Разработка прототипа ДНК-вакцины для иммунотерапии гепатоцеллюлярной карциномы

Морозов, Алексей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка прототипа ДНК-вакцины для иммунотерапии гепатоцеллюлярной карциномы
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка прототипа ДНК-вакцины для иммунотерапии гепатоцеллюлярной карциномы"

На правах рукописи

МОРОЗОВ АЛЕКСЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ПРОТОТИПА ДИК-ВАКЦИНЫ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЫ

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 НОЯ 2011

Москва-2011

005002152

Работа выполнена в Лаборатории структуры и функции хроматина Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель доктор биологических наук,

профессор Карпов В. Л.

Официальные оппоненты доктор биологических наук,

профессор чл.-корр. РАН Разин C.B.

доктор биологических наук.

Шарова Н.П.

Ведущая организация Учреждение Российской академии наук

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

РАН

Защита состоится « г. в часов на заседании Диссертационного

совета Д002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Список сокращений

АФП - альфа-фетопротеин;

ГКГ - главный комплекс гистосовместимости;

ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома; ■■

ОДК - орнитин декарбоксилаза;

ФБ - фосфатный буфер;

ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты

Актуальность проблемы

Работа затрагивает вопросы, связанные с профилактикой и лечением онкологических заболеваний. Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) - одна из самых злокачественных опухолей. Количество новых диагностируемых случаев ГЦК возрастает ежегодно, при этом эффективной терапии, обеспечивающей высокие показатели 5-летней выживаемости пациентов на сегодняшний день нет. Подавляющее большинство ГЦК (более 80%) активно синтезируют альфа-фетопротеин (АФП).

АФП - белок сыворотки эмбриона, уровень экспрессии которого резко падает сразу после рождения, и остаётся низким на протяжении всей жизни человека. Однако, при возникновении ГЦК, а также некоторых опухолей репродуктивной системы уровень АФП в сыворотке крови резко повышается. Таким образом, АФП является белком-маркером ГЦК и поэтому представляется удобной мишенью для иммунотерапии этого новообразования. Важно отметить, что лимфоциты, распознающие АФП, не элиминируются в процессе становления иммунной системы, а продолжают циркулировать в крови человека в неактивном состоянии на протяжении всей жизни, благодаря чему сохраняется возможность их активации и развития иммунного ответа против этого аутоантигена.

В составе АФП обнаружены иммунодоминантные и субдоминантные эпитопы. Иммунный ответ, возникающий у пациентов с ГЦК, направлен, в основном, против этих последовательностей. В этой связи были предложены подходы к терапии ГЦК, где в качестве вакцины были использованы пептиды с последовательностями

иммунодоминантных районов. Однако, существенного эффекта на динамику роста опухоли иммунизация такой вакциной не оказывала. Вакцинация полноразмерным АФП может быть более эффективна, однако, как и в случае с другими белковыми и пептидными вакцинами, приведет к стимуляции гуморального (Тх2) иммунного ответа против АФП. При разработке вакцины против опухоли предпочтение отдается стимуляции клеточного (Тх1) иммунного ответа. Для этого необходимо обеспечить деградацию белка-антигена в протеасоме, что позволит его пептидам быть презентированными клеткам иммунной системы молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) I класса. ДНК-вакцина представляет собой механизм, позволяющий решить эту проблему. В течение последних десяти лет велись работы по созданию ДНК-вакцин на основе АФП. В результате была продемонстрирована перспективность и безопасность такого подхода, однако, примененные ДНК-вакцины не обеспечивали должной защиты. В диссертационной работе предложен новый способ модификации рекомбинантного АФП, обеспечивающий его направленную деградацию в протеасомах. Для этого был использован вектор, кодирующий АФП в одной рамке считывания с коротким деградационным сигналом орнитин декарбоксилазы (ОДК). Известно, что добавление такого сигнала к С-концу различных белков приводит к их быстрой деградации в протеасомах. Таким образом, в работе были созданы условия для презентации пептидов рекомбинантного АФП в комплексе с молекулами ГКГ I класса и тем самым для активации цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ), направленных против клеток ГЦК, экспрессирующих АФП.

Цель работы

Целью данной работы является разработка и создание ДНК-вакцин против АФП экспрессирующих клеток - клеток ГЦК. Суть данной работы заключается в поиске способов смещения иммунного ответа, вызываемого иммунизацией ДНК-вакциной, в сторону клеточного, т.е. стимуляции специфических цитотоксических лимфоцитов, направленных против клеток опухоли.

Научная новизна

В работе впервые использован механизм направления рекомбинантного АФП на деградацию в протеасому путем слияния его с деградационным сигналом орнитин

декарбоксилазы. В результате чего, была обеспечена быстрая протеасомная деградация рекомбинантного белка, а также выявлено существенное замедление роста ГЦК у мышей, иммунизированных такой вакциной.

Практическая значимость

Практическая значимость работы заключается в разработке новых подходов для иммунотерапии ГЦК, а также других злокачественных новообразований, клетки которых экспрессируют АФП. Более того, использованные в работе подходы могут быть применены для профилактики и лечения как онкологических, так и ряда инфекционных заболеваний, где имеется возможность получения направленного цитотоксического иммунного ответа против известных «маркерных» белков.

Апробация результатов

Результаты работы доложены:

на форуме молодых ученых Yong Scientist Forum (YSF) FEBS Турин, Италия 2011г.; на 36-ом международном конгрессе FEBS, Турин, Италия 2011г.;

на 36-ом Европейском мультидисциплинарном онкологическом конгрессе, ЕССО, Стокгольм, Швеция 2011г.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 136 страницах, включает 29 рисунков, 5 таблиц и содержит 299 ссылок на литературные источники. Диссертация состоит из разделов: введение и цель работы, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, благодарности и литература.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) - наиболее распространенная первичная злокачественная опухоль печени. Частота развития ГЦК у мужчин составляет 13,6 на 100,000 (5-ое место по частоте развития среди других форм рака). У женщин этот показатель составляет 5,52 на 100,000 (8-ое место по частоте развития среди других

форм рака). Смертность от ГЦК в мире составляет около 662,000 человек в год. В России ежегодно выявляют от 1-5 случаев ГЦК на 100,000 человек. Важно отметить, что риск возникновения такой опухоли значительно повышают наличие цирроза печени и инфекция вирусами гепатита В и С.

Для лечения ГЦК используют хирургические подходы, включающие частичную или полную гепатоэктомию, с последующей трансплантацией печени, а также проводят химиотерапию. К сожалению, применяемые способы борьбы с ГЦК не эффективны и имеют существенные ограничения, при этом незначительно продлевают жизнь пациентов. Поэтому разработка новых путей профилактики и лечения ГЦК крайне необходима.

Одной из особенностей ГЦК является частая (до 80% случаев) экспрессия клетками опухоли альфа-фетопротеина (АФП). АФП - белок сыворотки крови развивающегося эмбриона млекопитающих. Он продуцируется желточным мешком и эмбриональной печенью, вскоре после рождения его концентрация в крови снижается до 5-20 нг/мл. Однако, АФП появляется в значительных количествах (до нескольких мкг/мл) в крови взрослого организма при развитии злокачественных новообразований печени и некоторых опухолей репродуктивной системы (Абелев Г.И. 1994).

При возникновении ГЦК ряд функций альфа-фетопротеина способствует росту и развитию опухоли. Одна из них - иммуносупрессорная (Murgita R.A. и соавт. 1975; Semeniuk D.J. и соавт. 1995). АФП влияет практически на все звенья иммунной системы. Так, АФП угнетает созревание специфических цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) и наработку антител (Peck A.B. и соавт. 1978); подавляет пролиферативный ответ лимфоцитов на митоген (Czokalo M. и соавт. 1981); снижает выработку клетками иммунной системы цитокинов, необходимых для развития иммунного ответа (Wang W. 1995); повышает активность специфических Т-супрессоров (Toder V. и соавт. 1982, Belyaev N.N. и соавт. 2008), а также снижает фагоцитирующую способность макрофагов и натуральных киллеров. АФП способствует направлению инфильтрирующих в опухоль лимфоцитов в апоптоз (Li M.S. и соавт. 2005). Таким образом, клетки опухоли, экспрессирующие АФП, предохраняют себя от нежелательного контакта с клетками иммунной системы. Кроме того, АФП - это эффективный регулятор роста и пролиферации как нормальных, так и опухолевых клеток (Mizejewski G.J. 2002). Было выявлено, что АФП может как стимулировать, так и подавлять рост клеток различных

линий (Dudich Е. и соавт. 1998). Yang X. и соавт. было показано, что при ингибировании синтеза АФП в клетках опухолевой линии Huh7 с помощью малых интерферирующих РНК наблюдалась стагнация клеточного роста, а также направление значительного числа клеток в апоптоз (Yang X. и соавт. 2008). Следует отметить, что также были получены результаты, указывающие на проапоптотическое действие АФП (Semenhova L. и соавт. 2003, Dudich Е. и соавт. 2006). Таким образом, АФП необходим для роста и пролиферации, а также защиты клеток опухоли. Поэтому АФП представляется удачной мишенью для иммунотерапии ГЦК (Vollmer, и соавт. 1999).

Предпосылкой к созданию эффективной противоопухолевой вакцины на основе

АФП является возможность активации иммунного ответа против этого аутоантигена.

Было показано, что популяция лимфоцитов, распознающих эпитопы АФП, не

элиминируется в эмбриогенезе, а продолжает циркулировать в крови взрослых особей

на протяжении всей жизни (Butterfield L.H. и соавт. 1999, Thimme R. и соавт. 2008). При

этом отличием этих лимфоцитов от прочих являлось их неактивное - «пассивное»

состояние, однако, удалось показать, что такие клетки могут быть активированы

посредством стимуляции их антигенными эпитопами АФП. Более того, в структуре

АФП были выделены иммунодоминантные (Butterfield L.H. и соавт. 1999, Butterfield

L.H. и соавт. 2001) и субдоминантные районы (Butterfield L.H. и соавт. 2001). В этой

связи был предложен подход к терапии ГЦК на основе введения пациентам пептидов,

соответствующих иммунодоминантным областям АФП (Butterfield L.H. и соавт. 2003,

Butterfield L.H. и соавт. 2006). В результате была показана гетерогенность иммунного

ответа на эпитопы АФП между различными пациентами. Кроме того, было выявлено,

что более сильный иммунный ответ против АФП возникает не при иммунизации

пептидами, а при вакцинации полноразмерным белком (Thimme R. и соавт. 2008, Bei R.

и соавт. 2011). Также была показана существенная роль презентации эпитопов АФП

иммунным клеткам, что напрямую влияло на характер вызываемого иммунного ответа

(Thimme R. и соавт. 2008). При разработке подходов к лечению опухолей предпочтение

отдается стимуляции клеточного иммунного ответа, чего, как правило, не удается

получить вакцинацией полноразмерным белком или его пептидами. Причина этого

заключается в том, что АФП не синтезируется клетками организма, а привносится

извне. Белок циркулирует в крови и после захвата клетками иммунной системы

разрушается, в основном, в лизосомах, а полученные пептиды презентируются на

мембранах клеток в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса (ГКГ II), что способствует активации гуморального (Тх2) иммунного ответа. Напротив, для получения сильного клеточного (Txl) иммунного ответа против АФП необходимо обеспечить его синтез внутри клеток, а также его протеасомную деградацию, что повлияет на презентацию пептидов АФП молекулами ГКГ I класса и в дальнейшем простимулирует активацию специфических цитотоксических лимфоцитов. ДНК-вакцина представляет собой один из возможных путей решения данной проблемы. В течение последних десяти лет в ряде стран проводились исследования по созданию ДНК-вакцин, кодирующих АФП. Были получены результаты, подтверждающие перспективность и безопасность этого подхода, однако, применяемые ДНК-вакцины не обеспечивали должной защиты (Saeki А. и соавт. 2004, Tian G. и соавт. 2004, Lan Y. и соавт. 2007, Rodriguez M. и соавт. 2008). Кроме того, использованные стратегии иммунизации были достаточно громоздкими.

В диссертационной работе предложен новый способ модификации рекомбинантного АФП, обеспечивающий его направленную деградацию в протеасомах. Предпосылками послужили публикации Xiang и соавт., и Starodubova Е. и соавт., в которых была показана эффективность модификации рекомбинантных белков для направления их на деградацию в протеасому путем слияния с последовательностями, приводящими либо к убиквитинизации (Xiang и соавт. 2000), либо к прямому взаимодействию белка-субстрата с протеасомами (Starodubova Е. и соавт. 2008). В диссертационной работе для направления рекомбинантного белка на деградацию в протеасому был использован АФП в одной рамке считывания с коротким деградационным сигналом (дегроном) орнитин декарбоксилазы (ОДК). Известно, что добавление такого сигнала, а также полноразмерного ОДК к С-концу различных белков приводит к их быстрому гидролизу в протеасомах (Starodubova Е. и соавт. 2008, Jungbluth M. и соавт. 2010). В результате были созданы условия для презентации пептидов рекомбинантного АФП в комплексе с молекулами ГКГ I класса, и тем самым для активации ЦТЛ, направленных против клеток, экспрессирующих АФП - клеток ГЦК.

Материалы и методы

1. Животные.

В работе использовали мышей линии С57В1/6 в возрасте 8-9 недель, полученных из питомника лабораторных животных «Столбовая». Мыши содержались в виварии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН и там же проводилась работа с животными.

2. Клетки.

В работе были использованы клеточные линии: НЕК 293, эпителиальных клеток почки эмбриона (АТСС, Manassas, VA по. СRL-1573); TZM-bl - генетически модифицированная линия клеток HeLa, человеческих эпителиальных клеток аденокарциномы шейки матки (AIDS Res. & Ref. Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH, no. 8129); Hepa 1-6, эпителиальных клеток гепатомы мыши (АТСС, Manassas, VA no. CRL-1830). Клетки всех линий культивировали в среде DMEM (PanEco, Russia), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (Hi clone, USA), 2 мМ L-Глютамина (PanEco, Russia) и антибиотики (Пеницилин/стрептомицин) при 37°С, 5% С02 и 95% влажности. Клетки Hepa 1-6, перед введением животным, снимали со дна флакона с помощью раствора трипсина/ЭДТА, а затем отмывали 5 раз фосфатным буфером (ФБ).

3. Экспрессионные векторы.

Конструирование вектора pAFP. Полноразмерный ген, кодирующий АФП мыши (ма/р) размером 1,8 кб, амплифицировали с плазмиды pallöAFP Evrogen (Evrogen, Russia) и переклонировали в вектор pcDNA3.1(-) (Invitrogen, USA). Сохранение рамки считывания и правильная нуклеотидная последовательность конструкции были подтверждены секвенсом.

