Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка РДСК для диагностики бабезиоза собак

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Разработка РДСК для диагностики бабезиоза собак"

На правах рукописи

Расстригин Алексей Евгеньевич

РАЗРАБОТКА РДСК ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БАБЕЗИОЗА СОБАК 03.00.19 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2005

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.

Научный руководитель - Главный научный сотрудник, доктор биологических наук

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор Горохов

Ведущая организация - Российский университет дружбы народов.

Защита состоится «27» апреля 2005 года в 1400 часов на заседании Диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (109428, г. Москва, Рязанский проспект, д. 24, к. 1, тел 995-88-67)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ Автореферат разослан

Ученый секретарь

Христофис Георгиу.

Владимир Васильевич (ВИГИС)

доктор биологических наук, профессор Меньшиков Владимир Григорьевич (МГАВМиБ)

Диссертационного совета, профессор

1.ВВЕДЕНИЕ.

Общая характеристика работы 1.1. Актуальность проблемы.

Бабезиоз - остро протекающее заболевание собак, вызванное паразитированием в эритроцитах животного простейших из отрада Piroplasmida, сопровождающееся высокой температурой тела, угнетением, анемичностью и желтушностью слизистых оболочек, гемоглобинурией, нарушением сердечной деятельности и нередко приводящее к летальному исходу.

В настоящее время трудно представить себе жизнь человека без общения с четвероногими друзьями.

Собака является слугой и другом, она преданный член семьи, компаньон в играх и помощник на охоте. Собака - помощник в повседневной жизни и спасатель в сложных ситуациях. Собака - символ статуса, престижа и моды. Собака служит в армии и милиции. О собаке говорят, что она создаёт комфорт и является близким товарищем. Собака -первое животное, одомашненное человеком, и оно следует за ним по всему миру от Арктики до Антарктики. Приручив это животное человек взял на себя обязанность заботы о его здоровье, охраны его от воздействия разных патогенных факторов.

Бабезиоз - грозное заболевание, именуемое также пироплазмоз, характеризуется трансмиссивностью, природной очаговостью и проявляется лихорадкой непостоянного типа, глубокой анемией, кахексией (Davis J.W., Anderson R.C. 1971; Кровопаразитарные болезни животных. 1995; Jacobson L.S. et al.,1996).

В России переносчиками бабезиоза является клещ Dermacentor marginatus, а за рубежом отмечены клещи: Rhipicephalus sanguineus, Haemaphysalis leachi (Марков АА и др. 1935; Uilenberg G. et al., 1989; Hauschild S. et al., 1995). Многими исследователями отмечена трансовариальная передача клещами возбудителя бабезиоза, а если учитывать, что восприимчивыми животными к заражению B.canis являются и дикие плотоядные семейства собачьих (Canis) (Велю Г. 1930; Якимов В. Л. 1931; Button С, 1979), то они следовательно могут служить природными резервуарами (Henning M.W., 1956). Заболевание обладает ярко выраженной весенней и осенней сезонностью (Sanders DA., 1937; Matthewman LA. et al., 1993; Zahler M. et al. 1998; Sanders DA. et al., 2002). Срок носительства после переболевания отмечен более 130 дней (Botros B.A.M. et al., 1975; YonamineH.etal., 1984).

Заболевание широко распространено во всех регионах земного шара, но чаще в тропической зоне (Марков А.А. и др., 1935; Uilenberg G. et al., 1989; Hauschild S. et al., 1995).

Несмотря на профилактическую обработку против клещей, смертность остается значительной. Это обусловлено отсутствием надежной диагностики при массовом обследовании животных и выявлении природных очагов.

Диагностика бабезиоза собак основана на учете эпизоотического состояния, сезона года, клинических признаков, патоморфологических изменений, и результатов микроскопического исследования мазков крови. Решающими в диагнозе являются положительные результаты микроскопического исследования мазков крови. При окраске мазков крови по Романовскому-Гимза Babesia canis может иметь различную форму: грушевидную, овальную, округлую, амебовидную, но в основном находят парногрушевидную форму паразита (Паразитология и инвазионные заболевания с/х животных., 1956; Протозойные болезни с/х животных., 1982; Паразитология и инвазионные заболевания животных., 1998; Балагула Т.В., 2000. Walter S. et al., 2002;). Все формы могут различно ассоциироваться в одном эритроците (Якимов В.Л., 1931).

Ограниченные возможности световой микроскопии сдерживают своевременное проведение лечебных и других мер борьбы с болезнью. Трудности в идентификации бабезий и особенно при паразитоносительстве, вызвали необходимость изыскивать специфические и более эффективные средства диагностики, такие как серологические.

Для предотвращения распространения бабезиоза необходима современная диагностика заболевания.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности исследований по серологической диагностике бабезиоза собак.

12. Цель и задачи исследования:

Учитывая необходимость своевременного выявления заболевания, основной целью работы явилось усовершенствовать существующие методы диагностики, освоить и разработать производство новых, более чувствительных тест-систем.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- отработать оптимальные режимы для получения высокой паразитемии бабезий у неспленэктомированных и спленэктомированных щенят, щенят в подсосный период с целью использования высокоактивных антигенов в РДСК.

- установить периоды появления и исчезновения бабезийных антител у экспериментально зараженных щенят в РДСК.

- провести выборочное серологическое исследование на бабезиоз собак в разных городах России.

1.3. Научная новизна.

Разработан метод приготовления высокоактивных антигенов для серологической диагностики бабезиоза собак, включающий получение высокой паразитемии у животных - доноров после снленэктомии.

Впервые доказана возможность экспериментального заражения бабезиозом щенят в подсосный период.

С помощью РДСК изучена динамика антителогенеза у экспериментально зараженных бабезиозом животных и уточнена эпизоотическая ситуация по бабезиозу собак в разных городах России.

1.4. Практическое значение работы.

Предложена и разработана методика получения бабезийного антигена B.canis для серологических реакций РДСК.

Предложена комплексная схема получения позитивной и негативной сыворотки собак и её высушивания.

Предложена схема получения антигена B.canis от экспериментально зараженных интактных щенят, от спленэктомированных и потом зараженных, и от щенят в подсосный период.

По результатам проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по приготовлению и контролю антигенов из B.canis для РДСК», рассмотренные и утвержденные на заседании Ученого Совета ВИЭВ 10 августа 2004года.

1.5. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены

на:

• 11 Московском международном ветеринарном конгрессе 17-19 апреля 2003 г. Москва.

• «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине». 15-16 мая 2003 г. Москва.

• Международной научно-практической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения проф. А.А.Маркова. Москва 2002 г.

• Заседании ученого совета ВИЭВ, Москва, 2003.

• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2005.

1.6. Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 6 работ в журналах «Ветеринарная медицина», «Ветеринарный консультант» и «Ветеринарная патология».

1.7. На защиту выносятся.

1.Отработка оптимального режима получения высокой паразитемии бабезий у неспленэктомированных и спленэктомированных щенят, щенят в подсосный период с целью использования высокоактивных антигенов в РДСК.

2.Метод приготовления высокоактивных антигенов для серологической диагностики бабезиоза собак, включающий получение высокой паразитемии у животных - доноров после спленэктомии.

3. Материалы по заражению бабезиозом подсосных щенят.

4.Материалы по изучению периода появления и исчезновения комплементсвязывающих антител у экспериментально зараженных бабезиозом щенят.

5.Метод получения положительных сывороток крови от зараженных бабезиозом щенят и от паразитоносителей.

6.Метод получения положительной сыворотки от иммунизированных бабезийным антигеном кроликов.

7.Метод лиофилизации сывороток и антигенов. Материалы по их титрации.

8.Материалы по изучению динамики антителогенеза у экспериментально зараженных бабезиозом животных с помощью РДСК и уточнения эпизоотической ситуации по бабезиозу собак в разных городах Европейской части РФ.

9.0птимизация режима постановки реакции длительного связывания комплемента для диагностики бабезиоза собак.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 117 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список использованной литературы включает 142 наименования, из них 102 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 5 рисунками. В приложении представлен документ, подтверждающий наиболее важный результат исследования и его практическую ценность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Настоящая работа выполнена в 2001 - 2003 гг. в лаборатории протозоологии Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко. Опыты приготовления антигена, сывороток, их лиофилизация и постановка РДСК проводились совместно с научным руководителем главным научным сотрудником Х.Георгиу.

В опытах была использована 23 собаки в возрасте от 3 недель до 4 месяцев (в1-ом опыте использовали -3, во 2-ом - 17, ив 3-ом -3 собаки) и 11 кроликов 6-7 месячного возраста.

Для заражения животных использовали штаммы Babesia canis из ветеринарных клиник города Москвы и Московской области. Для изучения эпизоотической ситуации по бабезиозу собак необходимый материал был доставлен из питомников различных областей РФ. Всего исследовали 56 проб сывороток крови собак. Исходным материалом для получения бабезиозного антигена послужила кровь от собак, больных бабезиозом с пораженностью эритроцитов от 20-35% и более. Заражение животных проводили подкожным введением крови oт больных животных. Обычно паразитемия у собак сравнительно невысока: 10-15%. Кровь с подобной паразитемией не может использоваться в качестве исходного материала для приготовления антигена. В связи с этим для получения большей паразитемии мы использовали спленэктомированных животных. Были проведены три опыта с использованием 23 собак, 4 из которых были сначала спленэктомированы, а затем заражены. У остальных селезенка не была удалена.

Спленэктомия собак проводилась согласно методическим указаниям, рекомендованным ГУВ МСХ СССР от 24 ноября 1975 года, учитывая видовую специфику подопытных животных.

Все собаки, поступающие для опыта, проходили обязательный карантин, во время которого собак дегельминтизировали, и вакцинировали от основных вирусных и бактериальных заболеваний, а также исключали бабезиоз собак на основании световой микроскопии окрашенных по Романовскому-Гимза мазков. Опыты выполняли во все сезоны года. Всех подопытных животных до заражения и один раз во время болезни

подвергали клиническим, паразитологическим, гематологическим и иммунологическим исследованиям.

В клинические исследования входило: наблюдения за общим состоянием и наличием аппетита, измерение температуры тела, частоты пульса и дыхания, осмотр цвета слизистых оболочек, проверка состояния сердечно-сосудистой системы.

