в качестве антигена в [ммунологических реакциях. Одним из способов преодоления указанного затруднения вляется получение препаративных количеств данного белка с помощью клонирования сна vif в удобной для экспрессии системе. Реконбинантный VIF—белок может быть [спользсван для скрншшга Н1И-паг.сяштельк5-« человеческих сывороток на [рисутствие VIF-специфических антится.

Целя и задачи,^ исследования. .Основной, целью настоящей работы явилась азработка способов детекции антител к белку VIF, одному из регуляторных белков 1ИЧ-1. '

В связи с этим в задачи исследования входило:

1. Конструирование рекомбинантных . плазмид, содержащих полную оследозательнОсть гена vif ВИЧ-Í, и детерминирующих синтез рекомбинантного елка. . . '

2. Изучение экспрессии гибридных гхлазмид, содержащих ген vif, в бактериях l.coii и дрожжах S.cerevisiae.

3. Определение потенциальных иммуногенных детерминант по амино-кислота последовательности белка VIF ВИЧ—1 и химический синтез пептида, соответствуют выбранной потенциальной иммуногеиной детерминанте. &

4. Получение сывороток животных, используя для иммунизации рекомбинантн белок к синтетический пептид. Исследование реактивности VIF-специфичес сывороток и применение их для анализа рекомбингнтного вирусного антигена.

5. Исследование ВИЧ-позитивных человеческих сывороток на наличие антите VIF-бслку двумя иммунологическими методами тестироваиия(ИФА и иммуноблот использованием рекомбииантного антигена и их сравнительный анализ.

Научная [шзкзкз работ. В результате проведенной работы на основе дрожжев! и бактериального всетороз были получены ргкомбинаншые плазмнды, содержал полную последовательность гена vif под контролем сильного промотора. AHaj экспрессии рекомбинактиой бактериальной плазмнды повслпя установить, что клетках Eccli происходит синтез' гкбрвдного полипептида, N—конец котор! представляет собой аминокислотную посяедэватоп.! »сть балка—носителя, а С—конег аминокислотную пегледоватеяьнот VIF—белка ВИЧ-1. Полученный пол.шеп-способен связываться с антителами к ВИЧ—1. Гибридный белок, ыштсзирующийс; бактериях Ecoîl, состовляст до 15% тотального белка клетки и образует "тей: включения", что значительно упрощает ia выделение и очистку для далькчщ исследований. Исследована Екгпрессия рекомбиншгшой дроязеевой плазмиды некоторые свойства сг поBsfieiroi в клетках S.cerevisias. Определена иммуногет деггермикыгга в С-концесой ч?«Ш \1Р-белка(с 155 по 16S аминокислотный сстатс Изучены иммунологические сисйства рекомбиштткого белка VIF ВИЧ—1.

Практическое значение работы заключается Е Использовании полученн! рекомбинантного VIF—белка дал изучения гуморального иммунного ответа ВИ' инфициросжиых лиц методом кепрлмого ИФА и 1!Ммуноблога.

На ззидату выносятся елгдуювде положения:

1. Анализ зкспрессии полученной рекомбинантной плазмиды YEpVIF в клет! дрожжей S.cerevisiae не выявил продукт вирусного гена ни в цитоплазме клеток, ш культуральной жидкости, вероятно, вследствии либо прочной ассоциации нерастворимой клеточной мембраной дрожжей, либо из—за блокировки экспрессии ге или на стадия транскрипции, или на стадии трансляции.

2. Сконструированная рекомбинантная плазмида pGEX—2TV обеспечивала в ках бактерий E.coli синтез гибридного полипептида, способного взаимодействовать иороткями ВИЧ—инфицированных лиц.

3. В результате компьютерного анализа в С-концевой части VIF—белка ВИЧ-1( — 168 аминокислотные остатки) выявлен потенциально иммуногенный участок, гетический пептид, соответсвующий данному эпитопу, индуцировал образование тел у кроликов, специфически взаимодействующих с рекомбинантным VIF— ом, синтезированным в клетках E.coli.

4. Препараты злектрофоретически чистого рекомбинантного белка V1F при унизации кроликов индуцировали образование еысокого уровня антител, способных ;нфично взаимодействовать с синтетическим пептидом.

5. Разработанные лабораторные варианты иммуноферментного анализа и уноблота на основе полученного рекомбинантного белка позволяют выявить [тела к VIF-белку в исследуемых сыворотках. Показано,' что 23% исследованных [-позитивных человеческих сывороток специфически реагировало с гибридным -белком.

