Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка способов получения гаплоидов и дигаплоидов сахарной свеклы как исходного материала для селекционного процесса

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Разработка способов получения гаплоидов и дигаплоидов сахарной свеклы как исходного материала для селекционного процесса"

р'З С : УКРАЇНСЬКА. АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК , ІНСТИТУТ ЦУКРОВИХ БУРЯКІВ

На правах рукопису

РЯБОВОЛ Людмила Олегівн»

ущ 633.63:581.143.6

РОЗРОБКА СПОСОБІВ (ДЕРКАННЯ ГАПЛОЇДІВ І гаГАШІОШВ ЦУКРОВОГО БУРЯКА, Я]{ ВИХІДНОГО МАТЕРІАЛУ ДЛЯ СЕЛЕКЦІЙНОГО ПРОЦЕСУ

Спеціальність 06.01.05 - селекція і нас інництво

Автореферат дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата сільськогосподарських наук

Київ - 1994

Дисертаційна робота виконана в Інституті цукрових буряків

У ЛАН на протязі І99І-І993 рр.

Науковий керівник Парій Федір Микитович

канд. біол. наук

Офіційні опоненти Балков Іван Якович

доктор біол. наук,

професор

Редько Віра Іванівна канд. біол.-наук

Провідна установа - Інститут фізіології рослин і . генетики АН України

Захист відбудеться "21" л ют о г,о 1994 р, на засіданні спеціалізованої ради Д. 020.51.01 при Інституті цукрових буряків УААН за адресою: 252110, ДСП, Київ-ІІО, вул. Клі-' нічна, 25, Інститут цукрових буряків УААН.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту цукрових буряків.

Автсрєфераг розісланий " ПО " с/ ~г~НЯ______________ 1994 р.

Вчений секретар

спеціалізованої ради, _ Балан

доктор с.-г. наук,професор о(Л<с^ -Василь Миколайович

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одна із найважливіших проблем селекційно-генетичних досліджень буряка е використання гетерозисам Найбільш ефективним у відношенні одержання константних ліній є метод експериментальної гаплоїдії. За допомогою гаплоїдії із збагаченого в генетичному відношенні гібридного матеріалу можна одержувати гомозиготний, тобто чистолінійний селекційний' матеріал, виключаючи при цьому багаторазове самоопилення. Інтерес до явища гаплоїдії все більше зростав, особливо в останній час, коли з особливою гострото» постало питання скоро чення строків виведення нових гібридів. Керування явищем гаплоїдії відкриває привабливі перспективи не тільки для удоско-иалення існуючих, але й розробки нових шляхів і методів селекції.

Основна причина, яка перешкоджав широкому використанню гаплоїдних рослин, пов'язала з труднощами в одержанні їх у достатній кількості для ведення селекції.

При використанні найбільш пояиреного метода одержання гаплоїдних структур, культури in vitro ізольованих насіннєвих зачатків, процентний вихід гаплоїдів досягав в середньому 2-4 й (Белоус В.Б., Ильенко И.И., Редько В.И. и др., 1988).

В зв’язку з цим гостро стоїть питання збільпення виходу гаплоїдних рослин шляхом стимулювання гаплоїдії. Складним залишається процес диплоїдкзації гаплоїдного матеріалу для одержання гомозиготних ліній цукрового буряка.

Мета досліджень, lb тою наших досліджень, було вирішення ' питань, пов’язаних з розробкою ефективних способів підвищення виходу рослин з гаплоїдним набором хромосом і одержання дига-плоїдних матеріалів цукрового буряка. .

Задачі досліджень: •

- підібрати оптимальне модифіковане поживне середовище для одержання гаплоїдів цукрового буряка;

- розробити способи, які гі дозволяли збільшувати вихід гаплоїдних структур шляхом об’єднання культуральних методів і прийомів стимулювання гаплоїдії;

- розробити методи виділення днгаплоїдів за допомогою уведення маркерних генів в генотип рослини-донора насіннєвих зачатків;

- вивчити вплив рівня геному донорних рослин на вихід

(макроструктур при культивуванні ізольованих насіннєвих зачатків в культурі in vitro; .

- визначити умови прямої регенерації рослин, які б забез-

печували одержання необхідної для селекційного процесу кількості експериментального матеріалу; .

- сформувати послідовну технологічну схему отримання гомозиготних штеріалів буряків.

Новизна і практичне значення роботи. В процесі досліджень підібрано оптимально модифіковане поживне середовище, яке забезпечує максимальний вихід гаплоїдних структур цукрового буряка. •

Розроблено спосіб одержання гаплоїдів, використання якого дозволяє підвищити вихід гаплоїдних рослин до 16,2 %. Встановлено найбільш ефективний період виділення ізольованій насіннєвих зачатків для уведення в культуру in vitro - 7-9 день після відкриття квітки. Показано, що запилення рослини-донора насіннєвих зачатків опроміненим пилком столового буряка сприяє • підвищєнш виходу гаплоїдних рослин до 9,2 %. . '

Встановлено явище виникнення спонтанно дипло їдиз осаних рослин цукрового буряка.

Розроблено принципи використання шркерних генів для виділення гаплоїдних і спонтанно диплоїдизованих рослин. Розроблено способи відбору гаплоїдів і дигапяоїдів при використанні донор-ного матеріалу, гетерозиготного за маркерними генами. Підібрано маркерний ген для створення вихідного ттеріалу з метою візуального відділення гаплоїдів і дигаплоїдів від диплоїдних рослин (ген забарвлення гіпокотилю Е ). Показано, що рослини з білим гілокотилем і диплоїдним набором хромосом (генотип гг ) - це спонтанно дїіплоїдизовані гаплоїди (дигаплоїди). При використанні цього способу ввділяють гомозиготний матеріал, який раніше при застосуванні цитологічних методів досліджень бракувався, як матеріал, одержаний з диплоїдної материнської тканини.

Встановлено, що при культивуванні в ідентичних умовах не-запліднених насіннєвих зачатків різних по плоїдності форм

iS

цукрового буряка, вихід, ріст і розвиток вище і інтенсивніше у проростків, одержаних на основі тетраплоїдної форми.

. Підібрано оптимальне модифіковане пониене середовище,екс-плант, умови культивування для прямої регенерації рослин цукрового буряка, минаючи стадію калусоутворення, з метою одержання необхідної кількості гаплоїдного, спонтанно диплоїдизовано-го и деполіпяоїдизованого матеріалу.

Розроблено загальну технологічну схему одержання гошззиго-тних ліній цукрового буряка. .

На захист виносяться слідуючі положення.

1. Стимулювання гаплоідії шляхом виділення насіннєвих зачатків у період цвітіння, а також запилення рослини-донора оп-.роміненим пилком дозволяє підвищити вихід гаплоїдних структур цукрового буряка з незаплідненйх насіннєвих зачатків у культурі in vitro.

2. Використання гетерозиготного за маркерними генами донори ого г.зтерішіу буряка доззоляа візуально виділяти гаплоїди і відокремлювати дигагноїдні рослиш, одержані в процесі спонтан- ' ної диплоїдизації гаплоїдних клітин, від диплоїдних, 40 регенерували з клітин донорної гатеринської тканини.

3. Розроблені ктт їлодкфіковані середовища е ефективними для одзртяння гаплоїдних і дигаплоїдних рослин цукрового буряка з нсзаплідненізс насіннєвих зачатків і розіаочення рослин за катодом пряі.юї регенерації.

Апробація роботи і публікація результатів досліджень. Основні положення дисертації доповідались на науково-практичнії? конференції молодих вчених і спеціалістів Українського науково-дослідного інституту землеробства "Вклад молодых ученых в интенсификация сельского хозяйства УССР" (Київ, 1991), на УІ з’їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М. І. Вавілова (Полтава, 1391), ка конференції молодих вчених Інституту фізіології, рослин і генетики АН України "Актуальные проблеш физиологии растений и генетики" (ІЬиїв, 1992), на Йіжнародноцу симпозіумі генетиків і селекціонерів "Управление генетической изменчивостью сельскохозяйственных растений" (Ялта, 1992), на

УІ з * їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М,І. Вавілова (Нінськ, 1992).

Результати досліджень доповідались на засіданні науково-матодичної Ради по селекції і насінництву Інституту цукрових буряків УААН.

За матеріалами дисертації опубліковано 6 тез доповідей»

І стаття, подано заявку на винахід.

Структура і об’єм роботи. Дисертація викладена на 137 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, б глав, заключения, висновків і пропозицій, списка основної використаної літератури, додатка. Робота включає 20 таблиць, 2 схеми,

21 рисунок. Список літератури містить 206 найменувань, у тому числі 127 іноземних авторів. '

УШВИ І МЕТОДИ ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛШЕИЬ

Дослідження за даного темоп проводились в І99І-І993 pp. в лабораторії генетики і цитології Інституту цукрових буряків УААН і в лабораторії культури тканини Центральної селекційно-генетичної станції ІЦБ (Черкаська обл. м. Умань). Штеріали для дослідів вирощували на дослідних ділянках в селекційно-тепличному комплексі ЦСГС та Білоцерківської дослідно-селекційної станції (Київська обл. с. Вільшанка).

Для отримання гаплоїдів, дигаплоїдів і деполішіоїдизованих диплоїдів цукрового буряка в наших дослідженнях використовувався метод культури in vitro ізольованих незапліднених насіннєвих зачатків. В дослідах використовували середовище, в основу поживного субстрату якого входили макро- і мікроелементи за прописом середовища Мурасіга і Скуга ( Muraohige T-.Slcoog F.J962) при додаванні різних концентрацій і співвідношень цитокінинів і ауксинів.

Для підвищення виходу гаплоїдних рослин поряд з культура-льними методами використовували прийоми стимулювання гаплоїдії:

- вилучення насіннєвого зачатка після розкриття бутону (до

12 днів); "

- запилення рослини-донора опроміненим пилком столового буряка. Доза опромінення пилку (100 Кр) летальна для даного виду рослин. Опромінення проводили в Інституті фізики АН України.

Підготовлений матеріал використовувався для взяття насіннєвих зачатків, які уводили в культуру in vitro для одержання

гаплоїдних структур.

З метоп вилучення гомозиготного матеріалу, одержаного при спонтанній диплоїдизації гаплоїдних клітин, насіннєві зачатки виділяли з рослин, гетерозиготних за геном к (забарвлення гі-покотшш),і серед шкроструктур за ьаркерними ознаками знаходили дигаплоїдні рослини.

Для одержання деполіллоїднзованих диплоїдів і проведення порівняльної характеристики виходу гаплоїдів та деполіплоїдизо-ваних диплоїдів, їх росту та розвитку також використовувався нетод культури тканин ізольованих насіннєвих зачатків.

Плоїдність сформованих структур визначали за допомогою цитологічного методу досліджень, розробленого в лабораторії генетики і цитології ІЦБ (Литвиненко И.И., Ворохов В.П., Кирсанова Ю. В. , 1969). ■, ’ •

Лля одержання в культурі in vitro необхідної кількості рослш для селекційного процесу були закладені експерименти по розробці кодифікованого поживного серодовшца, підбору екс-планту, умов культивування для прямої регенерації рослин цук-ропого буряка. '

ІІатематичну обробку даних проводили на персональній ЕОМ э використанням пакета програм СХСТаТ. .

Вихідний матеріал. Об’єктом досліджень для отримання гаплоїдів цукрового буряка були гібридні рослини після складної гібридизації. Гаплоїди і дигаплоїди, одержані з цих рослин, представляоть значний селекційний інтерес, так як компоненти цих гібридних ко!4бінаціа є матеріали, 40 широко використовуються а селекції.

В методичній дослідах щодо вивчення стиілуліяції гаплоі’дії і виділення спонтанно диплоїднз осаних гаплоїдів використовувалась чоловіча стерильна фор:.п цукрового буряка, гетерозиготна за геном Е (Ш 1628 Hr ).

Експерименти по одер-мніш деполіплоїдизованих'диплоїдів проводили з різноган ітннші тетраплоїднима фсрмаки цукрового . буряка, частина з яких була стіЯков до збудника церкоспорозу.

Всього з роботі використовувалось 10 селекційних но?,;зрів.

З котлого с*ленціі1ного номері брали від 3 до 5 рослин і з дочко! рослини ;,'3їеріал для уведення в культуру in vitro брали тричі. Експерименти проводили у'три строки: І) лптий-борелель

1991 р.; 2) лилень-серпень 1991 р.; 3) лютий-квітень 1992 р. Таким чином, кожний селекційний номер був представлений в наших дослідах від 9 до 15 генотипами в трьохкратній повторності. Досліди прямої регенерації рослин проводили в 1992-1993 рр.

- -результати досддашь

Підбір поживного модифікованого середовища для культивування незапліднених насіннєвих зачатків. В наших дослідах для одержання гаплоїдних рослин цукрового буряка незапліднені-насіннєві зачатки висаджували на різні варіанти поживних середовищ. Основу почсивного субстрату складали макро- і мікроелементи за прописами середовища %расіга.і Скула (ГигазМйе ач, бісооє р., 1962). Варіанти середовищ відрізнялись за присутністю в них 6-бензиламінопуріна і 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти (табл. 1).

• Таблиця І

Вплив 6-бензиламінопуріну на розвиток

насіннєвих зачатків

Варіанти досліду Кількість Кількість одержаних.структур

висадае-них насінь Всього Калус Проростки

нєвих за- ' чатків,тат.| шт. % шт. % шт. %

І мс + ■ 0,5мг/л 6-БАП 0,1 мг/л 2,4-Д 630 ' 65 10,3 60 9,5 5 0,8

ПЮ + І мг/л б-БАП 0,1 мг/л 2,4-Д 540 14 2,6** 6 1,1 8 1,5**

Ш «С + 1,5 мг/л б-БАП 0,1 мг/л 2,4-Д 1026 ■ 14 і,4** _ _ 14 1,4их

хх Достовірно при Р = 0,01.

В процесі експерименту було встановлено, що збільшення концентрації цитокінина в середовищі від 0,5 мг/л до І. мг/л збільшує вихід проростків, але зменшує вихід калусної маси (табл. І, рис. І,а; 2,а).

Більш високі концентрації б-БАП інгібують процес органогенезу. Робочим діапазоном концентрації цитокінина, ідо стиму-лвє розвиток насіннєвих зачатків у проростків, служить діапазон 0,5-1 мг/л. За даними концентраціями ростактивуючої речовини в середовищі вихід проростків збільшується від 0,8 до 1,5$. Більш низькі концентрації б-БАП істотно не впливають на формування і розвиток макроструктур.

Вплив ауксину на формування проростків негативний. Присутність у поживному субстраті 2,4-Д в діапазоні концентрація ,

0,1-1 мг/л стимулює калусогенез, а вихід проростків знижується ' до 0 (табл. 2, рис. 1,6; 2,6). .

Таблиця 2

Вплив 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти на розвиток насіннєвих зачатків

Варіанти досліду Кількість висадже- Кількість одержаних структур

них насіннєвих Всього ІСалус Проростки

зачатків, шт. шт. % шт. % шт. %

І ИЗ+ - ' 0,5 мг/л 6-БАП 0,1 мг/л 2,4-Д 1716 182 10,6 167 9,7 15 0,9

п ?<с+ 0,5 мг/л б-БАП 0,5 мг/л 2,4-Д 1629 433 26,6*“ 430 26,4** 3 0,2**

ш ш+ 0,5 мг/л 6-БАП 1,0 мг/л 2,4-Д 2079 916 и, ІШ£ 916 4-1,1** - -

Достовірно при Р=0,0І.

в

Рис. І. Вихід проростків (У), одержаних в процесі культивування незапліднених насіннєвих зачатків цукрового бурят на позивному _ середовищі, в залежності від концентрації Ш мг/л в середовищі ростактивугачої речовини:6—БАЛ (а) і 2,4-Д (б)

•Рис. 2. Процентний вихід калуса (У), одержаного в процесі культивування незапліднених насіннєвих зачатків цукрового буряка на поживному середовищі при різних концентраціях (X) мг/л цитокінина б-ВАП (а) і ауксина 2,3-Д (б) -

Таким чином, проведений нами аналіз показав, що для індукції розвитку насіннєвих зачатків в проростки оптимальним с ага-ризоване середовище, яке містить макро- і мікроелементи за Щ-расіге-Скугом: 5 мл/л ?е -хелат, _І мг/л б-бензиламінопуріну,

0,1 мг/л 2,4-дихлор$еноксіоцтової кислоти, 0,1 мг/л гібервлової .кислоти, 100 мг/л мезоінозіта, 30 г/л цукрози, pH середовища 5,6.

Б процесі експерименту такох виділені структури,♦ які можуть формуватися при культивуванні насіннєвих зачатків в культурі in vitro.. Вказано зляхи їх розвитку при культивуванні на різних поживних середовищах. .

Необхідно зауважити і те, що для підвищення виходу гаплоїдних рослин нам необхідно збільшити процент регенерації проростків безпосередньо з насіннєвих зачатків, минаючи стадію калусо-утворення, так лк,рослини, що формуйться з каяуса, на завтли незть гаплоїдну природу. '

В наяій роботі ші такоч вивчали вплив рівня геному при культивуванні незаплідаених насіннєвих зачатків в культурі in vitro. Проведені нами -дослідження показали, що при застосуванні ідентична середовищ і умов культивування частота формування проростків і калуса з насіннєвих зачатків тетрлплоїдиого >,сітвріалу достовірно вища ( проростків в 9,І раза, калуса в 4,6 раза), ' пік при культивуванні насіннєвих зачатків диплоїдиих форм цукрового буряка (табл. 3).

Таблиця З

Вплив рівня ЯЛ0ЇД5ЮСТІ донорного матеріалу на вихід макроструктур з касіннсвих зачатків

Площі ість КІЛЬКІСТі висадже- Одержано структур

донорного і.'дтеріалу них нас і-шшзих Всього Кдлі’с Проростки

зачатків, ит. зт. . ’ * tar. % шт. %

Диплоїдні рослини 4 540 14 2,6 6 ' 1,1 8 1,5

Тетряпдоптіп рослгаш 823 -Г63 Г9,8** •12 5,2*я 120 14,6*

7:4 Достовірно при P-O.OJ.

Слід також зауважити і те, що деполіплоїдизовані диплоїда значно читтєздатнімі, відзначаються більа швидким темпом розвитку і росту у порівнянні з гаплоїдними рослинами.

Стимулювання гаплоїдії рослин цукрового буряка. Наші дослідження були направлені на вивчення можливості підвищення виходу гаплоїдів цукрового буряка.

Для стимулювання гаплоїдії проводили вилучення незаплідне-них насіннєвих зачатків в період цвітіння квітки від І до 12 днів. Дослід показав, що культивування насіннєвих зачатків, виділених з розкритих квіток, підвищує частоту формування гаплоїдній структур. Незапліднені насіннєві зачатки, виділені на 1-3 день після розкриття бутонів, масового органогенезу не дали, хоч результати були одержані достовірно вищі, ніж в контрольному варіанті (табл. 4). Насіннєві зачатки, висаджені на 4-6 день після початку цвітіння, формували у всіх повторностях розпушений органогенний калус. Процент калусних структур, в середньому за повторностями, складав 45,8 % від загальної кількості висаджених насіннєвих зачатків. В даному варіанті ми спостерігали появу гаплоїдних проростків, хоч їх процент залишався низьким -2,9 %, Насіннєві зачатки, вилучені на ?-9 день після розкриття квітки, формували і калус і проростки. В даному варіанті спостерігалось різке зростання виходу гаплоїдних проростків. їх кількість складала 16,2 % від загальної кількості висаджених насіннєвих зачатків. Процент калусоутворення залишався приблизно на рівні попереднього варіанту (45,4 '%).

Достовірно нижчу частоту утворення гаплоїдних структур'

(3,8 %), у порівнянні з попереднім варіантом, давали насіннєві зачатки, виділені з квіток, період цвітіння яких складав 10-12 днів. Збільшення виходу гаплоїдних рослин при виділенні насіннєвих зачатків з квіток ми пов’язуємо з повним розвитком насіннєвого зачатка, який уке готовий до запліднення, розвитку і формування насіння. Насіннєві зачатки, виділені з бутонів, недорозвинені тому, що у них не завершені всі процеси мегагаметогене-зу. Це і може впливати на низький процентний вихід гаплоїдних рослин. На спосіб отримання гаплоїдів з виділених насіннєвих зачатків після розкриття квітки подано заявку в Патентне відомство України.

Утворення макроструктур ггри виділенні насіннєвта зачатків з квіток цукрового буряка в- період цвітіння

Варіанти

досліду

Контроль Дні,після початку цвітіння:

Кількість висаджених насіннєвих зачатків, шт.

445

Одержано структур

t ' Всього іїалус Проростки

гаплоїди дигаплоїди

і!ПТ- 55 ■ ат. % ит. % NT. %

10 2,2 5 1,1 3 0,7 2 0,5

1-3 944 102 10,8** 85 9,0** 10 1,1* 7 0,7

4-6 1081 545 50,4** 495 45,8й* 32 2,9ий 18 1,7м*

7-9 ПЗЗ . 748 66,0** 514 45, 184 16,2** 50 4,4*«

10-12 1002 439 43.8** 366 36,5** 38 з,е** 35 3,5**

Достовірно при Р« 0,05; достовіріо при Рв 0,01.

Другий експеримент був пов’язаний із стимулюванням гаплоі-дії при об’єднанні методу культури ізольованих насіннєвих зачатків' і прийому одержання гаплоїдів - запилення рослин цукрового буряка опроміненим пилком. Пилок столового буряка (Beta vulgaris var. esculentа ) опромінювали ^"-промінням. Доза опромінення 100 крад. Вона е летальною для пилку даного виду рослин (Bosftmark '.7.0., 1971; їисе H.V., 1973). Такий пилок не здат-

ний до запліднення, проте,має гормональний вплив на яйцеклітину і центральне ядро зародкового мітка, спонукаачи їх до розвитку. ,

Опроміненим пилком запилювали дослідні рослини цукрового буряка в період цвітіння, попередньо відмітивши розкриті КВІТКИ. Інтервал запилення - 2 доби; запилювали 3 рази. Ці рослини служили донорами насіннєвих зачатків для .культурального етапу роботи. .

В контрольному варіанті висаджували насіннєві зачатки з не-

розкритих бутонів. , '

Э процесі досліджень було одержано слідуючі результати:

- в контрольному варіанті кількість макроструктур, в середньому за повторностями, складала 11,6 %, з них 0,9 % - проростки

- в експериментальному варіанті ми одержали достовірно вищий процент гаплоідаих утворень: 17,8 % висаджених насіннєвих зачатків регенерувало калусну тканину; 9,3 % - гаплоїдні проростки цукрового буряка (табл. 5)..

, Таблиця 5

Утворення макроструктур при запиленні рослини-донора насіннєвих зачатків опроміненим пилком

Варианти досл іду

Кількість висаджених нас ін-нєвих зачатків, ■ шт.

Одержано структур

Всього

шт.

Калус

шт.

Проростки

гаплоїди

шт.

диплоїди

шт.

Контроль 823 . 96 17,6 85 10,3 8 0,9 3 0,4

Запилення ' донорного

матеріалу •

опроміне- 'же

ним пилком 2181 640 29,4** 388 17,Й** 202 9,3х* 50 2,З4*

* Достовірно при Р=0,05.

** Достовірно при Р=0,0І.

В даних дослідах ми спостерігаємо і збільшення кількості рослин з диплоїдним набором хромосом, яке пов’язуємо з процесом спонтанної диплоїдизації гаплоїдних клітин в умовах тривалого . цвітіння квітки та застосування прийому запилення рослини-дон>: ра опроміненим пилком. ■

Отже, об’єднання методу культури ізольованих насіннєвих за чатків з прийомами стимулюванні гаплоїдії - вилучення насіннєвих зачатків з квіток і запилення рослини-донора опроміненим

ІЗ

пилком - підвщує вихід гаплоїдних структур цукрового буряка. Виділення насіннєвих зачатків на 7-9 день після розкриття квітки дозволяє одержувати до 16,2 % рослин з гаплоїдним набором хромосом. При запиленні цукрового буряка опроміненим пилком (доза опромінення летальна) процент гаплоїдних проростків збільшується до 9,3 %. . '

Використання маркерів для виділення гаплоїдів і дигаплої-дів цукрового буряка. При культивуванні незапліднених насіннєвих зачатків на поживних середовищах в культурі in vitro формуються макроструктури різної плоїдносгі. '

Цитологічний аналіз показує, що процент гаплоїдних структур вище за диплоїдні. Можливими джерелами формування калуса або проростків можуть бути як гаплоїдні елементи зародкового мішка, так і диплоїдні клітини стінки зав’язі, нуцелусу і покровів, які потрапляють в процесі роботи на потивне середовище (Ереженов А.Е., Мухамедвднов С.К., Колумбаева С.Ж. и др. ,1991). Диплоїдні утворення бракуються, бо вважається, що в усіх випадках диплоїди формуються як матеріал, що випадково отримано з клітин диплоїдної материнської тканини. Проте в літературі в даний чао с повідомлення, що в меристематичних тканинах гаплоїдів спостерігаються процеси виникнення диплоїдних і двох’ядерних клітин. Ці процеси ідуть постійно (Ruttle , 1928; Webber,

1933; Иванов, 1937; Chase, 1949, 1968; Кириллова, -1966). При цьому автори вважають, що, поскільки, гаплоїдний рівень є одним

із крайніх станів існування організмів, а диплоїдний - найбільш збалансований, то не виключена моюіивість постійно існуючих процесів спонтанної диплоїдизації гаплоїдних клітин.

Повертаючись до наших дослідів, можна допустити, що такі фактори, як виділення насіннєвих зачатків в період цвітіння рослин цукрового буряка, запилення опроміненим пилком рослини-доно-ра, вплив,низьких температур на бутони перед уведенням в культуру in vitro незапліднених насіннєвих зачатків, регенерація рослин з калуса, одержаного при культивуванні насіннєвих зачатків, підвищують процент спонтанно диплоїдизованих гаплоїдів.

Одержання дигаплоїдів виключає складну проблему диплоїди-зації гаплоїдів. ,

Тому постає задача розмежування диплоїдів, одержаних з клітин материнської тканини і спонтанно диплоїдизованих гаплоїдів.

її рішення можливе через використання генетичних маркерів. Нами було проаналізовано всі групи генетичних маркерів. Ген забарвлення надземної частини рослини (гіпокотиль), проявлення якого контролюється домінантними генами, може служити для буряка ефективним маркером так, як проявляється на ранній стадії розвитку (Малецкий С.И., Дєнисова З.В., 1969; Балков И.Я., 1982).

Ми вивчали проявлення цієї ознаки (утворення червоного пігменту) в темноті, тому що для одержання проростків з насіннєвих зачатків обов’язковою умовою є культивування їх в темноті до появи макроструктур. В результаті експерименту було одержано позитивні результати - ми спостерігали утворення червоного пігменту гіпокотиля буряка в темноті.

Проаналізувавши методику одержання гаплоїдів і дигаплоїдів в культурі in vitro ми прийшли до висновку, що ген забарвлення гіпокотиля Rr моче бути використаний для спрощення відбору • гаплоїдного матеріалу і для виділення спонтанно диплоїдизованих гаплоїдів. - ,

Спрощення відбору гаплоїдного матеріалу досягається тим,що донором незапліднених насіннєвих зачатків слухить гетерозиготний за маркерними ознаками матеріал, і серед сформованих структур за иаркершага /рецесивними/ озкаягши виділяють гаплоїдні рослини. ' , . .

В процесі культивування насіннєвих зачатків в культурі іа vitro одержують проростки, які мають різні маркерні ознаки. Рослини з домінантними ознаками можуть бути гаплоїдами або диплоїдами, що сформувались з диплоїдних клітин материнської тканини рослини-донора. їх мочена розділити за допомогою цитологічного аналізу.

Рецесивні ознаки успадковують рослини з гаплоїдним наборам хромосом, які формуються з гаплоїдних клітин насіннєвих зачатків. Отже, одержавши проростки, ми можемо відразу візуально виділити частину гаплоїдних рослин, не звертаючись до цитологічних методів досліджень. Застосування цього способу значно спрощує і прискори є процес відбору гаплоїдного матеріалу. .

Наші дослідження були спрямовані також на виявлення дигаплоїдів при використанні гетерозиготного матеріалу за геном забарвлення гіпокотиля Ег (схема І).

Генетична схема виділення дигаплоїдів

Rr

гетерозиготні рослини буряка (донори насіннєвих зачатків)

проростки

дигаплоіди

Домінантна ознака (червоний гіпокотиль) '

ті

ДИПЛОІДИ

з клітин

материнської

тканини

Яг

К /

бракуються

гаплоїди

візуальне

розділення

Рецесивна

ознака

(білий

гіпокотиль)

гг

гомозиготний

дкгаплоїдний

матеріал

цитологічне

розділення

В процесі культивування незапліднених насіннєвих зачатків в культурі in vitro одержують гаплоїдні і диплоїдні проростки, які відрізняються за маркерними ознаками.

Виходячи з закону про розщеплення гетерозигот і розподіл генів у потомстві, ми робимо висновок, що проростки з диплоїд-

ним набором хромосом і домінантним забарвленням гіпокотиля можуть бути дишіоїдизованими гаплоїдами або проростками, що одер-жені з клітин материнсвкої гетерозиготної тканини. Ці проростки візуально неможливо розділити'-, а тому їх бракують. Рослини з диплоїдним набором хромосом, які успадкували рецесивну ознаку, -це-спонтанно диплоїдизовані гаплоїди (дигаплоїди). Цей процес поданий ка схемі І.

*

В експериментах при'запиленні рослини-донора опроміненим пилком процент проростків з білим гіпокотилем і диплоїдним набором хромосом, с середньому за повторностями, складав 1,01 % від загальної кількості висаджених насіннєвих зачатків і 1,87 % від загального числа одержанії* проростків.

У варіанті при виділені і насіннєвих зачатків на 7-9 день цвітіння квітки процент дигашіоїдів був достовірно вищим і складав відповідно 1,77 і 8,93 % (габл. 6). '

Таблиця б

Вихід дигаплоївнях проростків при різних методах стицулввання гаплоїдії

Кількість Кількість одержаних пророст- ків, Одержано дигаплоїдів

. Варіанти них насіннєвих. всього ,від загальної кількості X

досліду шт. . висаджених насіннєвих зачатків одержа- них пророс- тків

Запилення вихідного матеріалу опроміненим пилком _ 2181 252 22 1,01 3,73

Вилучення насіннєвих зачатків на 7-9 день цвітіння квітки ИЗЗ 224 20 1,77^ 8,93

Загальна кількість 3314 476 42 1,33 9,20

кк Достовірні при Р=0,0І.

Виділені таким способом дигаплоїдні рослини можуть використовуватись в селекції цукрового буряка ЯК ВИХІДНИЙ ЧИСТОЛІНІЙ-ний гомозиготний матеріал.

Отже, необхідно провести цілеспрямований пошук маркерних генів, які б могли бути використані в роботі по виділенню проростків 3' рецесивними алелями тону, що при використанні двох маркерних генів можна виділяти 75 % проростків з рецесивними алелями, при введенні трьох генів - вже 87,5 %, а при використанні чотирьох - можна одержати 93,75 % проростків.

На розроблені способи візуального відбору гаплоїдних рослім при використанні в культурі la vitro насіннєвих зачатків гетерозиготного за маркерним геном Е матеріалу" і одержання гомозиготного матеріалу цукрового буряка шляхом виділення спонтанно диплоїдизованих гаплоїдів в результаті візуального відділення дигаплоїдів від диплоїдних рослин, одержаних з клітин материнської тканини рослини-донора подано заявки на отримання патентів.

Пряма регенерація рослин цукрового буряка в умовах Ід vitro. Дія одержання необхідної кількості гаплоїдних, дигаплоїдних і дополіплоїдизованих рослин цукрового буряка ми звернулись до методу прямої регенерації рослин в культурі in vitro. Це питання заслуговує на особливу увагу, тому що при використанні прямої регенерації рослин з експланту, минаючи стадію налусоутво-рення, виключається можливість виникнення фено- і генотипічних відмінностей рослинних клітин, які широко спостерігаються при культивуванні калуса.

Питання регенерації рослин цукрового буряка мало вивчене.

На даній культурі поки що не одержано масової регенерації рослин з експлантів. В літературі є повідомленая тільки про її поодинокі випадки (Schneider, 1965; Zu, 1967; Славова й., 1988). До того ж, на середовищах, розроблених авторами, пряма регенерація одержана тільки у незначної кількості генотипів, що 'вивчались в експериментах.

Нашою метою був підбір модифікованого поживного середовища для індукції прямої регенерації в культурі іа vitro всіх генотипів, які були одержані в попередніх дослідах. .

Для вивчення регенераційної здатності різних: частин рослини в роботі використовували три варіанти середовищ. Ці поживні се-

редовища були нами складені і застосовувались в експериментах по одержанню регенерантів з калуса. Ці варіанти поживних субстратів не стимулювали масового морфогенезу калусної тканини, але при їх використанні ми спостерігали появу поодиноких проростків. Тому ці середовища ми застосували для вивчення прямої регенерації рослин з експланту.

Перший варіант середовища включав макро- і мікроелементи за прописами середовищ %расіга і Скуга: 0,2 мг/л кінетину,

1,5 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л 2,41. До другого варіанту середовищ входили макро- і мікроелементи за Гамборгом при додаванні

0,5 мг/л 6-БАЛ, 0,2 мг/л 2,4-Х. В склад поживного субстрату третього варіанту входили макро і мікроелементи за Ленсмайе-ром і Скугом: 0,2 мг/л 2*4*Д, І мг/л кінетину, 0,2 мг/л -КУК. До всіх варіантів середовищ додавали вітаміни за Уайтом:

З мг/л аскорбінової кислоти, 30 г/л цукрози.

Експлантами в експериментах були листки, центральна кішка листка, черешок.

В наших дослідах найкращі результати були одержані в першому варіанті середовищ. Вже на 5-7 добу культивування експланту ми спостерігали пряму регенерацію рослин з черешка, а на ■ Ю-15 добу-регенераціп через потовщений експлант.

Кількість регенерантів.на експлант була різно», і в залежності від генотипу коливалась у межах 2-Ю шг,/експлант.

Частота прямої регенерації рослин в цьому варіанті складала 55,7 %. Незначний процент регенерантів було одержано з лксто-'"їої пластинки (1,3 %) (табл. 7), . .

Цей варіант середовища також викликав посиленне наростання вихідного експланту і більш сильне калусоутворення на зрізі і по всій поверхні експланту листкового черешка і листкової жилки. Калус мав зелений або світло-коричневий колір, трохи розпушену або тверду консистенції). ' •

Перший варіант серодовила давав саму низьку частоту некрозів експланту всіх генотипів цукрового буряка що вивчались.

Найсприятливішим середовищем для стимуляції проліферації калуса і прямої регенерації рослім був також друг;; П Т>йр1й11Т СЙрЗ'ДО— вища, хоч результата були одержані шпсчі у порІБНяіші'з попергд-нім “варіантом. .

Третій варіант сєрздовица не викликав прямої регенерації

Частота регенерації і калусоутворення в залетшості від складу поживного середовища та походження експланту

Варіанти

середовища

1 ЬС+

0,2 мг/л кі-нетину

1,5 мг/л б-БАП 0,1 мг/л

2.4-Д

2 В5+

1,0 мг/л в—НАП,

0^2 мг/л

3 лс +

0,5 мг/л кінетину 0,2 мг/л

2.4-Д ,

0,2 мг/л НУК

Кількість ви- Регенерація рослдо ■ Калусоутво- рення Некроз планту екс-

Експлант саджених ек-сплан- пряма через ущільнений експлат всього •

тхв,шт. шт. % ат. % шт. % шт. т г> тт. а /«з

Листок 300 4 1,3 - - 4 1,3 166 55,3 130 43,4

Жилка листка 300 - ' . - - - - - 179 59,6 121 40,4

Черешок 300 53 17,7 114 38,0 167 55,7 82 27,3 51 1700

Листок 230 _ _ _ ПО 47,8х 120 52,2*

Жилка . листка 230 __ «* •• 124 53,9 106 46,1

Черешок 230 28 12,2х 85 36,9 ИЗ 49,Iх 58 25,2 59 25,7**

Листок 260 - - - - - 85 32,7** 175 67,3**

Жилка листка 260 — — _ 87 33,5** 173 6655**

Черешок 260 “ — — -* ** — 98 37,7** 162 62,3**

Достовірно при Р=0,05; ** Достовірно при Р=0,01.

рослин з експланту.

Порівняння генетично різних форм цукрового буряка показало, що генотипи, які вивчались в експерименті, відрізняються між собоп за здатністю до прямої регенерації рослин, строками утворення макроструктур, темпами наростання калуса. Необхідно відмітити схильність диплоїдного матеріалу до прямої регенерації рослин з експланту і початкового калусоутворення, у порівнянні з гаплоїдним матеріалом.

Вирішальним фактором є вибір експланту.

. Після ряду дослідів нами було показано, що найкращим екс-плантом для прямої регенерації рослин цукрового буряка є черешок. При його культивуванні на шживних середовищах різних генотипів цукрового буряка $|уіо виявлено слідувчі формування, (рис. 3). ' -

пряма регенерація рослин а експланту

пряма регенерація рослин після потовщення тканин:; л. ' експланту

органогенез

екСПЛЕНТ

вторинний

калус

У

первинний

калус

органогенез.

неоргаяогешіий калус некроз експланту

Риз. 5. Тиші розвитку експланту (черешка)

рослин цукрового буряка при культивуванні на поясненому середовкці в культурі іа гі^го

У всіх випадках одержані за допомогою прямої регенерації проростки за фенотипом не відрізнялись від вихідних рослин.

На основі-проведених досліджень нами розроблена загальна технологічна схема одержання гомозиготних ліній цукрового буряка. Вона включає слідуючі етапи: .

1) підбирають генетичні маркери, які проявляються на проростках (наприклад, генн ); .

2) готують донорні рослини шляхом схрещування рослин з домінантними і рецесивними ознаками;

3) рослину-донор поміщають під ізолятор і проводять кастрацій (видаляють тичинки з бутонів);

4) для підвищення процентного виходу макроструктур насіннєві зачатки вилучають в період цвітіння квітки (7-9 день);

5) стимулюють гаплоїдію,застосовуючи запилення донорного матеріалу опроміненим пилком з маркерними ознаками (доза опромінення летальна);

6) із гетерозиготних донорних рослин видаляють незаплід-нєні насіннєві зачатки, висаджують їх на регенераційне поживне середовище в культуру in vitro і культивують до появи проростків або проростків з калуса;

7) проводять цитологічний аналіз і за кількістю хромосом розділяють диплоїди і гаплоїди;

8) серед диплоїдів відбирають рослини з рецесивними маркерними ознаками, що являють собою гомозиготні дигаплоїдні рослини, а диплоїди з домінантними ознаками вибраковують, тому що вони являють собою гетерозиготні диплоїди, одержані з клітин материнської тканини або диплоїди, яких за забарвленням’ можна відділити від гетерозиготного матеріалу;

9) для одержання необхідної кількості матеріалу в культурі iavitrd застосовують метод прямої регенерації рослин;

10) дигаплоїдні рослини після розмноження і укорінення в

культурі in vitro використовують в подальшій селекційній роботі; -

. II) гаплоїдні рослини після розмноження і укорінення об-'робляють поліплоїдизуючими речовинами для одержання гомозиготного матеріалу і послідуючого використання в селекції.

Впровадження даної технологічної схеми в селекційній робо-

ту дозволить значно скоротити затрати праці, часу і коштів на одержання нових вихідних матеріалів і створення високопродуктивних гібридів цукрових буряків

ВИСНОВКИ

1. Виділення -насіннєвих зачатків для уведення в культуру in vitro після розкриття бутонів дозволяє підвицкти вихід гаплоїдних структур цукрового буряка. Максимальний вихід рослин з гаплоїдним набором хромосом (16,2 %) досягається при вилученні незапліднения насіннєвих зачатків на 7-9 день цвітіння квітки»

2. Запилення рослини-донора насіннєвих зачатків опроміне-

ним пилком в дозі 100 прад збільаус кількість гаплоїдних проростків до Ю%. ;,г >

3. Встановлено випадки спонтанної диплоїдизації гаплоїдів, ще дозволяє одержувати дигагшоїдний їла таргал іскрового буряка

в культурі in vitro. ' ' '

4. Показано, що забарвлення гіпокотиля, яке визначається

геном В , проявляється в тскноті на ранній, стадії розвитку . проростка при культивуванні насіннєвих зачатків в культурі ід vitro, що дозволяє використовувати його в технології створення гомозиготних матеріалів.' ;

5. Уведення в генотип рослини-донора насіннєвих зачатків маркерних генів дозволяє- візуально виділяти гаплоїди.

6. Використання-рослин, гетерозиготних за кзркерними ге-

нами, як донорів насіннєвих зачатків дозволяє відділяти за рецесивними ознаками дигаплоїдкі рослини, одержані в процесі спонтанної диплоїдизїщії гаплоїдних клітин,від днплоїднкх» які регенерують з клітин, донорноі тканини. ; ' ,

7. Підвищення концентрації цитокінина, t caua б-БАП, е се-

редовищі до І мг/л оптимізує поживне середовище для одержання гаплоїдних і дигаплоїдаях рослин буряка з незапліднених насіннєвих зачатків, а ауксини інгібують регенерацію і підвиїцуять процент калусогенезу. . .. ^

8. При вивченні впливу рівня геному на вихід макроструктур з насіннєвих "зачатків в культурі in vitro встановлено, що , процентний вихід деполіплоідизованих диплоїдів перевицус вихід гаплоїдних росякн в 9,1 раза, калуеа - 4,6 раза.

9. Розроблене модифіковане поживне середовище і підібраний експлант (черешок) являються ефективними для розмноження гаплоїдів і дигаплоїдів прямого регенерацією рослин в культурі

ПРОПОЗИЦІЇ

На підставі- одержаних результатів -досліджень пропонуємо використовувати в селекційній роботі для створення вихідних матеріалів:

- спосіб одержання гомозиготного матеріалу шляхом виділення спонтанно диплоїдизованих гаплоїдів; -

- спосіб одержання гаплоїдів буряка, оснований на вилученні незапліднених насіннєвих зачатків з розкритих квіток;

. - ефективний спосіб виділення гаплоїдів, оснований на візуальному відборі за маркерними ознаками;

•- прийом стимулювання виходу гаплоїдів з незапліднених насіннєвих зачатків в умовах іа vitro шляхом запилення опроміненим пилком донорних рослин;

- модифіковане поливне середовище для одержання гаплоїдних, дигаплоїдних і деполіплоїдизованих рослин цукрового буряка з насіннєві» зачатків;

- модифіковане пояиенє середовиде для прямої регенерації рослин з черешка в культурі in vitro з метоо розмноження різних генотипів, одержаних матеріалів цукрового буряка;

- виділені гаплоїди.для розробки методів поліплоїдизації за допомогою поліплоїдизупчих речовин; .

- виділені гаплоїди для створення гомозиготних ліній; ’-"виділені дигаплоїди і'деполіплоїдизовані диплоїди для

використання в селекції цукрового буряка. ’

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА TEIJDD ДИСЕРТАЦІЇ

1. Рябовол Л.О. Изучение сред для получения гаплоидов свеклы методом культуры изолированных' семяпочек /У Вклад молодых ученых в интенсификацию сельского хозяйства УССР : Тез. докл. науч.-практич. конф. молодых ученых и специалистов (март,

' 1991). - 1991. - Ч. Ш. - С. 81. ' ■.

2. Рябовол Л.О. Стимуляция гаплоидии у сахарной свеклы путем

задержания опыления // Актуальные проблемы физиологии растений и генетики : Тез. докл. конф. молодых ученых.-Киев,1992.-С. 107. .

3. Рябовол Л.О. К вопросу о получении гаплоидов сахарной свеклы // Тез. докл. У1 съезда Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Полтава, 1992). - Киев,

1992. - С. 132.. '

4. Рябовол Л.О., Парий Ф.Н. Управление процессами стимуляции гаплоидии растений сахарной свеклы //Управление генетической изменчивостью с.-х. растений : Тез. докл. Мекдунар. симп. (Ялта, 2 окт. 1992) - Ялта, 1992. - С. 74.

5. Рябовол Л.О., Парий Ф.Н. Повышение выхода гаплоидов у сахарной свеклы И Селекция' и семеноводство. - 1992. - № о. -С.30.

6. Собченко В.Ф., Рябовол Л.О., Манько А.Е. Получение гаплоидных линий сахарной свеклы в культуре 1л vitro // Тез..докл.

У1 съезда ВОГиС (ноябрь, 1992, !&шск). - Шнек, 1992. - С.123.

7. Рябовол Л.О. Разработка методов стимуляции гаплоидии сахарной свеклы // Тез. докл. У1 съезда ВОГиС (Минск, ноябрь,1992)-Минск, 1992. - С. 96. •

8. Парий §.Н., Рябовол Л.#* Способ получения гаплоидов растений.-Заявка на изобретение от 25.03.1993 г.