Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка подходов к оптимизации статистической оценки мутагенных эффектов лекарственных препаратов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бобринев, Евгений Васильевич

1ААТЕРУ1АЛЫ К МЕТОДЫ 5-13 РЕЗУЛЬТАТЫ ЙССЛЕД0ВА1-1ЙЙ.Статистический анализ и планирование экспериментов в методах оценки мутагенной активности химических соединений. I.Методы учета генных мутаций на индикаторных бактериях. а)Тест Эймса /микросомы 14-20 б)Метод промежуточного хозяина

2.Метод учета рецессивных летальных мутаций на дрозофиле

3.Метод доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей

4.Метод учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей

5.Метод учета аномалий головок спермиев у мьшей

6.Метод учета хромосомных аберраций в культуре ли1.1фоцитов периферической крови человека

7.Метод учета сестринских хроматидных обменов в культуре лимфоцитов периферической крови человека . 67-72 ОБСУлЩЕНйЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 73-79

ВЫВОДЫ 80-81 СШЮОК ЛИТЕРАТУРЫ 82-93 - I

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка подходов к оптимизации статистической оценки мутагенных эффектов лекарственных препаратов"

Актуальность проблемы. В связи с научно-техническим прогрессом перед человечеством встала одна из крупных проблем борьба с загрязнением окружающей среды, В самом деле, каждый человек повседневно сталкивается с разнообразием физических и химических агентов, включенных в его среду обитания. В по*' следние десятилетия появились как количественные, так и качественные изменения контакта человека с такими факторами, как радиоактивные соединения, продукты биологического синтеза, пищевые добавки, лекарственные синтетические препараты и др.Все это выдвинуло неотложные задачи по контролю загрязнения окружающей среда и по разработке научных направлений, которые позволили бы дать всестороннюю оценку влияния этих процессов на человека.Не подлежит сомнению, что для популяций человека увеличение мутагенных факторов крайне нежелательно. Оно создает реальную основу увеличения генетического груза, прежде всего изменения темпов мутационного процесса. В медико-генетическом отношении это может выразиться в повышении внутриутробной гибели особей, врожденных аномалий развития, наследственных болезней, генетически детерминированной предрасполо— женностй к заболеваниям разной природы.Испытания мутагенности химических и физических агентов на модельных объектах в лабораторных условиях направлены на поиск возможностей угленьшить контакт человека с мутагенными факторами, предотвратить неблагоприятные генетические последствия в случае введения их в среду обитания. - 2 В ряде стран в законодательном порядке приняты специальные программы тестирования, причем такому генетическому контролю подвергаются как уже распространенные и широко применяемые, так и вновь синтезируемые химические вещества.Проверка на мутагенность химических соединений позволяет наметить мероприятия, приводящие к снижению онкологических заболеваний, а также риска передачи мутационных изменений последующим поколениям, что будет способствовать профилактике спонтанных абортов, недоношенности, а также рождения детей с пороками развития и наследственными ;заболеваниями.Лекарства, как и другие химические соединения, способны индуцировать мутации различного типа - генные, хромосомные и геномные мутации. Отсутствие единого метода, позволяющего одновременно зарегистрировать все типы наследственной изменчивости, вынуждают пользоваться наборами методов, так называемыми тест-системами. Число показателей, характеризующих мутагенную активность химических соединений, достаточно велико, причем в одних и тех же тестах разные исследователи могут пользоваться и используют различные показатели мутагенной активности веществ.До сих пор недостаточно разработаны правила оценки результатов экспериментов, принципы выбора репрезентативных и значимых о биологической точки зрения показателей, а также методов статистического анализа, хотя подобные исследования ведутся как в нашей стране, так и за рубежом С /^^^^еъ , 1970; МитИма/п , 1976; Sc/ivoziiz^ojn, 1979; Яковенко, 1979).Поэтому ощущается необходимость в унификации как этих показателей, так и методов статистической обработки экспериментальных данных в каждом тесте. Такая необходимость неоднок- 3 ратно отмечалась на заседаниях Европейской и Всемирной ассоциациях мутагенных обществ, на ряде симпозиумов и совещаний по мутагенам окружающей среды {Аас. c-f -Не Second 6£^£ , 1977).Большие трудности у исследователей возникают при работе со слабыми мутагенами, а также в области малых доз, когда тестируемый показатель изменяется незначительно, В подобных ситуациях при использовании некорректных статистик легко придти как к ложно-позитивным, так и к ложно-негативным выводам, что в свою очередь может привести к изъятию ценных химических соединений из сферы обращения, или к занижению потенциальной опасности контакта человека с лекарственными препаратами.Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла Б разработке оптимальных подходов к статистическому анализу результатов оценки потенциальной мутагенной активности химических соединений, вводимых в среду обитания человека.Для ее достижения необходимо было решить следующие задачи: 1. Выбор и апробация оптимальных показателей мутагенности химических соединений.2. Выбор методов математйко-статистического анализа для оценки результатов тестирования химических соединений на различных бйолог^^ческйх объектах, 3. Разработка рекомендаций по планированию экспериментов, в частности, по определению оптимального объема выборки в системной оценке мутагенности лекарств.Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые осуществлен унифицированный подход к статистической - 4 оценке результатов проверки мутагенной активности химических соединений. Применен и апробирован унифицированный показатель, оценивающий в каждом методе тест-системы вероятность индуцированного возникновения генетических повреждений в геноме.Показана необходимость в практической работе осуществления предварительного преобразования исходных экспериментальных данных, для каждого метода разработаны соответствующие типы преобразований. Выявлено преимущество использования дисперсионного анализа и критерия независимых критериев. Проведена работа в области планирования экспериментов и определены минимальные объемы выборок в различных тестах на мутагенез.Внедрен в практику изучения химических соединений на мутагенность в тестах на индукцию хромосомных аберраций и аномальных спермиев у мышей метод последовательного анализа, что позволило сократить экономические затраты на проведение экспериментов в среднем на 40^.Штерйалы проведенных исследований были использованы в соответствующих разделах методических рекомендаций по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов, принятых Фармакологическим Коштетом МЗ СССР (I98I), в методических рекомендациях по использованию метода индукции аномальных спермиев как тест-системы для выявления мутагенов среды (1982), а также в ряде других методических рекомендаций, подготовленных к печати. - 5 Ш Т Ш Ш и МЕТОДЫ Материалом настоящей работы послужили экспериментальные данные оценки мутагенности активности ряда лекарственных препаратов, полученных в отделе генетики НИИ по биологическим испытаниям химических соединений. Проанализированы методы, входящие в общую программу изучения безопасности лекарств, а именно: I) учет генных мутаций на микроорганизмах в системах метаболической активации ih i//(/o и /иyJ^to ; 2) учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций на дрозофиле; 3) учет хромосомных аберраций в условиях 'h u/Vo ( в клетках ''" — ' " , '" " ' * " костного мозга мышей) и //7 iz/z-iio (на лимфоцитах периферической крови человека); 4) учет доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках млекопитающих; 5) учет сестринских хроматидных обменов на лимфоцитах периферической крови человека.Кроме того проанализирована дополнительная методика,, применяемая как в нашем институте, так и в ряде других учреждений; 6) учет аномальных головок спермиев у млекопитающих. Подфобное методическое описание каждого теста, а также анализ литературы будут приведены в соответствующих главах.Основной статистической задачей применения всех тестов в прикладном химическом мутагенезе является решение вопроса о значимости увеличения числа генетических событий (повреждений) в биологическом объекте над спонтанным уровнем под влиянием исследуемых агентов. Но понятие "генетическое повреждение" каждый исследователь может трактовать по своему. Например, в тесте на индукцию хромосомных аберраций -'^ vz/Vo и i^^ ui-l-co за генетическое событие можно принять: возникновение одного разрыва, возникновение одной аберрации, либо возникновение одной метафазы с аберрациями и т.д. Поскольку нам представляет- 6 ся важным оценить вероятность индуцированного возникновения генетического повреждения в объекте, то основное требование, предъявляемое нами к показателю генетической активности химического соединения в каждом тесте следующее: этот показатель можно представить в виде доли (р) генетически поврежденных систем от общего числа проанализированных систем.В любом из используемых тестов каждое химическое соединение исследуется на мутагенную активность в нескольких вариантах доз и, иногда, в нескольких повторностях. В первую очередь мы хотим получить ответ на воцрос: является ли данное хирлическое соединение мутагено^д?. Поэтому, желательно проанализировать весь эксперимент в целом, а не сравнивать каждый отдельный вариант опыта с контролем - в последнем случае мы теряем часть информации.Итак, эксперимент в каждом из тестов на мутагенез является многофакторным. Рассмотрим пример двухфакторного эксперимента.Главный эффект фактора В на уровне /' определяется следующим образом: так что Е. в>; - О С7) Когда есть взаимодействие между факторами А и В, изменение фактора А приводит к различным изменениям отклика на разных уровнях фактора В. Взаимодействие для фактора А на уровне / и фактора В на уровне у определяется так: Общая модель, используемая в двухфакторном эксперименте, такова: Для проверки значимости главных эффектов и взаимодействий используется дисперсионный анализ. Схема дисперсионного анализа приведена в табл.1, - 8 Таблица I Двухфакторный дисперсионный анализ.Обсуждаемые методы предполагают, что исследуемые показатели распределены нормально и на всех уровнях факторов имеют одинаковую дисперсию. Причем, если нарушение предположения о нормальности распределения не столь существенно, то неоднородность дисперсии влияет на точность полученных результатов (Шеффе, 1980; Z)om^c/i>oh , 1966). Однородность дисперсии в наших экспериментах проверяли по критерию Бартлетта (Закс,1976), В некоторых случаях можно стабилизировать дисперсию, используя соответствующие преобразования исходных данных. Описание подходяпщх преобразований можно найти у M<3holehliQ^t (1968), S^^Q (1967). В общем виде, если исходная переменная к имеет среднее м и дисперсию G* , так что б* можно выразить как функцию от ff то новая переменная и будет иметь приблизительную постоянную дисперсию, если - 10 Однако не всегда можно найти единую функциональную связь между средней и дисперсией. Например, Яковенко (1979) предлагает использовать различные преобразования данных в экспериментах по учету хромосомных аберраций на лиглфоцитах человека в зависимости от того, используется ли в эксперименте кровь одного или нескольких доноров. Кроме того, в некоторых случаях вообще стабилизировать дисперсию невозможно. В таких ситуациях возможны попарные сравнения опытных вариантов с контрольными, используя при этом либо различные типы преобразований для каждого сравнения, либо пользуясь непараметрическими методами сравнения. После проведения попарных сравнений необходимо провести анализ всего эксперимента, используя критерий независимых критериев (Шор, 1962). Если 2); - наблюдаемая величина критерия для сравнения i -го варианта опыта с контролем (имеется в виду любой критерий для парных сравнений), тогда -2|//.//Э>2;] CI5) имеет { - распределение с 2 К степенями свободы, где К общее число опытных вариантов в эксперименте.Отметим, что описываемый способ применим только для одностороннего критерия, поэтому мы не можем использовать этот метод анализа в тесте Эймса, где наряду с мутагенным эффектом на величину тестируемого показателя влияет бактерицидный эффект исследуемого "^шмического соединения.Обычно исследователей интересует минимальный объем выборки, необходимой для решения задач, поставленных в эксперименте.В дальнейшем для выявления количественных закономерностей предполагается использование критерия: независимых критериев, а также дисперсионного и регрессионного анализа.Мы предлагаем оценивать так, чтобы вероятность появления в контрольной совокупности объекта со значением тестируемого показателя х* >/^^ не превышала 5^, что согласуется с мнением^ Е.Н.Яковенко^ С личное-сообщение).Таким образом, принимаем //^=Д -^ii-^ (22) где: 6" - среднеквадратйческое отклонение для данной линии животных в данном тесте. Уровень значимости принято использовать пятипроцентный для ошибки I рода ( с/ = 0.05). Вероятность ложнонегативного результата или ошибка П рода ( /?> ) зависит от числа вариантов в эксперименте. Чем больше вариантов, тем меньше вероятность того, что истинный мутагенный эффект не выявится в каком-то из вариантов экспериментов. Поэтому мы оценивали значение f^ от 0.05 для двухвариантного эксперимента (опыт и контроль) до 0.20 в многовариантных экспериментах. 14 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНШ. I. Статистический анализ и планирование'экспериментов ' в методах оценки мутагенной активности химических соединений.Вначале в пробирки о агаром вносят раствор препарата в исследуемых концентрациях (0.1 мл), затем в пробирки вносят 0,1 мл суспензии бактерий. После этого вносят 0,5 мл микросомальной активирующей смеси, быстро размешивают содержимое пробирки и - 15 выливают его на слой нижнего.минимального агара на чашке Петри.Учет результатов проводят через 48 часов инкубации при 37^0.В контрольном варианте в слой верхнего полужидкого агара вместе с суспензией бактерий вносят микросомальную активирующую смесь, а также соответствующий объем растворителя препарата.Описываемый метод является полуколичественным, так как учитывает число селектируемых мутантов, а не частоту индуцированных мутаций. Однако получение данных о той или иной степени превышения числа колоний на чашках с опытными вариантами по отношению к контролю позволяет выявить мутагенную активность исследуемого вещества. Учет результатов эксперимента проводят, подсчитывая число колоний - ревертантов в контрольных и опытных вариантах отдельно на каждой чашке.Малый объем информации не позволяет нам достаточно надежно установить вид закона распределения числа ревертантов в наших экспериментах. Однако, как следует из вышенаписанного, мы и не ставили перед собой такую задачу, поскольку для решения вопроса о значимости увеличения числа ревертантов в опытном варианте по сравнению с контрольным гораздо важнее стабилизировать дисперсию тестируемого показателя, чем установить его точное соответствие какому-либо из априорных типов распределения.Преобразование ^h х стабилизировало дисперсию в наших экспериментах. В таб.2 приведены результаты эксперимента по изучению действия различных факторов на эффект мутагенной метаболической активации нитрозоморфолина, циклофосфамида и тиофосфамида на штамме S. ^/4^ма'с/^/у, ТА 1950. - 17 Поскольку стоящая перед нами задача предусматривает не анализ действия различных факторов на величину мутагенного эффекта, а установление зависимости дисперсии от среднего значения тестируемого показателя на некоторых уровнях факторов, изменяющих в различной степени среднюю величину показателя, то в табл,2 и в остальных таблицах мы не приводим конкретное описание всех уровней анализируемых факторов, а обозначаем их как вариант опыта. Рассчитанное значение А - статистики для выборочных дисперсий преобразованных данных не превышает пятипроцентный уровень значимости.Этот показатель рассчитывается только в случае выявления значимого увеличения числа ревертантов в опытном варианте по сравнению с контролем. То есть первый этап статистического анализа в этом тесте-сравнение числа ревертантов в опытном и контрольном вариантах - практически ничем не отличается от статистического анализа в тесте Эймса. Поэтому, и используемые в этом тесте методы статистического анализа такие же, как и в тесте Эймса (смотри глЛА).Преобразование у = ^ х ' стабилизировало дисперсию наших экспериментов (Бобринев и др., I98I). Рассчитанное значение f ^ -статистики для выборочных дисперсий преобразованных данных не превышает Ь% уровень значимости (смотри табл.4).В табл.4 приведены выборочные отдельные варианты экспериментов по изучению действия различных доз тубазида и циклофосфамида на величину мутагенного эффекта с целью проследить изменение дисперсии с ростом среднего значения тестируемого показателя (число ревертантов).Если же стандартная постановка предусматривает изучение нескольких доз вещества, то можно уменьшить число животных в каждом варианте до 4, оценивая значение Ь - 0,20.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Бобринев, Евгений Васильевич

в ы,в о д ы

1. Впервые на основе единого методического подхода проведена оптимизация математико-статистического анализа экспериментов в системе изучения мутагенной активности химических соединений.

2. В результате проведения анализа экспериментов по оценке мутагенности лекарственных препаратов на микроорганизмах, дрозофиле, млекопитающих и клетках человека показана возможность использования в качестве основного показателя мутагенной активности химических соединений в разных тестах "долю генетических повреждений в геноме".

3. Для корректного статистического анализа экспериментов показана необходимость проведения предварительного преобразования экспериментальных данных: в тестах на микроорганизмах (числа ревертантов); в тестах на млекопитающих и лимфоцитах человека - типа о тс ъ > и (доли генетических повреждений) с, с поправкой Фримэна и Тьюки.

4. Для минимизации вероятности ошибок I и П рода показана: а) необходимость анализа всего эксперимента в целом в каждом тесте для принятия окончательного решения об отсутствии или наличии мутагенной активности исследуемого химического соединения; б) возможность и пригодность использования критерия независимых критериев и дисперсионного анализа с последующим применением метода Даннета для выявления мутагенной активности химических соединений.

5. Проведенные исследования по планированию экспериментов позволили рассчитать необходимые объемы выборок во всех обсуждаемых тестах на микроорганизмах, дрозофиле, млекопитающих и клетках человека.

6. Впервые предложен и апробирован в тестах на индукцию хромосомных аберраций (в условиях ш \/ыо и //-? i//-/го ) и аномальных спермиев у мышей метод последовательного анализа, что позволяет снизить экономические затраты на проведение экспериментального исследования в среднем на 40 %*

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бобринев, Евгений Васильевич, Купавна

1. Бельговский М.Л., Абелева Э.А., Потехина Н.А. Характер зависимости частоты леталей, возникающих на разных стадиях сперматогенеза от дозы рентгеновских лучей.-Докл. АН СССР,1*959, т.124, с.922-924.

2. Бобринев Е.В., Облапенко Н.Г., Подольная М.А. О возможности применения метода множественных сравнений в тесте'Эймса

3. Soimon(A./микросомы. Тез.докл. Всес.конф. "Актуальные проблемы оценки фармакологической активности химических соединений", Ногинск, 1981, с.

4. Бобринев Е.В., Облапенко Н.Г., Фонштейн Л.М., Ревазова Ю.А., Подольная М.А. Анализ и планирование экспериментов с использованием теста Эймса /микросомы. Генетика, 1983, с.1835-1839.

5. Бобринев Е.В., Радченко Л.У., Фрид А.Ю., Ревазова Ю.А.

6. О возможности использования теста аномальных спермиев для оценки мутагенности химических соединений. Тез.докл.Всес. конф. "Чувствительность организмов к мутагенным факторам и возникновение мутаций", Вильнюс, 1980, с.28.

7. Бочков Н.П., Шрам Е.Я., Кулешов Н.П., Журков B.C. Система оценки химических веществ на мутагенность: общие принципы, практические рекомендации и дальнейшие разработки. -Генетика, 1975, т.П, с. 156.

8. Вальд А. Последовательный анализ. "Физматиздат", I960.

9. Гвазава Э.А., Ревазова Ю.А., Радченко Л.У., Брацлавский В.А., Облапенко Н.Г., Бобринев Е.В. Изучение мутагенной активности томизина. Хим.-фарм.журн., 1981, с.31-34.

10. Гинзбург Э.Х., Полищук A.M. О сравнении долей в связи с некоторыми вопросами статистической обработки и планирования цитологических экспериментов. Цитология, 1975, т.17, с.II94-II99.

11. Закс JI. Статистическое оценивание. М., Статистика, 1976.

12. Захаров А.Ф. Сестринские хроматидные обмены: феномен и механизмы. Б кн. "Итоги науки и техники", Генетика человека, 1978, г.З, с.76-121.

13. Кендал М., Стьюарт А. Статистические выводы и связи. М., "Наука", 1973.

14. Клейнен Дж. Статистические методы в имитационном моделировании. М., "Статистика", 1978.

15. Кулешов Н.П. Частота возникновения и судьба хромосомных аномалий у человека. Автореф. Дис.докт.мед.наук, Москва, 1979.

16. Лекявичус Р.К., Журков B.C., Ревазова Ю.А., Соколовский В.В., Моркунас В.К., Бобринев Е.В., Радченко JI.У.Аномалии человека спермиев как тест-метод для оценки активности мутагенов среды. (Методические указания). Вильнюс, 1983, с.12.

17. Малашенко A.M., Суркова Н.И., Семенов Х.Х. Определение мутагенности химических соединений (генетический скрининг)на лабораторных мышах (методические указания). М., Медицина, 1977, с.252.

18. Подольная М.А., Бобринев Е.В., Ревазова Ю.А.Анализ некоторых методов статистической обработки результатов экспериментов по индукций доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей. Генетика, 1981, т.17, с.651-657.

19. Подольная М.А., Бобринев Е.В., Радченко Л.У., Журков B.C., Ревазова Ю.А. Оценка индукции хромосомных перестроек в клетках костного мозга млекопитающих. Тез.докл.Всес.конф.

20. Актуальные проблемы оценки фармакологической активности химических соединений", Ногинск, 1981, с.124-125.

21. Поллард Дж. Справочник по вычислительным методам статистики. М., "Финансы и статистика", 1982.

22. Ревазова Ю.А., Бобринев Е.В., Подольная М.А. 0 показателях степени мутагенной активности химических соединений. -Тез.докл.Всес.учредительной конф. по токсикологии. М., 1980, с.129.

23. Ревазова Ю.А., Бобринев Е.В., Подольная М.А., Радченко Л.У., Гвазава Э.А. Унификация методов оценки степени мутагенной активности на различных биологических объектах. Тез.докл. 1У съезда ВОГиС. Кишинев, 1982, ч.1, с.202-203.

24. Тарусина Т.О. Индивидуальные вариации частоты хромосомных аберраций при действии химических мутагенов на лимфоциты периферической крови человека. Автореф.дис.канд.мед.наук, Москва, 1977, с.П-18.

25. Фу К. Последовательные методы в распознавании образов и обучении машин. М., "Наука", 1974.

26. Чеботарев А.Н. Количественный анализ сестринских хроматид-ных обменов в клетке. Генетика, 1979, т.15, с.1392-1398.

27. Чеботарев А.Н., Селезнева Т.Г., Платонова В.И. Модифицированный метод дифференциальной окраски сестринских хроматид.-Бюлл.эксп.биол, и мед., 1977, т.85, с.242-243.

28. Шварц Г. Выборочный метод. М., "Статистика", 1978.

29. Шеффе Г. Дисперсионный анализ. М., "Физматгиз", 1963.

30. Шор Я.Б. Статистические методы анализа контроля качества и надежности. М., "Наука", 1962.

31. Яковенко К.Н., Платонова В.И. Спонтанный уровень сестринских*хроматидных обменов и их распределение по клеткам человека. -Генетика, 1979, т.15, с.III5-II23.

32. Ames Б., Durston W., Jamasaki Е., Lee P. D. Carcinogens are mutagens: A simple test system combining liver homogenate for activation and bacteria for detection. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1973, v. 70, p. 2281-2285.

33. Ames B., Mc.Cann J., Jamasaki E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test. Mut. Res., 1975, v. 31, p. 347-364.

34. Aronson M.M., Miller R.C., Hill R.B.,"Nichols W.W., Meadows A.T. Acute and long- term cytogenetic effects of treatment in childhood cancer. Sister-chromatid exchanges and chromosome aberrations. Mut. Res., 1982, v. 92,p. 291-307.

35. Beatty R.A. The genetics of the mammalian gamete. Biol. Rev., 1970, v. 45, p. 73-119.

36. Becker K., Schoneich J. Expression of genetic damage induced by alkylating agents in germ cells of female mice. Mut. Res., 1982, v. 92, p. 447-464.

37. Веек В., Azanda I., Thomson E. Induction of sister chromatid exchanges, cell-cycle delay and chromosomal aberrations by human urine concentrates. Mut. Res., 1982, v. 92,p. 333-360.

38. Blijleven W.G.H. Mutagenicity of four hair dyes in Drosophila melanogaster. Mut. Res., 1977, v. 48., p. 181-186.

39. Brozek C. Proportion of morphologically abnormal spermatozoa in two inbred strains of mice, their reciprocal P^ and Pg crosses and backcrosses. Acta Biol. Cracov. (Ser. Zool.), 1970, v. 13, p. 189-198.

40. Committee-17. Environmental mutagenic hazards. Mutagenicity screening in now both-feasibly and necessary for chemicals entering the environment. Sci., 1975, v. 187, p. 503-514.

41. Donaldson T.S. Power of the F-tect for Uonnormal Distributions and Unequal Error Variances. Report no. RM-S072-PR, The Rand Corporation, Santa Monica, Calif., 1966.

42. Dunnett C.W. A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Stat. Assoc., 1955, v. 50, p. 1096-1121.

43. Eberle P., Hunstein W., Perings E. Chromosomes in patients13treated with Imuran . Humangenetik, 1968, v. 6, p. 69-73.

44. Ehling U.H., Machemer L., Buselmaier W. et. al. Standard protocol for the dominant lethal test on male mice, set up by the Work Group Dominant Lethal Mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics. Arch. Toxicol., 1978, v. 39»p. 173-185.

45. Fabry L., Leonard A., Decat G., Roba J. Mutagenicity studies on bufexamac. Mut. Res., 1982, v. 103, p. 107-109.

46. Fontignie-Houbrechts H. Genetic effects of formaldehyde in the mouse.- Mut. Res., 1981, v. 88, p. 109-114.

47. Forbes C. Sex-linked lethal mutations induced in Drosophila melanogaster by 7,12-dimethylbenz Anthracene. Mut. Res., 1980, v. 79, p. 231-237.

48. Friederich U., Aesehbacher H.U., Seiler J.P., Wurgler E.E. The Salmonella/microsome assay some possible causes for interlaboratory variations. Mut. Res., 1982, v. 103,p. 133-140.

49. Friedrich U., Zenthen E. Chromosomenabormitaten und1. T>

50. Behandlung mit Imuran (Azathioprin)nach Niezentranspla-tationen. Humangenetik, 1970, v. 8, p. 289-294.

51. Gabridge M., Legator M.S. A host-mediated microbial assay for the detection of mutagenic compounds. Proc. Soc. Exptl. Biol. OJ.J.),.1969, v. 130, p. 831.

52. Gannes E., Osment J., Dittrich P., Huber H. Chromosomes in patients treated v/ith arathioprine. Humangenetik, 1973, v. 18, p. 231-236.

53. Goetz P., Novotna B. Glastogenic effects of ftorafur.

54. Cytogenetic analysis of bone marrow in mice. Mut. Res., 1981, v. 88, p. 301-306.

55. Goud S.N., Usharani M.V., Reddy P.P., Reddy O.S., Rae M.S., Saxena V.K. Genetic effects of microwave radiation in Mice.-Mut. Res., 1982, v. 103, p. 39-42.

56. Grafe A., Vollmar J. The Collaborative Ames Test Study analysis and interpretation of results. Proc. of the Second Y/orkshop on Bacterial In vitro Mutagenicity Test Systems, Manheim, Germany, 1979.

57. Hartley-Asp B. Investigation of the cytogenetic effectsof ВС and LCMB on human peripheral lymphocytes in vitro. -Mut. Res., 1982, v. 100, p. 295-296.

58. Husum В., Wulf H.C., Niebuhr E. Normal sister-chromatid exchanges in oral contraceptive users. Mut. Res., 1982, v. 103, p. 161-164.

59. Kastenbaum M.A., Bowman K.O. Tables for determining the statistical significance of mutation frequencies. Mut. Res., 1970, v. 9, p. 527-549.

60. Kirkland D.J., Smith K.L., Jenkinson P.O. Metophase analysis of human lymphocytes treated with 4-chloromethyl-biphenyl and benzyl chlozide. Mut. Res., 1982, v. 100, p. 297-299.

61. Knaap A.G.A.C., Kramers P.G.IT. Absence of synergism between mutagenic treatments, given one generation apart, in Drosophila melanogaster. Mut. Res., 1982, v. 92, p. 117-121

62. Komatsu H., Kakizoe Т., Niijima Т., Kawachi Т., Sugimura T. Increased sperm abnormalities due to dietary restriction. -Mut. Res., 1982, v. 93, p. 439-446.

63. Kruger J. Statistical methods in mutation research. In: Chemical mutagenesis in mammala and man. (Б1. Vogel,

64. G. Rohrborn Eds), Heidelberg: Springer-Verlag, 1970, p. 460.

65. Krzanowska H. Influence of Y-chromosome on fertility.in mice. In: The Genetics of the Spermatozoan (R.A.Beatty, S. Gluecksohm-Waelsch Eds), Proc. Int. Symp. Edinburgh, Scotland, 1971, p. 370-386.

66. Kucerowa M. Cytogenetic analysis of human chromosomes and its value for the estimation of the genetic risk. -Mut. Res., 1976, v. 41, p. 123-130.

67. Kupper L.L., Haseman «Т.К. The use of a correlated Binomial Model for the analysis of certain toxicological experiments. Biometrics, 1978, v. 34, p. 69.

68. Lazzamendy M.L., Dulont F.N., Bianchi И.О., Olivero O.A. In vitro dose-response relation ship in bone-marrow cells of mice treated with adriamycin. Mut. Res., 1980, v. 79, p. 133-140,

69. Leigh В., Schalet A.P., Paradi E. Neutron- and X-ray-induced mutations at the yellow, white, forked and vermilion loci of Drosophila melanogaster, a preliminary analysis. Mut. Res., 1982, v. 92, p. 133-138.

70. Luning K.G., Eiche A. X-Ray-induced recessive lethal mutations in adult and foetal female mice. Mut. Res., 1982, v. 92, p. 169-180.

71. Margolin B., Kaplan N., Zeiger E. Statistical analysis of the Ames Salmonella/microsome test. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1981, v. 78, p. 3779-3783.

72. Mendenhall W. Introduction to Linear Modess and the Design Analysis of Experiments. Wadsworth, Belmont, Gal., 1968.

73. Mittler S., Eiss M.I. Failure of irradiated onion to induce sex-linked recessive lethal mutations in Drosophila melanogaster. Mut. Res., 1982, v. 104, p. 113-119.

74. Neau S.H., Hoebermen B.H., Frantz S.W., Sinsheimer J.E. Substituent effects of the mutagenicity of phenyl glycidyl ethers in Salmonella typhimurium. Mut. Res., 1982, v. 93, p. 297-304.

75. Newman S.M., Summitt R.L., Nunez L.J. Incidence of nickel-induced sister-chromatid exchange CXO. Mut. Res., 1982, v. 101, p. 67-75.

76. Norpoth K., Reisch A., Heinecke A. Biostatistics of Ames-Tes Test Data. Short. Term Test Syst. Detecting

77. Carcinog., Berlin e.a., 1980, p. 312-322.

78. Panigrahi G.B., Rao A.R. Chromosome-breaking abilityof arecoline, a major betel-nut alkaloids in mouse bone-marrow cell in vivo.,- Mut. Res., 1982, v. 103, p.197-204.

79. Peng K.C. The Design and Analysis of Scientific Experiments (an Introduction with Some Emphasis on Computation). Addison-Wesley, Reading, Pa., 1967.

80. Progress in genetic toxicology (D. Scott, B. Bridges, P. Sobels Eds), Proc. of the Second EEMS, 1977.

81. Rohrborn G. Mutagenicity tests in mice. The dominant lethal method and the control problem. Humagenetik, 1968, v. 6, p. 345.

82. Ryttman H. A new statistical evaluation of the dominant-lethal mutation test. Mut. Res., 1976, v. 38, p. 225.

83. Salsbura D.S. Statistical Considerations for Dominant Lethal Mutagenic Trials. In: Environmental Health perspectives, Proc. of the Workshop Held at Research Triangle Park, 1973, p. 51-59.

84. Sankaranarayanan K. Effects of a chromosome-3 mutator gene on radiation-induced mutability in Drosophilamelanogaster females. Mut. Res., 1982, v. 92, p. 139— 149.

85. Sechadri R., Baker E., Sutherland G.R. Sister-chromatid exchange (SCE)analysis in mothers exposed to DITA-damaging agents and their newborn infants. Mut. Res., 1982,v. 97, p. 139-146.

86. Schvartzman S.B., Costes P., Gonzales-Pernandez A. On the nature of sister-chromatid exchanges in S-bromdeoxyuridine-substituted chromosomes. Genetics, 1979, v. 92,p. 1251-1265.

87. Scott K., Topham J.C. Sperm head abnormality test. -Mut. Res., 1982, v. 100, p. 345-350.

88. Stella M., Montaldi A., Rossi R., Rossi G., Levis A.G. Clastogenic effects of chromium on human lymphocytes in vitro and in vivo. Mut. Res., 1982, v. 101,p. 99-114.

89. Vijayalaxmi, Evans H.J. In vivo and in vitro effects of cigarette smoke on chromosomal damage and sister-chromatid exchange in human peripheral Blood lymphocytes. Mut. Res., 1982, v. 92, p. 321-332.

90. Vogel E.W., Blijleven W.G., Kortselius M.J.H., Zijlstra J.A. A search for some common characteristics of the effects of chemical mutagens in Drosophila. Mut. Res., 1982, v. 92, p. 69-87.

91. Vormittag W. Zytoctatische immunodepressive Therapie, chromosomale Aberrationen und karzinogene Yfirkung. -Wien. klin. Y/ochenschz., 1974, v. 86, p. 69-75.

92. W.H.O. Evaluation and testing of drugs for mutagenicity: principles., 1971, p. 481.

93. Williams D.A. The analysis of Binary responses from toxicological experiments involving reproduction and teratogenicity. Biometrics, 1978, v. 31, p. 949.

94. Wirobek A.J. Changes in mamalian sperm morphology after X-ray and chemical exposures. Genetics, 1979, v. 92, p. 105-119.

95. Zeuthen E., Priedrich U. Chromosomenuntersuchungen bei Kindern von Imuran-behandelten Eltern. Humangenetik, 1971, v. 12, p. 74-76.