Апробация работы. Результаты работы бьии представлены на юбилейной научно— ггической конференции, посвященной 70 —летлю Института им.Пастера в г.С— :рбурге(1993 г.) и на 2 —ой Мегсдународной конференции "AIDS, cancer and Human viruses" в С—Петербурге (1993 г.)

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора ратуры, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, заключения модов. Объем работы составляет ЮЗ страниц машинописного текста. Полученные льтаты иллюстрированы 4 таблицами и 15 рисунками. Список литературы авляет 81 наименование.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение рекомбмиаитмой плаз.чиды YEpVIF, содержащей полноразмерный reu vifs составе дрожжевого вектора

В качестве источника ДНК ВИЧ—1 была использована плазмида рВНЮ, любезно [остаатеннля доктором R.Gallo , сконструированная на основе вектора pSP64 с -ментом ДИК генома изолята вируса ШВ размером 8926 пар нуклетидов.

ДНК, содержащая полноразмерный ген vif, была получена с помощью гмеразной цепной реакции (ПЦР). Используемые праймеры бьии выбраны таким

образом, чтобы после синтеза ку^допочечного фрагмента ДНК на 5"—конце находил сайт разрезания для рестриеташ ВашШ, а на З'-конца — сайт для ргстриктазгл Hindi

Л

Амплифицирсианная ДНК бита обработана последовательно рестриктазами HindIII Bam HI. Схема конструирования ргкомбинантной плазмиды приставлена на рис.1.

Используемый вектор YEpsecl предназначен для экспрессии и секрет чухероднкх белков в дрожясах Saccharornyces cerevisiae(S.cerevisïae). Вектор YEpse содержит индуцируемый промотор для транскрипции в клетках дрожжей, сигна; терминирования и полиаденилирования, два репликона дм размножения в клетк Escherichia ccli(E.coli) ц S.cerevisiae, сигнал дня секреции чужеродных белкез лидерную последовательность гена дромжеизго токсина Kluyveromyces lact расположенную между сигналами инициации транскрипции и полилинкером.

Плазмида YEpsecl был^тагаке последовательно обработана рестриктазами Hindi и BamHI.

Очищенную ДНК, содержащую геи vií; смешивали с обработанным плазмиднь вектором pGEX—2Т в ссэтнощсшш 2:1 соответственно и якгпрсваян с помощью ДНВ лнгаэы фага Т4 с течении 12 часов при 8° С. В результате трансформации гибридизации in situ быяи отобраны трансформанты, содержащие рекомбинантн) ш;азмиду. Сконструированная плазмида была обозначена как YEpVIF.

П&цчснке ргкод;бнкаатной плазмзди pGE%-2TV, содержащей полиоразмервый rea vif i состаге бактериального ecktojîe

Схема конструирования шазмнды pGEX—2TV представлена на рис.2.

Плазмидз pGEX-2T содержит ИПТГ индуцируемый tac промотер, г glutathione— S-transferasc, последовательность, кодирующую сайт для разрезания сай специфической ивотеазой — тромбином, пелилиякгр, содержавший уникальные сай: рестрикции дая Bam HI, Srnal и EcoRl, и кодоны терминащш трансляции во всех тр рамках считывания.

Вектор pGEX—2Т предназначен для синтеза чужеродных белков в клетках E.coü составе гибридных белкоз, содержат!« на К-конце белок Glutathione—S—transféra (GST) с молекулярной массой 26 kDa. .Рскомбинантный белок, имеющий в caoi составе домен ~ белок GST — можно очистить аффинным способом на глупило; ссфарозг, но белковый продукт должен находиться в растворимом, состоянии и nj этом дожи i а сохраняться биологическая активность GST.

ДНК, содержащая ген vif, бьша получена с помощью ПЦР. При конструирован) новой плазмиды использовались те же ираймгри, что и при получении плазми/

3 -

îpVIF. Фрагмент ДНК был обработан р-тстркктазой Hindi", затем липкий З'-конец и достроен фрагментом Кленка ДНК-цслнмерззы 1 E.coli и обработан рестриктазой >.шН!. Таким образом, была пол учет ДН1С, содержащая ген vif, у которого с 5'-конца водился липкий конец, а 3'—конец был тупым.