Паразитологические исследования заключались в микроскопии мазков периферической крови, фиксированных в метиловом спирте и в дальнейшем окрашенных по Романовскому-Гимза. Уровень паразитемии выводили путём просмотра мазков в 100 полях зрения микроскопа, а при большом количестве возбудителя - путём подсчета и процентного соотношения общего количества эритроцитов к количеству пораженных эритроцитов.

В гематологические исследования входило: определение содержания гемоглобина в грамм/литр, подсчет эритроцитов и лейкоцитов в 1мкл крови с помощью камеры Горяева.

Для изучении иммунологических реакций организма собак на введение бабезий, сыворотку крови исследовали на наличие бабезийных антител в реакции длительного связывания комплемента (РДСК), которую ставили по схеме временного наставления по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в реакции длительного связывания комплемента, утвержденного ГУВ Госагропрома СССР 6 мая 1988 года (Н.И.Степанова, Н.А.Казаков, Х.Георгиу).

Для титрования антигенов и постановки реакции необходимы позитивная и негативная сыворотки. Для этого на 15-25 день после заражения собак бабезиозом, когда титры антител в сыворотке крови достигали 1:20 и выше, у животных брали кровь для приготовления сыворотки. Кроме того, для получения положительной сыворотки крови собак использовали и сыворотку крови от паразитоносителей. От незараженных собак брали кровь для приготовления отрицательной сыворотки. Титры сывороток, характеризующие их активность и антикомплементарные свойства, определяли в РДСК с использованием бабезиозного антигена

Для отработки методов серологических исследований и получения иммунной сыворотки от кроликов, животным вводили бабезиозный антиген в рабочем разведении. После выявления комплементсвязывающих антител в высоких титрах (от 1:40 до 1:160) кроликов обескровливали, готовили сыворотку, титровали и

высушивали с целью длительного хранения так же как и антиген, но без защитной среды.

12. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1. Выбор штамма возбудителя и определение его видовой принадлежности

Бабезиоз собак вызывает возбудитель B.canis и B.gibsoni. B.canis имеет широкое распространение по всему земному шару, тогда как B.gibsoni распространена в Азии, некоторых регионах США и Южной Европе.

В России известен лишь один возбудитель бабезиоза собак - B.canis.

Дифференцировать виды возможно под световым микроскопом при окраске мазков по Романовскому - Гимза. Величина паразитов: круглых одиночных форм диаметром 2,13...4,26 мкм, круглых парных - 2,84...4,26 х 1,42...2,84 мкм, грушевидных одиночных - 3,5...4,26 х 2,13...2,82 мкм, грушевидных парных - 3,14...5,32 х 1,95...3,14 мкм (в среднем 4,12 х 2,73 мкм), овальных одиночных - 2,82...4,26 х 2,13...2,82 мкм, овальных парных - 2,13...2,43 х 1,42 ...1,77 мкм (Якимов В.Л., 1911,1929, 1931). Кроме того, отмечают округлую, амебовидную формы, но в основном находят парногрушевидную форму паразита (Ершов B.C., 1956; Zwart D. and Brocklesby D.W., 1979; Казаков Н.А., 1982; Акбаев М.Ш., 1998; Walter S. et al., 2002). Babesia gibsoni имеет очень малые размеры: 1,6 х 2,4мкм; и поэтому различают главным образом округлые и круглые формы паразита.

Рис 1 Возбудитель бабезиоза (В canis и В gibsoni), по Н Mehlhorn

На рисунках представленных с любезного разрешения г-ном Heinz Mehlhom, хорошо видны различия в размерах и формах между В canis и В gibsoni

1. В canis - типичные грушевидные и парногрушевидные формы. Размеры паразита больше или равны радиусу эритроцита.

2. 2, 3, 4. В gibsoni - типичные округлые и круглые формы паразита значительно меньше радиуса эритроцита

В наших опытах мы использовали паразита В cam's, такое заключение мы можем дать на основе формы и размера паразита. На наших рисунках 2а, 2б и 2в видно, что паразит парногрушевидной формы больше или равен радиусу эритроцита (эритроциты собак обычно типичный двояковогнутый диск около 7.0 мкм в диаметре и 1.7 мкм в толщину (Jain N. C. 1986) и имеет размер 2,5 X 4,5 мкм; паразит округлой формы имеет диаметром. 4,0 мкм

Рис 2 Возбудитсти бабезиоза (В canis)

А

8?

Щ

«°

о А «О

О о

Ой 4 'ъ. 9

V у- гл.

V "

щ4-

Б

Таким образом, сравнивая форму и размер используемого нами Московского штамма с ранее известными и зарубежными штаммами В canis и В gibsoni, мы можем дать заключение, что в наших опытах использовался штамм В canis На наших рисунках видно что паразиты грушевидной и парно- грушевидной форм больше или равны радиусу эритроцитов паразиты округлой формы также имеют большой размер Формы наших

2.2.2. Определение условий, влияющих на степень переболевания и выраженность паразитемии у зараженных бабезиозом собак.

Для приготовления бабезийного антигена, применяемого в серологических реакциях, используют кровь от больного животного, из которой после разрушения эритроцитов выделяют чистые бабезии. На активность такого антигена большое влияние оказывает уровень пораженности эритроцитов крови донора бабезиями - чем выше паразитемия, тем активнее антиген. В связи с этим перед вами была поставлена задача - отработать технологию получения высокой паразитемии у зараженных бабезиозом собак.

Учитывая литературные данные о различной длительности инкубационного периода у зараженных бабезиозом животных в зависимости от дозы введенного возбудителя и способа заражения, мы обратили внимание на факторы, способствующие сокращению инкубационного периода и появлению максимальной паразитемии.

Обычно паразитемия у собак, пораженных B.canis, сравнительно невысока. У отдельных животных она не превышает 10...15%, у большинства из них процент пораженности эритроцитов бабезиями составляет 1...5%. Кровь с подобной паразитемией не могла быть использована в качестве исходного материала для приготовления антигена. Для получения большей паразитемии мы, как правило, использовали спленэктомированных животных. Для решения этого вопроса поставлены два опыта и использовали 20 собак в возрасте от 3-х недель до 4-х месяцев. В 1-ом опыте использовали-3, во 2-ом 17.

2.2.3. Опыты с неспленэктомитрованными собаками

Исследования проводились в мае - июне и сентябре - октябре 2001 года.

В первом опыте использовали 3-х беспородных собаки в возрасте 4 - 5 месяцев. В день помещения собак в виварий была проведена дегельминтизация препаратом «Альбен -С» и вакцинация против основных заболеваний собак. Кормление двухразовое, концентрированным коммерческим кормом, воду для питья давали вволю.

Первый опыт проводили в конце мая - начале июня 2001 года. Кровь для заражения получили от больной собаки с диагнозом бабезиоз со станции по борьбе с болезнями животных в Нагатино.

Заражение проводилось подкожно в область лопатки в дозе 2 мл, где содержалось предположительно единичные бабезии в мазках периферической крови. Наблюдение за состоянием здоровья подопытных собак длилось две н дели. За это время никаких симптомов заболевания не было обнаружено, в мазках периферической крови паразитов также не было обнаружено. Во втором опыте использовали 17 собак в возрасте от 3-х недель до 4-х месяцев. Четверо из них были предварительно спленэктомированы.

Второй опыт проводили в сентябре - октябре 2001 года. Кровь для заражения получили со станции по борьбе с болезнями животных в Ясенево, от больной собаки с диагнозом бабезиоз (паразитемия: 3..5% в поле зрения микроскопа). Заражение проводилось так же, как описано в первом опыте.

Клинические признаки у первых четырех собак (1..4 мес. возраста) развились на 6...8 день (табл.1). У них отмечалось: снижение аппетита, угнетенное состояние, слизистые оболочки ротовой полости и конъюнктива анемичны и желтушны. На 6-8 день собаки были эвтаназированы и обескровлены и из их крови приготовили бабезиозный антиген.

Для достижения высокой паразитемии у щенят (1-4месячный возраст) во втором опыте потребовалось от 6 до 8 дней и получен активный антиген (табл.1).

Табл .1 Титр антигена неспленэктомированных щенят, зараженных В.саШБ

животных Возраст (месяцев) Кол-во введенной крови (мл) Сроки обескровливания (сут) Паразите-мия (%) Рабочий титр

1 1... 4 2 6 20 1:32

2 1... 4 2 7 21 1:16

3 1... 4 2 8 29 1:16

4 1... 4 2 6 19 1:64

Как видно из таблицы 1, антиген, приготовленный из инвазированной бабезиями крови (паразитемия 19...29%), оказался активным в титре 1:16 до 1:64.

Таким образом, этот опыт показал, что высокую паразитемию (19 - 29%) можно получить и от неспленэктомированных щенят, зараженных инвазированной В.саШБ кровью. Соответственно и титры приготовленных антигенов были высокими: от 1:16 до

1:64 (1 -1:32; 2 -1:16; 3 -1:16; 4-1:64).

2.2.4. Опыт со спленэктомированными щенятами.

Кровью, взятой от обескровленных щенят второго опыта, были заражены четыре спленэктомированных щенка. Клинические признаки (анемия, желтушность, угнетение, моча темного цвета) развились на седьмой день, одна собака пала, остальные были обескровлены при паразитемии 25 до 50%. Антиген, приготовленный из инвазированной бабезиями крови, оказался активным (табл.2).

Табл.2 Титр антигена спленэктомированных щенят, зараженных В.са^

Количество Возраст Кол-во Сроки Паразитемия Рабочий

введенной обескровливания титр

животных (месяц) крови (мл) (%)

(сут)

1 1... 4 2 7 35 1:32

2 1... 4 2 7 50 1:164

3 1... 4 2 7 25 1:256

4 1... 4 2 пала

Титры приготовленных антигенов из спленэктомированных и потом зараженных щенят были высокими от 1:32 до 1:256 (табл.2).

Опыт со спленэктомированными и потом зараженными щенятами показал, что клинические признаки у спленэктомированных щенят развились на 7 день, один щенок пал, а остальные обескровлены при высокой паразитемии - 25 - 50%. Активность бабезийных антигенов, полученных из крови спленэктомированных щенят, показала, что она находиться в прямой зависимости от паразитемии у обескровленных животных. При высокой паразитемии (25 - 50%) получили антигены в титрах от 1:32 до 1:256.

