Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка рекомбинантных вакцин-кандидатов против весенней виремии карпа и исследование их иммуногенных и протективных свойств

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка рекомбинантных вакцин-кандидатов против весенней виремии карпа и исследование их иммуногенных и протективных свойств"

На правах рукописи

Воронова Ольга Сергеевна

РАЗРАБОТКА РЕКОМБИНАНТНЫХ ВАКЦИН-КАНДИДАТОВ ПРОТИВ ВЕСЕННЕЙ ВИРЕМИИ КАРПА И ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОГЕННЫХ И ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

__ _ Кольцове - 2005

29092«

Работа выполнена в ФГУП Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», МЗ СР РФ

Научный руководитель:

кандидат химических наук Орешкова С. Ф.

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук Глотов А.Г.

кандидат биологических наук Шишкина Л. Н. ^

Ведущая организация:

ФГУП Всероссийский институт пресноводного рыбного хозяйства Федерального Агентства по рыболовству Минсельхоза России (п. Рыбное Московской области)

Защита состоится «29» декабря 2005 г. в /3 часов на заседании специализированного совета при ФГУП Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: 630559, Кольцове Новосибирской области (тел.: (8-383) 336-74-28)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Автореферат разослан «28» ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

zoo 6-4 1ÍQ67

2 2G4OM

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ашуальность проблемы.

В аквакультуре, как и в любой другой биоиндустрии, неизбежны проблемы, связанные с заболеваниями разводимых животных. Инфекционные болезни, которые в дикой природе возникают как спорадические случаи, могут вызвать высокую смертность в условиях рыбного хозяйства, поэтому для успешного развития отрасли необходимы эффективные средства их профилактики и лечения.

Весенняя виремия карпа - остро протекающее высококонтагиозное заболевание, вызываемое вирусом Rhabdovirus carpió (spring viremia of carp virus, SVCV). По классификации Международного эпизоотического бюро весенняя виремия карпа относится к категории особо опасных (декларируемых) болезней рыб. Она широко распространена в рыбоводческих хозяйствах Европы, в том числе в России и других государствах бывшего СССР. Кроме того, в последнее время вспышки заболевания были зарегистрированы в регионах, прежде считавшихся благополучными: в 2002 г. ВВК была обнаружена в США, а в 2004 г. - в Китае. В связи с этим, весенняя виремия карпа была внесена в список International Aquatic Animal Health Code of the OIE как заболевание, требующее контроля по причине его распространения.

Создание эффективной вакцины могло бы помочь в решении данной проблемы. В последнее время одним из приоритетных направлений в экспериментальной ветеринарии стала разработка рекомбинантных вакцин. По сравнению с традиционными, эти вакцины обладают рядом преимуществ, что делает их привлекательными для аквакулыуры.

Главный иммунопротективный белок рабдовирусов - расположенный на поверхности вириона трансмембранный шикопротеин - стимулирует выработку в организме рыб вируснейтрализующих антител. Как и у теплокровных, эти антитела в значительной степени определяют природу иммунитета при рабдовирусной инфекции. Таким образом, G-белок рабдовирусов является подходящим кандидатом на роль имму-ногенной основы для рекомбинантных вакцин.

В ихтиологии основные исследования в этой области проведены с двумя рабдовирусами рыб: вирусом инфекционного некроза гемопо-этической ткани (вирусом ИНГТ) и возбудителем вирусной геморрагической септицемии (ВГС). Было показано, что рекомбинантные белки частично защищают рыб от рабдовирусной инфекции, тогда как

ДНК-вакцины на основе последовательностей, кодирующих гликопро-теин этих вирусов, исключительно эффективны.

Цель работы и задачи иследования.

Цель настоящей работы - разработка и создание экспериментальных плазмидных конструкций - кандидатных рекомбинантных вакцин против весенней виремии карпа, и исследование их иммуногенных и про-тективных свойств.

В соответствии поставленной целью решались следующие задачи:

• Получить штамм-продуцент фрагмента вирусного гликопротеина, как вариант субъединичной вакцины против весенней виремии карпа.

• Сконструировать ряд рекомбинантных плазмидных ДНК - кандидатных ДНК-вакцин, со вставкой последовательностей, кодирующих гликопротеин или нуклеопротеин вируса.

• Оценить иммуногенные и протективные свойства созданных кандидатных вакцин в эксперименте.

• Оценить влияние на эффективность вакцинации неспецифических иммуностимуляторов, повышения температуры воды в аквариумах и дозы вводимой рыбам плазмидной ДНК.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате проделанной работы впервые была установлена принципиальная возможность профилактики ВВК с помощью рекомбинантных конструкций на основе прокариотического (иммунизация рекомбинан-тным белком) или эукариотического (ДНК-вакцинация) векторов, экс-прессирующих гликопротеин вируса. ДНК-вакцинация показала себя как наиболее перспективная технология при создании препаратов против этого заболевания.

Созданные кандидатные вакцины со вставкой гена вирусного гликопротеина могут представлять интерес для практической аквакульту-ры, поскольку являются эффективными при однократной иммунизации, экономически выгодными и простыми в обращении. Вирус ВВК стал, таким образом, четвертым рабдовирусом рыб (после вируса ИНГТ, ВГС и Нтте ЛаЬсктгиз), для которых такая возможность установлена.

Апробация работы и публикации.

Полученные результаты представлены на восьми международных конференциях. По материалам диссертации была опубликована статья и

получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из семи разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 129 страницах машинописного текста и включает рисунки, таблицы и список литературы, содержащий ссылки.

Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом, под руководством и в соавторстве с Ореш-ковой С.Ф. Испытания кандидатных вакцин были проведены на базе Всероссийского научно-исследовательского института пресноводного рыбного хозяйства.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Плазмидные ДНК-кандидатные вакцины, кодирующие гликопро-теин вируса весенней виремии карпа американского изолята вируса

Первостепенной задачей работы являлась оценка возможности профилактики весенней виремии у карпа с использованием рекомбинант-ных вакцин-кандидатов.

В нашем распоряжении имелась плазмида pcDNA3-G-a, которая была любезно предоставлена профессором J.C. Leong (Oregon State University, USA). Данная рекомбинантная ДНК кодирует полноразмерный шикопротеин американского изолята вируса ВВК, экспрессия которого проходит под контролем цитомегаловирусного (CMV) промотора (рис.1).

Фрагмент нуклеотидной последовательности гена гликопротеина из данной конструкции, кодирующий основные антигенные эпитопы этого белка, был встроен нами в экспрессирующий прокариотический вектор pQE31. В полученной конструкции pQE-G последовательность неполного G-гена находилась под контролем промотора фага Т5, содержащего две 1ас-операторные последовательности для прокариотической наработки фрагмента этого белка вируса, как основы экпериментальной субъединичной вакцины против ВВК (рис.1).

При электрофоретическом анализе лизатов клеток, E.cdi трансформированных плазмидой pQE-G, было выявлено наличие в индуциро-

Pcmv T1'EcoRI

G-ген-а

Ap(r)

Sail

фрагмент^ G-гена

nT5

АЫт)

ColE

риСоп

~ БУ40 ЭУ40 ро1УА №П(Г)

Рис.1. Схема конструкций со вставкой нуклеотидной последовательности, кодирующей гликопротеин вируса ВВК американского изолята.

ванных ИПТГ культурах дополнительного белка с молекулярной массой около 48 кДа, что соответствует расчетной массе фрагмента вирусного гликопротеина (рис. 2).

Рис. 2. (1-3) Электрофореграмма (10 % ДСН ПААГ) и (4-5) им-муноблот-анапиз лизатов клеток E.coli с анти-вирус ВВК кроличьей сывороткой в разведении 1:500 М - маркер молекулярного веса

1. индуцированная культура клеток Е. coli JM103/pQE-G

2. неиндуцированная культура клеток E.coli JM103/pQE-G

3. индуцированная культура клеток E.coli JM103/pQE31

4. индуцированная культура клеток E.coli JM103/pQE31

5. индуцированная культура клеток Е coli JM103/pQE-G.

Уровень продукции этого полипептида по данным денситометрии составлял более 3,5 % от суммарного клеточного белка. В ТИФА и им-муноблот-анализе была показана специфичность взаимодействия полученного рекомбинантного белка (фрагмента гиикопротеина) с анти-ви-рус ВВК кроличьей сывороткой (рис. 3).

1,6

штат Е соЦ/рОЕЗ 1 лизат Е со11/р(5Е-0 лизат вируса ВВК лизат ЕРС клеток

Ш анти-вирус ВВК сыворотка □ нормальная кроличья сыворотка

Рис 3. Связывание фрагмента рекомбинантного гликопротеина в составе клеточных лизатов Е. сок, трансформированных плазмидами р<ЗЕ-0 или р(?Е31, с анти-вирус ВВК кроличьей сывороткой в разведении 1:500.

Иммуногенность экспериментальных вакцин

В эксперименте годовики карпа были однократно иммунизированы рекомбинантным белком (внутрибрюшинная инъекция) или плазмид-ной ДНК рсБЫА-О-а (внутримышечная инъекция). Инактивированный формалином вирус ВВК российского изолята ЗЛ4 использовали в качестве положительного контроля вакцинации (внутрибрюшинная инъекция).

Вируснейтрализующая активность была зарегистрирована только в группе рыб, получивших ДНК-вакцину, причем в среднем только у половины вакцинированных карпов. Титры вируснейтрализугощих АТ

были невысокими (максимум 256), что согласуется с аналогичными данными, полученными на моделях с другими рабдовирусами рыб, которые свидетельствуют о слабых антигенных свойствах их белков.

Продукция вируснейтрализующих AT в организме карпов, иммунизированных ДНК-вакциной, доказывает, что молекула G-белка, синтезируемого непосредственно в организме рыб, очевидно, имеет более близкие к нативным антигенные свойства по сравнению с гаикопротеином, полученным в прокариотической системе E.coli.

