Разработка эффективной системы регенерации подсолнечника (Helianthus annuus L.) in vitro для получения трансгенных растений

Нескородов, Ярослав Борисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка эффективной системы регенерации подсолнечника (Helianthus annuus L.) in vitro для получения трансгенных растений
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка эффективной системы регенерации подсолнечника (Helianthus annuus L.) in vitro для получения трансгенных растений"

На правах рукописи

НЕСКОРОДОВ Ярослав Борисович

РАЗРАБОТКА ЭФФЕКТИВНОЙ СИСТЕМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ ПОДСОЛНЕЧНИКА (Helianthus annum L.) in vitro ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степень кандидата биологических наук

4854652

2 4 О Е В 2011

МОСКВА-2011

4854652

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН

Научный руководитель: Доктор биологических наук

Академик РАН и РАСХН Скрябин Константин Георгиевич

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук,

Долгих Юлия Ивановна

Доктор биологических наук, профессор,

Академик РАСХН

Юрий Яковлевич Спиридонов

Ведущая организация: Институт общей генетики

им. Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится "¿9/" tMfXpfHß 2011 года в //¡öb часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49 Ученый совет РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева л

Автореферат разослан «2Z » 2011 года, и размещен на

сайте Университета www .timacad.ru

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

JI.C. Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Подсолнечник {Helianthus annuus L.) является чрезвычайно важной масличной культурой для России, ежегодная площадь посевов которой составляет более 7 млн. гектаров. Подобные объёмы возделывания приводят к необходимости создания растений, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам. Однако в популяции культурного подсолнечника наблюдается низкая вариабельность ценных сельскохозяйственных признаков, что делает процесс селекции традиционными методами всё более трудоёмким и малоэффективным.

Применение методов генетической инженерии может значительно дополнить имеющийся спектр признаков и позволит решить широкий круг практических и фундаментальных задач.

Несмотря на тот факт, что A. tumefaciens является давно описанным естественным патогеном подсолнечника, существует ряд факторов, ограничивающих эффективность генетической трансформации этого растения. Прежде всего «бутылочным горлышком» данного процесса является низкий уровень регенерации побегов in vitro, а другим значимым фактором является процесс селективного отбора трансгенных побегов. К настоящему времени все трансгенные растения подсолнечника были получены с применением канамициновой селекции, однако многими авторами была отмечена её низкая эффективность, связанная с получением большой доли химерных побегов и ложных трансформантов (Schrammeijer В. и др. 1990, Escandön A.S., Hahne G. 1991, Knittel N., и др. 1991, Bidney D.L. и др. 1992, Radonic L.M. и др. 2008). Также было отмечено ингибирующее действие канамицина на процесс эмбриогенеза подсолнечника в культуре in vitro (Radonic L.M. и др. 2006).

В свете описанных проблем, разработка эффективной системы регенерации и использование фосфинотрицина при селекции клеток подсолнечника in vitro является актуальным.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы была разработка эффективного метода регенерации in vitro побегов подсолнечника {Helianthus annuus L.) и создание на его основе трансгенных растений, несущих ген bar.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Определить для каждого из исследуемых генотипов тип экспланта с целью получения регенерации побегов in vitro с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации;

2. Определить компетентность к агробактериальной трансформации выбранного типа экспланта подсолнечника, используя для оценки маркерный ген uidA (GUS);

3. Получить трансгенные растения подсолнечника, несущие ген bar и определить наличие экспрессии данного гена.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Разработана эффективная система стерилизации семян подсолнечника, позволяющая получать 100% стерильных семян со 100% всхожестью, что позволяет проводить их массовое проращивание в культуре in vitro;

2. Разработан экспресс-метод оценки качества семян подсолнечника, который может быть использован как в производстве, так и в лабораторных условиях;

3. Разработан высокоэффективный метод регенерации подсолнечника in vitro, в котором в качестве источников эксплантов используются зрелые зародыши (семена). Метод позволяет получать с одного семени подсолнечника четыре экспланта с высоким регенерационным потенциалом. Частота регенерации побегов на данном типе экспланта составила от 83,5 до 90,3 %;

4. Разработан эффективный способ индукции множественного побегообразования подсолнечника in vitro, основанный на удалении основного побега экспланта, что позволило индуцировать развитие от 2-х и более побегов на эксплант с частотой 78 %. На настоящий момент - это наиболее эффективный способ регенерации эксплантов подсолнечника. Разработанный способ индукции множественной регенерации побегов может быть использован при клональном микроразмножении ценного материала;

5. Были определены параметры селекции клеток подсолнечника in vitro с использованием фосфинотрицина в качестве селективного агента. Было показано, что фосфинотрицин может эффективно применяться в селекции как в условиях in vitro, так и in planta',

6. Впервые получены трансгенные растения подсолнечника, экспрессирующие ген bar, и показана их высокая устойчивость к фосфинотрицину in vitro (200 мг/л) и гербициду Баста (3 л/га) в условиях теплицы;

7. Полученные трансгенные образцы подсолнечника, устойчивые к действию фосфинотрицина, являются ценным исходным материалом и, в дальнейшем, могут служить донорами устойчивости при селекции новых сортов и гибридов;

8. Разработанные системы регенерации и трансформации могут быть применены для получения трансгенных растений подсолнечника с другими хозяйственно-ценными генами.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IX Международной конференции «Биология клеток in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); на V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященному 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина (Москва, 2009); на 1st Workshop on plant molecular biotechnology XV biotechnology summer school (Gdansk. Poland, 2009); на II международной научной конференции «Генетически модифицированные (биотехнологические) растения: перспективы использования и проблемы биобезопасности» (Киев, Украина, 2009); на 8™ European sunflower biotechnology conference SUNBIO 2010 (Antalya, Turkey, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано двенадцать печатных работ, в том числе три статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и глава в монографии.

Структура и объем работы. Диссертация включает: введение; обзор литературы; описание материалов и методов исследования; результаты и их обсуждение; выводы; список литературы; приложение.

Работа изложена на fit страницах машинописного текста, содержит 2& таблиц, рисунков и/-73 библиографических ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительный материал. В настоящей работе были использованы семь сортов подсолнечника, районированных на территории РФ: Азовский, Донской крупноплодный, Казачий, Мастер, Саратовский 85, Скороспелый 87, Юбилейный 60.

Среды. Растительный материал культивировали при 27°С (±2°С) с 16-часовым фотопериодом (16/8 - день/ночь). В состав всех питательных сред входили макро и микросоли MS (Murashige & Skoog, 1962), витамины В5 (Gamborg, 1970), фитогормоны и углеводы.

Получение асептического растительного материала. С целью получения асептического растительного материала, проводилось обеззараживание семян подсолнечника раствором гипохлорита натрия. Для этого семена очищались от внешних твёрдых оболочек, отмывались в воде с детергентами и обрабатывались раствором гипохлорита натрия (2-3%), под воздействием которого повреждённые семена изменяли цвет. Все семена, на поверхности которых наблюдалось то или иное изменение окраски, выбраковывались. Оставшиеся семена, на поверхности которых подобных изменений не наблюдалось, подвергались вторичной стерилизации.

Регенерация побегов in vitro.

Способ получения эксплантов для регенерации №1: Стерилизованные

семена высаживали по 1 шт. в пробирки, содержащие 10 мл 50%-ной по концентрации солей среды МБ, 10% сахарозы и 0,8% агар-агара. Семена проращивали в течение 6 суток. Растения, на стадии формирования первых настоящих листьев, извлекали из пробирок в асептических условиях и рассекали скальпелем на три диска толщиной 2-3 мм [Рисунок 1]. Экспланты располагали на питательной среде согласно схеме своей первоначальной локализации в гипокотиле и культивировали в течение 6 суток - до появления побегов [Рисунок 1].

Рисунок 1 - Способ получения эксплантов для регенерации №1

Способ получения эксплантов для регенерации Я°2: Стерильные семена по 100 шт. помещали в круглодонные колбы [Рисунок 2], содержащие 80 мл жидкой 10%-ной среды МБ, без витаминов, фитогормонов, сахарозы и агара. Семена проращивали в течение 48 часов при постоянном помешивании 100 об/мин.

Рисунок 2 - Способ получения эксплантов для регенерации №2

У проростков отсекали корни и удаляли верхние 2/3 части семядолей [Рисунок 3]. Полученные фрагменты гипокотиля рассекали вдоль, разделяя апикальную почку на две равные части. Полученные половинки гипокотиля располагали внутренней частью вверх и рассекали вдоль через апикальную

почку, разделяя её на две равные части. В результате из одного проростка получали четыре экспланта, которые помещали срезом вверх на питательную среду для регенерации побегов. Культивацию полученных эксплантов проводили в течение двух суток до появления побегов [Рисунок 7].

А - Отсечение у проростков корней и удаление части семядолей; В - Полученный сегмент гипокотиля; С - Рассечение фрагментов гшгокотиля вдоль с разделением апикальной почки на две равные части; D - Полученные сегменты гипокотиля; Е - Рассечение половинок гипокотиля вдоль через апикальную почку; F - Полученные сегменты гипокотиля; G - Схема одного из четырёх полученных эксплантов. 1 - Верхний срез семядоли; 2 - Область регенерации эпикотиля; 3 - Область отсечения семядоли; 4 - Вертикальный срез гипокотиля; 5 - Область отсечения корня.

Метод оценки качества семян. Для сравнения метода Taylor A.G., и др. (1990) с разработанным нами методом оценки качества семян подсолнечника, основанном на их способности изменять цвет под воздействием гипохлорита натрия, была проведена серия экспериментов. В каждом из них очищенные семена подсолнечника обрабатывали раствором гипохлорита натрия (2-3%) и разделялись на три группы по 100 шт.; в первую вошли семена не изменившие цвет; во вторую группу - семена, сортировку которых не проводили (контрольная группа); в третью - семена с измененным цветом (полностью или локально). Семена помещали в 50 мл стерильной дистиллированной воды, электропроводность которой принимали за ноль при построении диаграммы. Культивировали при постоянном перемешивании 50 об/мин. Через сутки от начала культивирования семян, проводили замер электропроводности воды, используя кондуктометр фирмы «Teleko» (модель № 5711).

Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использовали супервирулентную линию ЕНА105 (Hood Е., 1993), содержащую векторные конструкции pBAR (Падегимас Л.С и др., 1993), pVec035 (Becker D., 1990).

Молекулярный анализ. Интеграцию гетерологичных последовательностей

Рисунок 3 - Схема получения эксплантов способом №2

в геном подсолнечника определяли методом ПЦР. Гистохимическое определение активности гена uidA (GUS) проводили по методике Vitha S. (2003) с использованием 5-бром-4-хлор-3-индолилппокуронида (X-Gluc). Наличие экспрессии гена bar (фосфинотрицин-ацетил-трансфераза - ФАТ) определяли с помощью Trait LL Lateral Flow Test Kit (Strategic Diagnostics Inc.). Для проведения Саузерн блот-гибридизации (Southern, 1975) использовали одноцепочечный меченый [а-32Р] АТР зонд.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Полученные результаты экспериментов были обработаны с помощью стандартных методов статистического анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Получение стерильного растительного материала и разработка экспресс-метода оценки жизнеспособности семян

В процессе работы нами было отмечено, что после обработки семян раствором гипохлорита натрия часть семян меняла цвет от темно-зеленого до бледно-серого, полностью или отдельными участками. При проращивании на питательной среде, эти семена либо проявляли бактериальное или грибное заражение, либо вообще оказывались нежизнеспособными. Дополнительная сортировка, направленная на удаление из выборки всех семян, изменивших цвет, позволила получить 100% асептический материал, пригодный для массового проращивания в жидкой питательной среде.

Способность гипохлорита натрия окрашивать повреждённые или заражённые семена подсолнечника легла в основу разработанного нами экспресс-метода оценки качества семян.

В настоящее время существует способ оценки качества семян, основанный на изменении электропроводности воды, в которой анализируемые семена замачиваются на определённый срок (Taylor A.G, и др. 1990). Было показано, что в процессе замачивания из повреждённых семян происходит более интенсивная утечка различных соединений, что отражается на динамике изменения электропроводности воды.

После того, как нами была обнаружена способность повреждённых семян подсолнечника изменять цвет под воздействием раствора гипохлорита натрия, возникла необходимость определить то, каким образом предлагаемый нами метод соотносится с уже имеющимся.

Для этого была проведена серия экспериментов, в которых семена подсолнечника первоначально сортировались согласно наличию окраски после обработки раствором гипохлорита натрия. В первую вошли семена, не изменившие цвет; во вторую группу - семена, сортировку которых не проводили

(контрольная группа); в третью - семена с измененным цветом (полностью или локально). [Рисунок 4].

Полученные данные показали, что электропроводность воды после 24 часов культивирования выборки семян без изменения цвета, в среднем, составила 0,12 мС, в то время как выборка семян с изменением окраски вызвали повышение электропроводности воды до 0,72 мС. Из этого можно сделать вывод, согласно которому, сортировка семян, основанная на изменении цвета, позволяет объективно выделять из общей выборки семена, заражённые или с повреждениями.

1,0005 0,9005 0,8005 I 0,7005 | 0,6005 и 0,5005 £ 0,4005 | 0,3005 0,2005 0,1005 0,0005 йы! г-Ь | Ш

1 2 3 варианты опыта

□ Семена без повреждений □ Общая выборка семян Ш Семена с повреждениями

Рисунок 4 - Электропроводность воды после 24-х часового культивирования

семян

Разработанный нами метод оценки, основанный на способности повреждённых семян подсолнечника изменять окраску под воздействием гипохлорита натрия, позволяет оперативно проводить количественную оценку качества семян подсолнечника.

Разработанный метод может быть использован как в лабораторной практике, так и в производстве. На его основе могут быть созданы автоматизированные комплексы по сортировке и дражированию семян подсолнечника.

В нашем эксперименте, применив методику сортировки семян по признаку изменения цвета в процессе стерилизации, мы получили 100%-ный выход асептических семян в группе с неизменённым цветом. Это позволило использовать данный способ для массового проращивания семян в колбах, не опасаясь контаминации всей партии от одного семени.

Изучение влияния типа экспланта и генотипа на частоту регенерации побегов in vitro

Целью настоящей работы была разработка эффективного метода регенерации in vitro побегов подсолнечника. Для её достижения было необходимо определить тип эксплантата с максимальной эффективностью регенерации побегов in vitro, а также определить наличие возможного влияния генотипа используемого растения на этот процесс.

В первом варианте экспериментов экспланты представляли собой высечки гипокотиля (способ №1). В этом случае частота регенерации варьировала в пределах от 16,18 % (сорт Донской крупноплодный) до 25 % (Скороспелый 87) [Таблица 1].

Таблица 1 - Частота регенерации побегов из эксплантов, полученных способом №1

Сорт Кол-во семян, ШТ. Кол-во эксплантов, шт. Кол-во ■ побегов, шт. Частота регенерации (%)±ДИ

Азовский 1512 3014 551 18,3 ±4

Донской крупноплодный 1188 2367 383 16,1 ±2

Казачий 1473 2934 482 16,4 ±3

Мастер 2592 5165 856 16,6 ± 1

Скороспелый 87 3636 7147 1787 25,0 ± 3

Юбилейный 60 1809 3604 546 15,2 ± 4

Частота регенерации по способу №2 варьировала от 83,45% (сорт Казачий) до 90,30% (Скороспелый 87) [Таблица 2]. Достоверной зависимости от используемого генотипа обнаружено не было.

Таблица 2 - Частота регенерации побегов из эксплантов, полученных способом №2

Сорт Кол-во, семян, iirr. . Кол-во эксплантов, шт. Кол-во побегов, шт. Частота регенерации (%) ± ди

Азовский 160 630 566 89,8 ±4

Донской крупноплодный 210 833 749 89,9 ± 2

Казачий 370 1468 1225 83,5 ±2

Мастер 110 332 292 88 ±6

Скороспелый 87 225 897 810 90,3 ± 1

Юбилейный 60 170 681 594 87,2 ±3

Разработанный нами способ регенерации №2 показал существенные преимущества в сравнении со способом регенерации №1 [Рисунок 5]:

1. Сокращение времени культивирования растений до момента получения эксплантов. Если в первом случае требовалось выращивать растения в течение 6 дней, то способ №2 позволял сократить время эксперимента в 3 раза и необходимые экспланты можно получить уже на вторые сутки культивирования;

2. Суммарный выход эксплантов. Использование способа №1 позволяет получить из 1-го проростка три экспланта, а при способе № 2 - четыре экспланта;

3. Эффективность регенерации. При применении эксплантов, полученных способом №2, происходит увеличение эффективности регенерации побегов в несколько раз. Например, для сорта Азовский частота регенерации увеличилась почти в 5 раз с 18,28% до 89,84%, а для сорта Донской крупноплодный- в 5,5 раз с 16,18 % до 89,92 %.

кеэачяй Юбмлежый 6® Мастер Амвский Скороспелый 87

|ЙСпосо6 №2 □ Способ №?]

Рисунок 5 - Эффективность регенерации побегов подсолнечника из двух типов

эксплантов

На следующих стадиях работы по генетической модификации подсолнечника нами были использованы экспланты, полученные способом №2.

Индукция множественного побегообразования

В процессе работы нами было отмечено, что с точки зрения компетентности к органогенезу поверхность эксплантов, полученных способом № 2, была неравномерна. Практически во всех случаях, когда формировался побег, это происходило в области рассеченных апикальных меристем на третий день после получения экспланта [Рисунок 6]. Обычно формировался один побег [Рисунок 6:С и Рисунок 7:А], который считался основным [Таблица 3]. В 24 % случаев мы отмечали формирование двух побегов [Рисунок 7:В].

Таблица 3 - Эффективность регенерации экснлантов с усечённым апексом главного побега

Общее кол-во эксп-ов Кол-во эксп-ов с побегами Частота регенерации*, % Общее кол-во побегов Кол-во эксп-ов с множеств, побегами Кол-во побегов с множеств, регенер.**, % Кол-во побегов на эксплант, шт.

контроль 400 380 95,0±4,6 509 92 24,2±2Д 1,3±0,1

опыт 231 222 96,3±3,5 515 174 78,3±4,0 2,3±0,2

* - Кол-во эксплантов с побегами/Общее кол-во эксплантов х 100%

** - Кол-во эксплантов с множественными побегами/Кол-во эксплантов с побегами х 100%

Рисунок 6 - Схема регенерации экспланта подсолнечника с усечённым апексом

главного побега

1- верхний срез семядоли; 2 - область регенерации побега; 3 - боковой срез семядоли; 4 -срез гипокотиля; 5 - срез корня; 6 - вторичные побеги; 7 - формирование каллуса в области среза корня; 8 - формирование каллуса в области верхнего среза семядоли. А -схематическое изображение проростка подсолнечника через 48 часов культивирования. Серым цветом обозначены две удалённые семядоли и корень. Полученные экспланты -белого цвета (на схеме изображены два экспланта из четырёх получаемых). В -схематическое изображение экспланта; С - эксплант через неделю культивирования на питательной среде; О - отсечение апекса побега; Е - вторичная регенерация экспланта через неделю после отсечения побега.

Снятие апикального доминирования методом отсечения первого регенерирующего побега приводило к формированию добавочных побегов в области отсечения [Рисунок 6:Е, Рисунок 7:С], что повышало эффективность

регенерации. После отсечения основного побега у 78 % эксплантов происходило формирование дополнительных побегов [Таблица 3].

Рисунок 7 - Формирование побегов эксплантами подсолнечника

1 - верхний срез семядоли; 2 - область регенерации побега; 3- срез гипокотиля; 4 -формирование каллуса в области среза корня; 5 - сформированный побег; 6 - множественная регенерация побегов. А - типичный вид экспланта подсолнечника через неделю культивирования. Хорошо виден один сформированный побег. В - Эксплант подсолнечника с двумя сформированными побегами через неделю культивирования. С - эксплант через неделю после удаления главного побега. Хорошо видна множественная регенерация.

Предлагаемый способ индукции множественного побегообразования у эксплантов подсолнечника, основанный на удалении первого регенерирующего побега экспланта, позволяет получать от 2-х и более побегов на эксплант с частотой 78 %. На настоящий момент - это наиболее эффективный способ регенерации эксплантов подсолнечника

Определение компетентности эксплантов к заражению А. tumefaciens

При генетической трансформации подсолнечника важным условием, прямо влияющим на результативность процедуры, является вовлечение трансформированных клеток в процесс органогенеза. Так как экспланты, полученные способом № 2, имели локализованную область регенерации, необходимо было определить степень восприимчивости данной области к агробактериальной трансформации. Для этого проводили агробактериальную трансформацию эксплантов векторной конструкцией рУес035. Подсчёт очагов экспрессии гена шс1А на эксплантах проводили через 3 дня (первая группа) и через 21 день (вторая группа) после со-культивации.

Известно, что А. Ште/асгет эффективно трансформирует раневые поверхности растений. В связи с этим поверхность эксплантов (способ №2), была условно разделена на пять зон [Рисунок 8]: верхний срез семядоли, область регенерации эпикотиля, область отсечения семядоли, вертикальный

срез гипокотиля, область отсечения корня. У данного типа эксплантов формирование побегов происходила в области регенерации эпикотиля.

Согласно полученным данным, уровень временной (transient) экспрессии гена uidA у эксплантов подсолнечника сорта Скороспелый 87 и сорта Азовский, составил 100%, так как на каждом из эксплантов, в той или иной зоне, было отмечено GUS-окрашивание. При этом каждый из эксплантов имел множественные очаги GUS окрашивания.

Высокий уровень временной экспрессии гена uidA свидетельствует о высокой компетентности данных сортов подсолнечника к агробактериальному заражению.

Рисунок 8 - Локализация экспрессии гена uidA на экспланте подсолнечника

1 - Верхний срез семядоли; 2 - Область регенерации эпикотиля; 3 - Область отсечения семядоли; 4 - Вертикальный срез гипокотиля; 5 - Область отсечения корня.

Уровень стабильной экспрессии гена uidA определяли через 3 недели после совместного культивирования эксплантов с агробактерией. Для сорта Скороспелый 87 уровень экспрессии составил 28,6 % (в среднем - 0,2 очага GUS окрашивания на эксплант), для сорта Азовский - 31,3 % (в среднем - 0,3 очага GUS окрашивания на эксплант). Таким образом, уровень временной экспрессии был выше стабильной экспрессии гена в 3,2 и 3,5 раза [Рисунок 9].

В целом, при сравнительном анализе уровней временной и стабильной экспрессии гена uidA, по зонам экспланта были отмечены следующие закономерности:

- Как для сорта Скороспелый 87, так и для сорта Азовский высокий уровень восприимчивости к агробактериальной инфекции показали области отсечения корня (Сорт Скороспелый 87 - 45 %, для сорта Азовский - 48 %);

- Наименьшее значение активности гена uidA продемонстрировала область отсечения семядоли; для сорта Скороспелый 87 - 9,3 % и для сорта Азовский - 5,9 %.

- Общая схема распределения очагов окрашивания по поверхности экспланта, с небольшими вариациями, сохраняется у двух исследованных нами сортов в независимости от типа (временная/стабильная) активности.

Уровень временной активности гена uidA в области регенерации побегов

(область формирования эпикотиля) у сорта Скороспелый 87 через 72 часа после со-культвировапш эксплантов с А. tumefaciens составил - 37 %, а для сорта Азовский - 43 % [Рисунок 9]. При этом стабильная активность три недели спустя у сорта Скороспелый 87 составила - 12,6 %, а для сорта Азовский -10,9% [Рисунок 9]. Несмотря на более чем трёхкратное снижение уровня активности (в 3,5 раз - Скороспелый 87, и 3,2 раз - Азовский), уровень GUS окрашивания в область формирования эпикотиля у обоих сортов был выше, чем в остальных четырёх областях.

Полученные результаты подтвердили, что область регенерации и трансформации для данного типа экспланта совпадают. Это позволит использовать эксплант, полученный способом №2, для генетической трансформации.

нСкороспелый87- черезЗдня оАзовский- черезЗдня и Скороспелый 87- черезЗнедели вазовский- черезЗнедели

Рисунок 9 - Динамика изменений экспрессии гена шЛА

Получение фосфинотрицин-устойчивых ГМ растений подсолнечника

Известно, что эффективность методов генетической трансформации растений зависит от возможности осуществления конечного этапа - получения из клеток и тканей полноценных фертильных нехимерных растений. Однако сам процесс трансформации и последующее продолжительное культивирование трансгенных многоклеточных тканей в условиях клеточной селекции значительно снижает морфогенную способность клеток. Поиск оптимальной концентрации селективного агента, которая позволит избежать появления ложных трансформантов и химерных растений и не будет отрицательно влиять на последующий морфогенез, является важнейшим этапом получения растений подсолнечника.

Для определения оптимальной селективной концентрации фосфинотрицина было проведено тестирование выживаемости исходных линий

in vitro. Экспланты подсолнечника, полученные из зрелых зародышей, высаживали на среды для регенерации, содержащие различные концентрации селективного агента - РРТ (2,5; 5; 10, 20 и 40мг/л). Оптимальной рабочей концентрацией фосфинотрицина для последующих экспериментов по трансформации была выбрана 20 мг/л, т.к. при данных условиях происходила 100% гибель контрольных (нетрансгенных) побегов.

В эксперименте по генетической трансформации подсолнечника нами было использовано 1445 эксплантов, которые были получены по описанной ранее методике.

В первую неделю практически 90 % эксплантов в зоне рассечения апикальной меристемы формировали побег (иногда 2 или 3 на одном экспланте), однако, в процессе последующих двух-трех недель культивирования на питательной селективной среде, этот побег погибал и у его основания начинал формироваться новый (обычно один, реже два). Все полученные нами трансгенные растения формировались именно из этих вторичных побегов. После двенадцати недель селекции было получено четыре побега, которые были привиты на растение-донор.

В четырех полученных растениях-регенерантах (Т0) [Таблица 4] наличие гена bar было подтверждено ПЦР-анализом [Рисунок 10]. Отсутствие агробактериального заражения у растений поколения (Т0) также было подтверждено ПЦР-анализом. Экспрессия гена bar была подтверждена во всех четырех растениях с использованием иммунной хроматографии.

Рисунок 10 Элекгрофоретический анализ результатов ПЦР геномной ДНК подсолнечника (Та) в 1%-нои агарозном геле

1,10 - Маркер молекулярной массы (ЮОЬр); 2 - ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы; 3 - Нетрансгенное растение подсолнечника; 4-7 - Трансгенные растения подсолнечника, несущие ген bar; 8 - Трансгенное растение табака, несущее ген Ъаг\ 9 - Пяазмида pBAR.

Таблица 4 - Анализ наличия и экспрессии гена bar в полученных растениях подсолнечника

Растение №1 Растение №2 Растение №3 Растение №4

То ПЦР + + + +

Экспрессия гена bar + + + +

Кол-во семян, шт. 43 9 7 11

Кол-во проросших семян, шт. 36 6 4 6

Кол-во растений, обработанных гербицидом, шт. 36 6 4 6

т, Кол-во растений, устойчивых к гербициду, шт. 0 6 0 0

ПЦР - + - -

Экспрессия гена bar - + - -

Саузерн-блот - + - -

т2 Кол-во полученных семян, шт. - 427 - -

Высота полученных нами растений (То) составляла от 17 сантиметров (растение №3) до 30 сантиметров (растение №1), при этом, контрольные растения, которые не культивировали in vitro, достигали в высоту 150 - 170 см. Все растения-регенеранты в пазухах листьев формировали дополнительные побеги с соцветиями, которые всегда были меньшего (2-3 см) размера, чем основное соцветие.

С четырех растений (То) было собрано 70 семян, которые, после окончания периода покоя, были высажены в теплице [Таблица 4].

Из всех полученных от растений Т0 семян (ТО взошли только 52 шт. (74 % от общего количества), из которых, после обработки гербицидом, выжили только 6 растений (11,5 % от общего количества взошедших семян). От этих растений было получено 427 семян (Т2). Фенотип растений Tt не отличался от фенотипа контрольных растений. Было выявлено, что все растения, обладающие устойчивостью к гербициду, являются потомками растения-регенеранта №2 (То). В отобранных растениях была подтверждена экспрессия гена bar. В результате блоттинга по Саузерну показали одиночную вставку копии гена bar на геном [Рисунок 11].

(а)

rTnos-

BAR

,_RB

(б)

Ш'Ыщт

»Щ!

¡P -

Рисунок 11 - Схема Т-ДНК вектора и результаты

Саузерн-блот анализа

А - схема генетической конструкции; В - Саузерн-блотгинг трансгенных растений. Совмещенное изображение результатов рестрикции геномной ДНК и блотгинг-гибридизации с фрагментом bar гена.1 - маркер молекулярного веса GeneRuler DNA Laders (Fermentas); 2 - контроль, SamHl; 3 - контроль, XholV, 4 - трангенный подсолнечник (Ti), ВатШ; 5 - трангенный подсолнечник (Т]),Л7го11.

Определение уровня устойчивости полученных трансгенных растений подсолнечника (Тг) к действию фосфинотрицина при культивировании проростков в условиях in vitro на питательных средах с разной концентрацией селективного агента (от 50 мг/л, до 200 мг/л, [Рисунок 12]) показало, что полученные трансгенные растения устойчивы к действию фосфинотрицина в концентрации до 200 мг/л (включительно). Это в 100 раз превосходит норму использования гербицида «БАСТА».

Использование фосфинотрицина в качестве селективного агента позволяет проводить отбор не только в условиях in vitro, но in planta, что невозможно при использовании, например, канамицина. Являясь действующим веществом таких гербицидов широкого спектра действия, как «БАСТА», фосфинотрицин позволяет производить обработку растений в теплице, эффективно удаляя из выборки ложные трансформанты, трансгенные (с низким уровнем активности селективного гена) и химерные растения. В нашем эксперименте отбор растений Т[ и Т2 осуществлялся именно таким образом [Рисунок 13].

Рисунок 12 - Трансгенные (Тг) и контрольные растения подсолнечника на разных концентрациях РРТ в условиях in vitro

Восемь суток после начала культивирования. 1 - контрольное растение, 0 мг/л ppt; 2 -трансгенное растение, 0 мг/л ppt; 3 - контрольное растение, 50 мг/л ppl; 4 - трансгенное растение, 50 мг/л ppt; 5 - контрольное растение, 100 мг/л ppt; 6 - трансгенное растение, 100 мг/л 7 - контрольное растение, 200 uvlnppt; 8 - трансгенное растение, 200 мг/л ppt.

Рисунок 13 - Действие гербицида на контрольное и трансгенное растения подсолнечника в условиях теплицы

1 - контрольное растение до обработки гербицидом; 2 - трансгенное растение (Та) до обработки гербицидом; 3 - контрольное растение через семь суток после обработки гербицидом; 4 - трансгенное растение (Тз) через семь суток после обработки гербицидом.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор выражает признательность д.б.н. А.К. Гапоненко за предоставленную возможность использовать в работе запатентованный способ получения эксплантов подсолнечника (способ №1).

Автор выражает благодарность к.б.н. Я.В. Мишуткиной, к.б.н. A.M. Камионской, к.б.н. A.JI. Ракитину, д.б.н. А.Н. Игнатову за неоценимую помощь при проведении настоящей работы.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что заражённые семена подсолнечника изменяют цвет при взаимодействии с раствором гипохлорита натрия. Это позволило разработать эффективную систему стерилизации семян, позволяющую получать стерильные семена со 100%-ным результатом, и экспресс-метод оценки качества семян подсолнечника, который может быть использован как в производстве, так и в лабораторных условиях;

2. Разработан высокоэффективный метод регенерации подсолнечника in vitro, использующий в качестве источников эксплантов зрелые зародыши (семена). Метод позволяет получать из одного семени подсолнечника 4 экспланта с высоким регенерационным потенциалом. Частота регенерации побегов на полученных эксплантах составила 83,5 % - 90,3 %. Произведено сравнение разработанного нами метода с методом, использующим в качестве источников эксплантов проростки на стадии первых листьев. Частота регенерации побегов по разработанной нами методике была выше в 5-6 раз. Разработанный нами способ регенерации побегов не зависит от генотипа используемого растения. Применение в процедуре агробакгериальной трансформации данного типа экспланта позволило получить трансгенные растения подсолнечника;

3. Разработан эффективный способ индукции множественного побегообразования у эксплантов подсолнечника, основанный на удалении первого регенерирующего побега экспланта. Он позволяет получать от 2-х и более побегов на эксплант с частотой 78 %. На настоящий момент - это наиболее эффективный способ регенерации эксплантов подсолнечника;

4. Впервые получены трансгенные растения подсолнечника, несущие ген bar и обладающие высокой устойчивостью к действию фосфинотрицина in vitro (200 мг/л) и гербициду Баста (3 л/га) в условиях теплицы;

5. Показано, что фосфинотрицин может эффективно применяться при селекции подсолнечника как на уровне клеток in vitro, так и in planta.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Я.Б. Нескородов, Я.В. Мишутеина, А.К. Гапоненко, К.Г. Скрябин. Метод регенерации in vitro побегов подсолнечника (Helianthus annuus L.) из асептических семян, как эксплантатов для генетической трансформации. 2007. Биотехнология. Т 6: 27-33.

2. Я.Б. Нескородов, К.Г. Скрябин. Индукция множественного побегообразования у эксплантов подсолнечника {Helianthus annuus L.) в культуре in vitro. 2009. Масличные культуры. Вып. 2 (141), с. 6-10.

3. Ya.B. Neskorodov, A.L. Rakitin, A.M. Kamionskaya, K.G. Skryabin. Developing phosphinothricin-resistant transgenic sunflower (Helianthus annuus L.) plants. 2009. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 100:65-71.

4. Ya.B. Neskorodov, A.M. Kamionskaya, K.G. Skryabin. Agrobacterium-mediated transformation of sunflower (Helianthus annuus L.) using direct shoot regeneration protocol. Sunflowers: cultivation, nutrition, and biodiesel uses. 2010. Editors: Victor C. Hughes.c. 1-37. NOVA publishers. ISBN: 978-1-61209-325-3

Тезисы докладов

1. А.К Гапоненко, В.С.Фадеев, А.Н. Маркеев, Я.Б. Нескородов «Модификация и моделирование метаболических путей в трансгенных растениях». Материалы III Всероссийского научного конгресса генетиков и селекционеров. Москва, 2004. С. 473.

2. Я.Б. Нескородов, А.К. Гапоненко. «Регенерация подсолнечника in vitro». Материалы международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия». Москва, 2005. С. 197.

3. Я.Б. Нескородов, А.К. Гапоненко. «Определение оптимальной концентрации селективного антибиотика для селекции in vitro трансгенных растений подсолнечника». Материалы 1(1Х) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург. 2006. С. 176.

4. Я.Б. Нескородов. Генетическая трансформация подсолнечника (Helianthus annuus L.). IX Международная конференция «Биология клеток in vitro и биотехнология». 2008. Звенигород. С.276.

5. Я.Б. Нескородов. Генетическая трансформация подсолнечника (Helianthus annuus L.) геном bar. Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина. V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва. 2009. с. 380.

6. Ya.B. Neskorodov. "Regeneration and genetic transformation of Russian sunflower cultivars and production of herbicide-resistant plants". 1st Workshop on

plant molecular biotechnology XV biotechnology summer school. 2009. Gdansk. Poland.

7. Я.Б. Нескородов. «Генетическая трансформация подсолнечника (.Helianthus annuus L.) сортов российской селекции». II международная научная конференция «Генетически модифицированные (биотехнологические) растения: перспективы использования и проблемы биобезопасности». Киев, Украина,

2009.

8. Ya.B. Neskorodov, K.G Skryabin Regeneration and genetic transformation of Russian sunflower cultivars and production of herbicide-resistant plants. SUNBIO

2010. 8th European sunflower biotechnology conference. Antalya, Turkey, p.36.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60х84'/|6 Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Зак. 59.

Издательство РГАУ - МСХА имени К. А. Тимирязева 127550, Москва, Тимирязевская ул., 44 Тел.: 977-00-12, 977-26-90, 977-40-64

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нескородов, Ярослав Борисович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ И ТАБЛИЦ.

ВВЕДЕНИЕ.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Краткая история культуры подсолнечника и его систематическое положение.

1.2 Этапы генетической модификации подсолнечника.

1.2.1 Выбор генотипа подсолнечника для последующей работы.

1.2.2 Получение асептического растительного материала.

1.2.3 Культивирование эксплантов подсолнечника в условиях in vitro.

1.2.4 Генетическая трансформация подсолнечника.

1.2.5 Канамицин как селективный агент.

1.2.6 Фосфинотрицин как селективный агент.

1.3 Некоторые направления биотехнологии подсолнечника в мире.

1.3.1 Подсолнечник, устойчивый к абиотическим стрессам.

1.3.2 Подсолнечник, как продуцент.

II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.4 Использованные генотипы подсолнечника.

2.5 Получение асептического растительного материала.

2.5.1 Способ стерилизации №1.

2.5.2 Способ стерилизации №2.

2.5.3 Определение качества семян подсолнечника.

2.6 Условия культивирования растений iп vitro.

2.6.1 Состав питательных сред для культивирования растений.

2.6.2 Состав питательных сред для культивирования бактерий.

2.6.3 Способ получения эксплантов для регенерации №1.

2.6.4 Способ получения эксплантов для регенерации №2.

2.7 Процедура генетической трансформации эксплантов подсолнечника

2.7.1 Определение летальной концентрации РРТ для подсолнечника in vitro.

2.7.2 Использованные антибиотики.

2.7.3 Селективный отбор трансформантов.

2.7.4 Метод прививки и адаптация растеиий-регенерантов к условиям теплицы.

2.7.5 Отбор растений, устойчивых к действию гербицида.

2.7.6 Определение уровня устойчивости трансгенных растений к действию фисфинотрицина.

2.8 Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений.

2.8.1 Параметры ПЦР-анализа гена bar.

2.8.2 Параметры ПЦР-анализа v/r-генов Ágrobacterium tiimefaciens.

2.8.3 Параметры блот-гибридизации.

2.8.4 Определение экспрессии гена bar.

2.8.5 Определение компетентности эксплантов к заражению A. tumefaciens.

2.8.6 Электорофоретический анализ.

2.9 Статистическая обработка данных.

2.9.1 Дисперсионный анализ.

2.9.2 Наименьшая существенная разница.

2.10 Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.11 Микроскопы и другое оборудование.

III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Получение стерильного растительного материала.

3.2 Экспресс-метод оценки жизнеспособности семян подсолнечника.

3.3 Влияние типа экспланта и генотипа на частоту регенерации побегов in vitro

3.3.1 Способ получения эксплантов № 1.

3.3.2 Способ получения эксплантов № 2.

3.3.3 Сравнение эффективности 2-х способов.

3.4 Генетическая трансформация эксплантов, полученных способом №2.

3.4.1 Индукция множественного побегообразования.

3.4.2 Регенерация экспланта и его генетическая трансформация.

3.5 Получение канамицин-устойчивых ГМ растений подсолнечника.

3.6 Получение фосфинотрицин-устойчивых ГМ растений подсолнечника

IV ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка эффективной системы регенерации подсолнечника (Helianthus annuus L.) in vitro для получения трансгенных растений"

Актуальность работы

Подсолнечник (Helianthus annuus L.), совместно с соей (Glycine max (L) Merrill) и рапсом (Brassica napus L.) является одной из трёх важнейших масличных культур мира. В настоящее время Россия занимает лидирующие позиции в мире в области выращивания и переработки данной культуры [1]. Генетическая модификация подсолнечника позволит решить широкий круг фундаментальных научных вопросов. Таких, например, как изучение регуляции генов сложноцветных, ответственных за формирование соцветия. Предполагается, что изменения в подобных генах (ответственных за контроль развития) может быть главной причиной морфологических преобразований в процессе эволюции [2] и с этой точки зрения изучения сложноцветных представляет большой интерес, так как они являются вершиной эволюции цветковых растений. Подобная задача была успешно решена на таком модельном объекте семейства крестоцветных, как резуховидка Таля (Arabidopsis thaliana), изучение гомеозисных мутантов которой позволило в 1991 году построить модель контроля органогенеза цветка (ABC-модель) [3], однако для сложноцветных коллекция подобных мутантов ещё не создана и процессы их генетического контроля высоко консервативных механизмов развития цветка ещё только предстоит выяснить. Данная проблема может быть эффективно исследована через получение трансгенных растений. Посредством генетической трансформации в геном подсолнечника могут быть искусственно внесены либо маркерные гены, выявляющее тот или иной процесс, либо изменена (усилена или уменьшена) активность родных генов.

Также генетическая трансформация подсолнечника может представлять большой практический интерес, так как в данной культуре наблюдается низкое разнообразие ценных сельскохозяйственных признаков, что делает процесс селекции всё более трудоёмким и малоэффективным. К тому же методами традиционной селекции получить многие востребованные признаки либо чрезвычайно сложно, либо вообще невозможно. К таким признакам можно отнести устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам (например - устойчивость к неселективным гербицидам).

Известно, что в посевах подсолнечника могут произрастать более 20-ти видов сорных растений [на стр. 80] [4]. Притом, что подсолнечник обладает сравнительно высокой конкурентной способностью по отношению к сорнякам, тем не менее, потери от засорения полей сорняками могут достигать 40 %.

Сорная растительность на полях является хорошей средой обитания таких опасных вредителей, как, например, жук-фитофаг щелкун кубанский (Agriotes litigiosus Rossi), от деятельности которого могут быть потеряны до 100 % урожая [5].

В настоящее время, для борьбы с сорняками в посевах подсолнечника, применяют препараты на основе трифлюралина (Трефлан®, Трифлюрекс0), прометрина (Гезагард®), S-метолахлора (Дуал Голд®) и пендиметалина

Стомп ). Данные препараты достаточно эффективны, однако они обладают высокой токсичностью для людей и окружающей среды [6,7,8,9], что создаёт серьёзные трудности в их применении и хранении [Таблица 1]. К тому же, перечисленные препараты плохо поддаются биологическому распаду, что приводит к токсическому засорению почв и водоёмов. Например, в 2006 г. было проведено обследование почвы вокруг мест складирования и захоронения пестицидов. Пробы почвы отбирали в районе склада ГУП «Сельхозхимия» Аткарского р-на Саратовской области и в р-не «Областного пункта захоронения пестицидов» в Хворостянском р-не Самарской области. В пробах почвы обнаружены ХОП - ДДТ, ДДЕ и гербициды Трефлан® и 2,4-Д [10].

Также почвы, загрязненные остаточным количеством гербицида Трефлана® на уровне 1,9 ОДК, обнаружены в Самарской области (Ставропольский р-н ЗАО «Луначарск») [10].

Перечисленных выше недостатков (высокая токсичность и медленный распад) лишены гербициды, действующим веществом которых является фосфинотрицин, способный к быстрому и полному распаду в окружающей среде.

Мы полагаем, что создание генетически модифицированных растений подсолнечника, обладающих устойчивостью к гербицидам на основе фосфинотрицина (глюфосината) [11], позволит отказаться от использования экологически небезопасных гербицидов. Учитывая преимущества данного типа гербицидов, в сравнении с употребляемыми ранее, в 2007 году уже была озвучена идея о необходимости получения подсолнечника подобного типа [12], однако к настоящему времени подобных растений получено не было.

Таблица 1 Используемые гербициды с точки зрения безопасности использования

Гербицид Опасность для здоровья Опасность для окружающей среды в аварийных ситуациях (Утечка) Воспламеняемость

Дуал Голд Может вызвать сенсибилизацию при попадании на кожу. Очень токсично для водорослей. Очень токсично для рыб. Вредно для дафний. Очень токсично для пчёл. Легко воспламеняющееся вещество.

STOMP Вреден для здоровья при проглатывании. Раздражает глаза и кожу. Очень токсичен для водных организмов, в водоёмах может в течение длительного времени оказывать вредное воздействие. Легко воспламеняющееся вещество.

TREFLAN 48 HERBICIDE Вреден для здоровья при проглатывании. Раздражает глаза и кожу. Очень токсичен для водных организмов. Легко воспламеняющееся вещество.

Гезагард 50 WP Вреден для здоровья при проглатывании. Раздражает глаза и кожу. Очень токсичен для водных организмов. Легко воспламеняющееся вещество.

Несмотря на тот факт, что Agrobacterium tumefaciens (Smith and Townsend) Conn является давно описанным естественным патогеном подсолнечника, тем не менее, процесс генетической трансформации данной культуры остаётся малоэффективным и трудоёмким.

При генетической трансформации подсолнечника наиболее сложным этапом, «бутылочным горлышком» всего процесса, является индукция регенерации эксплантов и их селекция в культуре in vitro. Связано это с тем, что экспланты подсолнечника сравнительно легко формируют каллус, который, при правильном подборе условий культивирования, можно получить уже к концу второй недели, однако задача эффективного перевода ткани от каллусогенеза в сторону органогенеза всё ещё не решена.

Также существует проблема эффективного отбора генетически трансформированных клеток экспланта в процессе селекции. К настоящему времени все описанные в литературе трансгенные растений подсолнечника были получены с использованием антибиотика канамицина (Канатуcinum), который использовался в качестве селективного агента. Однако было отмечено, что при использовании данного препарата не происходит эффективный отбор клеток и получаемые растения-регенеранты (Т0) во всех описанных случаях получались химерными, а часть из них вообще были ложными трансформантами, сформировавшими устойчивость к канамицину неясной природы.

Также было отмечено ингибирующее действие канамицина на процесс эмбриогенеза подсолнечника в культуре in vitro. Ещё в 1987 году [109], когда впервые был получен трансгенный подсолнечник, авторы высказывали идею о необходимости поиска альтернативных канамицину селективных агентов, однако к настоящему моменту все опубликованные исследования выполнены с использованием антибиотиков аминогликозидной группы [Таблица 6 и Таблица 7].

В свете описанной проблемы мы полагаем, что использование фосфинотрицина при селекции клеток подсолнечника in vitro представляет большой интерес.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение регенерационной компетентности сортов подсолнечника (Helianthus annuus L.) отечественной селекции и создание трансгенных линий, с использованием селективного гена bar.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Определить для каждого из исследуемых генотипов тип эксплантата с целью получения регенерации побегов in vitro с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации.

2. Определить компетентность к агробактериальной трансформации выбранного экспланта подсолнечника, используя для оценки маркерный ген uidA (GUS).

3. Получить трансгенные растения подсолнечника, несущие ген bar, обуславливающий устойчивость к фосфинотрицину (действующему веществу гербицида Баста) и определить наличие экспрессии данного гена.

4. Оценить устойчивость полученных трансгенных линий к действию гербицида Баста в поколениях.

Научная новизна и практическая значимость полученных результатов

Частота регенерации побегов на данном типе экспланта составила от 83,5 до 90,3 %;

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на IX Международной конференции «Биология клеток in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); на V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященному 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина (Москва, 2009); на Ist

Workshop on plant molecular biotechnology XV biotechnology summer school (Gdansk. Poland, 2009); на II международной научной конференции «Генетически модифицированные (биотехнологические) растения: перспективы использования и проблемы биобезопасности» (Киев, Украина, 2009); на 8ТН European sunflower biotechnology conference SUNBIO 2010 (Antalya, Turkey, 2010).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Я.Б. Нескородов, Я.В. Мишуткина, А.К. Гапоненко, К.Г. Скрябин. Метод регенерации in vitro побегов подсолнечника (Helianthus annuus L.) из асептических семян, как эксплантатов для генетической трансформации. 2007. Биотехнология. Т 6: 27-33.

2. Я.Б. Нескородов, К.Г. Скрябин. Индукция множественного побегообразования у эксплантов подсолнечника (Helianthus annuus L.) в культуре in vitro. 2009. Масличные культуры. Вып. 2 (141), с. 6-10.

3. Ya.B. Neskorodov, A.L. Rakitin, A.M. Kamionskaya, K.G. Skryabin. Developing phosphinothricin-resistant transgenic sunflower {Helianthus annuus L.) plants. 2009. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 100:65-71.

Тезисы докладов

4. Я.Б. Нескородов. Генетическая трансформация подсолнечника {Helianthus annuus L.). IX Международная конференция «Биология клеток in vitro и биотехнология». 2008. Звенигород. С.21 в.

5. Я.Б. Нескородов. Генетическая трансформация подсолнечника (Helianthus anmius L.) геном bar. Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина. V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва. 2009. с. 380.

6. Ya.B. Neskorodov. "Regeneration and genetic transformation of Russian sunflower cultivars and production of herbicide-resistant plants". 1st Workshop on plant molecular biotechnology XV biotechnology summer school. 2009. Gdansk. Poland.

7. Я.Б. Нескородов. «Генетическая трансформация подсолнечника {Helianthus annuus L.) сортов российской селекции». II международная научная конференция «Генетически модифицированные (биотехнологические) растения: перспективы использования и проблемы биобезопасности». Киев, Украина, 2009.

8. Ya.B. Neskorodov, K.G. Skryabin Regeneration and genetic transformation of Russian sunflower cultivars and production of herbicide-resistant plants.

SUNBIO 2010. 8 European sunflower biotechnology conference. Antalya, Turkey, p.36.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

При работе с настоящим обзором литературы, посвященной проблеме регенерации эксплантов подсолнечника в культуре in vitro и генетической трансформации этой культуры, используя систему взаимных ссылок, удалось объединить подавляющее большинство опубликованных англоязычных и отечественных работ по данной тематике.

К сожалению, в настоящий обзор не вошло несколько публикаций, ссылки на которые встречаются в некоторых статьях, так как не удалось обнаружить ни электронные копии данных публикаций, ни оригиналы изданий. Однако, основываясь на том факте, что другие авторы единично ссылаются на отсутствующие в данном обзоре публикации, можно предположить, что изложенные в них результаты могут внести небольшие коррективы в некоторых разделах настоящего обзора, оставив без изменения материал в целом [Приложение 1].

В настоящем обзоре целенаправленно не рассмотрена тема получения и культивирования протопластов подсолнечника, так как это направление непосредственно не связано с темой настоящей работы, хотя и базируется на технике культивирования клеток этого растения in vitro.

Также, в настоящем обзоре не учтены работы, проводимые по исследуемой теме в различных коммерческих компаниях, таких как «Pioneer», «Monsanto» и других крупных производителей сельскохозяйственной продукции, которые не публикуют результаты собственных исследований в открытой печати и все упоминания в настоящем обзоре о проводимых ими исследований почерпнуты из косвенных источников (таких как тезисы конференций, справочники и т.п.).

Термин «биотехнология» был придуман и предложен в 1917 венгерским инженером Карлом Эреки, который использовал его для описания процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свёклы [13]. Однако в настоящее время этот термин используется в значительно более расширенной трактовке. Сам автор термина давал следующее определение - это «все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты». В настоящее время биотехнология представляет собой научную дисциплину являющеюся пограничной между биологией и техникой.

В узком смысле биотехнология - совокупность методов и приемов создания полезных для человека продуктов и явлений с помощью биологических агентов. В состав биотехнологии входят генная, клеточная и экологическая инженерии.

Поскольку биотехнология используется в различных отраслях промышленности и затрагивает многие сферы жизни человека, в мире была принято решение о классификации направлений в этой области деятельности и введена следующая «цветовая» классификация:

1. «красная» биотехнология — биотехнология, связанная с обеспечением здоровья человека и потенциальной коррекцией его генома, а также с производством биофармацевтических препаратов (протеинов, ферментов, антител);

2. «зеленая» биотехнология - направлена на разработку и создание генетически модифицированных (ГМ) растений, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам, определяет современные методы ведения сельского и лесного хозяйства;

3. «белая» - промышленная биотехнология, объединяющая производство биотоплива, биотехнологии в пищевой, химической и нефтеперерабатывающей промышленности;

4. «серая» - связана с природоохранной деятельностью, биоремедиацией;

5. «синяя» биотехнология - связана с использованием морских организмов и сырьевых ресурсов [14].

Настоящая работа относится к области «зелёной» биотехнологии, методы которой за последние 10 лет стали широко применяться в сельском хозяйстве. По данным Международной службы по внедрению сельскохозяйственной биотехнологии (18ААА) суммарная площадь генетически модифицированных культур в 2008 году превысила 800 млн. га. Из 25 стран (55 % населения Земли), выращивающих подобные культуры, -10 стран являются развитыми, а 15 - развивающимися [15].

К сожалению, по причинам разного характера, Российская Федерация, на данный момент существенно отстаёт в этом направлении от ведущих стран. Отставание столь значительное, что, по оценкам 18ААА, только через 10 лет интенсивного развития агробиотехнологии, в России смогут быть сформированы серьезные предпосылки для того, чтобы в последующие годы оказывать конкуренцию лидирующим в этой отрасли странам, а российские разработки соответствовать мировому уровню и занять свое место на рынке биотехнологических культур. Глобальная стоимость этого рынка в 2008 году составила 7.5 млрд. долл. США [15].

По оценкам экспертов Общества биотехнологов России им Ю.А. Овчинникова и Союза предприятий биотехнологической отрасли широкое использование биотехнологий в сельском хозяйстве РФ позволит решать следующие проблемы и добиться следующих результатов [14]:

1. увеличить производительности в отрасли (увеличение урожайности, в том числе путем проявления устойчивости растений к вредителям);

2. получить растения, устойчивые к вирусным, грибковым и бактериальным болезням, с улучшенными качественными характеристиками;

3. уменьшить использование пестицидов и гербицидов (экологические и экономические выгоды);

4. сократить выброс углекислого газа (сокращение выброса благодаря биотехнологическим с/х культурам в 2007 году, по данным 18ААА, составило 14.2 млрд. кг С02);

5. сохранить и увеличить биоразнообразие (в том числе путем использования меньшей площади сельскохозяйственных земель);

6. предотвратить эрозию почв (за счет перехода на метод обработки почвы, не требующий вспахивания).

Прогнозируется, что подобная модернизация сельского хозяйства должна дать положительный социально-экономический эффект, который будет заключаться как в улучшении уровня благосостояния работников сельскохозяйственного направления и улучшении здоровья потребителей за счет снижения содержания в потребляемых продуктах пестицидов, инсектицидов и прочих вредных химикатов, так и в снижении загрязнённости воды, воздуха и почвы.

Вопреки существующему стабильному негативному отношению общества к идее использования ГМ растений, в настоящее время в России уже созданы генетически модифицированные сорта таких важных для отечественного сельского хозяйства культур, как картофель, устойчивый к колорадскому жуку [16] и сахарная свёкла, устойчивая к фосфинотрицину [17]. Есть публикации, сообщающие о получении генетически модифицированной пшенице, льне, томатах и некоторых плодовых деревьев.

Несмотря на большое значение подсолнечника для России, отечественное направление исследований в области генетической модификации этой культуры развито слабо. К настоящему времени генетически модифицированных растений подсолнечника отечественным авторами получено не было, а имеющиеся публикации посвящены одной из проблем всего процесса, а именно — регенерацию эксплантов в культуре in vitro [18, 19, 20, 21 22, 23, 24, 25]. Первая публикация была выпущена в 1987 году, а последняя - 1995. Подобное положение дел нельзя назвать удовлетворительным, потому как результаты работы, выполненной иностранными исследователями, в которой впервые упоминается подсолнечник, культивируемый in vitro, были опубликованы ещё в 1923 году [26].

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Нескородов, Ярослав Борисович

1УВЫВОДЫ

2. Разработан высокоэффективный метод регенерации подсолнечника in vitro, использующий в качестве источников эксплантов зрелые зародыши (семена). Метод позволяет получать из одного семени подсолнечника 4 экспланта с высоким регенерационным потенциалом. Частота регенерации побегов на полученных эксплантах составила 83,5 % - 90,3 %. Произведено сравнение разработанного нами метода с методом, использующим в качестве источников эксплантов проростки на стадии первых листьев. Частота регенерации побегов по разработанной нами методике была выше в 5-6 раз. Разработанный нами способ регенерации побегов не зависит от генотипа используемого растения. Применение в процедуре агробактериальной трансформации данного типа экспланта позволило получить трансгенные растения подсолнечника;

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нескородов, Ярослав Борисович, Москва

1. Theissen G., Saedler H. MADS-box genes in plant ontogeny and phylogeny: Haeckel's 'biogenetic law' revisited. 1995. Curr Opin Genet Dev 5: 628-639.

2. Coen E.S., Meyerowitz E.M. The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development. 1991. Nature. Vol.353. 31-37

3. Лукомец B.M., Пивень B.T., Тишков H.M., Шуляк И.И. Защита подсолнечникаю. 2008.

4. Защита и карантин растений. №2. 78(2)-96(20)

5. Михальцов В.П., Воблов А.П. Как снизить численность проволочников. Защита и карантин растений. 1998. №4. с. 55-56.

6. Инструкция по технике безопасности. Дуал Гол 960 ЕС. 2001. Syngenta.

7. Инструкция по технике безопасности. Гезагард 50 WP. 2001. Syngenta.

8. Паспорт безопасности. STOMP. 2006. BASF.

9. Карта данных по безопасности. Treflan 48 herbicide. 1994. Dow AgroSciences.

10. Федеральная служба по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды. Обзор загрязнения природной среды в российской федерации за 2006 г. Москва.

11. Basta® Non-Selective Herbicide. Material safety data sheet. 2007. Bayer Cropscience. 1-6 p.

12. Cantamutto M, Poverene M. Genetically modified sunflower release: Opportunities and risks.2007. Field Crops Research. 133-144

13. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Москва. Мир. 2002.

14. Общество биотехнологов России им Ю.А. Овчинникова. Союз предприятий биотехнологической отрасли. Рабочие материалы к стратегии развития биотехнологической отрасли промышленности до 2020 года (проект). 2009. Москва.

15. Международная служба по внедрению агробиотехнологических разработок (ISAAA).2008. Обзор № 39. Найроби, Кения.

16. Патент на изобретение №2231551 от 27 июня 2004. Стародубцева (Камионская) A.M., Белоусова М.Б., Конов A.JL, Скрябин К.Г. Способ получения генетически модифицированных растений картофеля сорта Голубизна с помощью Agrobacterium tumefaciens.

17. Мишуткина Я.В., Камионская A.M., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений сахарной свеклы, экспрессирующих ген bar. Прикладная биохимия и микробиология. 2010, т. 46. № 1: 80-86.

18. Антонова Т.С., Маляровская В.И. Индукция адвентивных побегов в культуре апикальных меристем подсолнечника. 1987. Научно-технический бюллетень Всесоюзного научно-исследовательского института масличных культур.вып. 4 (99).

19. Антонова Т.С., Боровков А.Ю., Зезуль Т.Г., Краснянский С.Ф. Прямой соматический эмбриогенез из семядолей зрелых и незрелых зародышей подсолнечника. 1988. НТБ ВНИИМК. 4(103) 16-21.

20. Пушкаренко А.Я., Игнатова С.А., Лукьяшок С.Ф. Культура незрелых зародышей подсолнечника in vitro. 1988. ВСГИ (сборник научных трудов). 72-76.

21. Пушкаренко А.Я. Игнатова С.А., Лукьянюк С.Ф. Влияние эндогенных фенолов на индукцию каллусообразования и регенерацию in vitro у подсолнечника. 1989. НТБ ВСГИ. Т. 1. с. 36-42

22. Зезуль Т.Г., Антонова Т.С., Боровков А.Ю. Регенерационная способность каллуса из гипокотилей проростков различных генотипов подсолнечника. НТБ ВНИИМК. 1990. Вып. 2(109). С.3-7.

23. Ульянов А.Н. Каллусообразование у двух генотипов подсолнечника. 1990. НТБ ВНИИМК. 2(109) 8-10

24. Антонова Т.С., Краснянский С.Ф., Челюстникова Т.А., Зезуль Т.Г. Соматический эмбриогенез в каллусе из семядолей незрелых зародышей подсолнечника. 1991. Доклады ВАСХНИЛ. №4: 9-13

25. Зезуль Т. Г., Горбатенко Э.В., Ралдугина Г.Н. Регенерация in vitro растений подсолнечника (Helianthus annuus L.) через соматический эмбриогенез. 1995. Генетика. Том 31, №2, с. 228-233

26. Robbins J. Wm., Maneval W.E. Further experiments on growth of excised root tips under sterile conditions. 1923. Botanical Gazette.Vol.76, No.3. pp.274-287.

27. Тахтаджян A.JI. Система магнолиофитов. 1987. Л. Наука.439 с.

28. Seiler, G. Utilization of wild sunflower species for the improvement of cultivated sunflower. 1992. Field Crop Research, 30: 191-194.

29. Skoric, D., 1993. Wild species use in sunflower breeding results and future directions. Plant Genetic Resource Newsletter, 93: 17-23.

30. Heiser C.B., Smith D.M., Clevender S.B., Martin W.C., The North Americsn sunflower (.Helianthus). 1969. Mem. Torrey Bot. Club. V.22. № 3. p. 1-218.

31. Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи. Изд. 2-е переработан, и дополн. 1964. Л. Колос. 792 с.

32. Пустовойт B.C. Подсолнечник. 1975. М. Колос. 700 с.

33. Сациперов В.Ф. К вопросу классификации сортов подсолнечника. 1913. Тр. Прикладной ботаники. T.VI.

34. Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи. 1950. М.: Советская наука.С.206-210.

35. Heiser С.В. Species crosser in Helianthus. Ill Delimination of "section". 1965. Ann. Missouri. Bot. Gard. V.52. №3. p.364.

36. Seiler, G., Rieseberg, L.H., 1997. Systematic, Origins and Germoplasm resources of Wild and Domesticated Sunflower. In: Sclineiter, A.A. (ed.), Sunflower Technology and Production, 35: 21-65. Agronomy, Madison, Wisconsin, USA.

37. Shilling E.E., Heiser C.B. Infrageneric classification of Helianthus (Compositae). 1981. Taxon. №30. p.393-403.

38. Анащенко A.B. К систематике рода Helianthus L.1974. Бот. Жур. T.59-N 10.С.1472-1481.

39. Анащенко A.B. Филогенетические связи в роде Helianthus L. 1979. Труды по прикл. бот. ген. и сел. Т.64-Вып.2-с. 146-156.

40. Анащенко А.В. Центры происхождения геномов и центры наибольшего разнообразия видов и форм рода Helianthus L. 1982. Вести с-х науки.№ б.с. 47-52.

41. Schuster, W.H., 1993. Die Ztichtung der Sonnenblume (Helianthus annuns L.). Paul Parey Scientific Publishers. Berlin and Hamburg 184 p.

42. Gentzbittel Z., Pernault A., Nicolas P., Molecular phylogeny of the Helianthus genus, based on nuclear restriction fragment length polymorphism analysis. 1992. Mol. Biol. Evol. V.9-p. 872-892.

43. Венцлавович Ф.С. Подсолнечник (.Helianthus annuus L.). Мировые растительные ресурсы как исходный материал для селекции. 1935. М.-Л.:ВАСХНИЛ. выпУ1.:Масличные культуры. Технические культуры. С.5-39.

44. Калайджян А.А., Головин В.П., Петренко И.М., Трубилин А.И., Горковенко Л.Г., Вартанян В.В. Подсолнечник и его изменчивость. 2003. Монография. Симферополь: Таврия. С. 217.

45. Heiser С.В. Variation and subspeciation in the common sunflower, Helianthus annuus. 1954. Am Midland Naturalist. 51:287-305

46. Piperno D.R. On Maize and the Sunflower.2001.Science. Vol. 292. no. 5525, pp. 2260 2261

47. Тищенко E.H., Михальская С.И. Агробактериальная трансформация подсолнечника. 2006. Физиология и биохимия растений. Т.38. №3. 187-196

48. Paniego N., Heinz R, Fernandez P., Talia P., Nishinakamasu V., Hopp H.E. Genome mapping and molecular breeding in plants. Volume 2. Oilseeds. 2007. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 153-177

49. Афонин A.H., Гринн С.Л., Дзюбенко Н.И., Фролов А.Н. Интерактивный Атлас полезных растений, их вредителей и агроэкологических факторов России и сопредельных стран Интернет-версия 1.0. 2006. http://www.agroatlas.ru

50. ФГУ Госсорткомиссия. http://gossort.ru/lists/catalogll.html

51. James С. Global Status of Commercialized Biotech GM Crops: 2005 International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA). http://www.isaaa.org

52. Dalton Rex. Superweed study falters as seed firms deny access to transgene. 2002. Nature. Vol. 419. 655.

53. Sarrafi A., Roustan J.P., Fallot J., Alibert G. Genetic analysis of organogenesis in the cotyledons of zygotic embryos of sunflower (Helianthus annuns L.) 1996. Theor. Appl. Genet. 92:225-229

54. Deglene L., Lesignes P., Alibert G., Sarrafi A. Genetic control of organogenesis in cotyledons of sunflower (Helianthus annuus). 1997. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 48:127-130.

55. Bronner R., Jeannin G., Hahne G. Early cellular events during organogenesis and somatic embryogenesis induced on immature zygotic embryos of sunflower (Helianthus annuus). 1994. Can.J.Bot. 72: 239-248

56. Daimon Y., Takabe K„ Tasaka M. The CUP-SHAPED COTYLEDON genes promote adventitions shoot formation on calli. 2003. Plant Cell Physiol. 44: 113-121.

57. Henrickson C.E. The flowering of sunflower explants in aseptic culture. 1954. Plant Physiol. 29 (6): 536

58. Bohorova N.E., Cocking E.C., Power J.B. Isolation, culture and callus regeneration of protoplasts of wild and cultivated Helianthus species. 1986. Plant Cell Reports. 5:256-258

59. Espinasse A., Lay C. Shoot regeneration of callus derived from globular to torpedo embryos from 59 sunflower genotypes. 1989. Crop Sci. 29:201-205

60. Berrios E.F., Gentzbittel L., Alibert G., Griveau Y., Berville A., Sarrafi A. Gcnetic control of in vitro-organogenesis in recombinant inbred lines of sunflower (.Helianthus annuus L.). 1999. Plant Breeding. 118: 359-361.

61. Nestsres G., Zorzoli R., Mroginski L., Picerdi L. Heriatbility of in vitro plant regeneration capacity in sunflower. 2002. Plant Breeding. Volume 121 Issue 4, Pages 366 368.

62. Воронина И. П. Разработка системы генетической трансформации подсолнечника (.Helianthus annum L. ). Диссертация. Москва. 1992.

63. Сангван Х.С. Получение и исследование трансгенных растений подсолнечника Helianthus annum L. 1993. Москва. Диссертационная работа на соискание учёной степени кандидата биологических наук.

64. Riker A.J., Gutsche А.Е. The growth of sunflower tissue in vitro on synthetic media with various organic and inorganic sources of nitrogen. American Journal of Botany. 1948. Vol. 35, No. 4. pp. 227-238.

65. Мишуткина Я.В., Гапоненко A.K. Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и генотипа на частоту регенерации растений сахарной свёклы (Beta vulgaris L.) in vitro. 2006. Генетика. 42: 210-218.

66. Alibert G., Aslane-Chanabe C., Burrus M. Sunflower tissue and cell cultures and their use in biotechnology. 1994. Plant Physiol. Biochem. 32: 31-44

67. Heupel Т., Kutschera U. Effect of white light on meristematic activity in developing sunflower hypocotyls. 1996. Protoplasma. 123-129.

68. Hildebrandt A.C., Riker A.J., Duggar B.M. The influence of the composition of the medium on growth in vitro of excised tobacco and sunflower tissue cultures. 1946. Amer. Jour. Bot. 33:591-597

69. White P.R. A handbook of plant tissue culture. 1943. The Ronald Press Company, New York. Pp. 1-277.

70. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. 1962. Physiologia Plantarum 15 (3), 473-497

71. Moyne A.-L., Thor V., Pelissier В., Bergounioux C., Freyssinet G., Gadal P. Callus and embryoid formation from protoplasts of Helianthus annum. 1988. Plant Cell Reports. 7:437 440

72. Fischer C., Klethi P., Hahne G. Protoplasts from cotyledon and hypocotyl of sunflower (Helianthus annuus L.): shoot regeneration and seed production. 1992. Plant Cell Reports. 11:632-636.

73. Jeannin G., Bronner R., Haline G. Somatic embryogenesis and organogenesis induced on the immature zygotic embryo of sunflower (Helianthus animus L.) cultivated in vitro: role of the sugar. 1995. Plant Cell Reports. 15:200-204.

74. Chraibi B.K.M., Latche A., Roustan J.-P., Fallot J. Stimulation of shoot regeneration from cotyledons of Helianthus annuus by the ethylene inhibitors, silver and cobalt. 1991. Plant Cell Reports. 10: 204-207.

75. Knittel N., Escandon A.S., Hahne G. 1991. Plant regeneration at high frequency from mature sunflower cotyledons. Plant Sci 73: 219-226

76. Chraibi B.K.M., Castelle J.-C., Latche A., Roustan J.-P., Fallot J. 1992. Enhancement of shoot regeneration potential by liquid medium culture from mature cotyledons of sunflower (Helianthus annuus L.).Plant Cell Reports. 10:617-620.

77. Sadhu M.K. Effect of different auxins on growth and differentiation in callus tissue from sunflowers stem pith. 1974. Indian J. Exp. Biol. V.12, n. 1 P. 110-111.

78. Greco В., Tanzarella O.A., Carrozzo G., Blanco A. Callus induction and shot regeneration in sunflower (Helianthus annuus L.). 1984. Plant Sci. Lett. V.36, n.l. P. 73-77

79. Paterson K.E., Everett N.P. Regeneration of Helianthus annuus inbred plants from callus. 1985. Plant Science. 42:125-132.

80. Cavallini A., Lupi M.C. Cytological study of callus and regenerated plants of sunflower (#. annuus L.). 1987. Plant Breed. V.99, n.3.-P.203-208.

81. Lupi M.C., Bennici A., Locci F., Gennai D. Plantlet formation from callus and shoot-tip culture of Helianthus annuus (L.). 1987. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 11: 47-55

82. BogorovaN.E., Atanassov A.I., Antonova G.P. In vitro isolation of anthers from interspecific hybrids in the Helianthus genus. 1980. CR Acad Sci Bulg 33: 1545-1548.

83. Федорова T.C., Никитина Н.И. Цитология каллусогенеза пыльников подсолнечника в культуре in vitro. 1983. НТВ ВНИИМК.В.82. с. 17-22.

84. Gelebart P. Lean Han San. Production of haploid plants of sunflower (Helianthus annus L.) by in vitro culture of nonfertilized ovaries and ovules. 1987. Agronomie. V.7. n.2. P.81-86.

85. Фролова JI.B. Особенности популяции культивируемых клеток. 1981. Культура клеток растений. Москва. Наука, с. 167.

86. Лопатин М.И. Поражаемость растений возбудителем корневого рака растений Bast, TumefaciensSm.A.Town. 1936. Микробиология. Т.5. вып. 5. с. 716-724.

87. Linsmaier Е.М, Skoog F. Organic growth factor requirement of tobacco tissue culture. 1965. Physiol Plant 18:100-127

88. Егорова T.A., Клунова С.M., Живухина E.A. Основы биотехнологии: Учебное пособие для высш. пед. учеб. заведений. 2005. 2-е изд., стер. М: Издательский центр «Академия», 2005. - 208 с.

89. Смирнов Ю.С. Общее содержание фенолов у H. annuus (Asterасеае) при обогащении среды микроэлементами. 1982. Ботанический журнал. Т.67, №4, С. 440-446.

90. Смирнов Ю.С. Активность полифенолоксидазы у растений H. annuus L. (Compositae) при обогащении среды микроэлементами. 1978. Т.63, № 11, с. 1636-1639.

91. Finer J.J. Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of hybrid sunflower (.Helianthus annuus L.) on a high sucrose-containing medium. 1987. Plant Cell Reports. 6:372-374.

92. Freyssinet M., Freyssinet G. Fertile plant regeneration from sunflower (Helianthus annuus) immature embryo. 1988. Plant Science. 56: 177-181

93. Chraibi B.M.K., Latché A., Roustan J.P., Fallot J. Stimulation of shoot regeneration from cotyledons of Helianthus annuus by the ethylene inhibitors, silver and cobalt. 1991. Plant Cell Reports. 10:204-207.

94. Berrios E.F., Gentzbittel L., Serieys H., Alibert G., Sarrafi A. Influence of genotype and gelling agents on in vitro regeneration by organogenesis in sunflower. 1999. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 59:65-69.

95. Pélissier В., Bouehefra О., Pépin R., Freyssinet. Production of isolated somatic embryos from sunflower thin cell layers. 1990. Plant Cell Reports. 9: 47-50.

96. Espinasse A., Lay C., Volin J. Effects of growth regulator concentrations and explant size on shoot organogenesis from callus derived from zygotic embryos of sunflower {Helianthus annuus L.). 1989. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 17:171-181.

97. Power C.J. Organogenesis from Helianthus annuus inbreds and hybrids from the cotyledons of zygotic embryos. 1987. Am. J. Bot. 74:497-503

98. McCann A.W., Cooley G., Van Dreser J. A system for routine plantlet regeneration of sunflower {Helianthus annuus L.) from immature embryo-derived callus. 1988. Plant cell, tissue and organ culture. 14: 103-110.

99. Jeannin G., Bronner R., Hahne G. Somatic embryogenesis and organogenesis induced on the immature zygotic embryo of sunflower (Helianthus annuus L.) cultivated in vitro: role of the sugar. 1995. Plant Cell Reports. 15:200-204.

100. Sujatha M., Prabakaran A.J. High frequency embryogenesis in immature zygotic embryos of sunflower. 2001. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 65: 23-29.

101. Полевой B.B. Физиология растений: Учеб. для биол. спец. вузов. М.: Высш. шк., 1989.-464 е.: цв.ил.

102. Чумаков М.И. Механизм агробактериальной трансформации растений. Монография. 2001. Саратов. «Слово», с.256 с ил.

103. Paal Н.А., Kurnika Е., Szobo L. Plantlet regeneration from in vitro shoot-tip culture of sunflower. Novenytermeles 30: 201-209.

104. Paterson E.K. Shoot tip culture of Helianthus annuus flowering and development of adventitious and multiple shoots. 1984. American Journal of Botany. 71(7):925-931.

105. Ceriani M.F., Норр H.E., Hahne G., Escandon A.S. Cotyledons: an explant for routine regeneretion of sunflower plants. 1992. Plant Caell Physiol. 33(2): 157-164.

106. Everett N. P., Robinson К. E. P., Mascarenhas D. Genetic Engineering of Sunflower СHelianthus annuus L.). 1987. Nature Biotechnology 5, 1201 1204.

107. Peerbolte R., Dek G.J. 1991. The Everett transformation-protocol for sunflower hypocotyls. Why doesn't it work? In: Proceedings of the first International Sympsium on 'Sunflower Biotechnology in Europe, Cell Biology, Mittelwihr, France, P.3.

108. Bidney D., Scelonge C., Martich J., Burrus M., Sims L., Huffman G. Microprojectile bombardment of plant tissue increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens. 1992. Plant Molecular Biology. 18:301-313

109. Grayburn W.S., Vick B.A. 1995. Transformation of sunflower (Iielianthus annuus L.) following wounding with glass beads. Plant Cell Rep. 14: 285-289.

110. Weber S., Friedt W.5 Landes N., Molinier J. 2003. Improved Agrobacterium-medi?i\&<i transformation of sunflower (Helianthus annuus L.): assessment of macerating enzymes and sonication. Plant Cell Rep. 21: 475-482.

111. The Netherlands Culture Collection of Bacteria (NCCB, formerly LMD and Phabagen) http://www.cbs.knaw.nl/About/nccb.aspx

112. Manavella P.A., Chan R.L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. 2009. Nature protocols. Vol.4 №.11 1699-1707.

113. Matzke M.A., Susani N., Lewis E.D., Rubenstein I., Matzke A.J.M. 1984. Transcription of a zein gene introduced into sunflower using Ti plasmid vector. EMBO J. 3: 1525-1531.

114. Helmer G., Casadaban M., Bevan M., Kayes L., Chilton M. 1984. A new chimeric gene as a marker for plant transformation: The expression of Echerichia coli /?-galactosidase in sunflower and tobacco cells. Biotechnology, 2: 520-527.

115. Goldsborough P.B., Gelvin S.B., Larkins B.A. 1986. Expression of maize zein genes in transformed sunflower cells. Mol. Gen. Genet., 202: 374-381.

116. Schrammeijer B., Sijmons P.C., Peter J.M. van der Elsen, Hoekema A. Meristem transformation via Agrobacterium. 1990. Plant Cell Reports. 9:55-60.

117. Escandon A.S., Hahne G. 1991. Genotype and composition of culture medium are factors important for transformed sunflower (Helianthus annuus L) callus. Physiol. Plant., 81: 367376.

118. Knittel N, Lenee P., Ben Tahar S. 1992. Transformation of sunflower (Helianthus annum. L.). Du gène à l'entreprise, Forum jeunes chercheurs, Amiens, France, 122.

119. Pugliesi C., Biasini M.G., Fambrini M., Baroncelli S. 1993. Genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens in the interspecific hybrid Helianthus annum x Helianthus tuberosus. Plant Sci., 93: 105-115.

120. Knittel N., Gruger V., Hahne G., Lénéé P. 1994. Transformation of sunflower (.Helianthus annuus L.): A reliable protocol. Plant Cell Rep., 14: 81-86.

121. Laparra H., Burras M., Huonold R., Damm B., Bravo-Angel A. M., Bronner R., Hahne G. 1995. Expression of foreign genes in sunflower (Helianthus annuus L.) evaluation of three gene transfer methods. Euphytica, 85: 63-74.

122. Burras M., Molinier J., Himber C., Hunold R., Bronner R., Rousselin P., Hahne G. Agrobacterium-mediated transformation of sunflower {Helianthus annuus L.) shoot apices: transformation patterns. 1996. Molecular Breeding. 2: 329-338.

123. Gtirel E., Kazan K. 1998. Development of an efficient plant regeneration system in sunflower (.Helianthus annuus L.). Tr. J. of Botany. 22: 381-387.

124. Rao K.S., Rohini V.K. 1999. Agrobacterium-mediated transformation of sunflower (Helianthus annum L.): A simple protocol. Annals of Botany, 83: 347-354.

125. Lucas 0., Kallerhoff J., Alibert G. 2000. Production of stable transgenic sunflowers (Helianthus annuus L.) from wounded immature embryos by particle bombardment and co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens. Mol. Breed., 6:476-487.

126. Miiller A., Iser M., Hess D. Stable transformation of sunflower (Helianthus annuus L.) using a non-meristematic regeneration protocol and green fluorescent protein as a vital marker. 2001 Transgenic research 10: 435-444.

127. Molinier J., Thomas C., Brignou M., Hahne G. 2002. Transient expression of ipt gene enhances regeneration and transformation rates of sunflower shoot apices (Helianthus annuus L.). Plant Cell Rep., 21: 251-256.

128. Trifi M., Mezghani S., Marrakchi M. Vegetative propagation of the sunflower Helianthus annuus L. by in vitro culture. 1981. Physiol. Veg. 19:99-102.

129. Ivanov P., Enchiva J., Ivanova I. A protocol to avoid precocious flowering of sunflower plantlets in vitro. 1998. Plant Breed 117:582-584.

130. Mayor M.L., Nestares G., Zorzoli R, Picardi L.A. Reduction of hyperhydricity in sunflower tissue culture. 2003. Plant Cell Tissue Organ Cult. 72:99-103

131. Dekeyser R., Claes В., Marichal M., Montagu V.M., Caplan A. Evalution of selectable markers for rice transformation. 1989. Plant Physiol. 90:217-223.

132. Lloyd MA., Barnason A.R., Rogers S.G., Byrne M.C., Fraley R.T., Horsch R.B. Transformation of Arabidopsis thaliana with Agrobacterium twnefaciens. 1986. Science. Vol. 234. no. 4775, pp. 464 466

133. Radonic L.M., Zimmermann J.M., Zavallo D, Lopez N., Bilbao M.L. Rooting in Km selective media as efficient in vitro selection method for sunflower genetic transformation. 2006. Electronic Journal of Biotechnology. Vol.9. No 3.

134. Murakami Т., Anzai H., Imai S., Satoh A. Nagaoka K., Thompson C.J. The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus: molecular cloning and characterization of the gene cluster. Mol. Gen. Genet. 1986. V. 205. P. 42-50.

135. Lindsey К. Genetic manipulation of crop plants. J. Biotech. 1992. V. 26. P. 1-28.

136. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. GUS fusion: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. 1987. EMBOJ. V.6.P.3901-3907

137. Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D. Beta-glucuronidase from Escherichia coli as a genefusion marker. 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.83.P.8557-8451

138. Зверева С.Д., Романов Г.А. Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования. 2000. Физиология растений. T.47.C. 479-488.

139. Aono М., Kubo A., Saji Н., Tanaka К., Kondo N. Enhanced tolerance to photooxidative stress of transgenic Nicotiana tabacum with high chloroplastic glutathione reductase activity. 1993. Plant and Cell Physiology. 34: 129-135

140. Jaglo-Ottosen K.R., Gilmour S.J., Zarka D.G., Schabenberger O., Thomashow M.F. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. 1998. Science. Vol. 280. no. 5360, pp. 104-106

141. Center for environmental risk assessment. GM crop database. X81359.

142. Baumgartner J. R., A1 Khatib K., Currie S.R. 1999. Common sunflower resistance to imazethapyr and chlorimuron in northeast Kansas. Proceedings of the Western Society of Weed Science. 52: 12-15.

143. Seiler J.G. Improving oil quality in sunflower using its wild relatives. U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Crop Science Laboratory, Fargo, ND 58105

144. Cornish K., Scott D. Biochemical regulation of rubber biosynthesis in guayule (.Parthenium argentatum Gray). 2005. Ind. Crop Prod. 22 (1), 49-58.

145. Veatch M., Ray D., Май C., Cornish K. Growth, rubber, and resin evaluation of two-year-old transgenic guayule. 2005. Ind. Crops Prod. 22 (1), 65-74.

146. Murashige, Т., Skoog, F. A., Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol., 1962. V. 15. P. 473-476

147. Gamborg, O., The effects of amino acid and ammonium on the growth of plant cells in suspension cultures. Plant Physiol., 1970. V. 45. P. 372-375

148. Hood E.E., Gelvin S.B., Melchers L.S., Hoekema A. New Agrobacterium helper strains for gene transfer to plants. Transgenic Res. 1993. V. 2. P. 208-218.

149. Bertani G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Bacteriol, 1951. Bd. 62, Nr. 3, S.293-300.

150. Lichtenstem C., Draper J. Genetic engineering of plants, mDNA cloning. A practical approach. 1985. IRL Press, Oxford, UK, pp. 67-1 19.

151. Навашин C.M., Фимина Н.П. Справочник по антибиотикам. 1974. Москва. «Медицина», с.415.

152. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие для врачей. Часть вторая. Издание двенадцатое, переработанное и дополненное. Москва. "Медицина". 1993.

153. Пустовойт B.C. Подсолнечник (монография). 1975. Под общей редакций академика B.C. Пустовойта М. «Колос». 592 с. с ил.

154. Habermanhn Н., Wallace R. Н. Transfer of flowering stimulus from stock to scion in grafted Helianthus annum L. 1958. Amer. J. Bot. 45: 479-482.

155. Dellaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol.Biol.Rep. 1987. v. 1. p. 19-21.

156. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 3-17.клонирование. 1984. М.: Мир, 480 с.

157. Strategic Diagnostics Inc: www.sdix.com

158. Vitha S. Histochemical localization of P-glucuronidase (GUS) reporter activity in plant tissues. Microscopy and Imaging Center, Texas A & M University http://www.tamu.edu/mic

159. Падегимас JI.С., Шульга О.А., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum и Solarium tuberosum, устойчивых к гербициду фосфинотрицину. Мол. Биол. 1993. Т. 27. №4. С.947-951.

160. Becker D. Binary vectors which allow the exchange of plant selectable markers and reporter genes. Nucleic Acids. Res. 1990. V. 18. P. 203.

161. Гуляев Г.М., Гужов Ю.Л. Селекция и семеноводство полевых культур. 1987. Агропромиздат. 447 с.

162. Taylor A.G., Hill H.J., Xue-lin Huang, Tai-gi Min. Determining seed viability. United States petent. 1990. PNA4975364

163. Dadlania M., Agrawala P.K. Factors influencing leaching of sugars and electrolytes from carrot and okra seeds. 1983. Scientia Horticulturae. 19: 39-44.

164. Taylor A.G., Hill H.J., Xue-lin Huang, Tai-gi Min. Determining seed viability. 1990. United States patent 4975364.

Информация о работе

Нескородов, Ярослав Борисович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка эффективной системы регенерации подсолнечника (Helianthus annuus L.) in vitro для получения трансгенных растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Разработка эффективной системы регенерации подсолнечника (Helianthus annuus L.) in vitro для получения трансгенных растений - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы