Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка системы генетической трансформации подсолнечника (Helianthus annuus L. )

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы генетической трансформации подсолнечника (Helianthus annuus L. )"

РОССИИСКИП УНИВЕРСИТЕТ Д Р У Я Б Ы НАРОДОВ

На правах рукоанси

ВОРОНИНА ИРИНА ПЕТРОВНА

УДК 677.21:581.143.61633.854.78

РАЗРАБОТКА СКСТаИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ПОДСОЛНЕЧНИКА (ИвПкгНЬш алпим I.. I

Специальность - 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ дассертации на соискание ученой степена кандидата биологических наук

М О С К В А - 1992

Работа выполнена в Институте обпей генетики имени Н.Н.Вавилова Российской Академии наук и в Центре "Биоин-хенерия" Российской Академии наук.

Научные руководители: Президент Украинской аграрной Академии наук Украины, академик Академии наук Украины, доктор биологических наук, профессор А.А.Созинов, кандидат биологических наук А.К.Гапоненко.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ю.Л.Гухов, кандидат биологических наук С.П.Смирнов.

Ведущая организация - Институт клеточной биологии и генетической инхенерии Академии наук Украины.

часов на заседании С1 5

в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г.Москва, ул.Миклухо-Маклая, д.8.

С диссертацией мохно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета друхйы народов по адресу: 117198, Г.Носква, ул.Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан " МОЯЬО. 1992 года.

Ученый секретарь специализированного совета,

кзндидзт биологичесм И.Н.Варова

Защита состоится

ОЗЩЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность проблем». В селекции важнейших сельскохозяйственных растений, в том числе и подсолнечника, существует ряд проблем, которые не могут бить решены традиционными способами. а требуют применение методов генетической и клеточной инженерии, которые делают возможным введение в геном растопил гетерологичных генов, выделенных из представителей других таксонов животного и растительного царств или синтезированных химическим путем. Таким образом, возможно создание растений, устойчивых к некоторым гербицидам - basta, глифосату и патогенам. вызнгткдим судественную потерю урохая.

Е работах зарубежных исследователей имеются сведения о получении трансгошюго каллуса и растоний-транофср'антов подсолнечника на основе использования Ti-плазмидной системы Аа-

rob.4ct(?rium tunofaciena (Murai et al., 1983; Cobinbrough *t al., 1986¡ Everett ot al., 1987; Schrairra» 1 jer et al.. 1Q90 1.

Однако пол! сенная частота регенерации и эффективность трансформации чрезвычайно низка. Положительные результаты достигнуты лишь для отдельных генотипов, поскольку подсолнечник трудно регенерирует до взрослых растений в культуре соматических меток.

3 связи с народно-хозяйственной ценностью подсолнечника разработка гффектпвного способа регенерации растений in vitro и на его oc>:oi:e системы трансформации'посредством Ti-плазмид агробактерий с целью создания ценного материала для селекции представляет собой актуальную проблему.

Нчуччял L'illil"!1-1 л• Разработан способ регенерации растений для различных генотипов подсолнечника в культурэ соматических клеток. Определены оптимальные комбинации генотип-эксплантат-среда для индукции морфогекного каллуса и регенерации растений. Показано, что регенерация подсолнечника из каллуса, индуцированного из незрелых зародышей, происходит как путем непрямого' соматического эмбриогенеза, так и путем органогенеза. Разработан метод получения мотвфазных пластинок в делящихся клетках иктегумента семяпочки для проведения кариологического анализа растений-рогенорантов подсолнечника. Показана идентичность кариогакв рэгонеранта и донорных растений как по числу хромосом !2п=34), так и по группам хромосом.

Создана система гонотическсй трансформации соматичесгах плеток подсолнечника .посредством Т1-ПЛазМИД a.tuMfaclens, основанная на использовании незролых зародышей подсолнечника (К.аппиия L. ), позволяющая получать морфогешшЯ каллус, спо-

собный к регенерации растений. Показано, что компетентность клеток к генетической трансформации зависит от генотипа.

Неумно-практическая ценность ■ Система генетической трансформации незрелых зародышей подсолнечника с помощью Ti-плаз-адшх векторов A.turoefaciBna, разработанная в дшшом исследовании. может быть полезной для генетичоской модификации подсолнечника. Интеграция экспрессирущихся репортерных генов (NPT II и cus) в геном подсолнечшжа может быть использована как модель для изучения экспрессии в растительных клетках ге-терологичных генов, кодирующих полезные для подсолнечника признаки.

Цедь. Я судами исследования. Разработка системы генетической трансформации ПОДСЭЛЛОЧНИКа (Н.-аппииз L. ). Для достижения этой цели били поставлены следующие задачи:

- провести сравнительный анализ рогенерационного ответа раз- . личных генотипов подсолнечника при культивировании in vitro¡

- определить тип эксплантата, клетки которого наиболее компетентны к регенерации растений;

- подобрать оптимальный состав среды для индукции морфогенно-го каллуса и регенерации растений!