Конструирование вектора pAFPODCsignal. Полноразмерный ген ма/р был амплифицирован с конструкции pal 16AFP и введен вместо гена rt в вектор pCMVRTODCsignal, полученный вектор был назван pCMVAFPODCsignal. Затем с этой конструкции с помощью ПЦР был амплифицирован фрагмент AFPODCsignal и

переклонирован в вектор pcDNA3.1(-). Созданная плазмида была названа pAFPODCsignal. Правильная нуклеотидная последовательность вектора была подтверждена секвенсом.

Получение векторов pAAFP и pAAFPODCsignal. В работе были получены конструкции с делетированным экспортационным сигналом АФП. Используя вектор pAFP в качестве основы, были амплифицированы короткие фрагменты области 5' конца Mcifp, при этом полученные амплимеры не содержали последовательности экспортационного сигнала. Затем амплимеры были клонированы в векторы pAFP и pAFPODCsignal, замещая участки гена, содержащие экспортационный сигнал. Правильная нуклеотидная последовательность конструкций была подтверждена секвенсом. Новые векторы были названы pAAFP и pAAFPODCsignal соответственно.

Получение векторов pAAFPCAG и pAAFPLCAG. Мутации в последовательность 3' конца гена Aafp вектора pAAFP вводили, используя метод сайт-направленного мутагенеза (СНМ). Единичные нуклеотидные замены были внедрены с помощью набора Stratagene Quik Change II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, USA) согласно протоколу фирмы-производителя. В начале были произведены нуклеотидные мутации, приводящие к замене 3 аминокислот в белке AAFP (позиции 19,20,21 от С-конца AAFP) Glu564Cys, Val565Ala, Cys566Gly соответственно. Так была получена плазмида pAAFPCAG. Затем, используя тот же метод, в вектор pAAFPCAG была введена дополнительная нуклеотидная мутация, приводящая к замене аминокислоты Ala 560 на Leu в позиции 24 от С-конца AAFPCAG. Полученный вектор был назван - pAAFPLCAG. Наличие всех мутаций было подтверждено секвенсом.

4. Трансфекция и Вестерн блоттинг.

Трансфекция. Для трансфекции клеток линий НЕК293 Т и TZM-bl был использован Mirus TransIT-LTl reagent (MirusBio, USA) согласно инструкциям фирмы-производителя.

Лизирование клеток. Через 48 часов после трансфекции клетки отмывали 3 раза ФБ. После чего клетки снимали с планшета и дополнительно отмывали 2 раза ФБ. Клетки лизировали 10 мин на льду лизирующим буфером (I или 2), содержащим

ингибитор протеолиза Complété (Roche, Germany), после чего пробирки центрифугировали 10.000 об/мин 10 мин, собирали надосадочную жидкость. Лизаты хранили при температуре -80°С.

Анализ лизатов трансфицированных клеток проводили в градиентном 4-20% трис-глицин полиакриламидном геле (ДСН ПААГ) Invitrogen Novex Tris-Glycine Gel (Invitrogen, USA), используя Tris-Glycine Sample Buffer (Invitrogen, USA) и Tris-Glycine Running Buffer (Invitrogen, USA), согласно протоколу производителя. В работе также проводили электрофорез в неденатурирующих условиях (Нативный ПААГ), для этого были использованы Tris-Glycine Native Sample Buffer (Invitrogen, USA) и Tris-Glycine Native Running Buffer (Invitrogen, USA), согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Белки с геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad, USA), используя Tris-Glycine Transfer Buffer (Invitrogen, USA) содержащий 20% метанола. Эффективность переноса белков на мембраны была оценена с помощью окраски 0,1% раствором Ponceau Rouge (Sigma, Germany).

Полученные блоты инкубировали с поликлональными антителами кролика против АФП (Abcam, USA) и далее антителами козы против IgG кролика, конъюгированными пероксидазой хрена (Dako, Denmark). После чего, проявляли с помощью набора ECL (GE Healthcare, UK). Для нормализации сигнала мембраны отмывали от антител и инкубировали с моноклональными антителами мыши против Р-актина (Sigma, Germany), и антителами кролика против IgG мыши, меченными пероксидазой хрена (Dako, Denmark). Мембраны проявляли, как описано выше.

5. Анализ культуральной жидкости трансфицированных клеток.

После трансфекции клетки НЕК293 Т выращивали в среде с искусственным заменителем сыворотки Lifor (Lifor-acell, USA). Через 48 часов после трансфекции культуральную жидкость собирали, центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин, а затем еще 10 мин при 10000 об/мин, после чего культуральную жидкость фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм и концентрировали, используя колонки Vivaspin Д30 кДа (Sartorius,USA). Культуральные жидкости на наличие АФП анализировали в ДСН ПААГ, как описано ранее.

6. Изучение протеасомной деградации белков и их стабильности.

Изучение протеасомной деградации рекомбинантных белков осуществлялось с помощью ингибитора протеасомы MG132 (Sigma, Germany). Через 30 часов после трансфекции в культуральную жидкость клеток добавляли ингибитор MG132 (5 мкМ) и инкубировали клетки дополнительно 18 часов. Через 48 часов после трансфекции клетки лизировали. Клеточные лизаты разделяли в ДСН ПААГ и анализировали Вестерн блоттингом.

Анализ периода полураспада рекомбинантных белков проводился с помощью циклогексимида (циклогексимидная «гонка»). Для этого через 48 часов после трансфекции в культуральную жидкость клеток добавляли ингибитор трансляции -циклогексимид (100 мкг/мл) (Sigma, Germany). Сразу, а затем через 2, 4, 6 часов после добавления ингибитора клетки снимали и лизировали, как было описано ранее. Белки разделяли в ДСН ПААГ и анализировали с помощью Вестерн блоттинга. В работе также был использован метод двойного ингибирования с использованием MG132 и циклогексимида. Для этого через 30 часов после трансфекции в культуральную жидкость клеток добавляли MG132, а еще через 18 часов - циклогексимид. Клетки снимали сразу, через 2, 4 и 6 часов после добавления второго ингибитора, лизировали и белки анализировали, как описано выше.

7. Иммунофлюоресценция.

Иммунофлюоресценцию проводили на эпителиальных клетках линии TZM-bl. Через 48 часов после трансфекции плазмидами клетки инкубировали с антителами кролика против АФП (Abcam, USA), а также антителами мыши против калнексина (GeneTex, USA). Клетки промывали ФБ, после чего окрашивали антителами козы против кролика, меченными FITC (Dako, Danmark) и антителами козы против мыши, меченными TRITC (Dako, Danmark). Фотографии флюоресцирующих белков были получены с помощью флюоресцентного микроскопа Carl Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss, Germany) и обрабатывались с использованием программы "LSM 5 Image Examiner"(Carl Zeiss, Germany).

8. Создание модели перевиваемой гепатомы на мышах.

Двенадцать самцов линии С57В1/6 были разделены на 3 группы по 4 мыши в каждой, мышам подкожно в область холки вводили 4*10б, 2*105, 2* 104 клеток линии Hepa 1-6 в 100 мкл ФБ соответственно. Через 35 дней после перевивки клеток опухоли мышей забивали, собирали сыворотки, измеряли размеры образовавшихся неоплазм, а также забирали образцы тканей опухолей и печени животных. Ткани лизировали, как было описано ранее, и тестировали методом Вестерн блоттинга с антителами против АФП (Abcam, USA). Также методом Вестерн блоттинга оценивалось количество АФП в сыворотках животных. Кроме того, были отобраны еще 20 животных (10 самцов и 10 самок) и разделены на 4 группы по пять мышей. Десяти мышам (5 самцам и 5 самкам) вводили 2* 10s клеток Hepa 1-6 в 100 мкл ФБ. Оставшимся десяти животным вводили ~2* 105 клеток опухоли, взятой от мыши из предыдущего опыта.

9. Иммуногистохимия.

Образцы опухолевой ткани фиксировали 4% раствором параформальдегида, а затем инкубировали в 10% растворе сахарозы, после чего морозили в парах жидкого азота и хранили при -80°С. С помощью криостата были получены срезы ткани толщиной 10 мкм, которые помещались на стекла покрытые поли-Ь-лизином. Стекла инкубировали 1 час при комнатной температуре в буфере для забивки. Затем слайды инкубировали с поликлональными антителами кролика против АФП (Abcam, USA). После чего стекла отмывали и окрашивали антителами козы против IgG кролика, меченными Alexa 546 (Invitrogen, USA). Затем, слайды дважды промывали ФБ и окрашивали ядра клеток раствором DAPI (Invitrogen, USA). На последнем этапе стекла промывали ФБ, заключали в Mowiol (Sigma, Germany) и анализировали, используя флюоресцентный микроскоп Carl Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss, Germany). Слайды, использованные как контрольные, не окрашивались антителами против АФП.

10. Иммунизация мышей ДНК-вакцинами.

Всего в экспериментах участвовало 114 самцов линии C57BI/6 в возрасте 8-9 недель. Мыши были разделены на 3 большие группы: «А», «Б» и «В», причем в группу «А» входило 48 животных, в группу «Б» - 48, а в группу «В» -18.

Эффект выработки животными специфических антител после ДНК-вакцинации определяли используя мышей группы «А». Были составлены 6 групп по 8 животных в каждой. Дважды с интервалом в две недели мышей четырех групп иммунизировали экспрессионными векторами. Мышам двух оставшихся групп вводили pcDNA3.1(-) или ФБ. Через 14 дней после последней вакцинации животных забивали, а полученные сыворотки исследовали на содержание антител против АФП методом иммуноферментного анализа, при этом использовали пероксидазные конъюгаты -специфичные к IgGl и IgG2a (US Biological, USA) мыши.

Терапевтический эксперимент.

Для оценки лечебных свойств полученных конструкций был выполнен терапевтический эксперимент. Мышам группы «Б» перевивали опухолевую ткань (~2*105 клеток), ресуспензированную в ФБ. Спустя две недели из 48 мышей сформировали 6 групп по 8 животных, исходя из принципа равенства среднего объема опухоли в группе. Животных каждой группы однократно иммунизировали 100 мкг одной из плазмид: pAFP, pAAFP, pAFPODCsignal, pAAFPODCsignal или pcDNA3.1(-). Мышам контрольной группы вводили 100 мкл ФБ. Вакцинацию мышей осуществляли внутримышечно, в бедро. После чего контролировали рост опухолей у животных и определяли объем неоплазм по формуле (длина* ширина2)/2. Когда длина (больший размер) превосходила 2 см, использовали формулу (длина*ширина*высота).

Профилактический эксперимент.

В работе был также проведен профилактический эксперимент. Группу «В» разделили на три подгруппы по 6 мышей в каждой. Животных первых двух подгрупп с интервалом в две недели четырежды иммунизировали 50 мкг вектора (мышей первой подгруппы вакцинировали pAAFPODCsignal, а мышей второй подгруппы - pcDNA3.1(-)). Животным контрольной группы вводили ФБ. Спустя две недели после последней вакцинации мышам перевивали опухолевую ткань (~2х 10s клеток), ресуспензированную в ФБ. После чего наблюдали за ростом опухолей у животных и определяли их объем, как указано выше.

Результаты и обсуждение

1.Создание и in vitro анализ конструкций

1.1 Векторы.

На первом этапе работы были созданы четыре экспрессионных вектора: 1) pAFP -вектор, кодирующий АФП дикого типа; 2) pAFPODCsignal - вектор, кодирующий АФП дикого типа с соклонированным на С-конце дегроном ОДК; 3) pAAFP - вектор, кодирующий АФП дикого типа с удаленным N-концевым экспортационным сигналом, 4) pAAFPODCsignal - вектор, кодирующий АФП с соклонированным на С-конце дегроном ОДК и удаленным N-концевым экспортационным сигналом (рис.1).

АФП

01/

ав—

pAFP

pAFPODCsignal pAAFP

pAAFPODCsignal

Рис.1. Схематическое изображение рекомбинантных белков, синтезирующихся с полученных конструкций. Выделены последовательности АФП мышей и дегрона ОДК. Э.с.-экспортационный сигнал. Цифрами обозначены номера аминокислотных остатков, отсчитанные от Ы-конца полипептида.

Важно отметить, что в векторы pAFPODCsignal и pДAFPODCsignal вводили последовательность ОДК дегрона для обеспечения протеасомной деградации химерных белков. Конструкции рДАРР и рДАРР00С$1§па1 кодировали белки с делетированным экспортационным сигналом для улучшения доступа рекомбинантных белков к цитоплазматическим протеасомам. Важное место в работе было отведено анализу и характеристике рекомбинантных белков в трансфицированных клетках. В частности, был проанализирован уровень экспрессии рекомбинантных белков, их секреция из

трансфицированных клеток, внутриклеточная локализация, скорость протеасомной деградации, а также оценивалась способность белков к олигомеризации.

1.2 Экспрессия рекомбинантных белков в трансфицированных клетках.

Через 48 часов после трансфекции проводился сравнительный анализ экспрессии рекомбинантных белков в лизатах клеток. В результате было показано, что все белки эффективно синтезируются, однако, количества полноразмерных белков в лизатах различались, несмотря на равную концентрацию тотального белка, внесенного в ПААГ (рис.2).

анти-АФП

------>~ >»' -------- Ь......

- 70 иДа

• 40 кДа

анта-(3-актин

Рис.2. Сравнительный анализ количества рекомбинантных белков в трансфицированных клетках НЕК293 Т методом Вестерн блоттинга (а). Клетки трансфицированы: - рДАБР (дорожка 1), рАРР (дорожка 2), pAFPODCsignal (дорожка 3), pДAFPODCsignal (дорожка 4), рСЭЫАЗ.Ц-) (дорожка 5). Дорожка 6 - лизат нетрансфицированных клеток. Контроль нормализации загрузки белка проводился с помощью обработки мембраны моноклональными антителами к р-актину (б).

Следует отметить, что белков ДАРР и ДАРРСЮСз1£па1 в лизатах трансфицированных клеток было меньше по сравнению с другими рекомбинантными белками. С одной стороны, объяснение этого феномена можно найти в экспериментах (Сарога1е М. и соавт. 2009), которые продемонстрировали роль экспортационного сигнала в регуляции экспрессии гена ет ретровируса Jaagsiekte. Было показано, что наличие экспортационного сигнала усиливало экспрессию вирусных белков. Не исключено, что подобные механизмы регуляции экспрессии функционируют и в других случаях, где присутствуют подобные сигналы. С другой стороны, малое количество ДAFPODCsignal в лизатах трансфицированных клеток может свидетельствовать в

пользу направленной протеасомной деградации белка за счет наличия на его С-конце I деградационного сигнала ОДК. Однако, неожиданно большое количество белка AFPODCsignal в лизатах трансфицированных клеток требовало дополнительного объяснения.

1.3 Секреция рекомбинантных белков из трансфицированных клеток.

Для анализа секреции рекомбинантных белков, трансфицированные клетки 1 переводили в среду с искусственным заменителем сыворотки Lifor. Через 48 часов после трансфекции собирали культуральную жидкость и оценивали количество секретируемых белков методом Вестерн блоттинга. В результате было показано, что только АФП дикого типа эффективно экспортируется из клеток (рис.3).

1 2 3 4 5

анти-АФП

Рис. 3. Сравнительный анализ секреции рекомбинантных белков из трансфицированных клеток. Дорожка 1 - AFP, дорожка 2 - AAFP, дорожка 3 - AFPODCsignal, дорожка 4 -AAFPODCsignal, дорожка 5 - нетрансфицированные клетки.

Отсутствие секреции AAFP и AAFPODCsignal, вероятно, объясняется делецией экспортационного сигнала, однако это не объясняет отсутствия секреции рекомбинантного белка AFPODCsignal, у которого этот сигнал сохранен.

1.4 Определение периода полураспада рекомбинантных белков.

Период полураспада четырех рекомбинантных белков в трансфицированных клетках оценивали с помощью метода ингибирования трансляции циклогексимидом. Через 48 часов после трансфекции в культуральную жидкость клеток НЕК293 Т добавляли циклогексимид. Сразу, через 2, 4 и 6 часов после добавления ингибитора клетки лизировали и проводили сравнительный анализ количества рекомбинантных белков в лизатах. Было показано, что наименее стабильным белком являлся AAFPODCsignal, его период полураспада составлял 1,5-2 часа, тогда как другие белки были одинаково стабильны на протяжении 6 часов (рис.4).

ДАРР АРР ДАРРСЮСБ^па! АРРСЮСБ^па!

0ч 2ч 4ч 6ч Оч 2ч 4ч 6ч 0ч 2ч 4ч 6ч 0ч 2ч 4ч 6ч

— —

анти-АФП

— __

- «мь - » тт.

-70кДэ

-40 кДа

анти-13-актин

Рис. 4. Анализ стабильности рекомбинантных белков в трансфицированных клетках в присутствии циклогексимида (а). Для нормализации сигнала выполнена окраска мембраны антителами против р-актина (б).

Интересно, что количество АФП дикого типа практически не менялось со временем, несмотря на ранее продемонстрированную секрецию этого белка из трансфицированных клеток в норме (рис.3). Это можно объяснить действием циклогексимида. В клетках происходит ингибирование трансляции белков, вовлеченных в процессы гликозилирования и секреции и, таким образом, блокируется экспорт белка из клетки, в то же время действие циклогексимида не оказывает серьезного влияния на активность протеасом.

1.5 Анализ протеасомной деградации.

Анализ протеасомной деградации рекомбинантных белков в трансфицированных клетках проводили, используя ингибитор активности протеасомы 1УЮ132. С его помощью было показано, что направленной протеасомной деградации подвергается только ДAFPODCsignal, при этом AFPODCsignal в протеасоме не разрушается (рис.5). Поскольку AFPODCsignal не секретируется из трансфицированных клеток (несмотря на наличие экспортационного сигнала) и не деградирует в протеасоме, хотя несет деградационный сигнал ОДК, предположили, что АРРСЮСз1§па1 накапливается в клетке и, при этом не имеет доступа к протеасомам.

1234 567 89

+ - + - + - + М6132

- 70кДа

анти-АФП

40кДа

анти-(3-актин

Рис. 5. Анализ стабильности рекомбинантных белков в присутствии ингибитора протеасомы МС132 (а). Дорожка 1 - лизат нетрансфицированных клеток, дорожки 2,3 - лизаты клеток трансфицированных рДАРР, дорожки 4,5 - лизаты клеток трансфицированных рАРР, дорожки 6,7 - лизаты клеток трансфицированных рДАРРООС$1^а1, дорожки 8,9 - лизаты клеток трансфицированных рАРРОВСБ1^а1. «+» и «-» указывают на присутствие (отсутствие) ингибитора. Для нормализации сигнала выполнена окраска мембраны антителами против Р-актина (б).

Для подтверждения этой гипотезы был проведен иммунофлюоресцентный анализ локализации рекомбинантных белков в трансфицированных клетках.

1.6 Локализация рекомбинантных белков в трансфицированных клетках.

Для иммунофлюоресценции были использованы эпителиальные клетки линии Т2М-Ы (НеЬа-подобные). Эти клетки обладают хорошей адгезивностью к подложке и долго сохраняют морфологию во время их подготовки для иммунофлюоресцентного анализа. Предположили, что некоторые рекомбинантные белки могут быть локализованы в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР). Одним из белковых маркеров ЭПР является калнексин. Поэтому для определения внутриклеточной локализации химерных белков клетки трансфицировали и, спустя 48 часов проводили окрашивание антителами против АФП и калнексина. В результате было показано, что рекомбинантные белки распределены в клетках по-разному (рис.6). В частности, АФП дикого типа обнаруживался, в основном, в области клеточной мембраны, что может рассматриваться как промежуточный этап на пути его секреции из клетки (рис.б А, Б). Как и ожидалось, ДАРР, не имеющий экспортационного сигнала на "Ы-конце,

локализовался в цитоплазме (рис.6 В). ДAFPODCsignal был плохо различим в трансфицированных клетках (рис.6 Г), что подтверждает ранее полученные результаты, свидетельствующие в пользу его протеасомной деградации (рис. 5). В отличие от других белков, AFPODCsignal образовывал специфические «серповидные» агрегаты, четко колокализовавшиеся с калнексином (рис.6 Д, Е). Это подтверждает предположение о

АРР ДАГР AAFPODCsignal

AFPODCsignal

Рис. б. Локализация рекомбинантных белков в трансфицированных клетках, продемонстрированная с помощью конфокальной микроскопии. Двойная иммунофлюоресценция клеток Т2М-Ы, трансфицированных рАИР (А, Б), рДАРР (В), рДАРРСЮС81^а1 (Г) и рАРРСЮС81)гпа1 (Д, Е). Клетки окрашены антителами кролика против АФП и антителами козы против ^О кролика, меченными ПТС. Калнексин выявлен с помощью моноклональных антител мыши и антител козы против ^О мыши, меченных ТШТС. Желтый цвет указывает на колокализацию белков.

том, что «серповидные» структуры АРРСЖС51£па1 накапливаются в ЭПР. Таким образом, можно сделать вывод о том, что рекомбинантный белок «застревает» в ЭПР и

поэтому не подвергается протеасомной деградации. Что может быть связано с наличием экспортационного сигнала на 5' конце иРНК, который после начала трансляции распознается Signal Recognition Particle (SRP). После этого дальнейшая трансляция происходит на рибосомах шероховатого ЭПР. Синтезированный таким образом белок оказывается внутри ЭПР и, тем самым, не имеет контакта с цитоплазматическими протеасомами, что объясняет отсутствие его деградации. Несмотря на наличие экспортационного сигнала, AFPODCsignal, в отличие от АФП дикого типа, не секретируется из клетки, что вероятно связано с присутствием на его С-конце дегрона ОДК. Хотя дегрон в данном случае не выполняет свою основную функцию, он каким-то образом препятствует секреции химерного белка и способствует его накоплению в ЭПР. Механизм этого остается не ясным, так как дегрон ОДК не содержит мотивов KDEL или ККХХ и в то же время практически не имеет положительно заряженных аминокислот в своем составе, которые могли бы обеспечить локализацию химерного белка в ЭПР. Не исключено, что дегрон ОДК содержит доселе неизвестные аминокислотные мотивы, тормозящие экспорт химерного белка из ЭПР или же здесь играет роль сильная олигомеризация AFPODCsignal, подробный анализ которой представлен ниже (рис.7).

1.7 Олигомеризация.

Анализ олигомеризация белков важен для более детального понимания процессов, происходящих в трансфицированной клетке, а также является хорошим

1 2 3 4 5

_ кДа

1зо

анти-АФП

Рис. 7. Сравнительный анализ олигомеризации рекомбинантных белков в ПААГ без ДСН. Изображены три экспозиции одной и той же мембраны. Лизаты клеток НЕК293 Т трансфицированых pAAFPODCsignal - дорожка I, рДАРР - дорожка 2, рАРР - дорожка 3, pAFPODCsignal - дорожка 4, дорожка 5 - нетрансфицированные клетки. Мономеры, димеры, тримеры и тетрамеры указаны стрелками.

12345 12345

j f 1

S ,5

дополнением иммунофлюоресценции. Такой анализ проводят в нативном ПААГ, с последующим выявлением белковых структур методом Вестерн блотгинга. Известно, что АФП способен агрегировать и образовывать олигомеры, в том числе димеры и тримеры (Wu J. Т. и соавт. 1982, 1985). В представленной работе было показано, что димеры, тримеры и даже тетрамеры образуют все рекомбинантные белки, однако, наиболее выраженные олигомерные структуры были выявлены в лизате клеток, трансфицированных вектором pAFPODCsignal (рис.7). Можно предположить, что образование таких крупных белковых агрегатов является ключевой причиной, сильно затрудняющей процессы экспорта AFPODCsignal из клетки (рис. 3).

1.8 Дальнейшая модификация полученных конструкций.

Созданные плазмиды показали свою эффективность, однако, нами была предпринята попытка дальнейшего совершенствования векторов за счет модификации ОДК дегрона. Известно, что в его составе идентифицированы аминокислотные остатки, Cys441 и А1а442, мутации которых предотвращают деградацию самой молекулы ОДК (Miyazaki Y. и соавт. 1993, Takeuchi J. и соавт. 2007). Более того, показано, что эффективность деградационного сигнала зависит от местоположения этих аминокислот - точнее, от их удаленности от С-конца белка, которая, по данным авторов, составляет 20 аминокислот (Takeuchi J. и соавт. 2007). С целью изучить влияние ключевых аминокислот деградационного сигнала ОДК, введенных в состав других белков на их протеасомную деградацию, в качестве модели был использован белок АФП мышей, а для введения целенаправленных мутаций - вектор, содержащий ген Mafp (pAAFP). Предполагалось, что при удалении экспортационного сигнала и введении ключевых аминокислот дегрона ОДК на С-конец АФП, скорость деградации полученного модифицированного белка увеличится. В этом случае протеасомная деградация АФП будет достигаться посредством минимальных изменений рекомбинантного белка, и тем самым будет сведена на нет возможность возникновения аутоиммунных реакций. При этом следовало учитывать еще один важный момент - модификации не должны вносить существенных изменений во вторичную структуру (конформацию) белка.

1.9 Получение векторов, кодирующих АФП с модифицированным С-концом.

Как было показано выше (рис.3), при удалении N-концевого экспортационного сигнала АФП секреции AAFP не происходит, а эффективность экспрессии существенно не меняется. С помощью сайт-направленного мутагенеза в области З'-конца гена Дafp были произведены нуклеотидные замены, которые позволили воссоздать ключевой аминокислотный мотив ОДК-дегрона (Takeuchi J. и соавт. 2007) на С-конце AAFP, Так были сконструированы векторы, кодирующие белки AAFPCAG и AAFPLCAG (рис.8).

425 461

ОДК дегрон FPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV.

б 548 584

AFP (NM007423) I АФП [~ADFSGLLEKCCKAQDQEVCFTEEGPKL1SKTRDALGV.

pAAFPCAG Г hADFSGLLEKCCKAQDQCAGFTEEGPKLlSKTRDALGV.

р AAFPLCAG 1 А0П [—ADFSGLLEKCCKLQDOCAGFTEEGPKLISKTRDALGV.

Рис. 8 Аминокислотные последовательности С-концевых областей ОДК, AFP и модифицированных вариантов AAFP. (а) - Деградационный сигнал ОДК; подчеркнуты аминокислотные остатки, которые считаются ключевыми в составе дегрона. (б) - С-концевые последовательности АФП дикого типа и мутантных вариантов; подчеркнуты аминокислотные остатки, введенные сайт-направленным мутагенезом.

1.10 Анализ скорости деградации рекомбинантных белков.

Анализ кинетики деградации белков, экспрессированных с полученных конструкций, не подтвердил нашей гипотезы: скорость деградации модифицированных белков - без экспортационного сигнала и с измененным С-концом - не отличалась от скорости деградации AAFP (рис.9). Отсутствие деградации модифицированных белков может быть связано со значительными различиями их трехмерных структур и структуры ОДК. В частности, С-конец AAFPCAG (AAFPLCAG) может быть недоступен для взаимодействия с протеасомами. Кроме того, нельзя исключить наличия дополнительного, не установленного пока, структурного элемента в составе ОДК-дегрона (и потому не воспроизведенного в составе представленных конструкций), влияющего на скорость и направленность деградации.

1 234 5678

+ - + MG132

4— 70кДэ

анти-АФП 12345678

_ ---... ----- — • ■ - 4— 40 кДа

анти-13-актин

Рис. 9. Анализ протеасомной деградации белков с измененным С-концом. (а) -Иммуноблоттинг лизатов НЕК293 Т клеток: нетрансфицированных (дорожка 1), трансфицированных pAFP (дорожка 2), pAAFP (дорожка 3), pAAFPCAG (дорожка 4); находившихся под ингибитором MG132 клеток, трансфицированных pAAFPCAG (дорожка 5); клеток, трансфицированных pAAFPLCAG (дорожка 6); находившихся под ингибитором MG132 клеток, трансфицированных pAAFPLCAG (дорожка 7); клеток, трансфицированных контрольным вектором pcDNA3.1(-) (дорожка 8). (б) - Сигнал нормирован по р-актину с использованием соответствующих антител. «+» - наличие MG132,«-» - отсутствие MG132.

Таким образом, можно утверждать, что введение выявленных ранее ключевых аминокислот дегрона ОДК и их расположение относительно С-конца AAFP представляются необходимыми, но недостаточными условиями для обеспечения его деградации в протеасоме.

2. Исследование свойств полученных ДНК-вакцин in vivo

В результате проведенных исследований, наиболее перспективным вектором с точки зрения использования в качестве вакцины оказался pAAFPODCsignal. В первую очередь это связано с тем, что кодируемый им рекомбинантный белок быстро и направленно деградировал в протеасоме. Поэтому в экспериментах in vivo ему уделялось наибольшее внимание.

2.1 Получение модели перевиваемой гепатомы у мышей.