Пяазмида pGEX-2T была расщеплена рестриктазой Eco Ell, далее концы :г,зм!щного вектора были достроены до туштх с помощью фрагмента Кленова ДНК-элимерззы 1 E.coli. Полненная плазмида была обработана рестриктазой BamHl.

Очищенную ДНК, содержащую ген vif, смешивали с обработанным плазмидным :кгоро?,< pGEX—2Т в соотношении 2:1 соотсетстсенно и лигировали с помощью ДНК— «газы фггз' Т4 а течении 12 насоз при S° С. В результате трансформации и ?бр:1дн:зцш! in situ были отобраны трансформанты содержащие рекомбинантную лазмцду. Сконструированная плазмида била обозначена — pGEX—2TV.

Изучгкве зкссргссиа ре:;омбк:«а'таой слззмидм YEpVÎF к клетках S.cesevisiaa

Анализ экспрессии вирусного гена в клетках дрожжей проводили ■ методом лектрофсреткческош разделения в 10% ДСН-ПААГ, методом иммуноблота и методом 1ФА с использованием полученными нами VIF—специфическими сыворотками :ролякоз к синтетическому пептиду и рекомбинактному VIF—белку, синтезированному ; клетках E.coli. 3 наших исследованиях мы не обнаружили специфического сигнала, ■казыгающего на секрецию VIF-беякз s иуяьтурзвьную жидкость или m наличие этого ¡елка в цитоплазме дрогжевых клеток.

Для определения причин отсутствия продукта вирусного гена были исследованы лабильность наследования рекомбинактцой йдазмиды, так как дрожжи во время ждукцин Еыращивали на полной питательной среде, и возможность структурных перестроек в рекомбшштюй плазмиде. Однако, анализ показал, что 70% клеток после £0 генераций на неселективной среде сохраняют рекомбинантную плазмнду, а :труктурные перестройки по типу делеций или вставок ке имели места.

В результате были выдвинуты два предположения. Синтез VIF-белка бьш зеуществлен, но компартментализация рекомбинантнош полипептида в мембран — ассоциированной фракции не позволила нам его обнаружить. Существование VIF— беякз в ВИЧ—инфицированных клетках в мембран—ассоциированной форме дела юг гакое предположение вполне возможным. Другое объяснение экспериментальным фактам заключается в тем, что экспрессия вирусного гена была блокирована либо на этапе транскрипции, либо на этапе трансляции.

vif

рис.1. Схема конструирования ргко.мбикантной плазмиды YEpVlF

Изучение экспрессии рекомбнваятиой плазмиды pGEX—2TV & клетках Е.соУ Рехомбинантная плазмида pGEX—2TV я клетках E.coli детерминирует синтез ¡ридкого белка, содержащего на N-ксчце белок Ghitathion-S-Transferase, а на С— ■ще — потную последовательность белка VIF ВИЧ—1. Лизат трансформированных ток исследовался в 10% ПААГ с ДСН. На полиакрнламидно* геле среди полос, яветствующих бактериальным белкам, мы наблюдали появление новой мажорной тосы около 46 kDa, что соответствует ожидаемому размеру гибридного белка(рис.З).

Наличие вирус—специфических последовательностей в составе гибридного белка но подтверждено методом иммуноблота с использованием сывороток крови Минированных ВИЧ—1 пациентов.

Была'исследована кинетика роста трансформированных бактерий и кинетика ггеза гибридного белка в расчете на одну клетку. Максимальное количество :омбингнтного белка на клетку синтезировалось через три часа после 1укции(рис.З). Концентрации» клеток определяли спектрофотометрическим методом. !ТГ добавляли к растущим клеткам при оптической плотности (550нм) равной 0,5. хсимальной концентрации в куяьтураяьной жидкости клетки достигали только через асов после начала индукции. Исходя из этого, для получения максимального выхода !дукга бактериальные клетки выращивали в течении 5 часов после добавления ИПТГ.

Исследование растворимости гябрвдяого белка, сиатезнруемоп» в клетках E.coü Гибридный белок был обнаружен в нерастворимой мембранной фракции точного лизата бактериальных клеток. Попытки растворения рекомбинантного [ипеггшда в мягких денатурирующих условиях не дали положительного результата. В овиях сверхскнтезз " в клетках Е.соИ- гибридные белки часто формируют так ьгеаемыв "тельца включения", в которых накапливается в нерастворимой форме :овная масса белкового продукта. Тек ка:-: полученная нами «екно-инженерная ютрукция обеспечивала высокий уровень синтеза гибридного белка, представляло срес выяс:шть не формирует ли рекомбинантный полкпептид аналогичные азования. С этой целью мы провели анализ клеток бактерий, продуцирующих омбинаташй белок, с помощью методов алектрошгсй микроскопии. Эта часть оты была проведена сопмгстно со ст.н.с.НИИ вирусологии имДИ.Изановского ¡ошниковым Ю.П. При ксеяздокчаш ультрзтошсих срезов бактериальных клеток, [«формированных pGEX~2TV, были обнаружены внутри клеток плотные гпактиые структуры по типу "телец включения", которые мы не -наблюдали в тролг. При анализа лиззтоз этих клеток методами

s

vif

рис.2. Схема конструирова:

нактной плазмиды pGEX-2TV

ко

Г-*—

67

43

Р

•■■-••чт- -"{.у -«3

юиуноцитохнмии с помощью антипепткдной лворотки были зарегистрированы скопления :реп коллоидного зелота в районе этих SpaioKuaift, что дало нам возможность редпатахапъ о присутствии основной массы жомбинглтного белка в нерасткоримсй форме D ¡где "телец шоночешт".

Тот факт; что VIF накашивался о клетках в !{дс "телец Егаочмпй", погголгл чгелгпш чистить гиСридньгй безо::, кг гепояьзуя «амяп ргцедуры, методом . никссскоростнога .яприфупгроваши. •

Паяучеякз r&ct антител к Сглку VIS?

t с no?,?oütU3 рснолСшгаптсого гз.тгтпептпд*!

Сагаотиекив кммукогиш разного .роксхоглеюи (иааггеского к

кагсхкодатчесжсго) * :а;с;ат рззпне ;реимущгств,г. Тг:: тгепркмег», пептид дмт огно?.з!осгь получить

иссротку, я ргкомйагатгьй! бсяок позволяет гапучкхь пазаеюналтуп шперотку, содерггкуэ (ул антит-л к parnro:it4 згогггггг:,: r.coigsycuoro ¡глет.' Кро.'.о того, каигпгв дсук пкяшгсикз голучгниых «.короток пазсачзет ссутасгоять ¡зззолшй сфаюппггссй. гогггх'0-'^»-

В кггестг.г гапго-тгакгеяето иппгягз ?.п: хпальзеваш палуккний кзми рксокбшанпшЛ VIF-Cesc::, синтезируемый в клетках •.coli.

Так как прэдваргггсаыа» опыты по «имушгезцнл праяшззз показали, что "тельца яотачения", в которых и-ааашкгсгся осиопшя iicsca рекя,'Л!шантного VIF—белка, не вызывает индукции спецнфячееия ли г игл, бьга пркготеаяеи другой препарат ¡ыеохоочищкшого дензтурнрезанкого ргкпмбивагпшго VIF-йелка, полученного в >езультате препаративного злекгрофорстичеекего разд«тения в аггразком геле. После 1рсвея;г{кой иммунизации кроликов полученную сыворопгху мы исслвдовали а тесте

г г .3 4. а

СННТС3.1

pjfs.3. Ютпггкэ п:5п;стога белка 1 деролка — маркеры козекуггрцих мзег; 2 . - белки тт-!;сфо7Лг.1позак1ПЛс баетернй до нгд-кцлг; 3,4,5, - белки тржсфс'зз.згроззшак бактерий чгрез 1, 2, 3 чг.са поете начала гаиуккни._

иммуъ облога и обнаружили специфические антитела к рекомбинантному белку и к белкугносителю, GST. Для определения титра антител, которые взаимодействуют с С— концевой областью гибридного белка, представляющей полную аминокислотную последовательность VIF, кроличья сыворотка была исследована иммуно-ферментным анализом. Антитела, взаимодействующие с белком GST, были выведены из реакции в результате предварительной инкубации сыворотки с лизатом клеток, содержащим GST. Титр антител, специфически взаимодействующих с вирусспецифнческой последовательностью гибридного белка, составлял 1:25600. Антирекомбинантная сыворотка была исследована методом ИФА на взаимодействие с пептидом. Титр . антител, специфически реагирующих с пептидом, составлял 1:400, т.е. был значительно шоке по сравнению с титром антител против рскомбинантного антигена.

Получение поликлоиальиых антител к белку VIF ВИЧ-I с помощью синтетического пептида

Использование коротких пептидов в качестве иммуногеков основано на том, что образованные к ним антитела могут взаимодействовать с рекомбннантными и/или природными белками, аминокислотная последовательность которых содержит участок, соответствующий пептиду.

При выборе участка аминокислотной последовательности белка VIF как потенциальной ' иммуиогениой детерминанты были • исследованы гидрофильно— гидрофобный профиль первичной структуры белка V1F с помощью программы "Prosis" и локализация потенциальных бета-поворотов с помощью пакета программ "PC GENE". В результате исследования была выбрана область с 155 по 168 аминокислотных остатков первичной структуры белка VIF как потенциальная иммуногенная детерминанта: TPKKIKPPLPSVTK.

Синтез пептида, соответствующего аминокислотной последовательности выбранного эпнтопа, был осуществлен твердофазным методом на автоматическом синтезаторе "ExeelT(CIIIA).

Для. получения высокотшражной сыворотки к небольшому пептиду его коныогировали с белком—носителем. Из набора широко известных белков-носителей был шбракы два: бычий сывороточный альбумин и сталбкячнй анатоксин. Синтез пептида п конъюгация его на белок-носитель были просолены под руководством стл.с.НИИ вирусологии имД.И.Иваков с кого Ссмилстова Ю.А. Результаты тестирования ИФА антипелтидних сывороток не выявили разшщы в уровне

специфических антител в зависимости от белка-носителя. Титр антител к пептиду составлял 1:12800.

Взаимодействие антипептидной сыворотки с рекомбинантным белком было исследовано методами иммуноблота и ИФА. Реакцию иммуноблота проводили с использованием двух рекомбинантных VIF белков, сиитезировзнных в клетках Е.соН. Наряду с вышеописанным рекомбинантным белком был использован рекомбинантный псшипептид, любезно предоставленный к.б.н.3ееревьгм С.Я.. Этот б елок также является гибридным и содержит аминокислотные последовательности Д-галакгозидазы и VIF— белка. Реакция иммуноблота показала специфическое взаимодействие полученной сыворотки кролика с обоими гибридными балками и отсутствие взаимодействия с белками р— галактозидазой и GST, Титр антител антипептидной . сыворотки к рекомбинаятному VIF-белку,- определенный методом' ИФА, - составил 1:12800, что совпадает с титром антител данной сыворотки к пептиду.

Детекция аитител к VIF-белку в сыворотках крови пациентов, ииф^цировациюс ВИЧ—I

В качестве антигена в иммунологическюс реакциях был использован полученный нами рекомбинантный белок. Для оптимизации условий проведения иммунологических исследований по детекции антител к VTF-бглку в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных лиц были использованы полученные VIF—специфические сыворотки кроликов.

Детекция антител к VIF-белку методом иммуяоферментного анализа

В эксперименте анализировали две панели сывороток 13 сывороток контрольной группы были получены от здоровых доноров, 61 сыворотка опытной группы - от ВИЧ-инфицированных лиц, находящихся на разных стадиях заболевания. Выбор ВИЧ-негативных и ВИЧ—позитивных инфицированных лиц осуществлялся случайным образом.

Количественные измерения проводили с использованием лишь единичного разведения сыворотки. Каждому образцу ВИЧ—отрицательной или ВИЧ-положительной сыворотки было поставлено в соответствие значение оптической плотности.

Для определения величины порогового уров!Ш, или cut off, позволяющей надежно различать сигналы," соответствующие отрицательным н положи тельным образцам сыворотки, в подобранных стандартных условиях тестировали набор пргшоагоз ВИЧ-отрицательных сывороток.

" Г 2 5 H. 5 8 9 1ù и 11 15 M №

риг.4. Анализ ВИЯ-позитивных сывороток на присутствие антител к VIF-белку методом иммуноблота.

1 стрип был обработан ВИЧ-негативной сывороткой; 2—15 стрипы были обработаны ВИЧ-позитивными сыворотками. Стрелками указаны положения гибридного VIF— бежа и белка—носителя GST.

Довольно часто распределение значений оптических плотностей, полученных методом ИФА, описывается нормальным законом. Однако, в нашем случае на основании гистограммы частот встречаемости оптических величин для отрицательных сывороток был сделан вывод, что распределение оптических плотностей наиболее близко соответствует экспоненциальному закону. Применение критерия согласия Колмогорова—Смирнова подтвердило наше предположение с вероятностью правильного прогноза равным 0,95.

Пороговый уровень, или cut off, был рассчитан, исходя из вероятности равной 0,99. Таким образом, анализируемые сыворотки, имеющие оптические значения меньше cut off, с Еероятностыо равной 0,99 не имеют антител к VIF-белку. Однако, о сыворотках, имеющих оптические значения больших cut off, мы не можем говорить как о пояожз¡тельных, так как неизвестна функция распределения оптических плотностей для "УШ-позитивных сывороток.

Для выявления положительной сыворотки требовался дополнительный контроль. Так как значение оптической плотности является суммарным сигналом взаимодействия сыворотки с рехомбннантным белком и бактериальными примесями, необходимо было оценить долю сигнала, которая являлась результатом взаимодействия бактериальных белков и исследуемой сыворотки. Для каздей сыворотки была поставлена контрольная реакция на взаимодействие только с бактериальными белками. Если сигнал в опыте превышал сигнал в контроле в 2,1 и более раза, то соответствующую сыворотку считали положительной. Среда анализированных сывороток только 3% имели сигналы, лежащие » области значений большей cut off и превышающие ко;лрольный сигнал более, чем 2,1 рчза. Сыворотки, имеющие значения оптической плотности большие, чем cut off, но не превышающие сигнал в контроле считались сомнительными. Очевидно, что используя вышеописанные контроли, все VTr-положительные сыворотки не могли быть выявлены с помощью метода ИФА. Например,. в случае высокого титра антител к бактертгальным белкам и небольшого титра антител к VIF-белку контрольный сигнал в ИФА будет настолько велик, что опытный, исходя из наших требований, нельзя рассматривать как положительный.

Детекция аятител к VIF—белку методом иммупсЗлотз и сравнительный анализ примененных

. методов

Те же сыворотки, которые исследовались в ИФА, 6к-и анализированы методом иммуноблота. Методика проведения опыта была стандартной. Используя метод иммуноблота, было установлено, что 23% из рассмотренных сывороток являются позитивными, а 18% — слабо позитивными или сомнительными. Типичный эксперимент анализа БИЧ—позитивных сывороток на присутствие антител*к VIF-белку представлен на рис.4.

При сравнении использованных методов необходимо отметить, что все гыворотки, вычаленные, как VIF-положительные, методом ИФА, были подтверждены методом иммуноблота. А также: все сыворотки, оказавшиеся отрицательными в ИФА, Зыли отрицательными и при анализе иммуноблогом, т.е. те сыворотки, которые были

определены с помощью критерия cut off, как не содержащие антител к VIF-белку, были VIF—отрицательными при исследовании методом иммуноблота.

о

Таблица 1. Сравнительный анализ результатов исследования на наличие антител к VIF-белку в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных лиц

\ИФА ИБ полож. сомн. отриц. ИТОГО

полож. 2 12 0 14

COMM. 0 5 6 11

отриц. 0 >22 14 36

ИТОГО 2 39 20

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов было осуществлено конструирование рекомбинантных плаэмид YEpVIF к pGEX—2TV, содержащих полноразмерный ген vif ВИЧ—1. В дрожжах, содержащих рекомбинантиую плазмиду, продута вирусного гена не был обнаружен ни в.культуральной среде, ни в цитоплазме клеток. Этот факт связан, по-видимому, либо с тем, что синтезированный рекомбинантный белок ассоциирован с мембранной фракцией, либо с тем, что экспрессия вирусного гена была блокирована или на стадии транскрипции, или на стадии трансляции.

Для плазмиды pGEX—2TV была показана способность обеспечивать синтез гибридного белка в бактериальных клетках. Полипептид накапливался в клетках в виде нерастворимых "телец включения", что позволило нам частично очистить рекомбинантный VIF от бактериальных белков, не используя сложные процедуры.

С помощью компьютерных программ была проанализирована аминокислотная последовательность VIF—белка и определен участок потенциальной иммуногенной детерминанты. Пептид, соответсвующий данному аминокислотному участку, был

синтезирован твердофазным методом, а дня иммунизации кроликов его конъюгировали на белок—носитель. Подученная антилептидная сыворотка специфически взаимодействовала с рекомбинантным VIF—белком.

VIF-белок, синтезированный в клетках E.coli, был также использован для получения поликлональной сыворотки. Гибридный белок был очищеяг от примесей и применен для иммунизации кроликов. Полученная антирекомбиизитиая сыворотка взаимодействовала с синтезированным пептидом.

VIF-специфическне сыворотки животных были нспользозакм для определения локализации рекомбинантного белка в бактериальных клетках, для изучен: 1Я экспрессии вирусного гена в клетках дрожжей и для оптимизации условий иммунологических исследований ВИЧ-позитнвпых человеческих сшоротох.

С помощью рекомбинантного палипелтида была проанализирована панель сывороток крови ВИЧ-инфвдкрованяых пациентов методами иммуноблота и ИФА. Метод иммуноблота проводили стандартным способом, среда исследованных образцов им было выявлено 23% \7Р~лознт:цшых сыророток, что совпадает с данными литературы. Результаты ЙФА были обработаны с использованием методов математической статистики. Как VIF-позитнвные при пр!шенении вышеописанных критериев методом ИФА было выявлено 3% сывороток. Использование метода иммуноблота позволяет добиться наиболее точной диагностики. Однако, этот метод довольно трудоемкий. ИФА уступает в специфичности методу иммуноблота, но позволяет с помощь» критерия cut off быстро определить VIF-негатавные сыворотки, а также выявить позитивные сыворотки, содержащие высокий титр антител к VIF белку и небольший титр неслецифтгских антител, с возможностью последующего количественного анализа таких сывороток.

В Ы В О Л ы

1. На основе дрожжевого двурепликонного секретирующего вектора YEpsecl сконструирована плазмида YEpVIF, содержащая полную последовательность vif-гена ВИЧ-1 под контролем сильного промотора. Рекомбинантная плазмида стабильно таследовалясь клетками S.cerevisiae, не подвергаясь структурным изменениям, однако, 1родукт вирусного гена в клетках дрожжей не обнаруживался.

2. Сконструирована рекомбинантная плазмида pGEX—2TV, обеспечивавшая о щетках E.coli эффективный синтез гибридного подипептвда, содержащего полную юследоЕательность VIF-белка ВИЧ-1. Рекомбинантный полипептид составлял до 15%

общего белка клетки и накапливался в вице "телец включения", что позволило получа: частично очищенный гибридный белок с помощью несложных процедур.

3. В результате компьютерного анализа в С-концевоД части VIF ВЙЧ—1( 155 168 аминокислотные остаток) выявлен потенциально иммуногенный участо Поликлональиая сыворотка кролика к синтетическомупептиду, гомологичному данное эпнтопу, специфически взаимодействовала с рекомбмнантным VIF—белки синтезированным в клетках Ecoli.

4. Препараты злектрофоретическн чистого рехомбияантногс белка VIF пр иммунизации кроликов индуцировали образование высокого уровня антитез, способнг специфично взаимодействовать с синтетическим пептидом. ;

5. На основе полученного рехомбингягаого белка. разработаны лабораторнь варианты иммунофсрменткс-го анализа и иммуноблота для детсад: :п ыгягтел к VIF белку ВИЧ—1. Показано, что 23% исследованных ВИЧ-позитивных человеческ сывороток специфически реагировало с гибридным VIF-бмком.

Сокссг кгучямх трудов со теме днсссртащш:

1. Н.Г.Карасева, РА-Гибадулин, О.И.Кисеяев, Э.В.Карамов "Экспрессия генй ■ вируса иммунодефицита человека типа 1 в клетках Escherichia coli и исследован* иммунореактивности VIF—бслка"//Матскулярная генетика, микробиология вирусология, 1593, N5.

2. Карасева Н.Г., Семилетов ЮЛ., Гибадулин Р.А., Карамов Э.В., Шибнев В./ "Изучение взаимодействия рекомбинанткого VIF—белка ВИЧ—1 и синтетическ пептидов с run ер иммунными сыворотками загвотцых и с ВИЧ—позитивным человеческими сыворотками"// Сборник материалов юбилейной научно-практическо конференции, посвященной 70-лгпко Института им.Пгстера, С—Петербург, 25—27 ма

-1993 г. ' Л''".'

3. Karaseva N.G., Semiletov YoA., Gibadulin R.A., Shibnev V. A., Karamov E.V. "П main outlines to the HIV-l VIF-antigene. definition, using antiserum to synthet: peptides//Abstracts of 2nd International Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses St-Peteifcurg, November 29 - December 3, 1993.