- провести сравнительный анализ кариотипа полученных регенератов и донорных растений для изучегая цитогенетической стабильности рогенеранта:

- исследовать возможность генетической трансформации подсолнечника. различными векторами на основе Ti-плазмид A.tuae-f&clens;

- провести определение активности репортерных генов неоми-цинфосфотрансферазы '№Т II) и р-глюкуронидазы в трансформированных клетках подсолнечника! . .

- определить эффективность трансформацию! подсолнечника раз-, личными штаммами агробактерий. '_'-.,' "

Апробация táSfilü- Основные результаты диссертационной работы бцли представлены на Международном конгрессе "Культура клеток и тканей" в Аяахеме < CUbí. losii, i Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино. 1991i и доложены на советско-венгерском рабочем совещании "Молекуляр-. пая и клеточная генетика .'растений" I Москва".■ 1968 ), I Международном .симпозиуме. "Биотехнология подсолнечника в Европе" в Миттолвире (Франция. 19'Л), лабораторных и мемабораторном семинарах ■ Центра "Биоинзкенерил" .(1900-1992 >. Материалы дис-. ' сертации опубликованы в ) статье и 5 тезисах,.защищены одним авторским свидетельством на изобретение.' ." , • ' ,

2 ' У" : '' ' "

Структура и объем работы ■ Диссертация излскэна на 15в страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов. Список цитируемой литературы включает 177 наименований, из них 37 на русском языке и но на английском языке. Диссертация содеркит зв рисунков и ю таблиц.

материалы и нетоды

Растительнна материал. Материалом служили растения пяти генотипов подсолнечника HiUanthua annuua L.: Сорта &ШСОЙ. Передовик, Ржакскнский. Надежный, УСП (Ультраскороспелий>. предоставленные А.И.Гуидя&вим (ИОГен РАН, Москва) и инородная линия 3629. предоставленная ПТ."ЛГ^влепким| < КИИ биологии ГГУ, Ростов-на-Дону).

В качостве эксплантатов использовали незрелые зародыси на 9-21 день после опылония: сегменты гипокотиля, нерпу» пару листьев, ап ксн побегов 5-13 дневных асептических проростков.

ИехоЛ» ведения культуры соматических клеток подсолнечника. Стерилизацию растительного материала проводили в 50° этаноле в течение 1 минуты, далее в 9 t растворе продажного хлорамина Б в течош;е Ю минут, а затем третды промывали стерильной дистиллированной водой.

Л^-т инициации млр,1огн1пюго каллуса и фор-чирспанил побогсп исслелоЕзли 24 комбинации индуцируккнх питательшшх сред на

ОСНОПП среды КЗ (Uuraahige, Skoog, 1962) С ряЗЛИЧШЖ СОЧетп-

нием горкомов БАП I с- бензиламшюпурин» и ПУК (»-на^тилуксус-кая кислота), нитрата калия и инозитола. В качестве контроля использовали безгорчснальнув питательную сроду «s, лп^еннуп добавок. Всего исследовали 576 вариантов в 20-ти повторнос-тях. IIa все комбинации с род приходилось 111520 эксплантатов исходных генотипов.

Проанализировали 9 комбинаций сред для инициации корневой системы- у растений-регенерачтов. Использовали сЛ'"'.ДУ>"""1в основы сред: макро- И »«ИКрОСОЛИ US (Uur.-xnMce, Sk.:.c>cr, 1962 1, vh iviiite, 1963), Е5 (Сапьогг et ai., 1968). Варьировали paü" личным! концентрация1« тшридоксина HCl и ауксинов - ПУК, НУК iß-индолил-З-уксусная кислота!, ИМК (индолилмасляная кислота). Постоянным компонентом сред являлась сахароза в концентрации о,5г. В качестве контроля использовали среды при отсутствии витамина и фитогормонов.

Цитологически^ цо5ШШ£?Щ1и. Для подсчета числа хромосом и анализа кариотипа цветусих рогенерянтов подсолнечника ис-

пользовали метод получения метафазных пластинок в деляэдхся клетках интегумента семяпочки (Петрова и др., 1991 ). Для хромосомного анализа донорного растения использовали корневые меристемы (Паушева. 1980). Классификацию хромосом в кариотипе проводили по Левану С соавт. (Levan et al., 1964).

Гистологическую обработку материала осуществляли по стандартной парафиновой методике (Ромейс, 1953).

Бактериальные BI2ÜÍÍU И рлаэмиды. Использовали супервиру-лонтныЯ агрошшэвый стамм А281 i предоставленный M.П.Гордоном) и разоруженный октопиновый штамм LBA4404 (предоставления М.С.ЕОВШЮМ). 00а итамма Agrobacterium tumsfaciena содержали вектор бинарного типа рВП21 (созданный на основе вектора pbinioi, с маркершми генами npt ii и cus (предоставленный Р.А.Дх&ХСерсоном'. Плазмдда pBH2i была перенесена в штаммы A.tunwfacinns путем триродительских скрещиваний (Лихтенштейн, Дрейпер, 1983) с использованием плазмиды-помокника рйК2013 i предоставленной Р.А.Джефферсоном ). Использованные штаммы a.tumoгne lena были предоставлены А.С.Краевым (Центр "Биоинженерия" РАН. Москва».

Транс-формация ц селекция.• Трансформацию осуществляли методом сокультивирования незрелых зародышей подсолнечника о ночной культурой A.tumefaciena. Ночные культуры агробактерий Быраяавали на двукратной среде УТ или АВ с канамицином (50 мгли. Селекцию трансгенной ткани вели на безгормональной, модифицированной нами среде us, содержащей юо мг/л канами-циясульфага I Serva) И 500 МГ/Л КЛафОраНЭ Í Roussel ) I ДЛЯ А281 (рВИ21>1 и на среде того г.в состава с фитогормонами (для LEA4404 (pbiizi D. В качестве контроля использовали необработанные незрелые зародыш, помогая их на модифицированную и селективную среды us; а также незрелые зародыши, обработанные агробактериальными штаммами А261 и LBA4404, лишенными плаз-кзд, с последухсим культивированием на селоктивноЯ среде.

рпрадел*нир ÎAi'auiâÇinna е. растительной ткани. Срагменты каллусных и опухолевых лиц-.Я растирали в жидкой безгормональ-ноЯ среде ms. Бысевати полученную .'суспензию на поверхность бак-ериальной питательной среды АВ с канамицином (50 мг/л). По наличию или отсутствию выросших колоний делали вывод о присутствии A.turoafaclens В раСТИТОЛЫШХ ТКаНЯХ. ■ ' ■■

йакД£'Дени£ активности УЖ JLL проводили методом Pettcca с соаьт. lïWoa et ,-,1., i'ia4) . в модификации, описанной ранее

(Do Elock et al., 19&4).

frU>¿P«l£:ttl!á 'G-y-i 'í'iXf^JL'.'tTy В.тканях КОДСрЛИ9Ч1ШКа «флуо-

рометрически и пютохимичвскг) осуществляли по методу Джл1>-фврсона С соавт. (Jefferson et al., 1987).

результаты и обсузденив .

1.1. Ра:«раЗотка сиетемн регенррапии подсолнечника Id vitr?.

Получение траясгенных растения определяется способностью трансформированных клеток регенерировать до фертильных растений. Индукция морфогенного каллуса и регенерация растений зависит от трех Факторов: гонотипа исходного материала. типа используемого эксплантата, состава питательной среди. !!а первом этапе исследования перед нам:! стояла задача разработать экспериментальную систему регенерации подсолнечника in vitro, l.l . l ■ Изучение влияния состава питательной и генотипа

подсолнечника на пронесен каллусо- и морфогенеза-

С целью изучения влияния состава питательной среды и генотипа на образование морфогенного каллуса в первой серии опытов Cu.v: исследованы 24 комбинации индуцируп::их питательных сред ( модифиглции cpo.ru us ), с различным сочетанием фито-горконов IБАП. НУК>. нитрата калия и инозитола. Для анализа исходных генотипов подсолнечника на способность к кзллусеге-нозу и аторлчнсЯ дифференциации испольяоьали четыре типа эксплантатов: сегменты гипохотиля, первую пару листьев, апексы побегов, незрелые зародыш.

Анализ ответа типа эксплантатов в .зависимости от генотипа и соста::а среды позволил определить оптимальные питательные средн. на которых наблюдался интенсивный рост морфэгенной каллусной ткши и формирование побегоз. Наиболее эффективными оказались слодующо среды: Ml - для апексов побегов ' о, i мг/л БАП. з г/л нитрата калия, 20 мг/л шюзитола: n17 - для незрелых зародцсей (0,5 мг/л БАП, 5 мг/л НУК, 5 г/л нитрата калия, 100 мг/.ч шюзитола; n19 - для сегментов гнпскотиля (1 мг/л БАП. 6 г/л нитрата калия, 20 мг/л шюзитола) (табл.1).

Результаты.экспериментов показали, что исследуемые генотипы неодинаково реагируют на условия культивировать in vitro. Определены генотипы, обладателю максимальным регенераци-ошшм ответом: для апексов побегов - Надежный. 3629; для сегментов пшокотнля -•Енисей. Надежный, Передовик, ¿'СП; для незрелых зародышей - Енисей, Передовик, Ржаксинский, УСП, 3629.

Таким образом, в результате первой серил опытов отобрали генотипы и эксплантаты, обладающие повышенной регенерационной способностью. Для каждого из исследуемых генотипов определены оптимальные питательные среды для индукции мор1югегаюго кал-

луса и регенерации растения.

Таблица 1

ДИАПАЗОН ВАРЬИРОВАНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ ФИТОГОИЛОНОВ ДЛЯ ИНДУЦИРУЩЕИ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕЩЫ

БАП НУК 1 МГ/Л)

1МГ/Л1 0 0,5 2,0 2,5 5,0 5,5

0,10 апексы 2 3 4 5 6

0,25 7 8 9. 10 И 12

0 ,50 13 14 15 16 незрелые 18

зародыси

1 ,00 гипокотшш 20 21 22 23 24

1-24 : номера питательных сред и..-,?-.. Изучение елиЛ1Ш возраста ?ксплацтатов ца частоту иц-

юмешшйм водхга<

, Использовали незрелые зародыши на 9-13, 14-17, 1е-2I день посла отшлегая; о также 5-7, 8-ю, п-13 дновные асептические проростки. Результаты проведенных экспериментов по изучению влияния возраста эксплантатов на частоту индукции кор1огенно-го каллуса выявили оптимум для незрелых оародишоЯ '14-17 день поело опыления) и асептических проростков 18-ю дневчно проростки).

Сравнение частот ивдтлки керфогзшюго каллуса," получении х при культивировании апексов побегов. сегментов пгпокотиля и н-'Р'Эдих оародишоЯ показало, что по ггригнаку интенсивности каллуосоСразования изученные эксплантаты моуло расположить в с-:;еду>»цнЯ убывания ряд нозрелио зчроднют - сегменты гипо-котилл - апексы побегов-

Установлено, что 'объективнее всего для индукции морСоген-нсл кадлуспоЯ ткшг.: использовать в качестве эксплантатов не-зрздчз зародыши подсолнечника на 14-17 день после отадетм-Ь.Ь.щ Получение регенератов подсолнечника из каллуса, и'нду-

ивхлюжгй. на ндодош гзвйдиэга- ' •

Изолированные в асептических условиях зародыши на 14-17 донк поело опыления " поведали на модифицированную нами сроду 6

ws. На 3-5 сутки наблюдали образованно каллуснсй ткани. Однако не все каллусы проявляли способность к морфогенезу. Отмечали образование каллуса двух типов - морфзгенного и немор-фогенного. Наблюдали образование в морфогенном каллусе плотных темноокраденкых глобулярных участков, предположительно соматических эмбриоидов. дальнейшее развитие последних приводило к формированию побегов.

Для образования корней исследовали 9 комбинаций с род на основе УЗ, vi), Ь5 с добавлением ИУК. НУК, 1МК и пиридокси-на не:. На среде, содержащей соли К, о,5* сахарозы, 2 мг/д ИМК. 0,5 мг/л пиридоксииз HCl происходило укоренение побегов.. Учитывали количество регенерантов. дскивеих до. ядросадки б перлит, высаженных в почву и цветутах (табл.2 ). Результаты экспериментов, представленные в таблице 2, показывают хоросо выракеш'.ую зависимость регенерациошюй способности от генотипа. Гегенерацпош-шй потенциал наиболее пи сок у сортов Вглсой, "УСЛ. ГгаксинскиЙ.

Таким образом, в результате первого этапа исследовать! определены оптимальные комбинации генотип-эксплантат-срода дл>1 индукции морФогенного каллуса и регенерации растений в культуре соматических клеток подсолнечника.

Ы^ ШШШШ ааст^ия-^j^Hpj-vaHTp^ ауд^олн^никн.

Значительные морфологические отличия регенерантов от до-норных растений и прездо всего их карликовость вызвав необходимость провести подсчет числа хромосом.

При изучении кариотипа взрослых растений-регенерантоп невозможно ,использовать корневые и стоблеаые меристемы из-за опасности повредить растения. 3 связи с этим нами била разработана методика подсчета числа хромосом в деляилхся тканях женской генеративной сферы цветущих регенерантов подсолиичпика (Петрова и др., 1591 >. Эта методика изложена в данной работе на пр'.гмере анализа кариотипа у карликовой формы регенз-ранта подсолнечника. В результате экспериментов был получен ряд растений-регенерантов (табл.2). Ввиду малой численности регенерантов для исследования было взято одно - nepfoo из цветущих растений, которое било карликом ( как и нее последующие рзгенерэнтн) и отличалось по своим морфологическим прл-знакам от донорного растения.

Сущность разработа!шого нами метода заключается в использовании для подсчета 'хромосом и анализа кариотипа делящихся клеток из интегумента семяпочки в бутонах центральных цветков корзинки. Был проведен подсчет числа хромосом, показавший,

Таблица 2

ИНДУКЦИЯ КАЛЛУСА, ПОБЕГООБРАЗОВАНИЕ И РЕГЕНЕРАЦИЯ ПОДСОЛНЕЧНИКА ИЗ НЕЗРЕЛКХ ЗАРОЛЫЗЕЙ

Генотип подсолнечника Кол-во эксплантатов Получено каллусов Частота индукции корфо-гекного каллуса (X) Число обраэо-вазсих-ся побегов Частота побегообразования (X) Получено регенерантов

допивших до пересадки в перлит высаженных в почву цветущих

всего морфо-генкых

Енисей 220 233 153 69,5+0,03 86 39,1+0,03 64 10 3

Передовик 130 123 71 54,6+0,04 38 29,2+0,04 33 4 -

Ржакск-нсккй 180 165 120 66,6+0,03 70 38,8+0,04 48 6 8 1

УСП 310 268 170 54.8+0,03 98 31,6+0,03 59 2

3269 112 103 59 52,7+0.05 27 24,1+0,04 8 - -

• Таблица 3

ЧАСТОТА ТРАНСФОРМАЦИИ НЕЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА РАЗЛИЧИ! 1Ж ИТАЫМЛЛИ Л.ШгссГас1епз

Штамны агробгктерий

Генотипы А281 (рВ1121) 1.ВА4404 (рВ1121)

подсолнечника Кол-во Число тргн- Частота Кол-во Число тран- Частота

эксплан- сгешшх трансфор- эксплан- сгенных трансфор-

татов опухолевых мации татов каллусных мации

линий (X) линий • (X)

Енисей 158 _ - 119 - _

Передовик 167 - - 114 — -

Ржаксинский 112 40 37,3+0,04 86 5 6,6+0,03

УСП 123 - — 200 - -

3629 265 - — 211 — —

что растение-регенерант имеет 2п-34, что свойственно также растению-донору сорта Енисей и, является для подсолнечника

H.annuua L. ДИПЛОИДНЫМ ЧИСЛОМ.

Раскладка хромосом метафазных пластинок донора и регене-ранта показала, что карютип их идентичен и состоит из четырех груш хромосом (рис.1): i - sat - четыре спутничные хромосомы: II - М - двенадцать метацентрических хромосом; III -SU - десять субметацентрических хромосом; IV - а, Т - восемь акроцентрических и телоцентрических хромосом.

sat Ни ъш

и пив? тпп

3 0 <S 8

UnHUiS изтзаза А,т ШШАЬ döüAöftoft

Рио.1. Кариотип подсолнечника сорта Енисей: а - исходное донорное растение; б - карликовая форма регенеранта.

Показана идентичность кариотипов регенеранта и донорного растения как по числу хромосом (2п=34), так и по группам.

Таким образом, исследованный рэгекерант, несмотря на ого значительные морфологические отличия и карликовость имел нормальный по структуре кариотип, свойственный донорному растению. Из этого следует, что карликовость и морфологические отлитая регенеранта обусловлены не изменением кариотипа. а особенностями экспрессии генов в условиях in vitro.

l.s. Изучение процессов регенерации растения в культуре соматических клеток подсолнечника.

Гистологический анализ структуры морфогенного каллуса показал, что в морфогенном каллусе, индуцированном из незрелых зародышей, сроди клеток паренхимного типа, формирующих каллус, встречаются меристемные клетки, объединенные в группы и образующие меристематические очаги. Более детальные гистологические наблюдения показали образование в каллусной ткгни проэ.мбрио с последующим формированием проэмбрионального комплекса из которого впоследствии развивались эмбриоиды. При дальнейшем культивировании наблюдали начальную глобулярную стадию эмбриогенеза и более позднюю - сердцевидную. Развитие эмбриоидов приводило к формированию побегов.

Наряду с образованием в морХогенном каллусе соматических эмбриоидов наблюдали формирование в каллусной ткани зачатков органов - вегетативных и цветочных побегов. В процессе органогенеза в каллусе развивались листовые пластинки в основании которых закладывались пазушные почки- Наблюдали формирование соцветий н.аппииз L. in vitro с ярко-выраженной мито-тической активностью меристоматических клеток, формирующих корзинку.

Изучение процессов регенерации в культуре соматических клеток подсолнечника показало, что при культивировании незрелых зародышей на индуцирующей питательной среде образуется морфогенная каллусная ткань, в которой развиваются эмбриоиды и фордаруются зачатки органон. Однако регенерация целого растения происходит преимущественно по типу непрямого соматического эмбриогенеза. '

1.4. Разработка системы генетической транссормации незрелых Эаь^дыаеи подсолнечника при использовании Т^плаэмид Agrobac-

ter^lum tun^efac 1епз .

Первое сообщение о получении трансгенных растений подсолнечника ПОЯВИЛОСЬ в 1987 ГОДУ Í Everett üt al.,1987). АВТО~

ры инокулировали участки гапокотиля стерильных 7-дневных асептических проростков ночной культурой ноонкогенного штамма A.tumefaciens LBA2C8 (pDAL715). Доминантным СвлекТНВНЫМ маркером являлась устойчивость к аминогликозидному антибиотику канамищшу. Однако попытки воспроизвести описанную выше методику Эверетт с соавторами оказались безусловными (Peerboita, Dek, 1991). Возможно это объясняется тем,-что чувствительность кчеток подсолнечника к воздействию агробактерпй различ-

на и во многом определяется исходным генотипом, типом и возрастом используемого эксплантата.

В данной работе мы изучали возможность трансформации незрелых зародышей пяти различных генотипов подсолнечника путем

СОКУЛЬТИВИРОВШКЯ С НОЧНОЙ КУЛЬТУРОЙ А . ■ЬитеГас 1епа .

1.4.1. Изучение действия антибиотиков на образование кап-лусноя ткани и регенерацию растения при подборе селективной РРеды-

Одним из этапов разработки системы генетической гране-формации с помощью И-плазмидных векторов, является выбор подходящего антибиотика, который должен ингибироватъ рост агробактерий и не оказывать заметного влияния на жизнеспособность эксплантатов.

Известны антибиотики, которые в определенной концентрации подавляют бактериальный рост-- ванкомицин поо мг/л), карбенициллин (500 мг/л), клафоран (500 мг/л), 'рифампицин (50 мг/л) в сочетании с тетрациклином <10 мг/л). Однако разные виды растений реагируют на антибиотики неоднозначно..В этой связи нами была осуществлена проверка чувствительности исходных генотипов подсолнечника Н.аппииэ к ряду антибиотиков. Установлено, что применение ванкомицина и рифампицина -с тетрациклином значительно подавляло рост каллусной ткани. Добавление карбенициллина уменьшало частоту, побегообразования по сравнению с контролем в 1,8-2,2 раза. Показано, что только клафоран не оказывал заметного действия на пролиферацию каллуса и образование побегов.

Определяли концентрацию канамицина, используемую для селекции- Показано, что при культивировании незрелых зародышей, необработанных агробактерией, интенсивный рост каллусной ткани наблюдался на среде, содержащей 50 мг/л канамицина и полностью подавлялся при использовании 250 мг/л канамицина для всех исходных генотипов. При концентрации канамицина юо мг/л число незрелых зародышей, способных к росту,составило 38-62*.

Учитывая полученные данные, впоследствии селекцию растительных клеток исходных генотипов подсолнечника осуществляли по их способности расти на селективной среде, содержащей в качества селективного агента юо мг/л канамицина и 500 мг/л клафорана_для подавления роста агробактерий.

Сравнений эфиктивности трансформации незрелых дышея подсолнечника различными штаммами АигоЪас<:1?г1ит

с1епз.

Одним из путей увеличения частоты трансформации является

использование тех пташов A.tunefaciens, которые обладают повышенной вирулентностью по,отношению к данному виду растений. Штата А281 обладает белее широким кругом хозяев, чем ряд других штаммов (Hood et al., 1984). Он НВСвТ ПЛВЗМИДУ рТ1Вс542, названную супервирулентноS, поскольку было показано, что при использовании ее в качестве плазмиды-помоишка в бинарной системе частота трансформации возрастает более чей Ю раз (An et al., 1985). Был ОПрвДОЛбН учаСТОК ОблаСТИ Vir рТ1Во542, обуславливающей супервирулвкгный фенотип <Jin et al., 1987).

Транс<юрмэдия штаммами A2S1 и А281 (рВТ 121 ). Поскольку в Т-ДНК рТ1Во542 находятся гены биосинтеза фитогормонов, селбк-цию трансформированных тканей проводили на безгормональноЗ среде. При использовании рВП21, несущей е составе Т-ДНК гон npt ii, на среде без фитогормонов с юо мг/л канамицина происходил отбор двойных трансформантов, получивших как Т-ДНК рт1во542,так и Т-ДНК рв1121.

На 7-8 сутки после сокультивирования незрелых зародышей с А281 и селекции на среде без фитогормонов и канамицина наблюдали интенсивный опухолевый рост на семядолях. При"трансформации А281 (рВИ21) и культивировании на среде без конамицкпа картина была сходной, а на среде с юо мг/л канамицшт 40 из 112 эксплантатов сорта Ржаксинсккй' проявляли способность образовывать опухоли <табл.3). Однако использование онкогетшх векторных систем приводит к то;,;у, что взрослые растения но могут быть регенерированы из опухолевых клеток. Контрольные эксплантаты, необработанные агробактерией, быстро желтели на среде с канамицином-и погибали.

Трансформация штаммами JLBA4404 и LBA44Q4 tрвп21 ). Ввиду того, что Ti-плазмида штамма LBA4404 является разоруженной, при ое использовашш трансформированные эксплантаты помекапи на .элективную среду с фитогормонами- В результате были подучены морфогенные каллусы, компетентные к регелерации, расту' щие на среде с юо мг/л канамицина.

Образование каллусов на питательной среде с фитогормонами без Канамицина ПОСЛе СОКуЛЬТИБИрОВШШЯ С LEA4404 И LBA4404 (pBi121) происходило достаточно интенсивно- При селекции на канамицине 5 из 66 эксплантатов сорта Ракаксинский били способны к пролиферации морфогенной каллусной ткать однако, рост ее был несколько замедлен (табл.3).

Проверка раСТИТелЬНОЙ Ткани ЬЩ ПРИСУТСВИР A.tunafaclcna.

Для определения нрт и и выявления cus-активности в предположительно трансгенной ткани необходимо, чтобы растукие на се-

•J2

лективной среде опытные линии были свободны от агробактерий. Для этого получали суспензию из опытных линий и высевали ее на поверхность бактериальной питательной среды. Отсутствие колоний свидетельствовало о том, что каллусные и опухолевые линии очицены от а.tumefас tens. Следовательно, результаты определения npt II и cus-активности можно считать достоверным доказательством трансформации растительной ткани.

'Определение активности нрт II■ В нести независимо полученных опухолевых литиях, появившихся в результате обработки эксплантатов A.tumefaciens А281 (рВХ121) И ЧбТЫрЭХ КаЛЛуСНЫХ линиях, образовавшихся после сокультивирования с LBA4404 (pbh2i) была определена активность npt ii (рис.2). Тест подтвердил наличие этой активности во всех опухолях и каллусах, растущие на селективной среде с канамицином, тогда как в контрольных вариантах npt II не обнаружена.

Рис.2. Определение активности неомицинфосфотрансферазы inpt ii) в каллусных и опухолевых линиях подсолнечника сорта Ржаксинский.

1-8 - экстракты из опухолей, полученных в результате трансформации A.tumefaoien«: 1,7- А281 (КОНТРОЛЬ), 2-6, 8 - Л281 (рВХ121); 9-16 - экстракты из каллусов, полученных в результате трансформации A.tumefaclens: 9-12 - LBA4404 < pBI 121), 13-16 - LBA4404 (КОНТРОЛЬ).

Флуором°тричрское определение активности GUS, в двадцати пяти опухолевых линиях и пяти каллусных проводили флуоромет-рическое определение cus-активности. Для анализа р-глюкурони-дазы использовали в качестве-субстрата мис (4-метилумбеллифе-рилглюкуронид). По флуоресцентному свечению опытных экстрактов делали вывод о наличии активности fs-глюкуронидазы, в то время как в контрольном варианте свечения не наблюдали.

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Гистохимическое выявление GUS-активностп. Результаты гистохимического анализа выявили экспрессию cus в опытных линиях сорта ?5:аксинскиЛ, появившихся в результате обработки эксплантатов А.tumefaclena А281 (рВ1121) И LBA4404 < рВ1121). В качестве субстрата использовали X-cluc < 5-бром-4-хлор-з-индо-лилглюкуронид>. Голубое окрашивание опытных линий свидетельствовало о наличии cus-активности, тогда как контрольный вариант оставался неокрашенным. Изготавливали срезы и просматривали их под микроскопом. На срезах отчетливо видны места локализации фермента ß-глюкуронидазы в клетках трансгеннсй ткани подсолнечника.

Эффективность трансформации штаммами A2S1 (гР.1121 ) ц 1ВА4404 i pBiigi ). Показано, что при трансформации nü3poji¡jx зародышей подсолнечника a.tumefacíans A2öi tpBi121 ) эффективность образования опухолевых линий составляла 37,з%, после сокультивирования с LBA4404 (рВИ21) эффективность возник-новеье!шя морфогешшх каллусных линий составляла соответственно 6,6%-I табл.з)..Установлено, что компетентность клеток к генетической трансформации зависит от генотипа. Как видно из таблицы з, образование трансгенной ткани происходило только у одного из пяти используемых генотипов, при этом эффективность трансформации незролых зародышей сорта Екаксинский в случае использования штамма A2öi (pBH2i> была внхо, чогд при использовании штамма LBA4 4 04 (рВИ21). И хотя фартильныо растения невозмозаю регенерировать из опухолевых клеток, прш.'.он&нич вирулентного штамма a.tunei'acicnb a2öi целесообразно для быстрой разработки системы трансформации и поучения характера экспрессии генов.

ШБОДЫ

1. Отделены оптималыше комбинации генотип-эксплантат-среда для индукции морфогешюго каллуса и регенерации растений в культуре соматичешсих меток подсолнечника. .

2. разработан способ получения регенорантов подсолнечника из каллуса, индуцированного из незрелых задодыпаИ. Показано, .что регенерация растений происходит как путем непрямого соматического эмбриогенеза, так и путем органогенеза.

3. Разработан метод получения метафазных пластинок в д«-лящихся клетках интегумента семяпочки для проведения кардиологического анализа цветущих регенорантов подсолнечника.

4. Показана идентичность кариотинов регенеранта и донор-ного растения сорта Енисей как по числу хромосом (2л=34), так и по группам хромосом.

5. Установлено, что компетентность клеток к гэнетической трансформации зависит от генотипа. Показана экспрессия репор-тершх генов Ь'РТ Ни сиэ в трансформированных клетках подсолнечника сорта Ржаксинский. Получен морфогенный трансгенный каллус при трансформации разоруженным штаммом 1.ВА4404 .

6. Установлено, что при использовании штамма А281 с^-11121) эффективность трансформации незрелых зародышей подсолнечника сорта Ржаксинский выше, чем при использовании штамма 1.ВА4404 (рВ1121) и составляет 37,3* и 6,6« соответственно.

7. Разработана система генетической трансформации соматических клеток подсолнечника посредством Т1-плазмид А.-ЬиюГа-с!впз, основанная на использовании незрелых зародышей подсолнечника, позволяющая получать морфогенный каллус, •компетентный к регенерации растений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для индукции морфогенного каллуса и регенерации расте- . ний в культуре соматических клеток подсолнечника рекомендуется использовать определенные в данном исследовании оптимальные комбинации генотип-эксплантат-среда.

2. Для проведения кариологического анализа регенерантов подсолнечника предлагается методика получения метафазннх йла-стинок в делящихся клетках интегумента семяпочки. Предлагаемая методика может быть использована при изучении кариотипа цветущих растений-регенерантов, так как использование корневых и стеблевых меристем невозможно из-за опасности повредить растение.

3. система генетической трансформации незрелых зародышей

ПОДСОЛНеЧНИКа С ПОМОЩЬЮ Т1-ПЛаЗМИДНЫХ ВеКТОрОВ А.'ЬшмГас^епз,

разработанная в данном исследовании, может быть использована для генетической модификации подсолнечника. Интеграция экспрес-сирулцихся репортерных генов (ИРТ II и сиз) в геном подсолнечника мохет быть использована'как модель для изучения экспрессии в растительных клетках гетерологичных генов, кодирующих полезные для подсолнечника признаки.

СПИСОК РАБОТ,' ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШЗ ДИССЕРТАЦИИ

1. A.C.4S03717 СССР, МКИ'C12N5/04, C12N5/00, А01Н4/00. Способ получешю регенерантов подсолнечника в культуре соматических клеток/ Гапоненко А.К., Воронина И.П. (СССР).-5с.

2. ¡Петрова Т.ф.|, Ворошша И.П., Гапоненко А.К. • Генетическое исследование растений-рбгенерантов подсолнечника, полученных в культуре соматических клеток // Цитология и геноти-Ка.-1991.-Г.25, N4.-С.21-26.

.3. Гапоненко А.К.. Еоронина И.П.. [Белецкий Ю.Д.|. Конов А.Л., Краев А.С., Скрябин К.Г. Эффективность трансформации незрелых зародышей подсолнечника (Helianthu3 annuus L. )// Тезисы докладов I Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнолгии растений".-Пуцино, 1991.-С.13-14.

•4. Ворошша И.П., Гапоненко А.К. Разработка системы регенерации подсолнечники (Helianthua аппииз L.) in vitro// ТбЗИСЫ докладов Х- Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнологии растений".-Пущино, 1991 .-C.57-5S.

5. Ворошша И-П-. [Петрова Т."СГ| Новый цитогенетический метод исследования рогенерантов подсолнечника// Тезисы докладов I Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнолопш растений" .-Пущино, 1991.-С.90-91 .

6. Gaponenko A., Voronina I., Kraev A., Skry;\bin К. Plant regeneration and somatic cell transfon^ation of sunflowur in vitro // Abatracta "World Condress on Coil and Tis3uo Culture" .-Anaheim (USA!, 1991,- P.97A.

7. Voronina I., GapOnenko A., Konov A., Balecuki U.,Kraev A., Skryabin K. Efficiency of sunflower (Helianthus annuua L.) immature embryo transformation // Abstracta l3t aympoaluiii "Sunflower Biotechnology in Europe".- Ulttelwihr ( Francu), •J91.-P.13.