В ходе экспериментов на мышах линии C57BL/6 сначала была создана модель развития гепатомы, причем рост опухоли вызывался перевивкой животным клеток линии опухоли печени мышей Нера 1-6. Экспрессия АФП клетками возникших

новообразований была подтверждена методом Вестерн блоттинга, а также с помощью иммуногистохимического окрашивания срезов опухолей. В ходе предварительных экспериментов было определено количество клеток, необходимое для образования опухоли у животных. При введении мышам 2*105 клеток Нера 1-6 опухоли возникали наиболее часто, что согласуется с данными других авторов (Лап С. и соавт. 2004, ЬапУ. и соавт. 2007) (табл.1).

Перевивка клеток Hepa 1-6

Кол-во клеток 4 1*10 5 2*10 6 4*10

Количество мышей с опухолью на 35 день после перевивки 0/4 3/4 2/4

Табл. 1. Результаты эксперимента по перевивке различного количества клеток Hepa 1-6 мышам.

Следует отметить, что было обнаружено различие в эффективности образования опухолей у самцов и самок (табл.2). Этот эффект был показан в ходе исследования, в котором 20 животных (10 самцов и 10 самок) были разделены на 4 группы по пять мышей. Десяти мышам (5 самцам и 5 самкам) вводили 2*105 клеток Hepa 1-6. Оставшимся десяти животным вводили ~2*105 клеток опухоли, взятой от мыши из предыдущего эксперимента. Самцы оказались менее резистентными по сравнению с

Пол 3 ¥

5 Перевивка 2*10 Клетки Ткань Клетки Ткань

Количество мышей с опухолью на 35 день после перевивки 1/5 5/5 0/5 2/5

Табл. 2. Результаты экспериментов по перевивке опухолевых клеток и ткани мышам различного пола.

самками, что может быть связано с присутствием эстрогена в крови самок. Было показано, что АФП связывает эстроген, при этом известно, что сам по себе АФП, секретируемый клетками гепатомы, обладает выраженным иммуносупрессорным действием (Ми^ка Я. и соавт. 1975, Ваккег Д. и соавт. 2006). Вероятно, что в организме самок после перевивки клеток опухоли и начала активного синтеза ими АФП происходило связывание эстрогена АФП. Снижение концентрации свободного АФП в сыворотке ослабляло его иммунносупрессорное действие и, как следствие, препятствовало росту опухоли. Отсутствие же большого количества эстрогена в крови самцов приводило к полноценной супрессии иммунного ответа за счет АФП. В результате создавались благоприятные условия для пролиферации трансформированных клеток. Кроме того, следует отметить, что наблюдалось заметное ускорение роста новообразований при перевивке опухолевых клеток от одной мыши к другой. Основываясь на выше изложенном, в дальнейших экспериментах нами были использованы только самцы, а рост опухолей вызывался перевивкой трансфомированных клеток от одного животного к другому.

2.2 Иммунный ответ на рекомбинантный АФП.

ДНК-иммунизация мышей плазмидами рДАРРООС51£па1 и рАРР приводила к развитию иммунного ответа у вакцинированных животных, и характеризовалась увеличением титра антител, направленных против рекомбинантного АФП. В случае иммунизаций другими конструкциями в сыворотках мышей антител против АФП выявлено не было. Важно отметить, что в группе мышей, вакцинированных рАБР, средний титр антител 1§01 составлял 1:350, а титр антител ^02а - порядка 1:200, что может косвенно указывать на стимуляцию Тх2 иммунного ответа. Напротив, в группе мышей, иммунизированных рДАРРООСз'щпа1, титр антител ^01 составлял 1:300, а титр антител ^02а - порядка 1:250, т.е. наблюдался практически одинаковый уровень антител обоих типов, что указывает на некоторое усиление Тх1 иммунного ответа против АФП.

Для оценки иммуностимулирующего эффекта и противоопухолевого действия полученных ДНК-вакцин были проведены терапевтический и профилактический эксперименты.

Терапевтический эксперимент. Терапевтический эксперимент ставил своей целью ответ на вопрос: «Могут ли полученные ДНК-вакцины замедлить рост ГЦК?». Для этого животным сначала перевивали опухолевую ткань. Через 15 дней мышей разделили на шесть групп. Две группы служили контролем. Этим животным вводили ФБ или pcDNA3.1(-). Мыши каждой из оставшихся четырех групп были однократно вакцинированы одним из экспрессионных векторов. Затем на протяжении 90 дней анализировали динамику роста объема опухоли у животных. В результате существенного замедления роста опухоли у мышей, иммунизированных тестируемыми плазмидами, показано не было, напротив, было выявлено некоторое ускорение роста опухоли в этих группах (рис.10). Такие результаты могут быть с одной стороны объяснены недостаточной стимуляцией иммунного ответа рекомбинантными белками, при наличии в организме животного опухоли, а с другой стороны иммуносупрессорным действием АФП. Так как эффект подавления иммунного ответа вызванный АФП, экспрессированным клетками опухоли, может дополнительно усиливаться рекомбинантным АФП. Более того, как регулятор роста и пролиферации

День по еле перевивки опухолевых клеток

Средний объем опухоли в группах иммунизированных животных

6000

Рис.10. Терапевтический эксперимент. На 15 день после перевивки опухоли животных (6 групп по 8 мышей) вакцинировали 100 мкг одного из векторов или 100 мкл ФБ. Животных наблюдали в течение 90 дней и регулярно определяли объем опухоли. Стандартное отклонение обозначено.

-рАРР -рДАРР

- рАРРООС51зпа1 -рДАРРСЮСз^па! -рсОЫАЗД--ФБ

4000

2000

рекомбинантный АФП может способствовать росту клеток гепатомы, особенно ярко этот эффект выражен при вакцинации мышей pAFP (рис.10). Важно отметить, что выявленное замедление роста опухолей у животных, иммунизированных pcDNA3.1(-), может быть связано с отсутствием иммуносупрессии, ассоциированной с рекомбинантным АФП с одной стороны, и неспецифической активацией иммунного ответа неметилированными CpG динуклеатидными последовательностями вектора - с другой (Dalpke А. и соавт. 2002). Основываясь на результатах, полученных в опытах in vitro, результатах терапевтического эксперимента, а также литературных данных, где было показано отсутствие выраженного эффекта pAFP при профилактическом использовании (Saeki А. и соавт. 2004, Wang Х.Р. и соавт. 2004), количество тестируемых конструкций в дальнейшем было уменьшено, и в качестве наиболее перспективного был выбран вектор pAAFPODCsignal.

Профилактический эксперимент. Профилактический эксперимент ставил своей задачей определить, способна ли предварительная вакцинация мышей вектором pAAFPODCsignal предотвратить появление у них ГЦК. В ходе этого исследования

Рис. 11. Профилактический эксперимент. Оценка динамики роста объема опухоли в группах животных иммунизированных рДАРРООСз1§па1, рсОКА3.1(-) или ФБ. Стандартное отклонение обозначено.

животные были сначала вакцинированы четыре раза с интервалом 14 дней pAAFPODCsignal, pcDNA3.1(-) или ФБ, после чего им перевивали клетки опухоли. В результате этого эксперимента было показано трех и пятикратное замедление роста опухоли в группе мышей, иммунизированных pAAFPODCsignal, по сравнению с контрольными группами (рис.11). Это свидетельствует в пользу того, что направленная протеасомная деградация AAFPODCsignal (за счет наличия на его С-конце дегрона ОДК) может обеспечивать преодоление иммунологической толерантности и стимуляцию соответствующих CD4+, а главное - CD8+ Т-лимфоцитов. При этом существенную роль играет использование полноразмерного АФП, что очень важно для развития иммунного ответа к различным эпитопам белка (Thimme R. и соавт. 2008). Вследствие этого может образовываться широкий спектр клеток памяти, которые обеспечивают дальнейшую защиту животных и эффективное отторжение перевитой им опухолевой ткани. Из результатов экспериментов следует, что подобная иммунизация, хотя и существенно замедляет рост новообразований, тем не менее, не приводит к полной защите вакцинированных мышей от развития опухоли. Это может быть связано с тем, что в опухоли существуют клетки, практически не экспрессирующие АФП. В результате иммунного ответа такие клетки не элиминируются и потенциально могут обеспечить выживание опухоли.

Результаты in vitro, а также данные профилактического и терапевтического экспериментов in vivo, свидетельствуют в пользу того, что направление рекомбинантного AAFPODCsignal (за счет дегрона ОДК) на деградацию в протеасому обеспечивает необходимые условия для стимуляции ЦТЛ направленных против АФП-экспрессирующих клеток. Благодаря этому у вакцинированных животных вырабатывается противоопухолевый иммунный ответ, который приводит к замедлению роста ГЦК. Следует отметить перспективность такого подхода при создании профилактических вакцин не только против онкологических, но и инфекционных заболеваний, при которых протеасомной деградации будут подвергаться белки-мишени и будет стимулироваться специфический Тх1 иммунный ответ. В целом результаты данной работы свидетельствуют в пользу перспективности этого направления и принципиальной возможности создания эффективной вакцины против ГЦК на основе человеческого АФП.

Выводы

1) Показано, что отсутствие экспортационного сигнала и наличие дегрона орнитин декарбоксилазы на С-конце AAFPODCsignal - обеспечивают эффективную протеасомную деградацию рекомбинантного белка.

2) Введение ключевых аминокислот дегрона орнитин декарбоксилазы на С-конец ДАРР не влияет на скорость его деградации.

3) Создана перевиваемая модель гепатомы на мышах линии C57BL/6.

4) Выявлено, что терапевтическая иммунизация мышей ДНК-вакцинами не способствует супрессии роста имеющейся опухоли.

5) Установлено, что профилактическая вакцинация вектором pAAFPODCsignal приводит к преодолению иммунологической толерантности и стимуляции иммунного ответа против альфа-фетопротеина, что обеспечивает значительное замедление роста гепатоцеллюлярной карциномы у мышей.

Список публикаций по теме диссертации

1. Starodubova Е., Boberg A., Litvina М., Morozov A., Petrakova N.. Timofeev А., Latyshev О., Tunitskaya V., Wahren В., Isaguliants М., Karpov V. HIV-1 reverse transcriptase artificially targeted for proteasomal degradation induces a mixed Thl/Th2 type immune response. (2008) Vaccine 26(40): 5170-5176.

2. Морозов А. В., Тимофеев А. В., Морозов В. А., Карпов В. Л. «Наличие и каноническое положение ключевых аминокислот дегрона орнитин декарбоксилазы - недостаточное условие для деградации альфа-фетопротеина» (2011) Мол. £иол.45(3):529-537.

3. Морозов А.В., Морозов В.А., Астахова Т.М., Тимофеев А.В., Карпов В.Л. «ДНК-вакцина, кодирующая альфа-фетопротеин и деградационный сигнал орнитин декарбоксилазы, существенно замедляет рост перевиваемой гепатоцеллюлярной карциномы у мышей» (2011) Мол. Биол. в печати.

Результаты работы, опубликованные в виде тезисов на конференциях

1. Starodubova Е, Boberg A, Litvina М, Stepanenko R, Morozov A, Petrakova N, Tunitskaya V, Timofeev A, Wahren B, Kochetkov S, Isaguliants M, Karpov V. «Genes for proteasome targeted reverse transcriptase of HIV-1 generate T-cell response in mice». Malaga, Spain 2008 Abstract book p. 135.

2. A.V. Morozov, A.V.Timofeev, V.A.Morozov, V.L.Karpov «DNA vaccine expressing alpha-fetoprotein fused with ODC degron: a novel approach for hepatocellular carcinoma (HCC) prevention» 36th FEBS Congress, Turin, Italy 2011, FEBS Journal 278 suppl.l p.469.

3. A.V. Morozov, V.A.Morozov, Т. M. Astakhova,A.V.Timofeev, V.L.Karpov «DNA Vaccine Expressing Alpha-fetoprotein with the Degradation Signal From Ornithine Decarboxylase Provides Notable Protective Immunity Against Hepatocellular Carcinoma in Mice» 36th European Multidisciplinary Cancer Congress, ECCO, Stockholm, Sweden 2011 Abstract book p.367.

Заказ № 34-а/11/2011 Подписано в печать 09.11.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 (О^ www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Морозов, Алексей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ И ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Первичные злокачественные опухоли печени.

1.1.1 Класси фикация гепатом.

1.1.2 Этиологические факторы.

1.1.3 Диагностика ГЦК.

1.1.4 Современные подходы, применяемые при лечении печени, пораженной ГЦК.

1.2 Альфа-фетопротеин.

1.2.1. История открытия АФП.

1.2.2. Регуляция синтеза АФП.

1.2.3. Генетические варианты АФП.

1.2.4. Структура и функции АФП.

1.2.5. Мембранные рецепторы.

1.2.6. Возможные объяснения экспрессии АФП клетками опухоли

1.2.7. Клеточный и гуморальный иммунный ответ к АФП у больных ГЦК и здоровых доноров.

1.3 ДНК-вакцины.

1.3.1 Введение.

1.3.2 История.

1.3.3 Механизм развития иммунного ответа при ДНК-вакцинации.

1.3.3.1 26Б протеасома.

1.3.3.2 Образование антигенных пемтидов.

1.3.4 Факторы, влияющие на индукцию иммунного ответа.

1.3.5 Стратегии усиления иммунного ответа.

1.3.6 Клинический опыт использования ДНК-вакцин.

1.3.7 ДНК-вакцины, кодирующие АФП.

1.4 Орнитин декарбоксилаза.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Оборудование и реактивы.

2.1.1 Оборудование.

2.1.2 Реактивы.

2.1.3 Ферменты.

2.1.4 Питательные среды.

2.1.5 Буферы.

2.1.6 Антитела.

2.2 Животные.

2.3 Клеточные линии и условия их культивирования.

2.3.1 Клеточные линии.

2.3.2 Условия культивирования клеток.

2.4 Антигены.

2.5 Векторы.

2.5.1 Конструирование вектора pAFP.

2.5.2 Конструирование вектора pAFPODCsignal.

2.5.3 Создание плазмид pAAFP и pAAFPODCsignal.

2.5.4 Получение векторов pAAFPCAG и pAAFPLCAG.

2.5.5 Использованные праймеры.

2.5.6 Получение компетентных клеток.

2.6 Трансфекция и Вестерн блоттинг.

2.6.1 Трансфекция.

2.6.2 Лизирование клеток.

2.6.3 Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.6.3.1 Электорфорез в денатурирующих условиях.

2.6.3.2 Электрофорез в не денатурирующих условиях (Нативный ПААГ).

2.6.4 Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану.

2.6.5 Вестерн блоттинг.

2.7 Анализ культуральной жидкости трансфицированных клеток.

2.8 Изучение протеасомной деградации белков и их стабильности.