Только в одном эксперименте из трех была обнаружена статистическая взаимосвязь между уровнем антител в поствакцинальных сыворотках рыб и величиной создаваемой защиты, несмотря на то, что защитный эффект ДНК-вакцины проявился в каждом из них. Это подтверждает мнение о том, что большой вклад в формирование защиты против рабдовирусов у рыб вносят также факторы неспецифической резистентности и клеточное звено специфического иммунного ответа.

Защитные свойства экспериментальных вакцин

Эффективность экспериментальной ДНК-вакиины pcDNA-G-a

Используемая в нашей работе экспериментальная модель ВВК идентична патогенезу острой формы заболевания, развивающегося в естественных условиях. В контрольных группах с 3 по 6 день после заражения наблюдался экспоненциальный рост смертности рыб, который достигал 100%.

Для того, чтобы с большей вероятностью «попасть» при последующем заражении в пик продукции антител, было решено внутрибрюшин-но ввести выбранный наиболее вирулентный штамм вируса ВВК М2 в одной группе рыб на 8-ой неделе после вакцинации, а в другой - на 10-ой неделе.

В качестве положительного контроля был использован инактивиро-ванный формалином вирус ВВК. Введение заведомо эффективной дозы этого препарата обеспечило в этой группе рыб стопроцентную выживаемость, однако, по расчетам, такая вакцина была бы очень дорогой для массового применения в аквакультуре. Снижение дозы до экономически оправданной (в 6,8 раза, эксперимент 2) привело к полной утрате защитного действия введенного инактивированного вируса (табл. 1).

В задачи первого эксперимента (заражение на 8-ой неделе после вакцинации) дополнительно входил подбор оптимального способа выделения плазмидной ДНК для иммунизации рыб. Было проведено сравнение

трех способов ее очистки: метода ультрацентрифугирования в градиенте CsCl, щелочного метода, включающего дополнительную стадию с рядом осаждений ацетатом аммония, и с помощью набора Endotoxin-free фирмы Sigma.

Показатели эффективности ДНК-иммунизации конструкцией pcDNA-G-a в трех группах рыб, получивших препараты, выделенные этими тремя способами, между собой достоверно не различались (рис. 4). Полученные результаты позволили выбрать для дальнейшей работы менее дорогостоящий и менее трудоемкий щелочной метод, включающий дополнительную стадию с рядом осаждений ацетатом аммония.

pcDNA-G-a pcDNA-G-a pcDNA-G-a ultra am. ас. Endo free

Рис 4 Выживаемость карпов, вакцинированных препаратами pcDNA-G-a, выделенными разными методами- ultra - ультрацентрифугирование в градиенте CsCl, am.ас. - щелочной метод, включающий дополнительную стадию с рядом осаждений ацетатом аммония, Endofree - Endotoxin-free Maxiprep Plasmid Purification Kit

Индекс защиты (ИЗ) рассчитывали по формуле:

% гибели в контрольной группе - % гибели в опытной группе

ИЗ =--------------------х 100%

% гибели в контрольной группе

Таким образом, в первом эксперименте среднее значение ИЗ для ДНК-вакцины в случае заражения рыб через 8 недель после инъекции созданной рекомбинантной конструкцией составило 44,8 %. Причем протективный эффект кандидатной ДНК-вакцины достоверно отличался от соответствующего контроля (исходный плазмидный вектор pcDNA3)

Таблица 1. Результаты количественной оценки протективного действия испытанных вакцинных препаратов.

Препарат Заболеваемость, % Выживаемость Индекс защиты, % Средняя продолжительность выживания Дисперсия средней продолжительности выживания

% р* сутки р** * р***

Эксперимент 1

рсБЫА-О-а 80,0 46,7 <0,001 44,8 13,6 <0,05 130,9 <0,01

рсОИАЗ 100,0 3,4 - - 5,9 - 16,2 -

Ш103/р<ЗЕ-0 93,4 42,0 >0,05 38,0 10,2 >0,05 71,6 <0,05

ш юз/рис 19 93,4 16,7 - 13,9 7,6 - 26,6 -

Вирус инакт.(эф.) 13,2 100,0 <0,001 100,0 - - - -

буфер 100,0 3,3 - - 6,2 - 10,7 -

Эксперимент 2

рсОЫА-О-а 66,7 80 <0,001 78,6 8,3 >0,05 19,9 <0,05

рсОИАЗ 100,0 6,7 - - 5,0 - 7,7 -

ШЮЗ/р(}Е-0 100,0 0 >0,05 0 5,6 >0,05 12,2 <0,01

Ш103/рОЕ31 100,0 0 - - 4,8 - 0,9 -

Вирус инакт.(эк.) 96,7 6,7 >0,05 3,3 5,3 >0,05 7,2 >0,05

буфер 100,0 3,4 - - 5,4 - 13,2 -

Примечание: * [-критерий Стьюдента и х2-критерий Пирсона; ** ^критерий Стьгодента; ***Р-критерий Фишера. Достоверности различий и индексы защиты рассчитаны по отношению к соответствующим гомологичным контролям.

по всем трем количественным показателям: % заболеваемости, % выживаемости, значениям индекса защиты (табл. 1).

Выживаемость и индекс защиты во втором эксперименте (заражение на 10-ой неделе после введения ДНК) почти удвоились по сравнению с первым: 80 % рыб оказались устойчивы к используемому в наших экспериментах вирусу, значение ИЗ составило 78,6 % (табл. 1). Остальные учитываемые показатели также демонстрировали большую эффективность ДНК-вакцинации (табл. 1).

Вероятно, большая эффективность ДНК-вакцины во втором эксперименте свидетельствует о большей напряженности иммунного ответа у рыб в последнем случае. Возможно, в условиях более низких «весенних» температур (8-15°С), используемых при постановке наших экспериментов, развитие иммунных реакций замедляется, что и стало причиной различий в эффективности вакцинации плазмидной ДНК в двух описанных экспериментах.

Эффективность субъединичной вакцины

Лизат клеток E.coli, трансформированных плазмидной конструкцией pQE-G, кодирующей фрагмент G-белка, и индуцированных ИПТГ, обеспечивал развитие устойчивости с максимальными значениями ИЗ 38 % (табл. 1), что более чем в два раза ниже по сравнению с результатами для ДНК-вакцины. Это значение включает в себя вклад двух составляющих. Иммуногенная основа вакцины-кандидата - фрагмент гена гликопротеина вируса ВВК - индуцирует развитие специфического ответа, тогда как неспецифическая резистентность обеспечивается компонентами разрушенных клеток E.coli, выступающих в качестве адью-ванта. Именно этой неспецифической резистентностью, по-видимому, объясняется выживание 16,7 % карпов и значение ИЗ 13,9 % в группе рыб, иммунизированных лизатом клеток E.coli JM103 с исходным плаз-мидным вектором pQE31 (табл. 1).

Выживаемость у рыб в ответ на введение кандидатной субъединичной вакцины достоверно превышала таковую в группе, получившей буферный раствор, но недостоверно отличалась от выживаемости в группе собственного контроля (лизата клеток, трансформированных pQE31) (табл. 1).

Во втором эксперименте этот препарат субьединичной вакцины проявил лишь слабые признаки защиты, выразившиеся в достоверном увеличении дисперсии средней продолжительности выживания по сравне-

нию с таковой в группе гомологичного контроля (табл. 1) Тем не менее, в условиях естественной (весенней) динамики температуры воды такое увеличение могло бы позитивным образом сказаться на выживаемости рыб.

По-видимому, несовершенная, отличная от нативной конформация рекомбинантного гликопротеина в составе испытанной субъединичной вакцины негативно сказалась на ее протективных свойствах. На основании полученных данных было решено в дальнейшем сосредоточить основное внимание на разработке ДНК-вакцины и отказаться от использования рекомбинантного вирусного белка.

Подбор оптимальной дозы плазмидной ДНК для генетической иммунизации против весенней виремии карпа

Для подбора наиболее оптимальной дозы ДНК-вакцины против ВВК был проведен эксперимент на трех группах рыб, получивших разное количество плазмидной ДНК рсОКА-О-а. Годовики карпа были однократно иммунизированы 0,3 мкг, 1 мкг или 3 мкг плазмидной ДНК на грамм массы тела рыбы. Во всех группах отмечено протективное действие кандидатной вакцины у зараженных вирусом ВВК рыб. При этом достоверных различий в защитном действии между разными группами вакцинированных рыб выявлено не было. Тем не менее, в группе рыб, получивших наименьшую дозу плазмидной ДНК рсРКА-О-а, выявляется некоторая тенденция к снижению уровня развивающейся резистен-

дота кандидатной вакцины на грамм массы тела рыбы

Рис 5. Эффективность ДНК-иммунизации в зависимости от дозы кандидатной вакцины.

Для дальнейшей работы была выбрана доза 1 мкг на грамм массы тела рыбы. Вероятно, в случае внутримышечного введения препарата плазмидной ДНК она является наиболее оптимальной.

Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие гликопротеин референсного для России изолята вируса весенней виремии карпа.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pcDNA-G-3JI4

Иммуногенной основой вышеописанных рекомбинантных ДНК (кандидатных вакцин) был ген гликопротеина американского изолята, но для отечественной аквакультуры перспективнее было бы создать вакцину на основе референсного российского штамма вируса ВВК, которым является штамм 3JI4.

С этой целью была сконструирована плазмидная ДНК, содержащая полноразмерный ген гликопротеина российского изолята 3JI4. Выбор праймеров для ПЦР осуществлялся на основе анализа нуклеотидной последовательности G-гена и межгенных районов вируса ВВК референсного европейского штамма Fijan.

Секвенирование полученной нами последовательности ДНК подтвердило то, что она действительно кодирует гликопротеин вируса ВВК. Было обнаружено 9 нуклеотидных замен в отношении референсного европейского штамма Fijan, три из которых значимые, приводят к заменам аминокислотных остатков: изолейцина в 61 положении на триптофан, лизина в 350 положении на глутамин и лейцина на аргенин в 497 положении.

Конечная конструкция pcDNA-G-3JI4 - кандидатная ДНК-вакцина - содержит, таким образом, вставку полноразмерного гена гликопротеина штамма 3JI4 вируса ВВК под контролем цитомегаловирусного промотора (рис. 6).

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рВАСагрУах-G-3JI4 - кандидатной ДНК-вакцины

Для создания почти всех существующих к настоящему времени экспериментальных ДНК-вакцин против самых разных патогенов человека и животных были использованы плазмидные вектора с CMV промотором, который обеспечивает высокий уровень продукции целевого ре-комбинантного белка во многих типах эукариотических клеток. Однако

существует мнение, что цитомегаловирус человека является этиологическим агентом при развитии некоторых злокачественных опухолей. Поэтому, введение в организм человека и употребление в пищу продуктов (в нашем случае рыбы), содержащих ДНК этого вируса, может вызывать опасения. Это стало причиной для поиска замены СМУ промотору в составе ДНК-вакцины.

Известно, что (3-актиновый промотор карпа в составе плазмидного вектора способен обеспечить высокий уровень продукции рекомбинант- -

ного белка, хотя и немного ниже, чем СМУ промотор.

Для создания такой конструкции последовательность гена гликопро-теина из рсОКА-С-ЗЛ4 была клонирована в плазмиду рВ АСагрУах. Данный плазмидный вектор содержит р-актиновый промотор карпа, он был любезно предоставлен нам коллегами из Датской ветеринарной лаборатории (г. Орхус). Конечная конструкция рВАСагрУах-0-ЗЛ4 - кандидат-ная ДНК-вакцина - содержит, таким образом, вставку полноразмерного гена гликопротеина российского референсного штамма ЗЛ4 вируса ВВК 1

под контролем промотора р-актина карпа (рис. 6).

БУ40 ро!уА N111(0

Рис. 6 Схема конструкций со вставкой нуклеотидной последовательности, кодирующей гликопротеин вируса ВВК российского изолята ЗЛ4.

Защитные свойства вакцин-кандидатов

Эффективность полученных конструкций тестировали по схеме, аналогичной для экспериментальных вакцин со вставкой гена гликопротеина американского изолята вируса ВВК, описанной ранее.

Проведенные испытания показали, что в/м инъекция 1 мкг кандидат-ной ДНК-вакцины рсБЫА-С-ЗЛ4 на грамм массы тела рыбы обеспечи-

вает выживаемость 82% опытных животных, знггение индекса защиты - 72%. Кандидатная ДНК-вакцина pcDNA-G-a в этом эксперименте продемонстрировала самую высокую протективность: выживаемость - 92,9% рыб, индекс защиты - 89% (рис. 7).

Незначительно более низкий защитный эффект конструкции pcDNA-G-3JI4, вероятнее всего, обусловлен большей гетерологичностью между изолятами вируса ВВК, используемыми при создании этого варианта ДНК-вакцины (3JI4) и для заражения (М2). Молдавский изолят М2 входит в одну гено-группу с американским, тогда как 3JI4 относят к 5 группе. Известно, что эти две группы отличаются между собой серологически. К сожалению, наш референсный изолят (3JI4) не может использоваться для создания модели заболевания, поскольку даже при в/б заражении он не обеспечивает высокой смертности рыб.

Тем не менее, перспективность гена шикопротеина изолята 3JI4 как иммуногенной основы для ДНК-вакцины несомненна, поскольку данный штамм вируса принадлежит к пивной генетической группе на территории бывшего СССР и, следовательно, такая вакцина должна быть весьма востребована в отечественной акваиндустрии.

Уровень резистентности, развивающийся в ответ на введение кандидаткой ДНК-вакцины, в которой экспрессия рекомбинантного вирусного белка проходит под контролем промотора Р-актина карпа, был незначительно ниже по сравнению с конструкцией с CMV промотором (рис. 7). Значение ИЗ составило 58 %, при выживаемости 74% рыб.

100

£80 ый ¡60

во

§40 Я ш

20 0

pcDNA-G-a рсОЫА-С-ЗЛ4 рВАСагрУах-С-ЗЛ4

Рис. 7 Эффективность кандидатных ДНК-вакцин со вставкой гена, кодирующего гликопротеин вируса ВВК.

ш

Использование для создания ДНК-вакцины промотора р-актина карпа лишь незначительно снизило защитный эффект от иммунизации по сравнению с конструкцией с CMV промотором. Тем не менее, применение конструкции pBACarpVax-G-3JI4 в качестве вакцины против ВВК будет более безопасным для человека как потребителя рыбы.

Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие нуклеопротеин российского изолята вируса весенней виремии карпа

Наиболее подходящим кандидатом на роль иммуногенной основы для рекомбинантной вакцины против ВВК, несомненно, является, расположенный на поверхности вириона трансмембранный гликопротеин. Однако в литературе описаны работы по ДНК-иммунизации смесью плазмид, содержащих последовательности, кодирующие два разных вирусных белка. Протективные свойства подобных комбинированных препаратов зачастую выше, чем у вакцин, содержащих только один вирусный ген. В связи с этим, одной из задач работы являлось создание генетической конструкции, кодирующей нуклеопротеин вируса ВВК изолята 3JI4, и ее тестирование на рыбах в качестве самостоятельной ДНК-вакцины, и для иммунизации смесью плазмид, несущих гены пли-копротеина и нуклеопротеина данного патогена.

Секвенирование последовательности ДНК наших клонированных фрагментов подтвердило то, что они действительно кодируют нуклеопротеин вируса ВВК. Было выявлено 55 нуклеотидных замен в отношении референсного европейского штамма Fijan, 8 из которых значимые, приводят к заменам аминокислотных остаков. Конечная конструкция pBACarpVax-N-3JI4 - содержит таким образом вставку полноразмерного гена нуклеопротеина вируса ВВК российского изолята ЗЛ4 под контролем промотора р-актина карпа (рис. 8).

Xhol

C^BGHpoIy

N-ген ЗЛ4

Km(t)

EcoRJ ^ T7

Pba-carp oMBl

Nrul

Рис 8. Схема конструкций со вставкой нуклеотидной последовательности, кодирующей нуклеопротеин вируса ВВК российского изолята ЗЛ4.

Введение полученной конструкции со вставкой гена нуклеопро-теина практически не защищало иммунизированных рыб при экспериментальном в/б заражении вирусом ВВК. Инъекция рВАСагрУах-'ЬГ-ЗЛ4 обеспечивала только достоверное увеличение среднего времени выживания в этой группе рыб, свидетельствующее о том, что процесс гибели растянут во времени (0,01<Р<0,05). Это является выгодным признаком при развитии болезни на фоне весеннего подъема температуры воды.

В группе рыб, получивших обе плазмидные конструкции, защитный эффект не отличался от такового при введении одной кандидатной ДНК-вакцины рВАСагрУах-0-ЗЛ4 (Р>0,05).

Исследование влияния иммунистимулятора ридостина и температуры воды на эффективность ДНК-вакцинации.

С целью повышения эффективности «российской» кандидатной ДНК-вакцины процедура иммунизации была несколько модифицирована. В эксперименте две из четырех опытных групп рыб помещали в отдельный бассейн, температуру воды в котором через сутки поднимали до 17-19 °С и поддерживали в течение 10 дней, затем их возвращали в аквариум с температурой воды 13-15 °С. Для вакцинации двух групп рыб использовали совместное введение с плазмидной ДНК иммуностимулятора ридостина (Я) (НИКТИБАВ, Бердск) в дозе 1 мкг/кг ихти-омассы. В одной группе рыб были проделаны обе эти дополнительные процедуры.

Две примечательные особенности четко проявились в этом эксперименте. Первая - неожиданное отсутствие защитного эффекта при введении ДНК-вакцины в комплексе с ридостином, поскольку ранее Щелку-новым И.С. при исследовании неспецифической резистентности было показано эффективное его действие против вируса ВВК, продолжавшееся не менее месяца.

По-видимому, одновременное введение ридостина с ДНК-вакциной значительно ускорило элиминацию плазмиды из тканей карпа и заблокировало экспрессию в-гена, что негативно отразилось на развитии эффективного иммунного ответа к вирусному шикопротеину. Действие самого ридостина к моменту заражения (через 10 недель) почти закончилось и выражалось только достоверном увеличении средней продолжительности выживания в группе, получившей вместе с этим препаратом пустой плазмидный вектор рсГЖАЗ.

Таблица 2. Фактические данные эксперимента по испытанию способов модификации ДНК-вакцинации

Группа рыб Выживаемость, % Индекс защиты, % Средняя продолжительность выживания, сутки

рс01ЧА-0-ЗЛ4 43,3 37 5,5±1,7 (п=15)

рсОЫА-С-ЗЛ4Д 20,7 11,9 5,7+2,3 (п=20)

рсОЫАЗД 10,0 - 10,9+6,4 (п=27)

рс01ЧА-0-ЗЛ4,1° 69,0 64,2 20,8+20,3 (п=9)

рсВЫАЗ,1° 13,3 - 7,4+4,1 (п=26)

рс0МА-0-ЗЛ4Д+? 30,0 27,6 7,2+4,0 (п=20)

рсОИАЗД+Г 3,3 - 8,1+5,0 (п=28)

Вторая особенность, выявленная в эксперименте - усиление защитного эффекта от вакцинации в группе рыб, которых содержали в течение 10 дней после введения плазмидной конструкции при повышенной до 17-19"С температуре воды. Известно, что у карпа не все иммунные механизмы включаются в работу при температуре ниже 15°С, тогда как кратковременное содержание рыбы при температуре выше этого значения ведет к их запуску и дальнейшему функционированию даже при последующем понижении температуры воды. Очевидно, именно этот феномен проявился в данном случае.

выводы

1. Впервые выявлена способность генно-инженерной конструкции pcDNA-G-a со вставкой полноразмерного гена тикопротеина вируса весенней виремии карпа индуцировать синтез вируснейтрализующих антител в сыворотке крови внутримышечно иммунизированных рыб и эффективно защищать их при экспериментальном заражении вирусом ВВК (выживаемость 93 %).

2. Получен штамм-продуцент E.coli фрагмента гликопротеина вируса ВВК. Показана его умеренная способность защищать карпа от последующего заражения вирулентным вирусом (выживаемость 42 %).

3. Определены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих гликопротеин и нуклеопротеин вируса весенней виремии карпа российского изолята 3JI4.

4. Впервые создана генно-инженерная конструкция pcDNA-G-3JI4, кодирующая полноразмерный гликопротеин вируса референсного для России изолята. Данная кандидатная ДНК-вакцина обеспечивает высокий и воспроизводимый уровень защиты в эксперименте при введении карпу (выживаемость 82 %).

5. Создана генно-инженерная конструкция pBACarpVax-G-3JI4, в которой экспрессия гена тикопротеина вируса весенней виремии карпа проходит под контролем более безопасного для человека промотора ß-актина карпа. Иммунизация карпов данной кандидатной ДНК-вакциной обеспечивает высокий и воспроизводимый уровень защиты (выживаемость 74 %).

6. Создана генно-инженерная конструкция pBACarpVax-N-3JI4 со вставкой полноразмерного гена нуклеопротеина вируса. Иммунизация этой плазмидной ДНК обеспечивала увеличение среднего времени выживания рыб, что является выгодным признаком при развитии болезни на фоне весеннего подъема температуры воды.

7. Показано, что наиболее оптимальной дозой плазмидной ДНК для иммунизации является 1 мкг/г массы тела рыбы. Показано также повышение эффективности ДНК-вакцинации на 26 % при содержании рыбы при повышенной температуре воды.

Список публикаций:

1. О.С. Воронова, Г.Н. Николенко, И.С. Щелкунов, С.Ф. Орешкова, Т.И. Щел-кунова, А.А. Ильичев. Ген гаикопротеина (G-ген) российского референсного штамма 3JI-4 вируса весенней виремии карпа и рекомбинантные плазмидные ДНК pcDNA-G и pBACarpVax-G, экспрессирующие ген гликопротеина и обеспечивающие развитие у рыб защитного иммунитета против заражения вирусом весенней виремии карпа. Заявка № 2004108191 от 23.03.04. публикация 27.09.2005., № 27.

2. Щелкунов И.С., Воронова О.С., Орешкова С.Ф., Щелкунова Т.И., Николенко Г.Н., Ильичев А.А. «Иммунопротективные свойства экспериментальных рекомбинантных вакцин против весенней виремии карпа». - Биотехнология. - 2005. -№ 6. стр. 23-31.

Доклады и тезисы конференций:

1. Shchelkunov I.S., Oreshkova S.F., Shchelkunova T.I., Nikolenko G.N., Kupinskaya О.A., Voronova O.S., Johnson M., and Leong J.C. Comparative testing of experimental SVC-vaccines developed with the use of recombinant DNA technology. Abstr of 10th Intern. Confer, ofthe EAFP"Diseases of Fish and Shellfish".- September 9-14. - 2001. - Dublin, Ireland. - Abstract book - P. 173.

2.NikolenkoG.N.,ShchelkunovI.S.,VoronovaO.S.,OreshkovaS.F., Shchelkunova T.I., Ilyichev A. A. Development of vaccine against fish rhabdovirus - spring viremia of carp virus. Abstr. of IVth ISTC scientific advisory committee seminar on "Basic science in ISTC activities". - 23-27 April. - 2001. - Akademgorodok, Novosibirsk. -P.94.

3. Воронова O.C., Николенко Г.Н. Изучение протективных свойств рекомбинантных вакцинных препаратов против весенней виремии карпа. Доклад на конф. Молодых ученых ГНЦ ВБ Вектор. 2001.

4. Nikolenko G.N., Shchelkunov I.S., Voronova O.S., Oreshkova S.F., Shchelkunova TI, Ilyichev A A Development of recombinant vaccine against spring viremia of carp virus. Abstr. of Intern. Simp. "Molecular Mechanisms of Genetic Processes and Biotechnology". - November 22-24. - 2001. - Minsk, Belarus. - P. 296.

5. Voronova O.S., Shchelkunov I.S., Nikolenko G.N., Oreshkova S.F., Shchelkunova T.I., Ilyichev A.A. Development of vaccine against fish Rhabdovirus

- spring viremia of carp virus. Abstr. of Sixth John Humphrey advanced summer program in immunology molecular basis of the immune response. - September 15-22.

- 2002. - Pushchino, Russia. - P. 105.

6. Voronova O.S., Nikolenko G.N., Shchelkunov I.S., Oreshkova S.F., Shchelkunova T.I., Ilyichev A.A. A fish DNA vaccine against spring viremia of carp virus. Abstr. of the 3rd Fish Vaccinology Symposium. - Bergen, Norway, April 9-11. -2003.-P. 103.

7. Voronova O.S., Nikolenko G.N., Shchelkunov I.S., Oreshkova S.F., Shchelkunova T.I., Ilyichev A.A. A fish DNA vaccine against spring viremia of

carp virus. Abstr. of Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. Kiev, Ukraine. - September 25-28. - 2003. - P. 40.

8. Oreshkova S.F., Shchelkunov I.S., Voronova O.S., Popova A.G., Nikolenko G.N., Shchelkunova T.I., Ilyichev A.A. Development of Methods for Diagnosis and Specific Prevention of Spring Viraemia of Carp // Second Bilateral Conference USA/ Russia "Aquatic and marine animal health", Shepherdstown, West Virginia. - 21-28 September. - 2003. - P. 19.

9. Voronova O.S., Shchelkunov I.S., Nikolenko G.N., Shchelkunova T.I., Oreshkova S.F. Immunoprotective properties of experimental recombinant vaccines against spring viremia of carp. DAAD Summer School on "Current trends in comparative immunology". - St. Petersburg, May 22 - June 5. - 2005.

O.C. Воронова

Подписано в печать 21.11.05 Бумага офсетная Формат 60*84/16 Усл. печ. л. 1,5 Уч-изд. л. 1,5. Тираж 100. Отдел оперативной печати ЗАО «Вектор-Бест». 630559 Новосибирская обл., шт. Кольцово, а/я 125.

¡

í

f

)

•25062

РНБ Русский фонд

2006-4 29967

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воронова, Ольга Сергеевна

Список принятых сокращений

Введение

Научная новизна и практическая ценность работы

Публикации и апробация работы

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I.Весенняя виремия карпа

1. Историческая справка

2. Предрасполагающие факторы, группы риска

3. Клиническая картина

4. Возбудитель заболевания - вирус весенней виремии карпа

4.1. Структура вируса

4.2. Гликопротеин (G-белок) рабдовирусов

5. Существующие подходы к профилактике и лечению ВВК

II. Вакцинология в аквакультуре

1. Традиционные инактивированные и атгенуированные вакцины для рыб

2. Рекомбинантные технологии в аквакультуре

2.1. Субъединичные вакцины для рыб

2.2. ДНК-вакцины 25 2.2.1 .Опыт применения ДНК-вакцин для рыб

2.2.2. Возможные системы доставки вакцины в организм рыбы

2.2.3. Исследование тканевого распределения плазмидной ДНК и продолжительности экспрессии рекомбинантног гена в организме рыб

2.2.4. Изучение механизмов представления АГ клеткам ИС после введения ДНК-вакцин

2.2.5. Иммунный ответ

• Гуморальный ИО рыб в ответ на ДНК-вакцинацию

• Т-клеточный ИО у рыб на ДНК-вакцины

• Стимуляция врожденного ИО после введения ДНК-вакцин

2.2.6. Исследование безопасности ДНК-вакцин 43 Заключение

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1.Реактивы

2.2.Ферменты 47 2.3.0лигонулеотиды

2.4.Плазмиды

2.5. Бактерии

2.6. Культуральные среды

2.7. Вирусы и клетки 48 2.9. Растворы 49 2.9. Методы

2.9.1. Выделение вирусной РНК

2.9.2. Синтез ДНК, комплементарной вирусной РНК

2.9.3. Амплификация фрагментов ДНК

2.9.4. Элюция фрагментов ДНК

2.9.5. Коструирование рекомбинантных ДНК

2.9.6. Трансформация клеток Е. Coli плазмидной ДНК

2.9.7. Выделение плазмидной ДЕК

2.9.8. Ферментативный гидролиз ДНК

2.9.9. Электрофоретическое фракционирование ДНК

2.9.10.Анализ первичной структуры ДНК 53 2.9.11.Электрофоретический анализ белка

2.9.12.Получение иммунной сыворотки

2.9.13.Иммуноферментный анализ

2.9.14.Иммуноблотинг белков с иммунными сыворотками

2.9.15.Приготовление препарата субъединичной вакцины для иммунизации 55 2.9.16.Оценка протективности экспериментальных вакцин 56 2.9.17.Оценка иммуногенности экспериментальных вакцин

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 58 3.1 .Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие гликопротеин вируса весенней виремии карпа американского изолята

3.1.1. Рекомбинантная конструкция pcDNA-G-a

3.1.2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pQE-G для экспрессии гена гликопротеина вируса в E.coli - субъединичная вакцина

3.1.3. Исследование продукции рекомбинантного вирусного гликопротеина в клетках Е. coli

3.1.4. Иммуногенность экспериментальных вакцин

3.1.5. Защитные свойства экспериментальных вакцин

3.1.5.1. Эффективность экспериментальной ДНК-вакцины

3.1.5.2. Эффективность субъединичной вакцины

3.1.6. Влияние изменения дозы вводимой плазмидной конструкции и неспецифических иммуностимуляторов на эффективность ДНК-вакцинации

3.2.Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие гликопротеин референсного для России изолята вируса весенней виремии карпа

3.2.1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pcDNA-G-3JI4 - кандидатной ДНК-вакцины

3.2.2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBACarpVax-G-3JI4 - кандидатная ДНК-вакцина

3.2.3. Продукция рекомбинантного вирусного гликопротеина в культуре клеток

3.2.4. Защитные свойства вакцин-кандидатов, кодирующих гликопротеин референсного для России изолята вируса весенней виремии карпа

3.3. Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие нуклеопротеин россйского изолята вируса весенней виремии карпа

3.4. Влияние повышенной температуры воды и ридостина на эффективность ДНК-вакцинации

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка рекомбинантных вакцин-кандидатов против весенней виремии карпа и исследование их иммуногенных и протективных свойств"

В аквакультуре, как и в любой другой биоиндустрии, неизбежны проблемы, связанные с заболеваниями разводимых животных. Инфекционные болезни, которые в дикой природе возникают как спорадические случаи, могут вызвать высокую смертность в условиях рыбного хозяйства, поэтому для успешного развития отрасли необходимы эффективные средства их профилактики и лечения.

Весенняя виремия карпа (ВВК) - остро протекающее высококонтагиозное заболевание, вызываемое вирусом Rhabdovims carpio (spring viremia of carp virus, SVCV), которое является нерешенной проблемой российских рыбоводческих хозяйств. По классификации Международного эпизоотического бюро весенняя виремия карпа относится к категории особо опасных (декларируемых) болезней рыб (Office, 2002). Кроме того, в последние годы стали появляться сообщения о вспышках этого заболевания и выделении вируса в Северной и Южной Америке, в Средней и Юго-Восточной Азии. В связи с этим, в 2002 году весенняя виремия карпа была внесена в список International Aquatic Animal Health Code of the OIE как заболевание, требующее контроля по причине его распространения.

Вакцинология рыб в настоящее время только начинает развиваться, тем не менее, уже имеются достижения, которые были примечательны и с научной, и с практической точки зрения. Одним из самых приоритетных направлений в современной экспериментальной ветеринарии является разработка рекомбинантных вакцин. Во многих странах ведется активная работа по созданию и изучению свойств рекомбинантных вакцинных препаратов против целого ряда важных вирусных патогенов рыб. Наилучшие результаты были получены с ДНК вакцинами против заболеваний лососевых рыб, вызываемых рабдовирусами.

Цель настоящей работы - разработка и создание экспериментальных плазмидных конструкций - кандидатных рекомбинантных вакцин против весенней виремии карпа, и исследование их иммуногенных и протективных свойств.

В соответствии поставленной целью решались следующие задачи: Получить штамм-продуцент фрагмента вирусного гликопротеина, как вариант субъединичной вакцины против весенней виремии карпа.

• Сконструировать ряд рекомбинантных плазмидных ДНК - кандидатных ДНК-вакцин - со вставками последовательностей, кодирующих гликопротеин или нуклеопротеин вируса.

• Определить вируснейтрализующую активность в сыворотках карпов, иммунизированных кандидатными вакцинами.

• Оценить способность созданных кандидатных вакцин защищать карпов при заражении вирусом в эксперименте. Оптимизировать процедуру вакцинации, включая подбор дозы кандидатной вакцины, использование неспецифических иммуностимуляторов, повышение температуры воды в аквариумах.

Научная новизна и практическая ценность.

В результате проделанной работы впервые была установлена принципиальная возможность профилактики ВВК с помощью рекомбинантных конструкций на основе прокариотического (иммунизация рекомбинантным белком) или эукариотического (ДНК-вакцинация) векторов, экспрессирующих гликопротеин вируса. ДНК-вакцинация показала себя как наиболее перспективная технология при создании препаратов против этого заболевания.

Созданные кандидатные вакцины со вставкой гена вирусного гликопротеина могут представлять интерес для практической аквакультуры, поскольку являются эффективными при однократной иммунизации, экономически выгодными и простыми в обращении. Вирус ВВК стал, таким образом, четвертым рабдовирусом рыб (после вируса ИНГТ, ВГС и Hirame rhab do virus), для которых такая возможность установлена.

Апробация работы и публикации.

Полученые результаты представлены на восьми международных конференциях. По материалам диссертации была опубликована одна статья и получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Воронова, Ольга Сергеевна

выводы

1. Впервые выявлена способность генно-инженерной конструкции pcDNA-G-a со вставкой полноразмерного гена гликопротеина вируса весенней виремии карпа индуцировать синтез вируснейтрализующих антител в сыворотке крови внутримышечно иммунизированных рыб и эффективно защищать их при экспериментальном заражении вирусом ВВК (выживаемость 93 %).

2. Получен штамм-продуцент E.coli фрагмента гликопротеина вируса ВВК. Показана его умеренная способность защищать карпа от последующего заражения вирулентным вирусом (выживаемость 42 %).

3. Определены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих гликопротеин и нуклеопротеин вируса весенней виремии карпа российского изолята 3JI4.

4. Впервые создана генно-инженерная конструкция pcDNA-G-3JI4, кодирующая полноразмерный гликопротеин вируса референсного для России изолята. Данная кандидатная ДНК-вакцина обеспечивает высокий и воспроизводимый уровень защиты в эксперименте при введении карпу (выживаемость 82 %).

5. Создана генно-инженерная конструкция pBACarpVax-G-3JI4, в которой экспрессия гена гликопротеина вируса весенней виремии карпа проходит под контролем более безопасного для человека промотора р-актина карпа. Иммунизация карпов данной кандидатной ДНК-вакциной обеспечивает высокий и воспроизводимый уровень защиты (выживаемость 74 %).

6. Создана генно-инженерная конструкция pBACarpVax-N-3JI4 со вставкой полноразмерного гена нуклеопротеина вируса. Иммунизация этой плазмидной ДНК обеспечивала увеличение среднего времени выживания рыб, что является выгодным признаком при развитии болезни на фоне весеннего подъема температуры воды.

7. Показано, что наиболее оптимальной дозой плазмидной ДНК для иммунизации является 1 мкг/г массы тела рыбы. Показано также повышение эффективности ДНК-вакцинации на 26 % при содержании рыбы при повышенной температуре воды.

Заключение

В результате проделанной работы была установлена возможность использования ДНК-вакцинации для профилактики весенней виремии карпа. В первых предварительных экспериментах рыбы были в/м иммунизированы плазмидной конструкцией pcDNA-G-a, кодирующей полноразмерный гликопротеин американского изолята вируса, которая была любезно предоставлена профессором J.C. Leong (США). При жестком внутрибрюшинном заражении вирусом был получен высокий воспроизводимый уровень устойчивости (значения индекса защиты достигали 89 %).

Синтезированный в клетках E.coli рекомбинантый белок - фрагмент гликопротеина с основными антигенными эпитопами был протестирован нами в качестве субъединичной вакцины. Однако уровень развивающейся резистентности к вирусу был в два раза ниже по сравнению с ДНК-вакциной. Максимальный индекс защиты достигал 38 %. На основании полученных данных было решено в дальнейшем сосредоточить основное внимание на разработку ДНК-вакцины против ВВК и отказаться от использования рекомбинантного вирусного белка.

Для отечественной аквакультуры перспективнее было бы создать вакцину на основе референсного российского штамма вируса ВВК. С этой целью были созданы две генно-инженерные конструкции - варианты экспериментальной ДНК-вакцины против весенней виремии карпа (pcDNA-G-3JI4 и pBACarpVax-G-3JI4), иммуногенной основой которых яляется ген основного антигена вируса -поверхностного гликопротеина отечественного изолята 3JI4. В первой конструкции последовательность, кодирующая вирусный гликопротеин, находится под контролем цитомегаловирусного промотора, который наиболее часто используется при разработке ДНК-вакцин против заболеваний человека и животных. Однако существует мнение о том, что цитомегаловирус является этиологическим агентом при развитии некоторых злокачественных опухолей, что делает употребление рыбы, содержещей фрагменты его ДНК (промотор) потенциально опасным.

При создании второй кандидатной вакцины удалось обойти эту проблему: экспрессия гена гликопротеина в конструкции pBACarpVax-G-3JI4 проходит под контролем промотора |3-актина карпа в составе плазмидного вектора pBACarpVax,

106 любезно предоставленного коллегами из Датской ветеринарной лаборатории (г. Орхус).

Проведенные испытания показали, что в/м инъекция кандидатной ДНК-вакцины pcDNA-G-3JI4 обеспечивает выживаемость 82 % опытных животных, при индексе защиты - 72 %. Введение плазмидной ДНК pBACarpVax-G-3JI4, обеспечило незначительно более низкий уровень защиты от последующего заражения вирулентным вирусом по сравнению с pcDNA-G-3JI4. Значение индекса защиты составило 58 %, при выживаемости 74 % рыб.

Для повышения защитных свойств кандидатных ДНК-вакцин была проведена серия экспериментов, задачами которых являлись: подбор оптимальной дозы плазмидной ДНК, изменение температурного режима содержания рыбы в ходе исследования, оценка влияния неспецифических иммуностимуляторов (диэтиламиноэтилдекстрана, полиглюкина и ридостина) на эффективность созданных конструкций. В результате было выявлено, что содержание вакцинированных рыб при повышенной до 17-19°С температуре воды способно заметно усилить защитное действие ДНК-вакцины.

Вторым по значимости антигеном после гликопротеина является нуклеопротеин вируса ВВК. Созданная нами конструкция pBACarpVax-N-3JI4 содержит вставку полноразмерного гена этого белка. Иммунизация данной плазмидной ДНК практически не защищала рыб при экспериментальном в/б заражении вирусом ВВК. Тем не менее, было выявлено статистически значимое увеличение среднего времени выживания, свидетельствующее о том, что процесс гибели растянут во времени. Это является выгодным признаком при развитии болезни на фоне весеннего подъема температуры воды. Совместное введение двух конструкций pBACarpVax-G и pBACarpVax-N не потенциировало защитный эффект от иммунизации одной экспериментальной ДНК-вакциной pBACarpVax-G.

Таким образом, ДНК-вакцинация является наиболее перспективной технологией при создании препаратов для специфической профилактики весенней виремии карпа. Созданные кандидатные вакцины со вставкой гена вирусного гликопротеина могут представлять интерес для практической аквакультуры, поскольку являются эффективными при однократной иммунизации, экономически выгодными и простыми в обращении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воронова, Ольга Сергеевна, Кольцово

1. Гаврилова И. В., Шустов А. В., Нетесов С.В. Быстрые методы генотипирования изолятов вируса гепатита С с использованием анализа конформационного полиморфизма одиночных цепей ДНК и гетеродуплексного анализа. Мир вирусных гепатитов. 2001. - № 11. - С. 818.

2. Догель В.А., Пешков М.А., Гусева Н.В. Бактериальные заболевания рыб. Пшцепромиздат. Москва. Ленинград. 1939 с.

3. Кирпичников М.С. и др. Селекция пород карпов, резистентных к водянке. Докл. Зоол. Инст. А.Н. СССР. Ленинград,- 1987. - 171. - С. 35-46.

4. Кондратьева И.А., Киташова А.А., Ланге М.А. Современные представления об иммунной системе рыб. Часть 1. Организация иммунной системы рыб. Вестник Московского университета. 2001. - сер. 16. - Биология. - №4. -С. 11-20.

5. Лакин Г.Ф. Биометрия. 4-е издание, перераб. и доп. М.: Высшая школа. -1990.- 352 с.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. - 1984. - 479с.

7. Методические указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб. № 13-4-2/1054, утв. Департ. ветеринарии Минсельхозпрода РФ 10.10.97.

8. Остерман Л.А. Методы исследований белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М., "Наука", 1981.

9. Щелкунов И.С., Аликин Ю.С., Щелкунова Т.И., Купинская О.А. Способ профилактики вирусных заболеваний рыб. Патент РФ № 2043714, Зарег. 20.09.95

10. Щелкунов И.С., Щелкунова Т.П. Необычный случай осеннего выделения Rhabdovirus carpio от карпа. IX Всес.сов. по паразитам и болезням рыб. Тез. Докл. Л., С. 149-150.

11. Щелкунов И.С., Юхименко Л.Н., Щелкунова Т.И., Тромбицкий И.Д., Манчу А.П. О выделении вируса от белого толстолобика с синдромом краснухи //

12. И.П. Рыбное хозяйство. Сер.: Аквакультура. Болезни рыб. М.: ЦНИИТЭИРХ, 1984. - № 4. - С. 3-7.

13. Ahne W. The influence of environmental temperature and infection route on the immune response of carp (Cyprinus carpio) to spring viremia of carp virus (SVCV). Vet. Immunol. Immunopath. 1986. -V. 12. - P. 383-386.

14. Ahne W., Bjorlclund H.V., Essbauer S., Fijan N., Kurath G., Winton J.R. Spring Viremia of Carp (SVC). Diseases of aquatic organisms. 2002. - N 10.-P. 261272.

15. Alonso M, Johnson M, Simon B, Leong JA. A fish specific expression vector containing the interferon regulatory factor 1A (IRF1A) promoter for genetic immunization offish. Vaccine. 2003. - Apr 2;21(15). -P. 1591-1600.

16. Anderson E. D., D. V. Mourich, and J. C. Leong. Gene expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) following intramuscular injection of DNA. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1996a. - 5. - P. 105-113.

17. Andrews J.M., Newbound G.C. Lairmore M.D. Transcriptional modulation of viral reporter gene constructs following induction of the cellular stress response. Nucleic Acids Research. 1997. - Vol. 25. - N. 5. - P. 1082-1084.

18. Avtalion R.R. Environmental control of the immune response in fish // CRC Critical Reviews in Environmental Control. 1981. - V.ll. -P.163-188.

19. Babiuk L.A., Drunen Littel-van den Hurk S., Babiuk S.L. Immunization of animals: from DNA to the dinner plate. Veterinary Immunology and Immunopathology. 1999. - 72. - P. 189-202.

20. Bahloul C., Y. Jacob, N. Tordo, P. Perrin. DNA-based immunization for exploring the enlargement of immunological cross-reactivity against the Lyssaviruses. Vaccine 1998. - V. 16. - N. 4. - P. 417-25.

21. Ball L. A., Pringle C. R., Flangan В., Perepelitsa V. P., Wertz G. W. Phenotypic Consequences of Rearranging the P, M, and G Genes of Vesicular Stomatitis Virus. J. Virology. 1999. - June. - P. 4705-4712.

22. Benmansour A, de Kinkelin P. Live fish vaccines: history and perspectives. Dev Biol Stand. 1997. - 90. - P. 279-289.

23. Bergmann S., Fichtner D., Kiliari A., et al. Different methods for genetic immunization against fish viruses. 9th International Conference "Diseases of fish and Shellfish". - 1999. - Rhodes, Greece. - Abstract book. - P. 131.

24. Bernand J., Bremont M. Molecular biology of fish viruses: a review. Vet. Res.1995.-26.-P. 341-351.

25. Betts A.M., Stone D.M., Way K., Torhy C., Chilmonczyk S., Benmansour A., de Kinkelin P. Emerging vesiculo-type virus infections of freshwater fishes in Europe. Dis Aquat Organ. 2003. - Dec 29;57(3). - P. 201-212.

26. Birnboim H.C. and Doly J. A rapid ailcalin extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucl. Acids Res. 1979. - V.7. - p. 1513-1523.

27. Bjorclund H.V., K.H. Higman, G. Kurath. The glycoprotein genes and gene junction of the fish rhabdoviruses spring viremia of carp virus and hirame rhabdovirus: analysis of relationships with other rhabdoviruses. Virus research.1996.-42.-P. 65-80.

28. Bjorklund H., Lorenzen N., Vesely Т., Shchelkunov I., Oreshkova S. Diagnostic methods and reference panel of reagents for detection and typing of fish viruses. EC FAIR CT-98-4064 Consolidated Report 1999-2001. European Commission DG XIV.

29. Blatny JM, Brautaset T, Winther-Larsen HC, Karunakaran P, Valla S. Improved broad-host-range RK2 vectors useful for high and low regulated gene expression levels in gram-negative bacteria. Plasmid. 1997. 38(1). - P. 35-51.

30. Boudinot P, Salhi S, Blanco M, Benmansour A. Viral haemorrhagic septicaemia virus induces vig-2, a new interferon-responsive gene in rainbow trout. Fish Shellfish Immunol. -2001. Jul;ll(5). - P. 383-397.

31. Boudinot P, Boubekeur S, Benmansour A. Rliabdovirus Infection Induces Public and Private T Cell Responses in Teleost Fish. The Journal of Immunology. -2001.- 167.-P. 6202-6209.

32. Brown L.L, Sperker S.A, Clouthier S, Thornton J.C. Development of a vaccine against infectious salmon anemia virus. 9th International Conference "Diseases of fish and Shellfish". 1999. - Rhodes, Greece. - Abstract book. - P. 258.

33. Buchmann K, Sigh J, Nielsen C.V, Dalgaard M. Host responses against the fish parasitizing ciliate Ichthyophthirius multifiliis. Veterinary Parasitology. - 2001. -100.-P. 105-116.

34. Bussereau F, de Kinkelin P, Le Berre M. Infectivity of fish rhabdoviruses for Drosophila melanogaster. Ann Microbiol (Paris). 1975. - Apr;126(3). - P. 389395.

35. Caipang C.M.A, Hirono I., Aoki T. Development of DNA vaccine for the control of red seabream iridiviral dasease. 3th international Symposium on fish vaccinology. Bergen, Norway. - 2003. - Abstract book. - P. 75.

36. Chinabut S., Puttinaowarat S. Choice of disease control strategies to secureonternational market access for aquaculture products. 3th international Symposium on fish vaccinology. Bergen, Norway. - 2003. - Abstract book. - P. 18.

37. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 1987. -162.-P. 156-159.

38. Christie K.E. Immunization with viral antigens: infectious pancreatic necrosis. Dev.Biol.Stand. 1997. - 90. - P. 191-199.

39. Christie K.E., Koumans J.T.M., Fyrand K. et al. Vaccine against pancreas diseases in Atlantic salmon. 9th International Conference "Diseases of fish and Shellfish". - 1999. - Rhodes, Greece. - Abstract book. - P. 130.

40. Clark Т., Potential and constrains of antigen presentation by recombinant protein technology. Abstract book. 3-rd International Symposium on Fish Vaccinology. -Bergen, Norway. 2003. - P. 19.

41. Coll J.M. The glycoprotein G of Rhabdoviruses. Arch Virol, (1995) 140: P. 82751.

42. Collet B, Secombes CJ. Type I-interferon signalling in fish. Fish Shellfish Immunol. -2002. May; 12(5). - P. 389-397.

43. Corbeil, S., Kurath G., LaPatra S. E. Fish DNA vaccine against infectious hematopoietic necrosis virus: efficacy of various routes of immunization. Fish and Shellfish Immunol. 2000 (a). - 10. - P. 711-723.

44. Corbeil, S., S. E. LaPatra, E. D. Anderson, and G. Kurath. Nanogram quantities of a DNA vaccine protect rainbow trout fry against heterologous virus strains of infectious hematopoietic necrosis virus. Vaccine. 2000 (b). - 18. - P. 28172824.

45. Dijkstra J.M., Fischer U., Sawamoto Y., Ototake M., Nakanishi T. Exogenous antigens and the stimulation of MHC class I restricted cell-mediated cytotoxicity possible strategies for fish vaccines. Fish and Shellfish Immunol 2001a. -11.-P. 437-458.

46. Dijkstra JM, Okamoto H, Ototake M, Nakanishi T. Luciferase expression 2 years after DMA injection in glass catfish (Kryptopterus bicirrhus). Fish Shellfish Immunol. 2001b. - Feb, 11(2). - P. 199-202.

47. Dixon P. Immunization with viral antigens: viral diseases of carp and catfish. Dev Biol Stand. 1997. - 90. - P. 221-32.

48. Donnelly J.J., Ulmer J.B., Shiver J.W., Liu M.A. DNA vaccine. Annu.Rev. Immunol. -1997. 15. - P.617-648.

49. Engelking H.M., Leong J.C. The glycoprotein of infectious hematopoietic necrosis vims elicits neutralizing antibody and protective responses. Virus Res. -1989.- 13.-P. 213-230.

50. Estepa A., Thiry M., Coll J.M. Recombinant protein fragments from haemorrhagic septicaemia rhabdovirus simulate trout leucocyte anamnestic in vitro responses. J Gen Virol. 1994. 75. - P. 1329-1338.

51. Feigner P.L. DNA vaccines. Current Biology. 1998. -N. 8. - P. 551-553.117

52. Feigner P.L. Reflections on the discovery of DNA vaccine. Methods. 2003. -31.-P. 181-182.

53. Fernandez-Alonso M., Rocha A., Coll J.M. DNA vaccination by immersion and ultrasound to trout viral haemorrhagic septicaemia virus. Vaccine. 2001. - Apr 30;19(23-24). - P. 3067-3075.

54. Fijan N. Spring Viraemia of carp and other viral disaeses and agents of warm-water fish. In: Fish Diseases and Disorders. V. 3; Viral, Bacterial and Fungal infections, Woo P.T.K. & Bruno D.W., eds. CABI Publishing, UK. 1999. - P. 177-244.

55. Froehler B.C., Ny P.G. and Mattencci M.D. Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates. // Nucl. Acids. Res. 1986. v. 14. p. 5399-5407.

56. Frosr P., Ness A. Vaccination of Atlantic salmon with recombinant VP2 of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), added to a multivalent vaccine, suppresses viral replication following IPNV challenge. Fish & Shellfish Immunology. 7. - P. 609-619.

57. Fynan E.F., R.G. Webster, D.H. Fuller, J.R. Haynes, J.C. Santoro, H.L. Robinson. DNA vaccine: protective immunization by parenteral, mucosal and gene-gun inoculation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - December. - Vol. 90. - P. 11478-82.

58. Gilmore R.D, Engelking H.M, Manning D.S, Leong J.C. Expression in E. coli of complementary DNA fragment encoding an immunogenic determinant of the glycoprotein of infectious hematopoietic necrosis virus. Bio/Technology. 1988. -6.-P. 295-300.

59. Gomez-Chiarri M, Chiaverini LA. Evaluation of eukaryotic promoters for the construction of DNA vaccines for aquaculture. Genet Anal. 1999. - Nov.l5(3-5). - P.121-124.

60. Gomez-Chiarri, M, S. K. Livingston, C. Muro-Cacho, S. Sanders, and R. P. Levine Introduction of foreign genes into the tissue of live fish by direct injection and particle bombardment. Dis. Aquat. Org. 1996. 27. - P. 5-12.

61. Goodwin A.E. Spring Viraemia of Carp Virus in North America. 5th international symposium for viruses of lower vertebrates. Seattle, Washington. 2002. -Abstract book. - P. 6.

62. Goodwin, A.E. First report of spring viraemia of carp virus (SVCV) in North America // J. Aquat. Anim. Health. 2002. - V.l4. - P. 161-164.

63. Gudding R, A. Lillehaug, O. Evensen. Recent developments in fish vaccinology. Vet. Immunology & Immunopathology. 1999. - V. 72. - N. 12. - P. 203-212.

64. Hansen E, Fernandes K, Goldspink G, Butterworth P, Umeda P.K, Chang K.C. Strong expression of foreign genes following direct injection into fish muscle. FEBS Lett. 1991. - Sep 23; 290.(1-2). - P. 73-76.

65. Hasan U.A, Abai A. M, Harper D.R, Wren B.W, Morrow W.J.W. Nucleic acid immunization: concepts and techniques associated with third generation vaccines. Journal of Immunological Methods. 1999. 229. - P. 1-22.

66. He J, Yin Z, Xu G, Gong Z, Lam T.J, Sin Y.M. Protection of goldfish against Ichthyophthirius midtifiliis by immunization with a recombinant vaccine. -Aquaculture. 1997-V. 158(1-2).-P. 1-10.

67. Heistinger H, Behm D, Janacek R. Experiences in oral vaccination of carp against spring viremia of carp. 3th international Symposium on fish vaccinology. Bergen, Norway. - 2003. - Abstract book. - P.73.119

68. Heppell J., H.L. Davis. Application of DNA vaccine technology to aquaculture. Adv. Drug Delivery Reviews. 2000. - 43. - September. - P. 29-43.

69. Hill B.J. Physico-chemical and serological characterization of five rhabdoviruses infecting fish. J Gen Virol. 1975. - Jun;27(3). P. 369-378.

70. Hoffmann В., Schutze H., Mettenleiter T.C. Determination of the complete genomic sequence and analisis of the gene products of the vims of Spring Viremia of Carp, a fish rhabdovirus. Vims Research. 2002. - 84. - P. 89-100.

71. Houston W., Crabbs C. L., Kremer R. J., Springer J. W. Adjuvant Effects of Diethylaminoethyl-Dextran. \\ INFECTION AND IMMUNITY. 1976. - Vol. 13.-N. 6.-P. 1559-1562.

72. Johnson K.A., Flynn J.K., Amend D.F. Duration of immunity with Yersinia ruckery and Vibrio anguillamm bacterins // J. Fish Dis. 1982. - V. 5. - P. 207213.

73. Jorgensen J.B., Johansen L.H., Steiro K., Johansen A. CpG DNA induces protective antiviral immune responses in Atlantic salmon (Salmo salar L.). J Virol. 2003. - 77(21). - P. 11471-11479.120

74. Kanellos Т., Sylvester I. D., Howard C. R., Russell P. H. DNA is as effective as protein at inducing antibody in fish. 1999a. - Vaccine. - 17. - P. 965-972.

75. Kanellos Т., Sylvesterl.D., Ambali A.G. at al., The safety and longevity of DNA vaccines for fish. Immunology. 1999b. - 96. - P. 307-313.

76. Kiel W., Wagner R.R. Epitope mapping by deletion mutants and chimeras of two vesicular stomatitis virus glycoprotein genes expressed by a vaccinia virus vector. Virology. 1989. - Jun; 170(2). - P. 392-407.

77. Kim С. H., Johnson M. C., Drennan J. D., Simon В. E., Thomann E., Leong J. C. DNA vaccines encoding viral glycoproteins induce nonspecific immunity and Mx protein synthesis in fish. J. Virol. 2000. - 74. - P. 7048-7054.

78. Koutna, M., Vesely, Т., Psikal, I., Hulova, J. Identification of spring viraemia of carp virus (SVCV) by combined RT-PCR and nested PCR // Dis. Aquat. Org. -2003. P.55. - P.229-235.

79. Krieg A.M., Yi A.K., Schorr J., Davis H.L. The role of CpG dinucleotides in DNA vaccines // Trends Microbiol. 1998. -V.6. - P. 23-27.

80. Kurath G., Higman K.N., Bjorclund H.V. Distribution and variation of NV genes in fish Rhabdoviruses. J.Gen. Virol. 1997. - 78. - P. 113-117.

81. Kuzyk M.A., Burian J., Machander D., Dolhaine D., Cameron S., Thornton J.C., Kay W.W. An efficacious recombinant subunit vaccine against the salmonid rickettsial pathogen Pisciriclcettsia salmonis. Vaccine. 2001. - Mar 21;19(17-19).-P. 2337-2344.

82. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assemly of the head of •bacteriophage T4. // Nature. 1970. - v.227. - N 5259. - P. 680-685.

83. LaPatra, S. E., Corbeil S., Jones G. R., Shewmaker W. D., Kurath G. The dose-response effect on protection and humoral response to a DNA vaccine against

84. N virus in subyearling rainbow trout. J. Aquat. Anim. Health. 2000. - 12. -P. 181-188.

85. Lenoir G., de Kinkelin P. Fish rhabdoviruses: comparative study of protein structure. J Virol. 1975. - Aug;16(2). - P. 259-262.

86. Leong J.C, Anderson E, Bootland L.M, Chiou P.W, Johnson M, Kim C, Mourich D, Trobridge G. Fish vaccine antigens produced or delivered by recombinant DNA technologies. Dev Biol Stand. 1997. - 90. - P. 267-277.

87. Leong J.C, Bootland L., Anderson E. et al. Viral vaccine for aquaculture. J. Marine Biotechnology. 1995. - 3. - P. 16-23.

88. Lewis P.J., Babiuk L.A. DNA vaccine. A review. Advances in virus research. -1995. V.54.-P. 129-180.

89. Liljeqvist S., Stahl S. Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines. J. Bacteriology. -1999.- 73.-P. 1-33.

90. Lipford G.B., Heeg K., Wagner H. Bacterial DNA as immune cell activator. -Trends in Microbiology. 1998. - 6. - P. 496-500.

91. Liu H, Gao L, Shi X, Gu T, Jiang Y & Chen H (2004). Isolation of spring viraemia of carp virus (SVCV) from cultured koi (Cyprinns carpio koi) and common carp (Cyprinus carpio carpio) in P.R. China // Bull. EAFP. V.24. -P.194-202.

92. Lodmell D. L., Smith J. S., Esposito J. J., Ewalt L.C. Cross-Protection of Mice against a Global Spectrum of Rabies Virus Variants. J. Virology. Aug. - 1995. -P. 4957-4962.

93. Lorenzen E., Einer-Jensen K., Martinussen Т., LaPatra S.E., Lorenzen N. DNA vaccination of rainbow trout against viral hemorrhagic septicemia virus: a dose122response and time-course study. J. Aquatic animal health. 2000. - 12. - P. 167180.

94. Lorenzen N, Lorenzen E, Einer-Jensen K. Immunity to viral hemorrhagic septicemia (VHS) following DNA vaccination of rainbow trout at an early life-stage. Fish Shellfish Immunol. 2001. - Oct; 11 (7). - P. 585-591.

95. Lorenzen N, Lorenzen E, Einer-Jensen K. LaPatra S.E. Immunity induced shortly after DNA vaccination of rainbow trout against Rhabdoviruses protects against heterologous virus but not against bacterial pathogens. Dev Biol Stend. -2002a.-26. P. 173-179.

96. Lorenzen N, Olesen NJ. Immunization with viral antigens: viral haemorrhagic septicaemia. Dev Biol Stand. 1997. - 90. - P. 201-9.

97. Lorenzen N., E. Lorenzen, K. Einer-Jensen, J. Heppell, T. Wu, H. Devis. Protective immunity to VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) following DNA vaccination. Fish & Shellfish immunology. 1998. - 8. - P. 261270.

98. Lorenzen N., LaPatra S. E. Immunity to rhabdoviruses in rainbow trout. Fish & Shellfish Immunology. 1999a. - 9. - P. 345-360.

99. Lorenzen N., Lorenzen E., Einer-Jensen K., LaPatra S. E. DNA vaccines as a tool for analysing the protective immune response against rhabdoviruses in rainbow trout. Fish & Shellfish Immunology. 2002b. - 12. - P. 439-453.

100. Lorenzen N., Olesen N.J., Koch C. Immunity to VHS virus in rainbow trout. Aquaculture. 1999. 172. - P. 41-61.

101. Lorenzo G.A., A. Estepa, S. Chilmonczyk, J.M. Coll. Different peptides from hemorrhagic septicemia Rhabdoviral proteins stimulate leukocyte proliferation with individual fish variation. Virology. 1995. - 212. - P. 348-55.123

102. Lu Y., Nadala E.C.B., Brock J.A., Loh P.C. A new virus isolated from infectious hypodermal and infectious hematopoietic necrosis virus-infected penaeid shrimps. J. Virology Methods. 1991.-31. - P. 189-196.

103. MacKinnon A. Risk factors affecting adverse reactions in Atlantic salmon parr vaccinated with multivalent oil adjuvanted vaccine. 3-rd International Symposium on Fish Vaccinology. Bergen, Norway. 2003. - P. 83.

104. Manning D.S., J.C. Leong. Expression in Escherichia coli of the Large Genomic Segment of infectious pancreatic necrosis virus. Virology. 1990. - 179. - P. 1625.

105. O.Mars den MJ, Vaughan LM, Fitzpatrick RM, Foster TJ, Secombes CJ. Potency testing of a live, genetically attenuated vaccine for salmonids. Vaccine. 1998. -Jul;16(l 1-12). - P. 1087-1094.

106. Mikalsen AB, Torgersen J, Alestrom P, Hellemann AL, Koppang EO, Rimstad E. Protection of atlantic salmon Salmo salar against infectious pancreatic necrosis after DNA vaccination. Dis Aquat Organ. 2004. - Jul 5;60(1). - P. 11-20.

107. Montgomery D. L., Ulmer J. EL, Donnelly J. J., Liu M. A, DNA Vaccines. Pharmacol. Ther. 1997. - Vol. 74. - No. 2. - P. 195-205.

108. Nakanishi Т., U. Fischer, J.M. Dijkstra, S. Hasegawa, T. Somatoto, N. Okamoto, M. Otokake, Cytotoxic T cell function in fish. Dev. Сотр. Immunology. 2002. - V.2. - N. 3. - P. 131-139.

109. Petersen J.M., Her L.S., Dahlberg J.E. Multiple vesiculoviral matrix proteins inhibit both nuclear export and import. PNAS. 2001. - July. - V. 98. - N 15. -P.8590-95.

110. HO.Petrov N.A., Karginov V.A., Mikriukov N.N., Serpinski O.I., Kravchenko V.V. Complete nucleotide sequence of the bacteriophage X DNA region containing gene Q and promotor PR>// FEBS Lett. 1981. V. 133. N. 2 p.316-320.

111. Poinan A., Gomes A., Oliveira R., Silva J. Migration of vesicular stomatitis virus glycoprotein to the nucleus of infected cells. Biochemistry. 1996. -August. - 93. - P. 8268-8273.

112. Reed L.J., Muench H.A. A simple method of estimating fifty percent endpoints // Amercan J. Hygiene. 1938. - V. 24. - P. 493-497.

113. Rocha A., Fernandez-Alonso M., Mas V., Perez L., Estepa A., Coll J.M. Antibody response to a fragment of the protein G of VHS rhabdovirus in immunised trout. Veterinary Immunology and Immunopathology. 2002. - 86. -P. 89-99.

114. Rossius M., Thiry M. Towards a recombinant subunit vaccine against spring viraemia of the carp virus // Intern. Symposium on the Carp. Budapest, Hungary, 1993. Book of Abstract. P. 112.

115. Rossius M.T., F. Lecocq-Xhonneux, N. Vanderheijden, M. Thiry, J. Van

116. Beeumen, J. A. Martial. Cloning, sequencing and expression of a cDNA coding125for the glycoprotein of Spring Viraemia of carp virus: a fish Rhabdovirus. J. gen. Virology. 1995. - 9. - P. 452-465.

117. Roy P., Clewley J. P. Spring Viremia of Carp Virus RNA and Virion-Associated

118. Russell P. H., T. Kanellos, M. Negrou, A. G. Ambali. Antibody responses of goldfish {Car as sins auratus L.) to DNA-immunisation at different temperatures and feeding levels. Vaccine. 2000. - 18. - P. 2331-2336.

119. Sanger F., Coulson A. R., Barrel B. G. et al. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. // J. Mol. Biol. 1980. - Vol. 143, N2. - P. 161-168.

120. Saporito-Irwin SM, Geist RT, Gutmann DH. Ammonium acetate protocol for the preparation of plasmid DNA suitable for mammalian cell transfections. Biotechniques. -1997. Sep; 23(3). - P. 424-7.

121. Schmidt E.V., Christoph G., Zeller R., Leder P. The cytomegalovirus enhancer: a pan-active control element in transgenic mice. // Mol Cell Biol. 1990. -Aug; 10(8). -P. 4406-4411.

122. Sharma A.K., Khnuller G.K. DNA vaccines: strategies and relevance to intracellular pathogens. Immunology & Cell Biology. 2001. - 79. - P. 537-546.

123. Shchelkunov I.S., Oreshkova S.F^ Popova A.G., Nikolenko G.N., Shchelkunova T.I., Ilyichev A.A. Development of PCR-based techniques for routine detection and grouping of spring viraemia of carp virus. Aquaculture. 2005.

124. Simon R, Priefer U. and Puhler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria. Bio/Technology. 1983. - 1. - P. 784-791.

125. Smith P.A., Contreras J.R, Larenas J,J, et al. Immunization with bacterial antigens: piscirickettsiosis. In: Gudding R, Lillehaug A, Midtlyng PJ, Brown F, editors. Fish vaccinology. Basel, Switzerland: Karger Publishers. 1997. - P. 161-166.

126. Sommerset I, Lorenzen E, Lorenzen N, Bleie H, Nerland AH. A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot. Vaccine. 2003. - Dec 1. - 21(32). - P. 4661-4667.

127. Takano T, Iwahori A, Hirono I, Aoki T. Development of a DNA vaccine against hirame rhabdovirus and analysis of the expression of immune-related genes after vaccination // Fish Shellfish Immunol. 2004. - V.17. - P. 367-374.

128. Tanner F.C, Carr D.P, Nabel G.J, Nabel E.G. Transfection of human endothelial cells. Cardiovascular Research. - 1997. - 35. - P. 522-528.

129. Thomsen A. R, Nansen A, Andersen C, Johansen J, Marker O, Christensen J. P. Cooperation of В cells and T cells is required for survival of mice infected with vesicular stomatitis virus. International Immunology. 1997.-9.-P. 1757-1766.

130. Towbin H, Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding current status and outlook. // J. Immunol. Meth. 1984. v. 72. p. 313-340.a. Transcriptase Activity. J. Virology. March. - 1978. - P. 912-916.

131. Traxler, G. S, E. Anderson, S. E. LaPatra, J. Richard, W. D. Shewmaker, and G.

132. Kurath. Naked DNA vaccination of Atlantic salmon (Salmo salar) against IHNV. Dis. Aquat. Org. 1999. - 38. - P. 183-190.

133. Trobridge G.D., P.P. Chinou, J.C. Leong. Cloning of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) Mx2 and Mx3 cDNAs and Characterization of trout Mx protein expression in salmon cells. J. Virology. July. - 1997. - P. 5304-11.

134. USDA news releases, 2003: http://www.aphis.usda.gov

135. Vesterberg O. Staining of protein zones after isoelectric focusing in polyacrilamid gels. Biochim. Biophys. Acta. 1971. v. 243. p. 345-348.

136. Walker P.J., Kongsuwan K. Deduced structural model for animal rhabdovirus glycoprotein. J. Gen. Virology. 1999. - 80. - P. 1211-1220.

137. Wang WS, Wang DH. Enhancement of the resistance of tilapia and grass carp to experimental Aeromonas hydrophila and Edwardsiella tarda infections by several polysaccharides. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 1997. - Jun;20(3). - P. 261-70.

138. Winton JR. Immunization with viral antigens: infectious, haematopoietic necrosis. Dev Biol Stand. 1997. - 90. - P. 211-220.

139. Xu L., Mourich D. V., Engelking H. M., Ristow S., Arnzen J., Leong J. C. Epitope Mapping and Characterization of the Infectious Hematopoietic Necrosis128