2.2.5. Опыт с подсосными 3-4 недельными щенками

Кровью, взятой от спленэктомированных щенят после обескровливания, были заражены 9 щенков в возрасте 3...4 недель. У них отмечали развитие клинических признаков (анемия, желтушность) на 3..4 день, 4 щенка пали, остальные были обескровлены. Приготовленный из инвазированной крови при паразитемии от 10 до 15% бабезиозный антиген оказался активным (табл.3).

Табл.3 Титр антигена из крови щенят-сосунков, зараженных B.canis

Количество животных Возраст (нед) Кол-во введенной крови (мл) Сроки обескровливания (суг.) Паразитемия (%) Рабочий титр

1 3. .4 1,5 3 10 1:256

2 3. .4 1,5 4 12 1:128

3 3. .4 1,5 4 14 1:16

4 3. .4 1,5 4 15 1:32

5 3. .4 1,5 4 13 1:64

6 3. .4 1,5 Пал - -

7 3. .4 1,5 Пал - -

8 3. .4 1,5 Пал - -

9 3. .4 1,5 Пал - -

Как видно из табл.3, антигены, приготовленные из крови щенков в подсосный период, оказались активными в титре 1:16 до 1:256.

Опыт с подсосными щенятами, зараженными кровью, взятой от спленэктомированных щенят при паразитемии 25 - 50%, показал, что можно использовать подсосных щенят для получения паразитемии 10 - 15% на 3.. 4 день после заражения и антигенов крови с титрами от 1:16 до 1:256. Однако недостатком данного приёма, является то, что подсосные щенята дают очень малое количество крови. Сравнивая результаты наших опытов (заражения неспленэктомированных, спленэктомированных и

подсосных щенков) установили, что лучше заражать спленэктомированных щенков. Для получения большего количества возбудителя использовать щенков в возрасте 4-5 месяцев. Так как, в этом возрасте при массе тела в 5 - б кг, можно получить около 200300 мл крови, тогда как от подсосных щенков удалось получить всего 50- 70 мл.

2.2.6. Способ приготовления антигена для РДСК

Для приготовления бабезийного антигена тотальное обескровливание животных проводили в период максимальной паразитемии. Кровь собирали в стерильные колбы с лимоннокислым натрием из расчета: 50 мл 20%-ного цитрата натрия на 1 литр крови. Обработку крови проводили в день её взятия или не позднее следующих суток.

Отделение плазмы осуществляли центрифугированием на центрифуге К-70 при 6000 об/мин, эритроциты отмывали в физиологическом растворе (рН 7,2-7,4) также при 6000 об/мин в течение 30 мин, трехкратно.

Полученный осадок эритроцитов поместили во флаконы и ставили в замораживающую камеру холодильника для лизирования. При этом сосуд с жидкостью 23 дня держали на холоде, затем постепенно оттаивали, тщательно встряхивали, готовили мазки, просмотром которых контролировали лизирование эритроцитов и чистоту исследуемого материала. Обычно после второго оттаивания происходил полный лизис, и в препаратах просматривались свободные бабезий.

Как правило, достаточно двух, трехкратного замораживания-оттаивания эритроцитов в морозильнике обычного холодильника. Лизат эритроцитов смешивали с пятью объемами физиологического раствора (рН 7,2) и центрифугировали в течение 40-50 мин при 6000 об/мин 2-3 раза до просветления надосадочной жидкости.

Работу проводили с соблюдением стерильности и при постоянном контроле окрашенных препаратов под микроскопом.

Взвесь возбудителя, полученную вышеописанным методом, использовали для получения гомогенной суспензии; взвесь паразитов сливали во флакон с бусами и в течение 2-3 часов гомогенизировали во встряхивающем аппарате или вручную в течение часа. Суспензию проверяли на чистоту путем микроскопии приготовленных из нее мазков. Флаконы с готовым антигеном консервировали тиомерсаном 1:10000, плотно

закрывали пробками, этикетировали и ставили на несколько дней для созревания в рефрижератор при +2 - 4°С. После созревания антиген оттаивали, проверяли еще раз на чистоту путем микроскопии приготовленных из него мазков и титровали в РДСК с заведомо положительными и отрицательными сыворотками (Х.Георгиу, 1980).

2.2.7. Способ приготовления позитивной и негативной сывороток для РДСК 2.2.7.1. Способ приготовления позитивной и негативной сывороток от собак.

Для титрования антигенов и постановки реакции были необходимы позитивная и негативная сыворотки. Для этого на 10,15,20 день после заражения собак возбудителем бабезиоза (3-й опыт), когда титры антител сыворотки крови достигали 1:20 и выше, у животных брали кровь в стерильные узкие сосуды (цилиндры) и ставили в темное место при комнатной температуре (до образования плотного сгустка). Тромб обводили стерильной металлической спицей, отделяя его от стенок сосуда, и оставляли для отстаивания сыворотки. Сыворотку сливали в стерильные флаконы. При наличии в сыворотке эритроцитов её центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15-20 минут.

От здоровых собак брали кровь для приготовления отрицательной сыворотки. Титры сывороток, характеризующие их активность и антикомплиментарные свойства, определяли в РДСК с использованием приготовленного нами бабезийного антигена (табл. 4).

Табл. 4 Результаты титрования позитивных и негативных серий сывороток крови собак

№ серии Титры серий сывороток крови собак

Позитивной Негативной

1 1:40 Отрицательно

2 1:80 Отрицательно

Из таблицы 4 видно, что приготовленные серии положительных сывороток крови собак были высокоактивными и неантикомплементарными (№1 1:40, №2 1:80). Негативные сыворотки также не обладали антикомплементарными свойствами.

Для получения положительной сыворотки крови больных бабезиозом собак использовали и сыворотку крови от собак-паразитоносителей из разных городов России (табл. 17). Результаты видны в табл.5.

Табл. 5 Результаты титрования позитивных серий сыворотки крови собак от паразитоносителей.

Как видно из таблицы 5, позитивные серии сывороток были активными и неантикомплементарными (№1 - 1:20, №2 - 1:40). Поставленные нами опыты по получению позитивной сыворотки от зараженных бабезиозом собак и от бабезионосителей показали, что кровь от зараженных бабезиозом собак и кровь собак-паразитоносителей, для приготовления позитивной сыворотки можно брать, когда титры антител в РДСК находятся в титрах 1:20 и выше. Для приготовления негативной сыворотки - когда сыворотка крови у собак дает отрицательные результаты в РДСК с бабезийным антигеном.

2.2.7.2. Способ приготовления позитивной сыворотки от иммунизированных кроликов бабезийным антигеном

Для получения иммунной сыворотки от кроликов и отработки методов серологических исследований животным вводили бабезиозный антиген.

С целью выявления возможности использования таких серологических реакций как РДСК, с сывороткой крови кроликов и получения иммунной сыворотки на

антиген B.canis, было поставлено два опыта с использованием 11 кроликов. Животным вводили бабезиозный антиген.

В опытах использовали кроликов 6-7 месячного возраста массой 2,5 - 3,0 кг. В первом опыте использовали 5 животных, которых разделили на две группы. В первой группе 3-м кроликам ввели внутримышечно антиген B canis в рабочем разведении. Во второй группе два кролика служили контролем. Титр антител у кроликов первого опыта первой группы видны в таблице 6.

Табл. 6 Титр антител у кроликов, иммунизированных антигеном В canis (первый опыт).

Первая группа кроликов Вторая группа кроликов

№п/п Титр антител №п/п Титр антител

1 1:20 1 отрицательный

2 1:80 2 отрицательный

3 1:40 -

Как видно из таблицы 6, титр антител был в пределах 1:20... 1:80.

Второй опыт ставили с целью уточнения полученных результатов первого опыта. Для этого использовали шесть кроликов, которых разделили на две группы. Одной группе ввели антитен, а вторая группа служила контролем, как и в первом опыте. Титр антител у кроликов второго опыта первой группы видны в таблице 7.

Табл. 7 Титр антител у кроликов, иммунизированных антигеном B.canis (второй опыт).

Первая группа кроликов Вторая группа кроликов

№ п/п Титр антител № п/п Титр антител

1 1:40 1 отрицательный

2 1:40 2 отрицательный

3 1:80 3 отрицательный

Как видно из таблицы 7, титр антител был в пределах 1:40... 1:80.

Для изучения иммунологических реакций организма на введение бабезиозного антигена, сыворотку их крови исследовали на наличие антител к бабезиям в реакции длительного связывания комплемента (РДСК).

Таким образом, в сыворотках крови кроликов, которым вводили бабезиозный антиген, комплементсвязывающие антитела выявляли в опытах в высоких

титрах - от 1:20... 1:80. Следовательно в качестве отрицательных и положительных сывороток могут быть использованы в наборах для РДСК не только сыворотки крови собак, но и кроликов.

2.2.8. Сравнительное изучение активности нативных и высушенных антигенов, положительных и отрицательных сывороток в РДСК

С целью длительного сохранения, бабезийный антиген, а также необходимые для реакции сыворотки, высушивали. Для этого серии антигенов, полученные от неспленэктомированных щенят, смешали в одном флаконе, создавая при этом одну серию. Тоже самое сделали и с остальными сериями полученных антигенов от спленэктомированных и подсосных щенят, получив при этом три серии антигенов. Далее серии антигенов титровали в РДСК (табл. 8).

Табл. 8 Титры нативных серий антигенов щенят, зараженных В.саШБ

№ серии

Щенята

Рабочий титр

1 Неспленэктомированные 1:32

2 Спленэктомированные 1:128

3 Подсосные 1:64

Из таблицы видно, что бабезийные антигены сохранили свою активность: 1-ая серия - 1:32; 2-ая серия - 1:128; 3-я серия - 1:64. Полученный антиген консервировали тиомерсаном (1:10000) и лиофилизировали.

Сублимационное высушивание приготовленных серий антигена позитивных и негативных сывороток проводили в лаборатории биофизики.

Перед лиофилизацией приготовленные серии бабезийного антигена смешивали с защитной средой в соотношении 1:1. Последняя состоит из равных частей 0,5%-го раствора карбоцил-метил-целлюлозы (КМЦ), (Н.И.Степанова, ВАГорбатов, В.В.Петровский, 1973). Полученную смесь разливали стерильно в ампулы по 2 мл, позитивные и негативные сыворотки разливали также по 2 мл, но без защитной среды.

В наших опытах использовали и защитную среду №3 ВГНКИ: 100 мл Н2О, 8 г сахарозы и 2 г. желатины. В дальнейшем, к 100 мл антигена добавляли 50 мл среды №3. Полученную смесь разливали стерильно в ампулы по 2 мл, позитивные и негативные сыворотки также по 2 мл, но без защитной среды.

Лиофилизированный антиген хранили в бытовом холодильнике (при +4°С).

После лиофилизапии антиген разводили в 2 мл физиологического раствора и вновь титровали в сравнении с нативным. (табл.9).

Табл. 9 Титры высушенных серий антигенов щенят зараженных В.саг^.

1 Неспленэктомированные 1:16

2 Спленэктомированные 1:64

3 Подсосные 1:32

После высушивания, как видно из табл. 9, антигены хотя и снижали титрыв двое против нативных, но сохранили свои достаточно высокие значения: 1-ая серия — 1:16; 2-ая серия - 1 : 64; 3-я серия -1:32. Защитные среды КМЦ + сахарозы и №3 ВГНКИ дали одинаковые результаты.

Специфичность метода РДСК подтверждена при исследовании сыворотки крови собак больных чумой, трипаносомозом и бруцеллезом табл.10.

Табл. 10 Определение специфичности РДСК с бабезийным антигеном

№№ Происхождение сывороток Разведение сывороток БА

1:5 1:10

1 Положительная сыворотка при бруцеллезе собак Положительная сыворотка Отрицат. Отрицат. Отрицат.

2 при чуме собак Положительная сыворотка Отрицат. Отрицат. Отрицат.

3 при трипаносомозе собак Положительная сыворотка Отрицат. Отрицат. Отрицат.

4 при бабезиозе собак Полож. Полож. Отрицат.

5 -«- Полож. Полож. Отрицат.

6 Отрицательная Отрицат. Отрицат. Отрицат.

7 -«- Отрицат. Отрицат. Отрицат,

Как видно из табл. 10, ни в одном случае эти сыворотки не реагировали с бабезийным антигеном.

Полученные нами положительные сыворотки от зараженных неспленэктомированных щенят смешали и приготовили пул положительной сыворотки. Сыворотки, полученные от собак-бабезионосителей тоже смешали и получили второй пул положительной сыворотки. Третий пул положительной сыворотки получили, смешивая в одну серию, две серии положительной сыворотки крови, полученной от иммунизированных бабезийным антигеном кроликов. Одну серию негативной сыворотки крови собак. Позитивные и негативные серии сывороток крови титровали в РДСК (табл.11).

Табл. 11 Титры нативных сывороток (позитивных и негативных) крови собак и кроликов в РДСК.

№ серии

Вид животного

Рабочий титр

1 От зараженных неспленэктомированных щенят

2 От паразитоносителей собак

3 От иммунизированных кроликов

4 От контрольных собак

1:16 1:64 1:32

Как видно из таблицы 11, позитивные сыворотки крови собак и кроликов были высокоактивными и не антикомплементарными. Негативная сыворотка также не обладала антикомплементарными свойствами.

В дальнейшем позитивные и негативные сыворотки крови собак и кроликов с целью длительного хранения, так же как и антиген высушивали, но без защитной среды. После лиофилизации сыворотку разводили в 2 мл физиологического раствора и вновь титровали в сравнении с нативными (табл. 12).

Табл.12 Титры высушенных сывороток (позитивных и негативных) крови собак и кроликов в РДСК

№ серии

Вид животного

Рабочий титр

1 От зараженных неспленэктомированных щенят 1:16

2 От паразитоносителей собак 1:64

3 От иммунизированных кроликов 1:32

4 От контрольных собак

Из таблицы 12 видно, что высушенные сыворотки крови от зараженных неспленэктомированных щенят, от собак-паразитоносителей и от иммунизированных бабезийным антигеном кроликов, сохранили свою активность и не были антикомплементарными. Негативные сыворотки тоже не были антикомплементарными.

Таким образом, поставленный нами опыт показал, что высушенные бабезийные антигены сохранили свои высокие титры от 1:16 до 1:64. Позитивные сыворотки сохранили свою активность и не были антикомплементарными. Негативные высушенные сыворотки тоже не были антикомплементарными.

Высушенные антигены и сыворотки заново титровали в РДСК. Положительные сыворотки и антигены сохраняют свою активность в течение 2-х лет при хранении их в холодильнике при температуре +4°С (срок наблюдения).

2.2.9. Динамика паразитемии и комплемевтсвязывающих антител у экспериментально зараженных бабезиозом собак

Динамику аятителообразования у животных после введения им возбудителя изучали на щенятах 3... 4 месячного возраста. В опыте использовали 3-х щенков.

Третий опыт поставили с целью изучения периода появления и исчезновения комплементсвязывающих антител. Заражение животных проводили путем подкожного введения в область лопатки в дозе 0,5 мл цитратной крови от собаки с острой формой бабезиоза (паразитемия 3 - 5%).

Начало выявления комплементсвязывающих антител в среднем приходился на 10...15 день после заражения (табл. 15). Затем уровень антител повышался, достигая максимума на 1:20...1:40 к 20...25 дню. После этого, наблюдалось постепенное снижение уровня антител, и к 35 дню заражения они выявлялись в среднем в разведении сыворотки 1:5 в 2+ и 3+ (срок наблюдения, табл. 15).

Параллельно с исследованием сыворотки крови с целью выявления комплементсвязывающих антител проводилась также микроскопия периферических мазков крови. По времени обнаружение паразитов не совпадало с появлением комплементсвязывающих антител. У собак бабезии в периферической крови стали появляться раньше, чем комплементсвязывающие антитела. Более того, пик выработки комплементсвязывающих антител наблюдался после угасания паразитемии и начала восстановления показателей крови (табл. 15).

Динамика антителообразования изучалась у спленэктомированных щенков и у щенков, зараженных в подсосный период жизни. Комплементсвязывающие антитела не обнаружены ни у первой ни у второй группы, несмотря на то, что уровень паразитемии у них был высокий.

Комплементсвязывающие антитела в основном выявлялись только у зараженных щенят. У спленэктомированных и у щенков в подсосный период комплементсвязывающие антитела не обнаруживали, несмотря на то, что паразитемия была в пределах 20...35%.

Таким образом, проделанные нами опыты показали, что комплементсвязывающие антитела выявляли только у зараженных щенят на 10-15 сутки после заражения в титрах 1:5, в то время как в мазках периферической крови бабезии появлялись на пятый день после заражения.

У спленэктомированных щенков и у щенков, зараженных в подсосный период жизни, комплементсвязывающие антитела не обнаружены ни у первой пи у второй группы, несмотря на то, что уровень паразитемии был высоким в пределах 20 - 25%.

2.2.10. Результаты серологических исследований на бабезиоз собак из разных регионов России

Бабезиоз собак зарегистрирован на многих территориях РФ. Начиная с 2003года с целью проверки бабезийного антигена, мы проводили серологические исследования по изучению эпизоотической ситуации на бабезиоз собак в разных регионах России. Необходимый материал был доставлен из ветеринарных лечебниц и клиник различных районов и городов России.

Зараженность собак бабезиозом составляла в среднем 23,2% из 56 проб сывороток крови. По городам Российской Федерации: Москва - 9 (16,7%), Пермь - 2 (%), Воронеж --1(%), Калуга-1(%).

Больше положительных результатов получили с собак породы немецких овчарок (8 из 24) и кавказских овчарок (2 из 6), и положительная проба выявлена у керри-блю-терьера.

Таким образом, серологические исследования на бабезиоз собак из разных регионов России, показали, что бабезионосительство выявлялось в Москве, Перми, Воронеже, Калуге. Зараженность собак бабезиозом составила в среднем 23,2%из 56 проб сывороток крови. Больше положительных результатов получали с сывороткой крови собак немецких и кавказских овчарок.

3. ВЫВОДЫ.

1. Инкубационный период у щенков при экспериментальном заражении возбудителем бабезиоза собак равен 5... 7 дней. Однако, если проводить заражение тем же объемом крови, но с большей паразитемией - срок инкубации сокращается. У подсосных щенков клинические признаки появились на 3-й день, к пятому дню 4 щенка пали.

2. Активность бабезийных антигенов находится в прямой зависимости от паразитемии крови, используемой для их приготовления, а степень пораженности эритроцитов бабезиями зависит от дозы вводимых донору паразитов.

3. Переболевание собак бабезиозом сопровождается реакцией иммунокомпетентных систем организма, одной из форм которой является образование специфических антител, для выявления которых была использована РДСК с антигеном из B.canis, антиген получен из крови собак по усовершенствованной (попеременное замораживание и оттаивание, примененное при экспериментальном бабезиозе; а так же центрифугирование на больших оборотах) методике, обеспечивающей накопление большой массы возбудителя и повышение его серологической активности.

4. Изучена динамика антителообразования у щенков при экспериментальном бабезиозе с использованием полученного по усовершенствованной методике антигена. Показано:

а) Выявление антител в сыворотке крови по срокам не совпадает с обнаружением бабезий в мазках из периферической крови.

б) Паразитемия обычно предшествует появлению и нарастанию титров комплементсвязыващих антител;

5. РДСК с антигеном из бабезий является надёжным диагностическим тестом при бабезиозе и бабезиозоносительстве собак.

6. Установлено, что высушенные бабезийные антигены сохранили свои высокие титры (от 1:16 до 1:64) в течении 2-х лет, при хранении в холодильнике при 4°С (срок наблюдения).

7. Позитивные и негативные сыворотки сохраняют свою активность в течение 2-х лет при хранении их в холодильнике при температуре +4°С (срок наблюдения).

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

По результатам проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по приготовлению и контролю антигенов из В.сашй для РДСК», рассмот ренные и утвержденные на заседании Ученого Совета ВИЭВ 10 августа 2004 года.

5.СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Георгиу X., Расстригин А.Е. Следствие жизнедеятельности В.сатй. Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения проф. А.А.Маркова. Москва 2002 г. стр. 37-38.

2. Георгиу X. Расстригин А.Е. Гемолитическая анемия при бабезиозе собак. Там же, стр.38-39.

3. Георгиу X., Расстригин А.Е. Изготовление и контроль антигенов из В.сашй для РДСК. Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине №1(5). Москва- 2003 г. стр. 144-147. 4.

4. Георгиу X., Расстригин А.Е. Методы диагностики бабезиозасобак (В.сашй). Одиннадцатый Московский Международный конгресс 17-19 апреля 2003 г. Москва, тр. 24-25.

5. Георгиу X., Расстригин А.Е. Динамика накопления антител у кроликов, иммунизированных антигеном В.сатй. Там же стр. 28.

6. Георгиу X., Расстригин А.Е. Обзор зарубежной и российской литературы по бабезиозу собак. Ветеринарный консультант №17 (65), Москва, 2003 г., стр. 21-23.

Принято к исполнению 24/03/2005 Исполнено 25/03/2005

Заказ № 719 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

22 АП Р 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Расстригин, Алексей Евгеньевич

1. Введение 4

2. Обзор литературы

2.1. Исторический обзор заболевания 10

2.2. Восприимчивость 15

2.3. Жизненный цикл ' 21

2.4. Патогенез 22

2.5. Исследование иммунитета 28

2.6. Серологические методы диагностики бабезиоза собак 35

3. Собственные исследования

3.1. Материалы и методы 37

3.2. Результаты исследования

3.2.1. Выбор штамма возбудителя и определение его видовой принадлежности 42

3.2.2. Определение условий, влияющих на степень переболевания и выраженность паразитемии у зараженных бабезиозом собак 46 —

3.2.3. Опыты с неспленэктомированными собаками 47

3.2.4. Опыт со спленэктомированными щенятами 49

3.2.5. Опыт с подсосными 3-4 недельными щенками 50

3.2.6. Способ приготовления антигена для РДСК 52

3.2.7. Способ приготовления позитивной и негативной сыворотки для РДСК

3.2.7.1.

Способ приготовления позитивной и негативной сывороток от собак

3.2.7.2. Способ приготовления позитивной сыворотки от иммунизированных бабезийным антигеном кроликов 56

3.2.8. Сравнительное изучение активности нативных и высушенных антигенов, положительных и отрицательных сывороток в РДСК 59

3.2.9. Методика постановки РДСК 66

3.2.10. Динамика паразитемии и комплементсвязывающих антител у экспериментально зараженных бабезиозом собак 72

3.2.11. Результаты серологических исследований на бабезиоз собак из разных регионов России 74

4. Обсуждение 82

5. Выводы 88

6. Практические предложения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка РДСК для диагностики бабезиоза собак"

Общая характеристика работы 1.1. Актуальность проблемы.

Бабезиоз - остро протекающее заболевание собак, вызванное паразитированием в эритроцитах животного простейших из отряда Piroplasmida, и сопровождающееся высокой температурой тела, угнетением, анемичностью и желтушности слизистых оболочек, гемоглобинурией, нарушением сердечной деятельности и нередко приводящим к летальному исходу.

В настоящее время трудно представить себе жизнь человека без общения с четвероногими.

Собака является слугой и другом, она преданный член семьи, компаньон в играх и помощник на охоте. Собака - помощник в повседневной жизни и спасатель в экстремальных ситуациях. Собака - символ статуса, престижа и моды. Собака служит в армии и милиции. О собаке говорят, что она создаёт комфорт и является близким товарищем. Собака - первое животное, одомашненное человеком, оно следует за ним по всему миру от Арктики до Антарктики. Приручив это животное, человек взял на себя обязанность заботы о его здоровье, охраны его от воздействия патогенных факторов.

Бабезиоз - грозное заболевание, именуемое также пироплазмоз, характеризуется трансмиссивностью, природной очаговостью и проявляется лихорадкой непостоянного типа, глубокой анемией, кахексией (Davis J.W., Anderson R.C. 1971;

Кровопаразитарные болезни животных. 1995; Jacobson L.S. et al.,1996).

В России переносчиками бабезиоза является клещ Dermacentor marginatus, а за рубежом отмечены клещи: Rhipicephalus sanguineus, Haemaphysalis leachi (Марков А.А. и др. 1935; Uilenberg G. et al., 1989; Hauschild S. et al., 1995). Многими исследователями отмечена трансовариальная передача клещами возбудителя бабезиоза, а если учитывать, что восприимчивыми животными к заражению B.canis являются и дикие плотоядные семейства собачьих (Canis) (Велю Г. 1930; Якимов B.JI. 1931; Button С., 1979), то они, следовательно, могут служить и природными резервуарами (Henning M.W., 1956). Заболевание обладает ярко выраженной весенней и осенней сезонностью (Sanders D.A., 1937; Matthewman L.A. et al., 1993; Zahler M. et al. 1998; Sanders D.A. et al., 2002). Срок носительства после переболевания отмечен более 130 дней (Botros В.А.М. et al., 1975; Yonamine Н. et al., 1984). Заболевание широко распространено во всех регионах земного шара, чаще в тропической зоне (Марков А.А. и др, 1935; Uilenberg G. et al., 1989; Hauschild S. et al., 1995).

Несмотря на профилактическую обработку против клещей, смертность остается значительной. Это обусловлено отсутствием надежной диагностики при массовом обследовании животных и выявлении природных очагов.

Диагностика бабезиоза собак основана на учете эпизоотического состояния, сезона года, клинических признаков, патоморфологических изменений и результатов микроскопического исследования мазков крови. Решающими в диагнозе являются положительные результаты микроскопического исследования мазков крови. При окраске мазков крови по Романовскому-Гимза

Babesia canis может иметь различную форму: грушевидную, овальную, округлую, амебовидную, но в основном находят парногрушевидную форму паразита (Паразитология и инвазионные заболевания с/х животных., 1956; Протозойные болезни с/х животных., 1982; Паразитология и инвазионные заболевания животных., 1998; Балагула Т.В., 2000. Walter S. et al., 2002;). Все формы могут различно ассоциироваться в одном эритроците (Якимов В. Л., 1931).

Ограниченные возможности световой микроскопии сдерживают своевременное проведение лечебных и других мер борьбы с болезнью. Трудности в идентификации бабезий, и особенно при паразитоносительстве, вызвали необходимость изыскивать специфические и более эффективные средства диагностики, такие как серологические.

Для предотвращения распространения бабезиоза необходима современная диагностика заболевания.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности исследований по серологической диагностике бабезиоза собак.

1.2. Цель и задачи исследования: Учитывая необходимость своевременного выявления заболевания, основной целью работы явилось - усовершенствовать существующие методы диагностики, освоить и разработать производство новых, более чувствительных тест-систем.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- отработать оптимальные режимы для получения высокой паразитемии бабезий у неспленэктомированных и спленэктомированных щенят, щенят в подсосный период с целью использования высокоактивных антигенов в РДСК. установить периоды появления и исчезновения бабезийных антител у экспериментально зараженных щенят в РДСК.

- провести выборочное серологическое исследование на бабезиоз собак в разных городах России.

1.3. Научная новизна

Разработан метод приготовления высокоактивных антигенов для серологической диагностики бабезиоза собак, включающий получение высокой паразитемии у животных -доноров после спленэктомии.

Впервые доказана возможность экспериментального заражения бабезиозом щенят в подсосный период.

С помощью РДСК изучена динамика антителогенеза у экспериментально зараженных бабезиозом животных и уточнена эпизоотическая ситуация по бабезиозу собак в разных городах России.

1.4.Практическое значение работы

Предложена и разработана методика получения бабезийного антигена B.canis для серологических реакций РДСК.

Предложена комплексная схема получения позитивной и негативной сыворотки собак и её высушивания.

Предложена схема получения антигена B.canis от экспериментально зараженных интактных щенят, от спленэктомированных и потом зараженных, и от щенят в подсосный период.

По результатам проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по приготовлению и контролю антигенов из B.canis для РДСК», рассмотренные и утвержденные на заседании Ученого Совета ВИЭВ 10 августа 2004года.

1.5. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:

• 11 Московском международном ветеринарном конгрессе 17-19 апреля 2003 г. Москва.

• «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине». 15-16 мая 2003 г. Москва.

• Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения проф. А.А.Маркова. Москва 2002 г.

• Заседание ученого совета ВИЭВ, Москва, 2003.

• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2005.

1.6. Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 6 работ в журналах «Ветеринарная медицина», «Ветеринарный консультант» и «Ветеринарная патология».

1.7. На защиту выносятся

1. Отработка оптимального режима получения высокой паразитемии бабезий у неспленэктомированных и спленэктомированных щенят, щенят в подсосный период с целью использования высокоактивных антигенов в РДСК.

2. Метод приготовления высокоактивных антигенов для серологической диагностики бабезиоза собак, включающий получение высокой паразитемии у животных - доноров после спленэктомии.

3. Материалы по заражению бабезиозом подсосных щенят.

4. Материалы по изучению периода появления и исчезновения комплементсвязывающих антител у экспериментально зараженных бабезиозом щенят.

5. получения Метод положительных сывороток крови от зараженных бабезиозом щенят и от паразитоносителей.

6. Метод получения положительной сыворотки от иммунизированных бабезийным антигеном кроликов.

7. Метод лиофилизации сывороток и антигенов. Материалы по их титрации.

8. Материалы по изучению динамики антителогенеза у экспериментально зараженных бабезиозом животных с помощью РДСК и уточнения эпизоотической ситуации по бабезиозу собак в разных городах Европейской части РФ.

9. Оптимизация режима постановки реакции длительного связывания комплемента для диагностики бабезиоза собак.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 117 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список использованной литературы включает 142 наименования, из них 102 иностранных автора. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 5 рисунками. В приложении представлен документ, подтверждающий наиболее важный результат исследования и его практическую ценность.

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Расстригин, Алексей Евгеньевич

5. ВЫВОДЫ.

1. Инкубационный период у щенков при экспериментальном заражении равен 5.7 дней. Однако, если проводить заражение тем же объёмом крови, но с большей паразитемией — срок инкубации сокращается. У подсосных щенков клинические признаки появились на 3-й день, к пятому дню 4 щенка пали.

2. Активность бабезийных антигенов находится в прямой зависимости от паразитемии крови, используемой для их приготовления, а степень пораженное™ эритроцитов бабезиями зависит от дозы вводимых донору паразитов.

3.Переболевание собак бабезиозом сопровождается реакцией иммунокомпетентных систем организма, одной из форм которой является образование специфических антител, для выявления которых была использована РДСК с антигеном из B.canis, антиген получен из крови собак по усовершенствованной (попеременное замораживание-оттаивание, примененное при экспериментальном бабезиозе; а так же центрифугирование на больших оборотах) методике, обеспечивающей накопление большой массы возбудителя и повышение его серологической активности.

4.Изучена динамика антителообразования у щенков при экспериментальном бабезиозе с использованием полученного по усовершенствованной методике антигена. Показано:

А) Выявление антител в сыворотке крови по срокам не совпадает с обнаружением бабезий в мазках из периферической крови. Б) Паразитемия обычно предшествует появлению и нарастанию титров комплементсвязующих антител;

5. РДСК с антигеном из бабезий является надёжным диагностическим тестом при бабезиозе и бабезионосительстве собак.

6. Установлено, что высушенные бабезийные антигены сохранили свои высокие титры (от 1:16 до 1:64) в течение 2-х лет, при хранении в холодильнике при 4°С (срок наблюдения).

7. Позитивные сыворотки сохранили свою активность и не были антикомплементарными. Негативные высушенные сыворотки тоже не были антикомплементарными.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

По результатам проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по приготовлению и контролю антигенов из В.canis для РДСК», рассмотренные и утвержденные на заседании Ученого Совета ВИЭВ 10 августа 2004года.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Расстригин, Алексей Евгеньевич, Москва

1. Акаевский А.И. Анатомия домашних животных. М: «Колос» 1975.

2. Биохимия животных. Под редакцией проф. А.В.Чечёткина, М: «Высшая школа», 1982.

3. Большая медицинская энциклопедия. М: "Советская энциклопедия", 1984.

4. Бондаренко М. Пироплазмоз на практике. "Друг", 1998, №6

5. Балагула Т.В. автореферат диссертации М.2000

6. Велю Г. Пироплазмы и пироплазмозы. Под редакцией проф. С.И.Драчинского. М: «Сельхозгиз», 1930.

7. Вилли К. Биология. М: "Мир", 1968

8. В.Ф.Вракин, М.В.Сидорова. Морфология с/х животных. М: Агропромиздат, 1991.

9. Георгиу X. Дисс. Канд. Вет. наук. М. 1980.

10. Ю.Георгиу X., Расстригин А.Е. Следствие жизнедеятельности B.canis. Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения проф. А.А.Маркова. Москва 2002 г.стр.37-38.

11. П.Георгиу X. Расстригин А.Е. Гемолитическая анемия прибабезиозе собак. Там же стр. 38-39.

12. Георгиу X., Расстригин А.Е. Изготовление и контроль антигенов из B.canis для РДСК. Ветеринарная медицина №1 (5). Москва- 2003 г. стр. 144-147.

13. З.Георгиу X., Расстригин А.Е. Методы' диагностики бабезиоз собак (B.canis). Одиннадцатый Московский Международный конгресс 17-19 апреля 2003 г. Москва стр. 2425.

14. Георгиу X., Расстригин А.Е. Динамика накопления антител у кроликов, иммунизированных антигеном B.canis. Одиннадцатый Московский Международный конгресс 17-19 апреля 2003 г. Москва. Там же стр. 28.

15. Георгиу X., Расстригин А.Е. Обзор зарубежной и российской литературы по бабезиозу собак. Ветеринарный консультант №17 (65), Москва 2003 г., стр. 21-23.

16. Дьяконов Л.П. Биологические особенности, ультраструктура и вопросы таксономии кровопаразитов рогатого скота. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва, 1972, стр. 359.

17. Дьяконов Л. П. Роль неспецифических хозяев в поддержании пироплазмидозных очагов. // Бюлл. Всес. инст. экспер. ветерин. 1974. № 18. С. 15-18.

18. Казаков Н.А. Пироплазмоз собак. В книге «Протозойные болезни с/х животных». Под редакцией Степановой Н.И. М: «Колос», 1982. стр.68-72

19. Кровопаразитарные болезни животных. Подготовили: Ятусевич А. И. Заблоцкий В.Т. Витебск. ВГАВМ. 1995. стр.21 -22.

20. Крылов М. В. Определитель паразитических простейших. // Санкт-Петербург: Наука, 1996.

21. Лебедева В. Л. Сравнительный анализ активности нуклеиновых кислот при пироплазмозе собак. //Диагн., леч., профил. инваз. и инфекц. забол. с.-х. жив-х: Сб. науч. тр. -. Ставрополь, 1992.-С.27-33.

22. Лебедева В. Л. Пироплазмоз собак. // Докл. 5 Всес. съезда протозоологов. / Витебск, 1992. № 4. С. 85.

23. Макашов А.В. К вопросу о методике спленэктомии у собак. Журнал научной и практической ветеринарной медицины. 10(3):87-93.1910.

24. Марков А.А., Петрашевская Е.М., Калмыков Е.С. Пироплазмозы сельскохозяйственных животных. М: «Сельхозгиз», 1935.

25. Никитин В. Н. Атлас клеток крови сельскохозяйственных и лабораторных животных. М: «государственное издательство сельскохозяйственной литературы», 1949.

26. Назаров С.Б., Горожанин Л.С. системный подход к изучению физиологии эритрона и его реализация в онтогенетических исследованиях. Вестник Ивановской медицинской академии. 1996, т. 1 №3-4, стр. 30-37.

27. Ниманд Х.Г., Сутер П.Ф. Болезни собак, практическое руководство для ветеринарных врачей. М: «Аквариум», 1998, стр 261-262.

28. Паразитология и инвазионные заболевания с/х животных. Под редакцией Ершова B.C. М: Госиздат с\х литературы. 1956,стр. 420-422.

29. Протозойные болезни с/х животных. Под редакцией Степановой Н.И. М: «Колос», 1982. стр.68-72

30. Паразитология и инвазионные заболевания животных. Под редакцией д-ра вет. наук Акбаева М.Ш. М: «Колос», 1998, стр. 241-242.

31. Паразитология и инвазионные болезни животных. Под ред. проф. М.Ш.Акбаева, М: «Колос», 1998.

32. Патологическая анатомия. Курс лекций под редакцией В.В.Серова, М.А.Пальцева. М: Медицина, 1998, стр. 59.

33. Руководство по иммунологии. Под редакцией проф. О. Е. Вязова и проф. Ш. X. Ходжаева. М: «Медицина», 1973.

34. Степанова Н.И., Малахов А.Г. Усовершенствованный метод приготовления анаплазменного антигена. Тр. ВИЭВ, т. XXVIII, 1963, стр. 215-218.

35. Степанова Н.И. Действие ультразвука на антигенные свойства анаплазм. Тр.ВИЭВ, 1970, т. 38, стр. 90-95.

36. Учайкин В.Ф. Руководство по инфекционным болезням у детей. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА. 1998г.

37. Хейсин Е. М. Некоторые данные о строении Piroplasma bigemina и Piroplasma canis. // Паразитология. 1968. Т. 2., № 1. С. 77-82.

38. Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с болезнями животных. Сборник' научных трудов. — Новосибирск, 1997, стр. 38-40.

39. Якимов B.JT. Болезни домашних животных, вызываемые простейшими (Protozoa). М: Государственное издательство сельскохозяйственной и колхознокооперативной литературы. 1931.

40. Andersen А.С., Gee W. Normal blood values in the beagle. Vet. Med., 53:135, 1958.

41. Aikawa, M., and Antonovych, Т. Т.: Electron Microscopic Observations of Plasmodium berghei and Kupffer's Cells in the Liver of Rats. J. Parasitol., 50, (1964): 620-629.

42. Aikawa, M., and Sprinz, H.: Erythrophagocytosis in the Bone Marrow of Canary Infected with Malaria. Electron Microscope Observations. Lab. Invest., 24, (1970): 45-54

43. Andersen A.C., Schalm O.W. The beagle as an experimental dog. pp. 261-281. In Hematology. Andersen A.C., ed Iowa state university press, Ames, 1970.

44. Anderson J.F., Magnarelli L.A., Sulzer A.J. Canine babesiosis indirect fluorescent antibody test for North American isolate of B.gibsoni. Am. J. Vet. Res., 41, 1980, 2102-2105.

45. Atlas of hematology of the dog and cat. / P. Keller and U. Freudiger. Berlin; Hamburg: Parey, 1983.

46. Adachi K., Yoshimoto A., Hasegawa T et al. Anti-erythrocyte membrane antibodies detected in sera of dogs naturally infected with Babesia gibsoni. J. Vet. Med. Sci. (1992), 54(6): 1081-1084.

47. Adachi K., Makimura S. Changes in anti-erythrocite membrane antibody level of dogs experimentally infected with Babesia gibsoni. J. Vet. Med. Sci. (1992) 54(6): 1221-1223.

48. Adachi K., Makimura S. Changes in anti-erythrocyte membrane antibody level of dogs experimentally infected with Babesia gibsoni. J. Vet. Med. Sci. 54(6): 1221-1223, 1992.

49. Adachi K., Ueno C., Makimura S. Immunosuppression in dogs naturally infected with Babesia gibsoni. J. Vet. Med. Sci. 55(3): 503-505, 1993

50. Adachi K., Watanabe Т., Yamane S., Makimura S. Isolation of Babesia gibsoni piroplasms from infected erythrocytes of dogs. J. Vet. Med. Sci. 55(3): 487-490, 1993

51. Bradley O.C. Topographical anatomy of the dog. Edinburgh: Oliver and Boyd. 1935.

52. Bosson P.A., Pienaar J.C. Canine babesiosis: a report on the pathology of three cases with special reference "celebral" form. . Journal of the South African Veterinary Associations., 36:333341, 1965.

53. Bulgin M.S. et al. Hematologic changes to 4V2 years of age in clinically normal beagle. J. Amer. Vet. Med. Ass., 157:1064,1970.

54. Botros B.A.M., Moch R.W., Barsoum I.S. Some observations on Experimentally induced infecteion of dogs with Babesia gibsoni. Am. J. Vet. Res. (1975), 36(3): 293-296.

55. Bellamy J.E.C., MacWilliams P.S., Searcy G.P. Cold-agglutinin hemolytic anemia and Haemobartonella canis infection in a dog. J. Am. Vet. Med. Ass., (1978), 173(4):397-401.

56. Button C. Metabolic and electrolyte disturbances in acute canine babesiosis. J. Am. Vet. Med. Ass., 1979, 175:5 475-479.

57. Bobade P.A., Oduye O.O. Antibody titres in naturally occurring Babesia canis infections in dogs. Rev. Eiev. Med. vet. Pays, trop., 1986,39 (2): 185-188.

58. Bobade P.A., Oduye O.O. Aghomo H.O. Prevalence of antibodies against Babesia canis in dogs in an endemic area. Rev. Eiev. Med. vet. Pays, trop., 1989, 42 (2): 211-217.

59. Baneth G., Breitschwerdt E.B., Hegarty B.C., Pappalardo В., Ryan J. A survey of tick-born bacteria and protozoa in naturally exposed dogs from Israel. Veterinary Parasitology 74:133-142, 1998

60. Clinicopathologic principles for veterinary medicine / edited by W. R. Robinson and C. R. R. Huxtable, Cambridge, 1988.

61. Conrad P., Thomford J., Yamane I., Whiting J., et al., Hemolytic anemia caused by Babesia gibsoni infection in dogs. . J. Vet. Med. Assoc., 199:601-605,1991.

62. Camacho A.T., Pallas E., Gestal J.J., Guitian F.J., Olmeda A.S. Babesia canis infections in a splenectomised dog. Bull Soc Pathol Exot, 94, p. 17-19,2001.

63. Camacho A.T., Pallas E., Gestal J.J., Guitian F.J., Olmeda A.S. Goethert H.K., Telford S.R. Infection of dogs in north-west Spain with a Babesia microti-like agent. The vet. Rec. 3, pp. 552-555, 2001.

64. Camacho A.T., Pallas E., Gestal J.J., Guitian F.J., Olmeda A.S. Natural infections by a Babesia microti-like piroplasm in a splenectomised dog. The vet. Rec. 23, pp. 381-382, 2002.

65. Dougherty J.H. and RosenblattL.S. Changes in the hemograme of the beagle with age. J. Gerontol., 20:131, 1965

66. Doxey D.L. Cellular changes in the blood as an aid to diagnosis. J. small animal pract., 7:77,1966

67. Dorner J.L. Clinical and pathologic features of canine babesiosis. J. Amer. Vet. Med. Ass., 154(6), 1969, 648-652.

68. Davis J.W., Anderson R.C. Parasitic diseases of wild mammals. The Iowa state university press, Iowa, U.S.A. 1971.

69. Eaton P. Piroplasma canis in Florida. J. of Parasit. 20:312-313, 1934.

70. Ederstrom H.E., DeBoer В., Changes in the blood of the dog with age. Anat. Rec., 94:663, 1946.

71. Ewing S.A. Evaluation of methods used to detect Babesia canis infections in dogs. Cornell Veterinarian, 56:211-220, 1965.

72. Ewing S.A. Method of reproduction of Babesia canis in erythrocytes, Am. J. Vet. Res., 26:112, 727-733; 1965

73. Earl F. L. The hemogram and bone marrow profile of normal neonatal, and weanling beagle dogs.' Lab. Anim. Sci., 23:690, 1973.

74. Farwell G.F., LeGrand E.K., Cobb C.C. Clinical observations on Babesia gibsoni and Babesia canis infections in dogs. J. Am. Vet. Med. Ass., 180(5):507-511.1982.

75. Freeman M.J., Kirby B.M., Panciera D.L., Henik R.A., Rosin E., . Sullivan L.J. Hypotensive-shock syndrome associated with acute

76. Babesia canis infections in a dog. J. Am. Vet. Med. Ass. 204:9496, 1994.

77. Graham-Smith G.S. Canine piroplasmosis. III. Morbid anatomy. Journal of Hygiene, 5:250-267, 1905.

78. Gilles H.M., Maegraith B.G. The liver in Babesia canis infection. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 47:426-430, 1953.

79. Henning M.W. Animal diseases in South Africa. South Africa: central news agency LTD., 1956.

80. Hagan W.A., Bruner D.W. The infections diseases of domestic animals. London: Bailliere, Findall & Cox, 1957.

81. Heneghan T. Hematological and biochemical variables in the greyhound. Vet. Sci. commun., 1:277, 1977

82. Harvey J.W., Taboada J., Lewis J.S. Babesiosis in a little of pups. J. Amer. Vet. Med. Ass., 192(12): 1751-1752, 1988.

83. Higuchi S., Simomura S., Yoshiba H., Kawamura S., Yasubo Y. Developed of Babesia gibsoni in the gut epithelium of the tick Haemaphysales longicornis. J. Vet. Med. Sci. (1991), 53(1):129-131.

84. Horak I.G. Ixodid tics collected at the Faculty of Veterinary Science, Onderstepoort, from dogs diagnosed with Babesia canis infections. Journal of the South African Veterinary Associations. 66:170-171, 1995.

85. Hauschild S., Shayan P., Stein E. Characterization and comparison of merozoite antigens of different B.canis isolates by serological and immunological investigations. Parasitol Res. (1995) 81:638642.

86. Ishimine Т., Nagasawa H., Suzuki N. An in vitro study of monocyte phagocytosis in the peripheral blood of healthy and Babesia-infected beagles. Jap. J. Vet. Sci. (1979), 41: 487-493.89Jain N.C. Veterinary hematology. Philadelphia, Lea & Febiger, 1986.

87. Jacobson L.S., Clark I. The pathophysiology of Canine babesiosis: new approaches to an old puzzle. Journal of the South African Veterinary Associations 65:134-145, 1994.

88. Jacobson L.S., Swan G.E. Supportive treatment of canine babesiosis. Journal of the South African Veterinary Associations. 66:95-105, 1995.

89. Jacobson L.S., Lobetti R.G., Vaughan-Scott T. Blood pressure changes in dogs with babesiosis. Journal of the South African Veterinary Associations., 71:14-20, 2000.

90. Lewis R.M. A syndrome of autoimmune hemolytic anemia and thrombocytopenia in dogs. Proc. Annu. Meeting Amer. Vet. Med. Ass., (1963), 100:140.i

91. Lund J.E. Hemaglobin crystals in canine blood. Amer. J. Vet. Res., 35:575, 1974

92. Lee et. al. Blood volume changes and production and destruction of erythrocytes in newborn dogs. Amer. J. Vet. Res., 37:561,1976

93. Lewis B.D., Penzborn B.L., Lopez-Rebollar L.M. Immune responses to South African Babesia canis and the development of a preliminary vaccine. Journal of the South African Veterinary Associations., 66:61-65, 1995.

94. Lewis B.D., Penzborn B.L., Lopez-Rebollar L.M. Isolations of South African vector-specific strain of Babesia canis. Vet. Parasitol. 63:9-16, 1996.

95. Lobetti R.G. and Reyers F. Met-haemoglobinuria in occurring Babesia canis infection. J. of the South Afr. Vet. Ass. (1996), 67(2):88-90.

96. Mcllvane J. P, McCampbell E. F. Infectious jaundice due to piroplasma commune. Centralblat fur bacteriologie, parasitenkunde und infektionskrankheiten. 47(1908) 592-608.

97. Maegraith В., Gilles H.M., Devakul K. Pathological processes in Babesia canis infections. Trop. Med. Parasitol., 8:485514,1957.

98. Michaelson S. M. et al.; The blood of the normal beagle. J. Amer. Vet. Med. Ass., 148:532, 1966.

99. Maronpot R.R., Guindi E. Preliminary study of Babesia gibsoni Patton in wild carnivores and domesticated dogs in Egypt. Am. J Vet. Res., 31(4): 797 799, 1970.

100. Moore D.J. Williams M.C. Disseminated intravascular coagulation: a complication of Babesia canis infections in the dog. Journal of the South African Veterinary Associations., 50:265275, 1979.

101. Mehlhorn H. The life cycles of piroplasms and related groups. / Proceedings of fifth international congress of parasitology held in Toronto, Canada, on 7-14 august, 1982// Editors D. F. Mettrick and S. S. Desser Elsevier biomedical press

102. Amsterdam New York - Oxford, 53-56. (жизненный цикл бабезий).

103. Mimori Т., Kono I., Sakamoto Т., Yasuba N. Morphological studies of multiplication of Babesia gibsoni in canine erythrocytes. Jpn. J. Vet. Sci. (1982), 44(4):669-701.

104. Mehlhorn H., Schein E. The piroplasms: life cycle and sexual stages. Adv. Parasitol. 23:37-103, 1984.

105. Martinod S., Brossard M., Moreau. Immunity of dogs against Babesia canis, its vector tics Dermacentor reticulatus, and Ixodes ricinus in endemic area. J. Parasitology., 71(3),1985, pp. 269-273.

106. Martinod S., Laurent N., Moreau Y. Resistance and immunity of dogs against Babesia canis in an endemic area. Vet. Parasitol., 19(1986): 245-254.

107. Matthewman L.A., Kelly P.J., Bobade P.A., Tagwira M., Mason P.R., Majok A. Brouqui P., Raoult D. Infections with Babesia canis and Ehrlichia canis in dogs in Zimbabwe. Vet. Rec., 2,344-346,1993.

108. Mehlhorn H., Schein E. The piroplasms: "A long story in short" or "Robert Koch has seen it". Europ. J. Protistol. 29:279293, 1993.

109. Murase Т., Hashimoto Т., Ueda Т., Maede Y. Multiplication infected dogs: the different in the activity between self and nonself red blood cells. J. Vet. Med. Sci. 55(2): 203-206, 1993

110. Morita Т., Saeki H., Imai S., Ishii T. Reactivity of anti-erythrocyte antibody induced by Babesia gibsoni infection against aged erythrocytes. Veterinary Parasitology 58 (1995) 291-299.

111. Piercy S.E. Hyper-acute canine babesia. The veterinary record., 59(44): 612-613, 1947.

112. Porter J.A., Canaday W.R. Hematologic values in mongrel and greyhound dogs being screened for research. J. Amer. Vet. Med. Ass., 159:1603,1971

113. Pharles F. Simpson. Phagocytosis of Babesia canis by Neutrophils in the Peripheral Circulation. J. Amer. Vet. Med. Ass., 53(6):1105-1110., 1974.

114. Pinkerton P.H. Hereditary stomatocytosis with hemolytic anemia in the dog. Blood, 44:557,1974

115. Robinson F.R. Ziegler R.F. Clinical laboratory values of beagle dogs. Lab. Anim. Care,, 18:39, 1968

116. Reece W.O., Snodgrass R.R. Effect of splenectomy in postfeeding changes in packed cell volume of dog. Amer. J. Vet. Res., 33:635, 1972

117. Ristic M. Babesiosis of domestic animals and man. Boca Raton, Florida, 1988.

118. Reyers F., Leisewitz A.L., Lobetti R.G., Milner R.J., Jacobson L.S. Canine babesiosis in South Africa: more that one disease. Does this serve as a model for falciparum malaria? Annals of tropical medicine and parasitology, Vol.92 №4 (1998) 489-502

119. Sanders D.A.: Observations on canine babesiasis (pyroplasmosis). J. Am. Vet. Med. Ass., 1937, 43:1, 27-40

120. Seneviratna P. Studies of Babesia gibsoni (Patton, 1910) infections in the dogs. Brit. Vet. J. (1965), 121: 263-271.

121. Simpson, C. F., Kling, J. M., and Love, J. N.: Morphology and Histochemical Nature of Anaplasma marginale. Am. J. Vd Res., 28,(1967): 1055-1065.

122. Simpson, C. F.: Electron Microscopic Comparison Babesia spp. and Hepatic Changes in Ponies and Mice. Am. J Vet. Res., 31, (1970): 1763-1768.

123. Shifrine M. et al.: Hematologic changes to 60 days of age in clinically normal beagles. Lab. Anim. Sci., 23:894, 1973.

124. Schetters Th.P.M., Kleuskens J.A.G.M., Scholtes N.C. et al. Vaccination of dogs against Babesia canis infection using antigens from culture supernatants with emphasis on clinical babesiosis. Veterinary Parasitology (1994), 52:219-233.

125. Schetters P.M., Scholtes N.C., Kleuskens J.A.G.M., Bos H.J. Strain variation limits protective activity of vaccines based on soluble Babesia canis antigens. Parasite immunology, 1995, 17: 215-218.

126. Schetters Th.P.M., M.Kleuskens J.A.G., Scholtes N.C. et al. Vaccination of dogs against Babesia canis infection. Veterinary Parasitology (1997), 73:35-41.

127. Schetters Th. P. M., Moubri K., Precigout E. et al. Different babesia canis isolates, different diseases. Parasitology. (1997), 115,485-493.

128. Schetters P.M., Scholtes N.C., Kleuskens J.A.G.M., Bos H.J. Not peripheral parasitaemia but the level of soluble antigen in plasma correlates with vaccine efficacy against Babesia canis. Parasite immunology 18, 1-6, 1999.

129. Schetters P.M., Scholtes N.C., Kleuskens J.A.G.M., Gorenflot A., Moubri K., Vermeulen A.N. Vaccination of dogs against heterologous Babesia canis infection using antigens from culture supernatants. Veterinary Parasitology 100 (2001), 75-86.

130. Taylor J.H., Guthrie A.J., Van Der Walt J.G., Leisewitz A. The effect of Babesia canis induced haemolysis on the canine haemoglobin oxygen dissociation curve. J. S. Afr. Vet. Ass.(1993), 64(4): 141-143.

131. The Merk Manual. Под редакцией Robert Berkow, M: «Мир», 1997, стр. 788-790.

132. Uilenberg G., Franssen F.F.J., Perie N.M., and Spanjer A.A.M. Three groups of Babesia canis distinguished and a proposal for nomenclature. The veterinary quarterly. (1989), 11(1): 33-40.

133. Vercammen F., R. De Deken, Maes L. Duration of protective immunity in experimental canine babesiosis after homologous and heterologous challenge. Veterinary Parasitology. 68(1997) 51-55.

134. Walter S., Mehlhorn H., Zweygarth E., Shein E.: Electron microscopic investigations on stages of dog piroplasms cultured invitro: Asian isolates of Babesia gibsoni and strain of B. canis from France and Hungary., Parasitol Res., (2002), 88:32-37

135. Yamane I., Thmford J.W., Gardner I.A., Dubey J.P., Levy M., Conrad P.A., Evaluation of the indirect fluorescent antibody test for diagnosis of Babesia gibsoni infections in docs. Amer. J. Vet. Res., 54(10): 1579-1584, 1972

136. Yonamine H., Ichici H., Hamakawa M., Shimabukuro Т., Sugiyama M., Isoda M. Studies on canine babesiosis in Okinawa Island, The Jap. J. of Vet. Sci., 46:4, 511-518, 1984.

137. Yamane I., Conrad P.A., Gardener I.A. Babesia gibsoni infections in dogs. J. Protozool. Res. 3:11-125, 1993.

138. Zwart D., Brocklesby D.W. Babesiosis: non-specific resistance, immunological factors and pathogenesis. Adv. Parasitol. 17:49-113,1979.

139. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ И КОНТРОЛ Ю АНТИГЕНОВ ИЗ B.CANIS ДЛЯ РДСК.

140. Исходным материалом для получения антигенов является кровь больных животных (собак), зараженных соответствующим возбудителем.

141. Для получения выраженной паразитарной реакции животных спленэктомируют. На высоте паразитемии (не менее 50% пораженных эритроцитов) животное обескровливают, но не позднее 5.6 дней с момента операции, чтобы избежать антикомплементарности антигена.

142. Кровь берут из яремной вены в стерильную сосуды, содержащие ; натрия цитрат из расчета 50 мл 20%-ного натрия цитрата на 2 литра крови. Дальнейшею обработку крови проводят в день её взятия.

143. На специфичность антиген проверяют с сыворотками животных, перенесших болезни непротозойной природы.

144. Компоненты Разведение антигена контрольреакции 1:2 1:4 1:8 1:6 1:32 1:64 1:128

145. Антиген одно разведение 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

146. Сыворотки 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

147. Комплемент 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

148. Холодильник при температуре +2-4°С на 18-20 часов, затемпри комнатной температуре 30 минут.1. Гемолитическая0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2система

149. Водяная баня при 37-38°С 20 минут, затем холодильник при2.4°С на 4-5 часов.

150. Учет реакции производится по степени гемолиза. По этой схеме ставят реакцию и с остальными разведениями сыворотки.

151. Для контроля антигена используют ряд пробирок с физиологическим раствором (по 0,1мл) вместо сыворотки, в которые добавляют те же компоненты.

152. Рабочий титр антигена определяют по сыворотке низкого титра. Обычно он соответствует двойной или тройной дозе предельного титра (в данном случае 1:16).

153. Приготовленную серию антигена лиофилизируют или разливают во флаконы и хранят в морозильной камере бытового холодильника.

154. Примерный результат реакции

155. Разведения Разведение антигена б/асывороток 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

156. Позитивная сыворотка: 1:5 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+1:10 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ 1:20 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ 2+ + 1:40 4+ 4+ 3+ 2+ + -

157. Нормальная сыворотка 1:5 Физиологический раствор - - - - - -

158. ПОСТАНОВКА И УЧЕТ РЕАКЦИИ ДЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РДСК) С АНТИГЕНАМИ В. CANIS.

159. Реакцию ставят в объеме 0,5 .мл (по 0,1мл каждого компонента) в пробирках 10-12X120 мм.1. Компоненты реакции

160. Антиген (лиофилизированный) с наполнителем из сахарозы и карбоксиметилцеллюлозы. Имеет вид пористой таблетки, хорошо растворим в физиологическом растворе, хранится при плюс 2-4°С. Используют в рабочем титре, указанном на этикетке ампулы.

161. Испытываемые и контрольные (позитивная и нормальная) сыворотки животных в разведеннии 1:5, инактивированные при 58-59°С в течение 30 мин в день постановки реакции.

162. Комплемент сыворотка морской свинки (свежая или лиофилизированная).

163. Гемолитическая сыворотка гемолизин, выпускаемый биопромышленностью. В реакции используют тройной титр гемолизина.

164. Эритроциты барана, отмытые 3 раза физиологическим раствором путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Из осадка готовят 2%-ную взвесь в физиологическом растворе.

165. Перед постановкой реакции взвесь эритроцитов и гемолизин, разведенный в тройном титре, смешивают в равных объемах (гемолитическая система) и выдерживают 20 мин при температуре 37°С для сенсибилизации эритроцитов.

166. Нативный комплемент перед титрованием разводят физиологическим раствором в соотношении 1:30 (0,1 мл комплемента + 2,9 мл физиологического раствора). Сухой комплемент разводят в соотношении 1:20 (0,1 мл комплемента + 1,9 мл физиологического раствора)

167. Водяная баня при 37.38°С- 10.15 минрезультат нг нг чг пг пг пг пг пг пг пг

168. Примечание: НГ нет гемолиза

169. ЧГ частичный гемолиз ПГ - полный гемолиз

170. Титром является наименьшее количество разведенного 1:30 (1:20) комплемента, который дает полный гемолиз эритроцитов. В приведённом примере титр равен 0,04. Для реакции берут 2 дозы, т.е. 0,08.

171. Расчет количества комплемента необходимого для главного опыта делают по формуле: АХБ------------- = хВ1. Где:

172. А рабочая доза комплемента, Б — количество пробирок в реакции, В - разведение комплемента, Х- количество чистого комплемента.1. Пример: 0,8 X 100-------------- = 0,420

173. Так как общий объем разведенного комплемента, необходимого для 100 пробирок, равен 10 мл (100X0,1мл), то к 0,4 мл чистого комплемента следует добавить 9,6 мл физиологического раствора.1. Главный опыт.

174. Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1:5 с антигеном и без антигена.

175. Для контроля в реакцию берут 2 позитивные (бабезийные) и 2 негативные (нормальные) сыворотки в разведении 1:5.

176. Одновременно ставят контроль антигена на антикомплементарность (антигена 0,2 + комплемента 0,1 + гемолитической системы 0,2) и на гемотоксичность (антигена 0,1 мл + физиологического раствора 0,2 мл + 0,2 гемолитической системы).1. Схема главного опыта.

177. Компонент Пробирки для каждой сыворотки Контроль Контроль гемолитиреакции 1 ? антигена ческойсистемы1. Испытуемая 0,1 0,1 сыворотка Физиоло- гический раствор (0,85%) Антиген в — 0,1 0,2рабочем 0,1 0,2 0,1титре

178. Комплемент 1:30 0,1 0,1 0,1 (1:20)

179. После чего пробирки ставят в холодильник при температуре 2.4°С на 18.20 часов, а затем на 30 мин при комнатной температуре.

180. Гемолитическая 0,2 0,2 0,2 0,2 системаводяная баня при 37.38°С 10. 15 мин в зависимости от прохождения контролей. Холодильник при 2.4°С на 4.5 часов.

181. Примечание: позитивные и негативные сыворотки (контроли) испытывают по схеме главного опыта.