2.9 Иммунофлюоресценция.

2.9.1 Анализ скорости деградации АФП с помощью иммунофлюоресценции.

2.9.2 Двойная иммунофлюоресценция.

2.10 Получение модели перевиваемой гепатомы.

2.11 Иммуногистохимия.

2.12 Получение новых клеточных линий.

2.13 Иммунизация мышей ДНК-вакцинами.

2.14 Компьютерные программы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Эксперименты in vitro.

3.1.1 Дизайн и создание ДНК-вакцин.

3.1.2 Анализ экспрессии рекомбинантных белков в трансфицированных клетках.

3.1.3 Анализ секреции рекомбинантных белков из трансфицированных клеток.

3.1.4 Анализ олигомеризации рекомбинантных белков в клетках.

3.1.5 Анализ периода полураспада рекомбинантных белков в клетках

3.1.6 Анализ эффективности протеасомной деградации рекомбинантных белков.

3.1.7 Локализация рекомбинантных белков в трансфицированных клетках.

3.1.8 AFPODCsignal накапливается в Эндоплазматическом Ретикулуме (ЭПР).

3.1.9 Создание векторов pAAFPCAG и pAAFPLCAG.

3.1.10 Анализ вероятных изменений структуры С-концевых областей модифицированых белков pAAFPCAG и pAAFPLCAG.

3.1.11 Введение ключевых аминокислот дегрона ОДК на С-конец AAFP не влияет на скорость его деградации.

3.2 Эксперименты in vivo.

3.2.1 Создание модели перевиваемой гепатомы у мышей линии C57BL/6.

3.2.1.1 Определение оптимального количества вводимых клеток Нера 1-6, вводимых животным.

3.2.1.2 Самцы линии C57BL/6 сильнее подвержены развитию опухоли после перевивки клеток Нера 1-6, чем самки.

3.2.1.3 Клетки образовавшихся у животных опухолей активно экспрессируют АФП.

3.2.2 Иммунизированные мыши эффективно вырабатывают антитела против АФП.

3.2.3 ДНК вакцинация полученными конструкциями не способствует регрессии или замедлению роста опухоли в терапевтическом эксперименте.

3.2.4 Предварительная вакцинация мышей pAAFPODCsignal способствует значительному замедлению роста опухоли у животных.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

5. ВЫВОДЫ.

6. БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка прототипа ДНК-вакцины для иммунотерапии гепатоцеллюлярной карциномы"

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) - наиболее распространенная первичная злокачественная опухоль печени. Частота появления ГЦК в России составляет 1-5 случаев на 100000 населения в год, однако, при наличии у больных цирроза печени и у носителей вирусов гепатитов В и С, риск развития гепатомы резко возрастает.

К современным методам лечения ГЦК относятся: резекция, трансплантация печени, транс артериальная химоэмболизация, гормональная терапия, криохирургия. К сожалению, ни один из вышеупомянутых методов не является достаточно эффективным, особенно на поздних стадиях заболевания. В этой связи, выявление новых подходов для профилактики и лечения больных остается крайне актуальным.

Характерной особенностью большинства ГЦК является активная экспрессия клетками опухоли альфа-фетопротеина (АФП). АФП - белок, который в норме активно синтезируется только в период внутреутробного развития плода [1]. Таким образом, будучи онко-фетальным белком АФП может служить маркером ГЦК и мишенью для противоопухолевой терапии. При этом создание вакцины против ГЦК на основе АФП представляется наиболее перспективным подходом. Важно отметить, что стандартные методики вакцинации в случае противоопухолевой терапии, как правило, оказываются не достаточно эффективными ввиду того, что в результате иммунизации наблюдается стимуляция гуморального (Тх2) иммунного ответа при этом не происходит специфической активации С08+ Т-лимфоцитов способных разрушать опухолевую ткань. Поэтому результаты экспериментов по вакцинации больных ГЦК пептидами АФП не принесли ожидаемых результатов.

Одним из подходов к решению этой проблемы может быть создание ДНК-вакцины, кодирующей АФП. Важно отметить, что для стимуляции клеточного (Тх1) иммунного ответа необходимо также обеспечить протеасомную деградацию рекомбинантного белка. В течение последних 10 лет в ряде стран, но не в России, был продемонстрирован эффект усиления клеточного иммунного ответа против АФП при использовании ДНК-вакцин кодирующих АФП и производные [2-5]. Однако, в этих работах искусственного полноценного направления химерных белков на деградацию в протеасоме обеспечено не было. Интересно отметить, что одним из механизмов обеспечения протеасомной деградации рекомбинантных белков может быть создание векторов кодирующих химерный белок: сам белок-антиген с соклонированной к его С-концу орнитин декарбоксилазой или ее частью.

Орнитин декарбоксилаза (ОДК) - короткоживущий регуляторный белок млекопитающих, играющий значительную роль в клеточном цикле полиаминов. Выполнив свою функцию, ОДК быстро деградирует в протеасоме по убиквитин независимому пути. При этом, быстрая направленная протеасомная деградация ОДК обеспечивается наличием на С-конце белка 37 аминокислот известных как деградационный сигнал. Недавно нами было показано смещение иммунного ответа против обратной транскриптазы ВИЧ-1, в сторону Тх1 ответа. При этом была использована ДНК-вакцина, кодирующая ген обратной транскриптазы с соклонированным геном одк, а также для уменьшения вероятности возникновения аутоиммунных реакций, сигнальной (деградационной) последовательностью одк [6].

Целью данной работы является применение этого подхода для обеспечения стимуляции специфического клеточного (Txl) иммунного ответа против альфа-фетопротеин (АФП) экспрессирующих клеток - клеток гепатомы, т.е. попытка создания вакцины против ГЦК. Задачей данной работы было создание серии ДНК-вакцин, кодирующих АФП мышей и деградационный сигнал ОДК, а также оценка их протективных и лечебных свойств in vitro и in vivo.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Первичные злокачественные опухоли печени

Первичные опухоли печени (гепатомы) составляют до 3% злокачественных новообразований в печени; остальные случаи возникновения опухоли этого органа представляют собой метастазы злокачественных новообразований другой локализации [7]. Среди первичных опухолей печени диагностируются несколько форм, отличающихся по своим проявлениям и этиологии.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Морозов, Алексей Владимирович

5. ВЫВОДЫ

2) Введение ключевых аминокислот дегрона орнитин декарбоксилазы на С-конец AAFP не влияет на скорость его деградации.

3) Создана перевиваемая модель гепатомы на мышах линии C57BL/6.

6. БЛАГОДАРНОСТИ

В первую очередь я хотел бы выразить глубокую признательность моему руководителю д.б.н. профессору Карпову Вадиму Львовичу, за поддержку, всестороннюю помощь в работе и организации проведения исследований, за ценные советы и комментарии, за понимание и терпение, а главное за веру в положительный исход этой работы.

Кроме того, мне хочется поблагодарить целый ряд высококлассных профессионалов в разных областях науки, помогавших мне.

В первую очередь я хотел бы поблагодарить моего папу д.б.н. Морозова Владимира Алексеевича, который несмотря на некоторые черты моего характера, нерасполагающие к этому, ценой больших усилий и огромных затрат времени заложил фундамент меня как самостоятельного ученого и привил мне основные навыки работы в лаборатории. При этом, благодаря его усилиям я приобрел умение правильно мыслить, планировать эксперимент и интерпретировать полученные результаты. Его вмешательство неоднократно обеспечивало успешное решение многих сложных вопросов и во много раз ускоряло продвижение работ.

Я также хотел бы от души поблагодарить к.б.н. Астахову Татьяну Михайловну за неоценимую помощь во всех без исключения экспериментах на животных, за поддержку в трудные минуты, когда в процессе экспериментов возникали сложные ситуации, требующие неординарного разрешения; за многочасовые дискуссии о роли АФП в организме, в опухолях и в моей работе, и конечно за помощь на заключительном этапе подготовки диссертации.

Я также очень признателен д.б.н. Тимофееву Андрею Викторовичу за большую помощь на начальном этапе работы, интересные дискуссии и активное вовлечение меня в изучение АФП. Кроме того, я хотел бы поблагодарить д.б.н. Борисову Татьяну Константиновну за плодотворное сотрудничество и большую помощь в изучении иммунного ответа у животных, вызванного ДНК-вакцинацией. Я также очень хотел бы высказать слова благодарности д. Иохиму Деннеру за предоставленные мне возможности делать часть работы в его лаборатории в Институте Роберта Коха и многочисленные полезные обсуждения. Я хотел бы также сказать спасибо д. Робину Вайсу назвавшего меня однажды: «Морозов младший», что определило мой дальнейший жизненный путь. И конечно д. Роберту Галло за предоставленную возможность учиться и работать в Институте Вирусологии Человека и замечательный бейсбольный матч, в котором, не смотря на поражение «Ориолов», я понял, как надо болеть и как надо работать, чтобы достигать поставленных целей. Я хочу также поблагодарить Карпову Ярославу за ее время, потраченное на обучение меня методам иммуногистохимии, интересные советы и предложения. И выразить признательность Бульдяевой Тамаре Васильевне, Люпиной Юлии Вячеславовне, Гореловой Вере Сергеевне, Абатуровой Светлане Борисовне и Столярову Сергею Дмитриевичу за теплый прием и доброжелательное отношение.

В заключении, я хотел бы выразить слова благодарности коллективу лаборатории структуры и функции хроматина Института Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, а также коллективу Р13 Института Роберта Коха за дельные советы, хорошее отношение и готовность помочь. Кроме того я очень признателен коллективу вивария Института Биологии Развития им. Н.К. Кольцова РАН, и в частности его заведующему Подмареву Виктору Ивановичу за то, что он всегда шел нам навстречу. Наконец я также очень благодарен д.б.н. Прасолову Владимиру Сергеевичу за помощь в организации работы в клеточном блоке лаборатории биологии клетки Института Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Все высказанные благодарности были бы неполными без слов признательности моей маме Морозовой Любови Александровне поддерживавшей меня на всем этом трудном пути и возвращавшей мне веру в себя в минуты, когда в силу разных обстоятельств мне было непросто ее сохранять.

Посвящается памяти Морозова Алексея Ивановича (1928-2009).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Морозов, Алексей Владимирович, Москва

1. Blair J.1., Carachi R., Gupta R., Sim F.G., McAllister E.J., Weston R. "Plasma alpha fetoprotein reference ranges in infancy: effect of prematurity." (1987). Arch. Dis. Child. 62 (4): 362-369.

2. Tian G., Yi J., Xiong P., "Specific cellular immunity and antitumor responses in C57BL/6 mice induced by DNA vaccine encoding murine AFP" (2004) Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 3(3):440-443.

3. Wang X.P., Liu G., Song A., Li H.Y., Liu Y. "Antitumor immunity induced by DNA vaccine encoding alpha-fetoprotein/heat shock protein 70" (2004) World J. Gastroenterol. 10(21):3197-3200.

4. Lan Y., Li Y., Liang Z., Chen M., Peng M-L., Tang L., Ни H., Ren H. "A DNA vaccine against chimeric AFP enhanced by HSP70 suppresses growth of hepatocellular carcinoma" (2007) Cancer Immunol. Immunother. 56:1009-1016.

5. Kumar V., Fausto N., Abbas A. (editors). Robbins & Cotran Pathologic Basis of Disease (2003) (7th ed.). Saunders, p. 914-917.8. "Cancer". World Health Organization. February (2006).

6. Lai C.I., Lau J.Y.N., Wu P.C., Hui W.M., Lai E.S.C., Fan S.T., Ngan H., Lin H.J. "Subclinical hepatocellular carcinoma in Hong Kong Chinese". (1992) Oncology 49:347-53.

7. Lai C.L., Lam K.C., Wong K.P., Wu P.C., Todd D. "Clinical features of hepatocellular carcinoma: review of 211 patients in Hong Kong". (1981) Cancer 47:2746-2755.

8. Caselmann W.H. "Transactivation of cellular gene expression by hepatitis B viral proteins: possible molecular mechanism of hepatocarcinogenesis". (1995) J. Hepatol 22(Suppl 1): 34-37.

9. Twu J.S., Lai M.Y., Chen D.S., Robinson W.S. "Activation of protooncogene c-jun by the X protein of hepatitis B virus". (1993) Virology, 192(1): 346-350.

10. Yuen M.F., Wu P.C., Lai V.C.H., Lau J.Y.N., Lai C.L. "Expression of c-Myc, c-Fos and c-Jun in Hepatocellular carcinoma". (2001) Cancer, 91:106-112.

11. Gong G., Waris G., Tanveer R., Siddiqui A. "Human hepatitis C virus NS5A protein alters intracellular calcium levels, induces oxidative stress, and activates STAT-3 and NFkappa B". (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 98: 9599-9604.

12. Waris G., Huh K.W., Siddiqui A. "Mitochondrially associated hepatitis B virus X protein constitutively activates transcription factors STAT-3 and NF-kappa B via oxidative stress". (2001) Mol. Cell Biol. 21: 7721-7730.

13. Waris G., Turkson J., Hassanein T., Siddiqui A. "Hepatitis C virus (HCV) constitutively activates STAT-3 via oxidative stress: role of STAT-3 in HCV replication". (2005) J. Virol 79:1569-1580.

14. Bressac B., Kew M., Wands J., Ozturk M. "Selective G to T mutations of p53 gene in hepatocellular carcinoma from southern Africa". (1991) Nature 350:429-431.

15. Hsu I.C., Metcalf R.A., Sun T., Welsh J.A., Wang N.J., Harris C.C. "Mutational hotspot in the p53 gene in human hepatocellular carcinomas". (1991) Nature 350:427-428.

16. Morgan T.R, Mandayam S., Jamal M.M. "Alcohol and hepatocellular carcinoma". (2004) Gastroenterology 127(5):S87-S96.

17. Lee S., Lee H.J., Kim J.H., Lee H.S., Jang J.J., Kang G.H. "Aberrant CpG island hypermutation along multistep hepatocancerogenisis". (2003) Am. J. Pathol 163:13711378.

18. Татаринов Ю.С. „Обнаружение эмбриоспецифического а-глобулина в сыворотке крови больного первичным раком печени". (1964). Вопр. мед. химии 1:90-91.

19. Abelev G.I., Assecritova I.V., Kraevsky N.A., Perova S.D., Perevodchikova N.I. «Embryonal serum a-globulin in cancer patients diagnostic value» (1967) Int. J. of Cancer 2:551-558.

20. Abelev G.I. «Alpha-fetoprotein in ontogenesis and its association with malignant tumors». (1971) Adv. Cancer Res. 14:295-358.

21. Abelev G.I. «а-Fetoprotein as a marker of embryo-specific differentiations in normal and tumor tissues». (1974) Transplant. Rev. 20:3-37.

22. Ruoslahti E., Seppala M. «Alpha-Fetoprotein in cancer and fetal development» (1979) Adv. Cancer. Res. 29:276-346.

23. Tamaoki Т., Muira K., Lin Т., Banks P. «Oncodevelopmental Gene Expression (Fishman WH and Sell S)» (1976) Academic Press, New York pi 15-122.

24. Sala-Trepat J.M., Dever J., Sargent T.D., Thomas K., Sell S., Bonner J. «Changes in expression of albumin and alpha-fetoprotein genes during rat liver development and neoplasia» (1979) Biochemistry 18:2167-2178.

25. Sell S., Becker F.F., Leffert H.L., Watabe H. «Expression of an oncodevelopmental gene product (alpha-fetoprotein) during fetal development and adult oncogenesis». (1976) Cancer Res. 36:4239-4249.

26. Bergstad C.G., Czar B. «Demonstration of a new protein fraction in serum from the human fetus». (1956) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 8:174-179.

27. Абелев Г. И., Авенирова 3. А. «Выделение преципитирующих антител к специфическим антигенам печени и гепатомы мышей». (1960) Вопр. онкологии. 6 (6): 57- 62.

28. Абелев Г. И., Цветков В. С. «Выделение специфического антигена перевивной гепатомы мышей методом иммунофильтрации». (1960) Вопр. онкологии. 6(6): 6272.

29. Mizejewski G.J. «Alpha-fetoprotein structure and function: relevance to isoforms, epitopes and conformational variants». (2001) Exp. Biol. Med. 226(5):377-408.

30. Godbout R., Ingram R.S., Tilghman S.M. «Fine-structure mapping of the three mouse alpha-fetoprotein gene enhancers». (1988) Mol. Cell. Biol. 8:1169-1178.

31. Wen P., Group E.P., Buzard G., Crawford N., Locker J. «Enhancer, repressor, and promoter specificities combine to regulate the rat alpha-fetoprotein gene». (1991) DNA cell Biol. 10:525-536.

32. Mathew J.K., Knoll B.J., Pilla A., Durham D., Sell S. «Discrete cell-type specific enhancer region 5' of the rat alpha-fetoprotein gene: identification of a highly active distal enhancer». (1994) J. Tumor Marker Oncol. 9:21-28.

33. Groupp E.R., Crawford N., Locker J. «Characterization of the distal alpha-fetoprotein enhancer, a strong, long distance, liver-specific activator». (1994) J. Biol. Chem. 269: 22178-22187.

34. Vacher J., Tilghman SM. «Dominant negative regulation of the mouse alpha fetoprotein gene in liver». (1990) Science 235:53-58.

35. Abelev G. I., Lazarevich N. L. «Alpha-Fetoprotein: Solved and Unsolved Problems. Review». (1996) McGill Journal Med. 2(2): 127-134.

36. Lazarevich N.L. «Molecular mechanisms of Alpha-fetoprotein gene expression». (2000) Biochemistry 65(1): 117-133.

37. Feuerman M.H., Godbout R., Ingram R.S., Tilghman S.M. «Tissue-specific transcription of the mouse alpha-fetoprotein gene promoter is dependent on HNF-1». (1989) Mol. Cell. Biol. 9:4204-4212.

38. Wen P., Locker J. «A novel hepatocytic transcription factor that binds the alpha-fetoprotein promoter-linked coupling element». (1994) Mol. Cell. Biol. 14:6616-6626.

39. Bois-Joyeux В., Danan J.L. «Members of CAAT/enhaneer-binding protein, hepatocyte nuclear factor-1 and nuclear factor-1 can differentially modulate the activities of rat alpha-fetoprotein promoter and enhancer». (1994) Biochem. J. 301:49-55.

40. Глейберман А. С., Храмкова H. И., Белошапкина Т. Д. «Структура печени как возможный фактор регуляции синтеза а-фетопротеина». (1979) Бюл. эксперим. биологии и медицины. 6:576-579.

41. Gleiberman A. S., Kuprina-Khramkova N. I., Rudinskaya-Beloshapkina Т. D., Abelev G. I. «Alpha-fetoprotein synthesis in relation to structural peculiarities in postnatal and regenerating mouse liver». (1983) Int. J. Cancer. 32:85-92.

42. Глейберман А. С. «Синтез альфа-фетопротеина в первичных культурах гепатоцитов взрослых мышей». (1982) Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1:5558.

43. Gleiberman A.S., Kudrjavtseva E.I., Sharovskaya Yu.Yu., and Abelev G.I. «Synthesis of alpha-fetoprotein in hepatocytes is co-ordinately regulated with cell-cell and cellmatrix interactions». (1989) Мої. Biol. Med. 6(2):95-107.

44. Kudryavtseva E.I, Engelhardt N.V. «Requirement of 3D extracellular network for maintenance of mature hepatocyte morphology and suppression of alpha-fetoprotein synthesis in vitro». (2003) Immunol. Lett. 90(1):25-31.

45. Andres O.K., Dziadek M., Tamaoki T. «Expression of methylation of the mouse alpha-fetoprotein gene in embryonic, adult, and neoplastic tissue». (1982) J. Biol. Chem. 257:5148-5153.

46. Miura K., Law S.W.T., Nishi S., Tamaoki T. «Isolation of alphafetoprotein messenger RNA from mouse yolk sac». (1979) J. Biol. Chem. 254:5515-5521.

47. Hammer R.E., Krumlauf R., Camper S.A., Brinster R.I., Tighman S.M. «Diversity of alpha-fetoprotein gene expression in mice is generated by a combination of separate enhancer elements». (1987) Science 235:53-58.

48. Tamaoki T., Fausto N. «Expression of the alpha-fetoprotein gene during development, regeneration, and carcinogenesis In: Stein G, Stein J, Eds. Recombinant DNA and Cell Proliferation». (1984) New York: Academic Press, pl45—168.

49. Petropoulos C., Andrews G., Tamaoki T., Fausto N. Alpha-fetoprotein and mRNA levels in liver regeneration and carcinogenesis. (1983) J. Biol. Chem. 258:4901-4906.

50. Chou J.Y, Savitz A.J. «AFP synthesis in transformed fetal rat liver cells». (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 135:844—851.

51. Chou J.Y., Ito F., Evans G., Chiu F.J., Feldman M. «Alpha-fetoprotein biosynthesis and hepatocellular differentiation». (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 108:15241530.

52. Lemire J.M., Fausto N. «Multiple alpha-fetoprotein RNAs in adult rat liver: Cell type-specific expression and differential regulation». (1991) Cancer Res. 51:4656-4664.

53. Wan Y.J.V, Chou J.Y. «Expression of the AFP gene in adult rat liver». (1989) Arch. Biochem. Biophys. 270:267-276.

54. Watanabe T., Jimenez-Molina J.J., Chou J.Y. «Characterization of a rat variant alpha-fetoprotein». (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 185:648-656.

55. Wan Y.J.Y., Jimenez-Molina J.J., Chou J.Y. «Fetal and variant AFPs are encoded by mRNAs that differ in sequence at the 5' end». (1988) Biochemistry 27:7269-7276.

56. Morinaga T., Sakai M., Wegmann T.G., Tomaoki T. «AFP messenger RNA in human embryonal carcinoma grown in nude mice and cloning of its complementary DNA». (1982) Oncodev. Biol. Med. 3:301-313.

57. Smalley J.R, Sarcione E.J. «Synthesis of alpha-fetoprotein by immature rat uterus». (1980) Biochem. Biophys. Res. Commun. 92:1429-1434.

58. Sarcione E.J, Zlotty M., Delluomo D.S., Mizejewski G.J., Jacobson H.I. «Detection and measurement of alpha-fetoprotein in human breast cancer cytosol after treatment with 0.4 M potassium chloride». (1983) Cancer Res. 43:3739-3741.

59. Sarcione E.J., Hart D. «Biosynthesis of alpha-fetoprotein by MCF-7 human breast cancer cell». (1985) Int. J. Cancer 35:315-318.

60. Seal W., Hanstein B., Brown M., Moore D.D. «Inhibition of estrogen receptor action by the orphan receptor SHP (short heterodimer partner)». (1998) Mol. Endocrinol. 12:1551-1557.

61. Resnick E.M., Schreihofer D.A., Periasamy A., Shupnik, M.A. «Truncated estrogen receptor product-1 suppresses estrogen receptor transactivation by dimerization with estrogen receptors a and p». (2000) J. Biol. Chem. 275:7158-7166.

62. Mizejewski G.J. «An apparent dimerization motif in the third domain of alpha-fetoprotein: Molecular mimicry of the steroid/thyroid nuclear receptor superfamily». (1993) Bioessays 15:427^132.

63. McLeod J.F., Cooke N.E. «The vitamin D-binding protein, alpha-fetoprotein, albumin multigene family:Detection of transcripts in multiply tissues». (1989) J. Biol. Chem. 264:21760-21769.

64. Naidu S., Peterson M.L., Spear B.T. «Alpha-fetoprotein related gene (ARG): a new member of the albumin gene family that is no longer functional in primates». (2010) Gene 449(l-2):95-102.

65. Carter D.C., He X.M. «Structure of human serum albumin». (1990) Science 249:302304.

66. Lufit A.J., Lorscheider F.L. «Structural analysis of human and bovine alpha-fetoprotein by election microscopy, image processing, and circular dichroism». (1983) Biochemistry 22:5978-5981.

67. Mizejewski G.J. «The phylogeny of alpha-fetoprotein in vertebrates: Survey of biochemical and physiological data». (1995) Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 5:281316.

68. Mizejewski G.J. «Alpha-fetoprotein as a biologic response modifier: Relevance to domain and subdomain structure». (1997) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 215:333-362.

69. Dudich I., Tokhtamysheva N., Semenkova L., Dudich E., Hellman J., Korpela T. «Isolation and structural and functional characterization of the two stable peptide fragments of human alpha-fetoprotein». (1999) Biochemistry 38:10406-10414.

70. Mizejewski G.J. «New insights into AFP structure and function: Potential biomedical applications». In: Mizejewski G.J. Porter I.H, Eds. «Alpha-Fetoprotein and Congenital Disorders». (1985) Orlando: Academic Press, p5-34.

71. Deutsch H.F. «Chemistry and biology of a-fetoprotein». (1991) Adv. Cancer Res. 56:253-312.

72. Энгельгардт H. В. «Синтез белков плазмы крови и альфа-фетопротеина в онтогенезе. Иммунологические аспекты биологии развития» Под ред. Н. Г. Хрущова. М. (1984): Наука С. 92.

73. Bakker J., De Mees C., Douhard Q., Balthazart J., Gabant P., Szpirer J., Szpirer C.« Alpha-fetoprotein protects the developing female mouse brain from masculinization and defeminization by estrogens». (2006) Nat. Neurosci. 9(2):220-226.

74. Murgita R.A., Tomasi T.B. «Suppression of the immune response by a-fetoprotein». (1975) J. Exp. Med. 141:269-286.

75. Semeniuk D.J., Boismenu R., Tam J., Weissenhofer W., Murgita R.A. «Evidence that immunosuppression is an intrinsic property of the alpha-fetoprotein molecule». (1995) Adv. Exp. Med. Biol. 383:25-269.

76. Toder V., Blank M., Nebel L. «Immunoregulatory mechanisms in pregnancy. Evidence for the alpha-fetoprotein-induced generation of suppressor cells in vitro». (1982) Transplantation 33( 1 ):9741 -9744.

77. Peck A.B., Murgita R.A., Wigze U.H. «Cellular and genetic restrictions in the immunoregulatory activity of AFP. II. AFP-induced supression of cytotoxic T-lymphocyte development» (1978) J. Exp. Med. 148(2):360-372.

78. Czokalo M., Wisniewski L. «Culture conditions modify the effects exerted by human fetal АФП on some lymphocyte functions in vitro». (1981) Exp.Pathol. 20(4):233-238.

79. Um S.H., Mulhall C., Alisa A., Ives AR, Karani J, Williams R, Bertoletti A, Behboudi S. Alpha-fetoprotein impairs APC function and induces their apoptosis (2004) J. Immunol. 173(3)1772-1778.

80. Murgita R.A., Goidl E.A., Kontianen S., Wigze U.H. «Alpha-Fetoprotein induces suppressor T cells in vitro». (1977) Nature 267(5608):257-259.

81. Aussel C., Masseyeff R. «Alpha-foetoprotein and oestrogen metabolism. I. Influence of alpha-foetoprotein on the metabolism of steroids by rat liver microsomes in vitro» (1976) Biochimie 58(6):737-741.

82. Aussel C., Fehlmann M «Effect of alpha-fetoprotein and indomethacin on arachidonic acid metabolism in P388D1 macrophages: role of leukotrienes». (1987) Prostaglandins Leukot. Med. 28(3):325-336.

83. Wang W., Alpert E. «Downregulation of forbol 12-myristate 13-acetate-induced TNF-alpha and IL-l-beta production and gene expression in human monocytic cells by human alpha-fetoprotein» (1995) Hepatology 22(3):921-928.

84. Cardoso E., Valdez G., Comini E., Matera L. «Effect of human A<DII on native and in vitro-stimulated NK activity» (1991) Clin. Lab. Immunol. 34(4):183-188.

85. Cohen B.L, Orn A, Gronvik K.O., Gidlund M., Wigzell H., Murgita R.A. «Suppression by alpha-fetoprotein of murine natural killer cell activity stimulated invitro and in vivo by interferon and interleukin 2». (1986) Scand. J. Immunol. 23(2):211-223.

86. Martinez J., Potier P. «Peptide hormones as prohormones». (1986) Trends Pharmacol. Sci. 7:139-147.

87. Campbell I.D, Bork P. «Epidermal growth factor-like modules». (1993) Curr. Opin. Struct. Biol 3:385-392.

88. Thim L, Moody A.J. «The primary structure of porcine glicentin (proglucagon)». (1981) Regul. Pept. 2:139-150.

89. Ohno S. «Many peptide fragments of alien antigens are homologous with host proteins, thus canalizing T-cell responses». (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3065-3068.

90. Mizejewski G.J. «Mechanism of cancer growth suppresion of alpha-fetoprotein derived growth inhibitory peptides (GIP): comparison of GIP34 versus GIP8 (AOIlep). Updates and prospects». (2011) Cancers 3:2709-2733.

91. Mizejewski G.J. «Biological role of alpha-fetoprotein in cancer: prospects for anticancer therapy». (2002) Expert Rev. Anticancer Ther. 2:89-115.

92. Dudich E., Semenhova L., Gorbatova E., Dudich I., Khromykh L., Tatulov E., Grechko G., Sukhikh G. Growth-regulative activity of human alpha-fetoprotein for different types of tumor and normal cells. (1998) Tumor Biol. 19(l):30-40.

93. Yang X., Zhang Y., Zhang L., Zhang L., Mao J. «Silencing alpha-fetoprotein expression induces growth arrest and apoptosis in human hepatocellular cancer cell». (2008) Cancer letters 271:281-293.

94. Li M.S., Li P.F., He S.P., Du G.G., Li G. «The promoting molecular mechanism of alpha-fetoprotein on the growth of human hepatoma Bel7402 cell line». (2002) W. J. Gastroenterol. 8(3):469-475.

95. Leal J.A., Gangrade B.K., Kiser J.L., May J.V., Keel B.A. «Human mammary tumor cell proliferation: primary role of platelet-derived growth factor and possible synergism with human alpha-fetoprotein». (1991) Steroids 56:247-251.

96. Keel B.A., Eddy K.B., Cho S. «Synergistic action of purified alpha-fetoprotein and growth factors on the proliferation of porcine granulosa cells in monolayer culture». (1991) Endocrinology 129:217-225.

97. Yano H., Basaki Y., Oie S. Effects of IFN-alpha on alpha-fetoprotein expressions in hepatocellular carcinoma cells. (2007) J. Interferon Cytokine Res. 27:231-238.

98. Dudich E., Semenkova L., Dudich I., Denesyuk A., Tatulov E., Korpela T. «Alpha-fetoprotein antagonizes X-linked inhibitor of apoptosis protein anticaspase activity and disrupts XIAP-caspase interaction». (2006) FEBSJ. 273(16):3837-3849.

99. Torres J.M., Carracq N., Uriel J. «Membrane proteins from lymphoblastoid cells showing cross-affinity for alpha-fetoprotein and albumin. Isolation and characterization». (1992) Biochem. Biophys. Acta 1159:60-66.

100. Suzuki Y., Zeng C.Q.Y., Alpert E. «Isolation and characterization of a specific alpha-fetoprotein receptor on human monocytes». (1992) J. Clin. Invest. 90:1530-1536.

101. Naval J., Villacampa M.J., Goguel A.F., Uriel J. Cell type-specific receptors for AOn in a mouse T-lymphoma cell line. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:33013304.

102. Moro R., Tamaoki T., Wegmann T.G., Longnecker B.M., Laderoute M.P. «Monoclonal antibodies directed against a widespread oncofetal antigen: The alpha-fetoprotein receptor». (1993) Tumor Biol. 14:116-130.

103. Alava M.A, Sturralde M., Lampreave F., Pineiro A. «Specific uptake of alpha-fetoprotein and albumin by rat Morris 777 Hepatoma cells». (1999) Tumor Biol. 20:5264.

104. Tsuboi S., Taketa K., Nouso K., Fujikawa T., Manabe K., Ohmori H., Higashi T., Shiratori Y. «High level of expression of alpha-fetoprotein receptor in gastric cancers». (2006) Tumor Biol. 27:283-288.

105. Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C., Lampreave F., Uriel J. «Alpha-fetoprotein receptors in a human breast cancer cell line». (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 122:1322—1327.

106. Mizejewski G.J. «Review of the putative cell-surface receptors for alpha-fetoprotein: identification of a candidate receptor protein family» (2011) Tumor Biol. 32:241-258.

107. Illmensee K. and Mintz B. «Totipotency and normal differentiation of single teratocarcinoma cells cloned by injection into blastocysts». (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73(2):549-553.

108. Абелев Г. И. «Эмбриональный сывороточный а-глобулин при злокачественных опухолях». (1970) Вестн. АМН СССР. 7:49-57.

109. Абелев Г.И. «Альфа-фетопротеин: Биология, биохимия, молекулярная генетика». (1994) Иммунология 3:4-9.

110. Elgort, D.A. and Abelev, G.I., «Immunoautoradiographic Assay of a-Fetoproteins of Animals and Humans». (1971) Byull. Eksp. Biol. Med. 2:118-120.

111. Abelev GI and Eraiser TL. Cellular aspects of alpha-fetoprotein reexpression in tumors. (1999) Seminars in Cancer Biology 9(2):95-107.

112. Кудрявцева E. И., Морозова О. В., Рудинская Т. Д., Энгельгардт Н. В. Нарушение межклеточных контактов и взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом в быстрорастущей гепатокарциноме мышей (2001) Арх. патологии. 4:33-37.

113. Lee Н.С., Kim М., Wands J.R. «Wnt/Frizzled signaling in hepatocellular carcinoma». (2006) Front. Biosci. 11:1901-1915.

114. Thompson M.D., Monga S.P. WNT/beta-catenin signaling in liver health and disease. (2007) Hepatology 45(5): 1298-1305.

115. Thompson MD, Wickline ED, Bowen WB, Lu A, Singh S, Misse A, Monga SP. Spontaneous repopulation of (3-catenin null livers with P-catenin-positive hepatocytes after chronic murine liver injury. (2011) Hepatology находится в печати.

116. Zeng G., Apte U., Micsenyi A., Bell A., Monga S.P. «Tyrosine residues 654 and 670 in beta-catenin are crucial in regulation of Met-beta-catenin interactions». (2006) Exp. Cell. Res. 312:3620-3630.

117. Lee, К. C., Crowe, A. J., and Barton, M. C. «p53-mediated repression of alpha-fetoprotein gene expression by specific DNA binding». (1999) Mol. Cell. Biol., 19:1279-1288.

118. Hussain SP, Schwank J, Staib F, Wang XW, Harris CC. TP53 mutations and hepatocellular carcinoma: insights into the etiology and pathogenesis of liver cancer. (2007) Oncogene 26(15):2166-2176.

119. Bei R., Mizejewski G.J. «Alpha fetoprotein is more than hepatocellular cancer biomarker: from spontaneous immune response in cancer patients to the development of an AFP-based cancer vaccine». (2011) Current Mol. Med. 11(7) находится в печати.

120. Hogquist К.A., Baldwin Т.A., Jameson S.C. «Central tolerance: learning self-control in the thymus». (2005) Nat. Rev. Immunol. 5:772-782.

121. Toubi E., Shoenfeld Y. «Protective autoimmunity in cancer» (review). (2007) Oncol. Rep. 17: 245-51.

122. Livingston P.O., Ragupathi G., Musselli C. «Autoimmune and antitumor consequences of antibodies against antigens shared by normal and malignant tissues». (2000) J. Clin. Immunol. 20:85-93.

123. Bei R., Masuelli L., Palumbo C., Modesti M., Modesti А. «А common repertoire of autoantibodies is shared by cancer and autoimmune disease patients: Inflammation in their induction and impact on tumor growth». (2009) Cancer Lett. 281: 8-23.

124. Mizejewski G.J. «Alpha-fetoprotein (AFP)-derived peptides as epitopes for hepatoma immunotherapy: a commentary». (2009) Cancer Immunol. Immunother. 58: 159-170.

125. Butterfield L.H., Ribas A., Potter D.M., Economou J.S. «Spontaneous and vaccine induced AFP-specific T cell phenotypes in subjects with AFP-positive hepatocellular cancer». (2007) Cancer Immunol. Immunother. 56:1931-1943.

126. Behboudi S., Boswell S., Williams R. «Cell-mediated immune responses to alpha-fetoprotein and other antigens in hepatocellular carcinoma». (2010) Liver Int. 30: 521-526.

127. Nakata K., Muro T., Furukawa R., Kono K., Kusumoto Y., Ishii N., Munehisa T., Koji T., Nagataki S. «Presence of immunoglobulin G in human sera binding to alphafetoprotein» (1983) Oncodev. Biol. Med. 4:C101-104.

128. Asano T., Yamada N., Ochiai T., Sato H., Fukao T. «Presence of anti-AFP-antibody producing B cells in peripheral blood lymphocyte of hepatocellular carcinoma patient». (1984) Nippon Shokakibyo Gakkai Zasshi 81:278.

129. Butterfield L.H., Meng W.S., Koh A., Vollmer C.M., Ribas A., Dissette V.B., Faull K., Glaspy J.A., McBride W.H., Economou J.S. «T cell responses to HLA

130. A*0201-restricted peptides derived from human alpha-fetoprotein». (2001) J. Immunol. 166:5300-5308.

131. Liu Y., Daley S., Evdokimova V.N., Zdobinski D.D., Potter D.M., Butterfield L.H. «Hierarchy of alpha fetoprotein (AFP)-specific T cell responses in subjects with AOn-positive hepatocellular cancer». (2006) J. Immunol. 177:712-772.

132. Mizukoshi E., Nakamoto Y., Tsuji H., Yamashita T., Kaneko S. «Identification of alpha-fetoprotein-derived peptides recognized by cytotoxic T lymphocytes in HLA-A24+ patients with hepatocellular carcinoma». (2006) Int. J. Cancer 118:1194-1204.

133. Alisa A., Ives A., Pathan A.A., Navarrete C.V., Williams R., Bertoletti A., Behboudi S. «Analysis of CD4+ T-Cell responses to a novel alpha-fetoprotein-derived epitope in hepatocellular carcinoma patients». (2005) Clin. Cancer Res. 11:6686-6694.

134. Evdokimova V.N., Liu Y., Potter D.M., Butterfield L.H. « AFP specific CD4+ helper T-cell responses in healthy donors and HCC patients». (2007) J. Immunother. 30:425-437.

135. Shaw D.R, Strong T.V. «DNA vaccines for cancer». (2006) Front, in Biosci. 11:1189-1198.

136. Dunn G. P., Bruce A. T., Ikeda H., Old L. J., Schreiber R. D. «Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape». (2002) Nat. Immunol. 3:991-998.

137. Wolff J. A, Malone R. W., Williams P., Chong W., Acsadi G., Jani A., Feigner P. L. «Direct gene transfer into mouse muscle in vivo». (1990) Science 247:1465-1468.

138. Hansen E., Fernandes K., Goldspink G., Butterworth P., Umeda P. K., Chang K. C. «Strong expression of foreign genes following direct injection into fish muscle». (1991) FEBS Lett. 290:73-76.

139. Jiao S., Williams P., Berg R. K., Hodgeman B. A., Liu L., Repetto G., Wolff J. A. «Direct gene transfer into nonhuman primate myofibers in vivo». (1992) Hum. Gene. Ther. 3:21-33.

140. Danko I., Wolff J. A. «Direct gene transfer into muscle». (1994) Vaccine 12:1499-1502.

141. Wolff J. A., Ludtke J. J., Acsadi G., Williams P., Jani A. «Long-term persistence of plasmid DNA and foreign gene expression in mouse muscle». (1992) Hum. Mol. Genet. 1:363-369.

142. Tang D. C., DeVit M., Johnston S. A. «Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response». (1992) Nature 356:152-154.

143. Williams R. S., Johnston S. A., Riedy M., DeVit M. J., McElligott S. G., Sanford J. C. «Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles». (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730.

144. Barry M. A., Johnston S. A. «Biological features of genetic immunization». (1997) Vaccine 15:788-1791.

145. Fynan E. F., Webster R. G., Fuller D. H., Haynes J. R., Santoro J. C., Robinson H. L. «DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations». (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482.

146. Ross H. M., Weber L. W., Wang S., Piskun G., Dyall R., Song P., Takechi Y., Nikolic-Zugic J., Houghton A. N., Lewis J. J. «Priming for T-cell-mediated rejection of established tumors by cutaneous DNA immunization». (1997) Clin. Cancer Res. 3:21912196.

147. Cui Z., Baizer L., Mumper R. J. «Intradermal immunization with novel plasmid DNA-coated nanoparticles via a needle-free injection device». (2003) J. Biotechnol 102:105-115.

148. Klenchin, V. A., Sukharev S. I., Serov S. M., Chernomordik L. V., Chizmadzhev Y. A. «Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis». (1991) Biophys. J. 60:804-811.

149. Sukharev, S. I., Klenchin V. A., Serov S. M., Chernomordik L. V., Chizmadzhev Y. A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells — the effect of DNA interaction with electropores. (1992) Biophys. J. 63:1320-1327.

150. Eriksson K., Holmgren J. «Recent advances in mucosal vaccines and adjuvants». (2002) Curr. Opin. Immunol. 14:666-672.

151. White S. A., LoBuglio A. F., Arani R. B., Pike J. F., Moore S. E., Barlow D. L., Conry R. M. «Induction of antitumor immunity by intrasplenic administration of a carcinoembryonic antigen DNA vaccine». (2000) J. Gene Med. 2:135-140.

152. Pertmer T. M., Roberts T. R., Haynes J. R. «Influenza virus nucleoprotein-speciflc immunoglobulin G subclass and cytokine responses elicited by DNA vaccination are dependent on the route of vector DNA delivery». (1996) J. Virol. 70:6119-6125.

153. Feltquate D. M., Heaney S., Webster R. G., Robinson H. L. «Different T helper cell types and antibody isotypes generated by saline and gene gun DNA immunization». (1997) J. Immunol. 158:2278-2284.

154. Coico R., Sunshine G., Benjamini E., Immunolgy: a short course. (5th edittion) (2003) Willey-Liss. P. 113-125.

155. Rammensee H.G. «Chemistry of peptides associated with MHC class I and class II molecules». (1995) Curr. Opin. Immunol. 7:85-96.

156. York I.A., Chang S.C., Saric T., Keys J.A., Favreau J.M., Goldberg A.L., Rock K.L. «The ER aminopeptidase ERAP1 enhances or limits antigen presentation by trimming epitopes to 8-9 residues». (2002) Nat. Immonol. 3:1177-1184.

157. Reits E., Neijssen J., Herberts C., Benckhuijsen W., Janssen L., Drijfhout J.W., Neefjes J. «A major role for TPPII in trimming proteasomal degradation products for MHC class I antigen presentation». (2004) Immunity 20:495-506.

158. Groll M., Ditzel L., Lowe J., Stock D., Bochtler M., Bartunik H.D., Huber R. «Structure of 20S proteasome from yeast at a 2,4A resolution». (1997) Nature 386:463471.

159. Coux O., Tanaka K., Goldberg A.L. «Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes». (1996) Annu. Rev. Biochem., 65:801-847.

160. Orlowski M. «The multicatalitic proteinase complex. A major extralysosomal proteolytic system». (1990) Biochemistry 29:10289-10297.

161. Kisselev A.F., Akopian T.N., Castillo V., Goldberg A.L. «Proteasome active sites allosterically regulate each other, suggesting a cyclical bite-chew mechanism for protein breakdown». (1999) Mol. Cell 4:395-402.

162. Bochtler M., Ditzel M., Groll M., Hartmann C. and Huber R. «The proteasome». (1999) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28:295-317.

163. Gaczynska M., Rock K.L. and Gogdberg A.L. «Gamma-interferon and expression of MHC genes regulate peptide hydrolysis by proteasomes». (1993) Nature 365:264-267.

164. Kloetzel P.M. «Antigen processing by the proteasome». (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2:179-187.

165. Rechsteiner M., Realini C. and Ustrell V. «The proteasome activator 11S REG (PA28) and class I antigen presentation». (2000) Biochem. J. 345:1-15.

166. Yewdell J.W., Bennink J.R. «Cut and trim: generating MHC class I peptide ligands». (2001) Curr. Opin. Immunol. 13:13-18.

167. Condon C., Watkins S. C., Celluzzi C. M., Thompson K., Falo L. D. «DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells». (1996) Nat. Med. 2:11221128.

168. Casares S., Inaba K., Brumeanu T. D., Steinman R. M., Bona C. A. «Antigen presentation by dendritic cells after immunization with DNA encoding a major histocompatibility complex class II-restricted viral epitope». (1997) J. Exp. Med. 186:1481-1486.

169. Doe B., Selby M., Baraett S., Baenziger J., Walker C. M. «Induction of cytotoxic T lymphocytes by intramuscular immunization with plasmid DNA is facilitated by bone marrow-derived cells». (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8578-8583.

170. Iwasaki A., Torres C. A., Ohashi P. S., Robinson H. L., Barber B. H. «The dominant role of bone marrowderived cells in CTL induction following plasmid DNA immunization at different sites». (1997) J. Immunol. 159:11-14.

171. Corr M., Damm A., Lee D. J., Tighe H. «In vivo priming by DNA injection occurs predominantly by antigen transfer». (1999) J. Immunol. 163:4721-4727.

172. Song K., Chang Y., Prud'homme G. J. «IL-12 plasmid-enhanced DNA vaccination against carcinoembryonic antigen (CEA) studied in immune-gene knockout mice». (2000) Gene Ther. 7:1527-1535.

173. Dranoff G. «Coordinated tumor immunity». (2003) J. Clin. Invest. 111:11161118.

174. Klinman D. M., Yi A. K., Beaucage S. L., Conover J., Krieg A. M. «CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma». (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2879-2883.

175. Ashkar A. A., Rosenthal K. L. «Toll-like receptor 9, CpG DNA and innate immunity». (2002) Curr. Mol. Med. 2:545-556.

176. Agrawal S., Kandimalla E. R. «Medicinal chemistry and therapeutic potential of CpG DNA». (2002) Trends Mol. Med. 8:114-121.

177. Dalpke A., Zimmermann S., Heeg K. «Immunopharmacology of CpG DNA».2002) Biol. Chem. 383:1491-1500.

178. Davila E., Velez M. G., Heppelmann C. J., Celis E. «Creating space: an antigen-independent, CpG-induced peripheral expansion of naive and memory T lymphocytes in a full T-cell compartment». (2002) Blood 100:2537-2545.

179. Zinckgraf J. W., Silbart L. K. «Modulating gene expression using DNA vaccines with different 3'-UTRs influences antibody titer, seroconversion and cytokine profiles».2003) Vaccine 21:1640-1649.

180. Hanke T., Neumann V. C., Blanchard T. J., Sweeney P., Hill A. V., Smith G. L., McMichael A. «Effective induction of HIV-specific CTL by multi-epitope using gene gun in a combined vaccination regime». (1999) Vaccine 17:589-596.

181. Smith B. F., Baker H. J., Curiel D. T., Jiang W., Conry R. M. «Humoral and cellular immune responses of dogs immunized with a nucleic acid vaccine encoding human carcinoembryonic antigen». (1998) Gene Ther. 5:865-868.

182. Ito K., Ito K., Shinohara N., Kato S. «DNA immunization via intramuscular and intradermal routes using a gene gun provides different magnitudes and durations on immune response». (2003) Mol. Immunol. 39:847-854.

183. Gregoriadis G., Bacon A., Caparros-Wanderley W., McCormack B. «A role for liposomes in genetic vaccination». (2002) Vaccine 20 Suppl 5:Bl-9.

184. Singh M., Briones M., Ott G., O'Hagan D. «Cationic microparticles: A potent delivery system for DNA vaccines». (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:811-816.

185. Drabick J. J., Glasspool-Malone J., King A., Malone R. W. «Cutaneous transfection and immune responses to intradermal nucleic acid vaccination are significantly enhanced by in vivo electropermeabilization». (2001) Mol. Ther. 3:249255.

186. Paster W., Zehetner M., Kalat M., Schuller S., Schweighoffer T. «In vivo plasmid DNA electroporation generates exceptionally high levels of epitope-specific CD8+ T-cell responses. (2003) Gene Ther. 10:717-724.

187. Hung C. F., Wu T. C. «Improving DNA vaccine potency via modification of professional antigen presenting cells». (2003) Curr. Opin. Mol. Ther. 5:20-24.

188. Hung C. F., Hsu K. F., Cheng W. F., Chai C. Y., He L., Ling M, Wu T. C. «Enhancement of DNA vaccine potency by linkage of antigen gene to a gene encoding the extracellular domain of Fms-like tyrosine kinase 3-ligand». (2001) Cancer Res. 61:1080-1088

189. Boyle J. S., Brady J. L., Lew A. M. «Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusion antigen that is directed to sites of immune induction». (1998) Nature 392:408-411.

190. Rice J., Buchan S., Stevenson F. K. «Critical components of a DNA fusion vaccine able to induce protective cytotoxic T cells against a single epitope of a tumor antigen». (2002) J. Immunol. 169:3908-3918.

191. Cid-Arregui A., Juarez V., zur Hausen H. «A synthetic E7 gene of human papillomavirus type 16 that yields enhanced expression of the protein in mammalian cells and is useful for DNA immunization studies». (2003) J. Virol. 77:4928-4937.

192. Conry R. M., Widera G., LoBuglio A. F., Fuller J. T., Moore S. E., Barlow D. L., Turner J., Yang N. S., Curiel D. T. «Selected strategies to augment polynucleotide immunization». (1996) Gene Ther. 3:67-74.

193. Irvine K. R., Rao J. B., Rosenberg S. A., Restifo N. P. «Cytokine enhancement of DNA immunization leads to effective treatment of established pulmonary metastases». (1996) J. Immunol. 156:238-245.

194. Kim J. J., Yang J. S., Dang K., Manson K.H., Weiner D. B. «Engineering enhancement of immune responses to DNA-based vaccines in a prostate cancer model in rhesus macaques through the use of cytokine adjuvants». (2001) Clin. Cancer Res. 7:882s-889s.

195. Kim J. J., Yang J. S., Dentchev T., Dang K., Weiner D. B. «Chemokine gene adjuvants can modulate immune responses induced by DNA vaccines». (2000) J. Interferon Cytokine Res. 20:487-498.

196. Kim T. W., Hung C. F., Ling M., Juang J., He L., Hardwick J. M., Kumar S., Wu T. C. «Enhancing DNA vaccine potency by coadministration of DNA encoding antiapoptotic proteins». (2003) J. Clin. Invest. 112:109-117.

197. Fong C. L., Hui K. M. «Generation of potent and specific cellular immune responses via in vivo stimulation of dendritic cells by pNGVL3-hFLex plasmid DNA and immunogenic peptides». (2002) Gene Ther. 9:1127-1138.

198. Weber L. W., Bowne W. B., Wolchok J. D., Srinivasan R., Qin J., Moroi Y., Clynes R., Song P., Lewis J. J., Houghton A. N. «Tumor immunity and autoimmunity induced by immunization with homologous DNA». (1998) J. Clin. Invest. 102:1258.1264.

199. Hawkins W. G., Gold J. S., Blachere N. E., Bowne W. B., Hoos A., Lewis J. J., Houghton A. N. «Xenogeneic DNA immunization in melanoma models for minimal residual disease». (2002) J. Surg. Res. 102:137-143.

200. Fong L., Brockstedt D., Benike C., Breen J. K., Strang G., Ruegg C. L., Engleman E. G. «Dendritic cellbased xenoantigen vaccination for prostate cancer immunotherapy». (2001) J. Immunol. 167:7150-7156.

201. Woodberry T., Gardner J., Elliott S. L., Leyrer S., Purdie D. M., Chaplin P., Suhrbier A. «Prime boost vaccination strategies: CD8 T cell numbers, protection, and Thl bias». (2003) J. Immunol. 170:2599-2604.

202. Pasquini S., Peralta S., Missiaglia E., Carta L., Lemoine N. R. «Prime-boost vaccines encoding an intracellular idiotype/GM-CSF fusion protein induce protective cellmediated immunity in murine pre-B cell leukemia». (2002) Gene Ther. 9: 503-510.

203. MacGregor R. R., Ginsberg R., Ugen K. E., Baine Y., Kang C. U., Tu X. M., Higgins T., Weiner D. B., Boyer J. D. «T-cell responses induced in normal volunteers immunized with a DNA-based vaccine containing HIV-1 env and rev». (2002) AIDS 16:2137-2143.

204. Calarota S., Bratt G., Nordlund S., Hinkula J., Leandersson A. C., Sandstrom E., Wahren B. «Cellular cytotoxic response induced by DNA vaccination in HIV-1-infected patients». (1998) Lancet 351:1320-1325.

205. Tagawa S. T., Lee P., Snively J., Boswell W., Ounpraseuth S., Lee S., Hickingbottom B., Smith J., Johnson D., Weber J.S. «Phase I study of intranodal delivery of a plasmid DNA vaccine for patients with Stage IV melanoma». (2003) Cancer 98:144-154.

206. Timmerman J. M., Levy R. «The history of the development of vaccines for the treatment of lymphoma». (2000) Clin. Lymphoma 1:129-139.

207. Kern A.D., Oliveira M.A., Coffino P., Hackert M.L. «Structure of mammalian ornithine decarboxylase at 1.6 A resolution: stereochemical implications of PLP-dependent amino acid decarboxylases». (1999) Structure 1 (5):567—581.

208. Tabor C.W., Tabor H. «Polyamines». (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:749-790.

209. McCann P.P., Pegg A.E. «Ornithine decarboxylase as an enzyme target for therapy». (1992) Pharmacol. Ther. 54(2): 195-215.

210. Coffino P., Poznanski A. «Killer polyamines?». (1991) J. Cell Biochem. 45(l):54-58.

211. Coffino P. «Regulation of cellular polyamines by antizyme». (2001) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2(3): 188-194.

212. Marton L.J., Pegg A.E. «Polyamines as targets for therapeutic intervention». (1995) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35:55-91.

213. Tabor C.W., Tabor H. «Polyamines in microorganisms». (1985) Microbiol. Rev. 49(l):81-99.

214. Thomas T., Thomas T.J. «Polyamines in cell growth and cell death: molecular mechanisms and therapeutic applications». (2001) Cell. Mol. Life Sci. 58(2):244-258.

215. Bercovich Z., Rosenberg-Hasson Y., Ciechanover A., Kahana C. «Degradation of ornithine decarboxylase in reticulocyte lysate is ATP-dependent but ubiquitin-independent». (1989) J. Biol. Chem. 264(27): 15949-15952.

216. Kahana C., Nathans D. «Translational regulation of mammalian ornithine decarboxylase by polyamines». (1985) J. Biol. Chem. 260(29): 15390-15393.

217. Katz A., Kahana C. «Transcriptional activation of mammalian ornithine decarboxylase during stimulated growth». (1987) Mol. Cell. Biol. 7(7):2641-2643.

218. Rosenberg-Hasson Y., Bercovich Z., Ciechanover A., Kahana C. «Degradation of ornithine decarboxylase in mammalian cells is ATP dependent but ubiquitin independent». (1989) Eur. J. Biochem. 185(2):469-474.

219. Shantz L.M., Pegg A.E. «Translational regulation of ornithine decarboxylase and other enzymes of the polyamine pathway». (1999) Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31(1): 107122.

220. Murakami Y., Matsufuji S., Kameji T., Hayashi S., Igarashi K., Tamura T., Tanaka K., Ichihara A. «Ornithine decarboxylase is degraded by the 26S proteasome without ubiquitination». (1992) Nature 360(6404):597-599.

221. Matsufuji S., Matsufuji T., Miyazaki Y., Murakami Y., Atkins J.F., Gesteland R.F., Hayashi S. «Autoregulatory frameshifting in decoding mammalian ornithine decarboxylase antizyme». (1995) Cell 80(l):51-60.

222. Rom E., Kahana C. «Polyamines regulate the expression of ornithine decarboxylase antizyme in vitro by inducing ribosomal frame-shifting». (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91(9):3959-3963.

223. Ghoda L., van Daalen Wetters T., Macrae M., Ascherman D., Coffino P. «Prevention of rapid intracellular degradation of ODC by a carboxyl-terminal truncation». (1989) Science 243(4897): 1493-1495.

224. Takeuchi J., Chen H., Hoyt M.A., Coffino P. «Structural elements of the ubiquitin-independent proteasome degron of ornithine decarboxylase». (2008) Biochem. J. 410(2):401-407.

225. Jungbluth M., Renicke C., Taxis C. «Targeted protein depletion in Saccharomyces cerevisiae by activation of a bidirectional degron» (2010) BMC Syst. Biol. 4:176.

226. Caporale M., Arnaud F., Mura M., Golder M., Murgia C., Palmarini M. «The signal peptide of a simple retrovirus envelope functions as a posttranscriptional regulator of viral gene expression». (2009) J. Virol. 83(9):4591-4604.

227. Mizejewski G.J. «Alpha-fetoprotein signal sequences: a proposed mechanism for subcellular localization and organelle targeting». (1995) J. Theor. Biol. 176(1): 103-113.

228. Wu J.T., Waterhouse W.J. «Identification of alpha-fetoprotein polymers. Artifacts of the isolation procedure». (1982) Clin. Chim. Acta. 125(1):9-19.

229. Wu J.T., Knight J.A. «In-vitro stability of human alpha-fetoprotein». (1985) Clin. Chem. 31(10): 1692-1697.

230. Miyazaki Y., Matsufuji S., Murakami Y., Hayashi S. «Single amino-acid replacement is responsible for the stabilization of ornithine decarboxylase in HMOA cells». (1993) Eur. J. Biochem. 214(3):837-844.

231. Takeuchi J., Chen H., Coffino P. «Proteasome substrate degradation requires association plus extended peptide». (2007) EMBOJ. 26(1): 123-131.

Информация о работе

Морозов, Алексей Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Разработка прототипа ДНК-вакцины для иммунотерапии гепатоцеллюлярной карциномы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы