Разработка питательных сред для индикации санитарно-показательных микроорганизмов

Полосенко, Ольга Вадимовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка питательных сред для индикации санитарно-показательных микроорганизмов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка питательных сред для индикации санитарно-показательных микроорганизмов"

На правах рукописи

ПОЛОСЕНКО ОЛЬГА ВАДИМОВНА

РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ИНДИКАЦИИ САНИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.00.07 микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003486032

Оболенск - 2009

003486092

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Научный руководитель:

Кандидат медицинских наук Храмов Михаил Владимирович. Официальные оппоненты: -Доктор медицинских наук, доцент

Терентьев Александр Николаевич

-Доктор медицинских наук, с.н.с. Саяпииа Лидия Васильевна

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Защита состоится « 2009 года в на заседании диссертационного

совета Д.350.002.01Д при Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФГУН ГНЦ ПМБ) по адресу 142289, Московская обл., п. Оболенск С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ПМБ.

Автореферат разослан « // »М^Л^Ц? 2009 ]

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Фурсова Н.К.

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Состояние инфекционной заболеваемости по медицинской и социально-экономической значимости остается актуальной проблемой и в настоящее время. В 2008 г в Российской Федерации зарегистрировано почти 750 тыс. заболеваний острыми кишечными инфекциями, среди которых почти половину составляет кншечные заболевания неустановленной этиологии [Онищенко Г.Г., 2009]. Возникновение очагов холеры, угроза появления и распространения опасных кишечных инфекций вследствие ухудшения экологического состояния поверхностных вод, возможности возникновения в любом регионе эпидемической ситуации и по другим инфекциям, таким как псевдотуберкулез, кишечный иерсиниоз - все это определяет необходимость контроля качества объектов внешней среды, пищевых продуктов, причем не только в отношении санитарно-показательных микроорганизмов, но и условно-патогенных энтеробак-терий (УПЭ). Выявление и ускоренная идентификация УПЭ - Е. coli и других коли-форм - имеет большое значение, как для эпидемиологии, так и при проведении сани-тарно-микробиологического контроля объектов внешней среды, пищевых продуктов, а также для предупреждения внутрибольничных инфекций [Меджидов М.М. и др., 2007]. Обнаружение Е. coli в воде является сигналом об опасности, которое связано с самим фактом попадания в неё фекальных масс, являющихся местом обитания болезнетворных микробов кишечно-тифозной и дизентерийной групп.

Одной из основных и актуальных проблем клинических лабораторий и практических служб Роспотребнадзора является правильная и своевременная диагностика инфекций, вызываемых санитарно-значимыми микроорганизмами и, как следствие, обеспечение поддержания благополучной санитарно-эпидемической обстановки.

В настоящее время реально существует угроза появления и распространения опасных социально-значимых инфекций, которая находит отражение в современных понятиях «новые и возвращающиеся» инфекционные болезни. На саммите «Группы восьми» в Санкт-Петербурге 15-17 июля 2006 г по предложению России рассматривались вопросы, связанные с противодействием угрозе инфекционных заболеваний, возможностью проявления биотерроризма и биогенными катастрофами [Онищенко Г.Г., 2006]. В этой связи повышается роль обеспечения противоэпидемических мероприятий новыми высококачественными и стабильными диагностическими препарата-

ми, создание которых основано на использовании методов современной биотехнологии. В то же время, надежным «золотым стандартом» при диагностике большинства современных инфекционных заболеваний остается классический бактериологический метод. Наиболее важным этапом микробиологического исследования является выделение и идентификация возбудителей, определение их родовой и видовой принадлежности с использованием питательных сред, что, в свою очередь, поможет решить сложные и ответственные задачи микробиологической диагностики заболеваний и санитарно-эпидемиологического благополучия. Вопросы расширения номенклатуры производства питательных сред, улучшения их ростовых и дифференциально-диагностических свойств, внедрение в лабораторную практику методик, позволяющих сократить время исследования, не теряют значимости.

Принимая во внимание указанное выше, остаётся актуальной задача создания эффективных, стандартных, дающих стабильные результаты бактериологических питательных сред для выделения энтеробактерий, позволяющих повысить надежность санитарно-бактериологического мониторинга.

Цель

Научно-экспериментальная разработка прописей бактериологических питательных сред, оценка качества и усовершенствование методов их применения для индикации возбудителей кишечных инфекций.

Задачи исследований

• Обоснование разработки составов питательных сред для дифференциации коли-бактерий по признакам ферментации глюкозы и лактозы, образования сероводорода, гидролиза мочевины.

• Оценка диагностической ценности новых питательных сред с препаратами сравнения в лабораторных условиях.

• Обоснование разработки состава флюорогенного селективного бульона (ФСБ) для определения колиформных бактерий и Е.соИ с использованием гидролизата желатина в качестве белковой основы.

• Определение алгоритма использования питательных сред Эйкмана с лактозой и глюкозой в одноразовой индивидуальной упаковке, простерилизованных у-облучением, для оценки наличия бактерий группы кишечной палочки в модельных исследованиях водных объектов.

• Определение возможности использования прибора «Бак Трак 4100» для экспресс-исследования показателей качества разработанных накопительных питательных сред.

• Изучение биологических свойств питательных сред на широком наборе музейных штаммов и клиническом материале для определения их диагностической ценности.

Научная новизна

1. Впервые на основе экспериментальных данных о характере роста возбудителей кишечных инфекций разработана промышленная технология производства усовершенствованных питательных сред Эйкмана с лактозой (глюкозой), Кесслера-ГРМ, SDS-бульона, железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной с использованием отечественных белковых основ: панкреатического гидролизата рыбной муки, пептонов, гидролизата желатина.

2. Разработаны и экспериментально обоснованы требования к основным показателям качества питательных сред при их серийных выпусках, доказана их высокая диагностическая ценность, стандартизованы методы контроля и сформулированы требования к чувствительности, ингибирующим и дифференцирующим свойствам, определены области их применения в лабораторной практике.

3. Впервые предложена современная методология контроля водоисточников с использованием сухих расфасованных, готовых к употреблению, стерильных сред Эйкмана для применения в полевых условиях. Для стерилизации сред Эйкмана адаптирован метод радиационной стерилизации у-облучением с целью упрощения их использования.

4. Разработана питательная среда нового поколения - флюорогенный селективный бульон (ФСБ). Получены новые данные о ее преимуществе по чувствительности, скорости роста, интенсивности свечения.

5. Впервые обосновано использование железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной для проведения первичной идентификации представителей родов Yersinia и Vibrio по отношению к углеводам и мочевине.

Практическая значимость

1. Разработаны и внедрены в производство в ФГУН ГНЦ ПМБ питательные среды Эйкмана с лактозой и глюкозой, среда Кесслера-ГРМ, SDS-бульон, железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной.

2. Внедрение в производство и в практику здравоохранения разработанных и усовершенствованных стандартных сухих питательных сред для дифференциации эн-теробактерий (с 2007 по 2009 гг выпущено около 20 тонн) повысило стабильность микробиологических исследований, а также эффективность эпидемиологического мониторинга объектов внешней среды (почвы, воды), пищевых продуктов и др.

3. Предполагаемый промышленный выпуск и внедрение в практику здравоохранения флгоорогенного бульона (ФСБ) существенно сократит время исследования по сравнению с классическим методом, обеспечивая высокую точность результатов в условиях чрезвычайных ситуаций и сложной эпидобстановки.

4. Применение готовых расфасованных сред Эйкмана с лактозой (глюкозой) в одноразовой индивидуальной упаковке, простерилизованных у-излучением, позволяет получать быстрые и надежные результаты в стационарных и передвижных лабораториях.

5. По результатам проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Обнаружение колиформных бактерий и Е. coli при санитарно - микробиологическом анализе питьевой воды с использованием питательной среды Эйкмана с лактозой».

Внедрение результатов работы

Разработаны, утверждены и согласованы ТУ, регламенты производства, инструкции по применению, зарегистрированы в установленном порядке и разрешены к применению питательные среды Эйкмана с лактозой (глюкозой), Кесслера-ГРМ, SDS-бульона (регистрационные удостоверения № ФСР 2007/00971, № ФСР 2007/00969, № ФСР 2008/03656, № ФСР 2008/03655).

Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке от 18 августа 2009 г, № 2008125457/13 (030956) на № 12-05/838), «Питательная среда для определения общих колиформных бактерий и Е. coli в исследуемых образцах».

Материалы диссертации используются преподавателями в лекциях для магистрантов и аспирантов ФГУН ГНЦ ПМБ, на курсах повышения квалификации Россель-

хозакадемии (ГНУ ВНИИ мясной промышленности им. В.М. Горбатова) и Роспотреб-надзора (ФГУЗ «Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии»).

Разработаны методические рекомендации по применению среды Эйкмана с лактозой.

Положения, выносимые на защиту

1. Составы отечественных питательных сред промышленного производства для дифференциации коли-бактерий по признаку ферментации глюкозы и лактозы, а также возможность их использования в лабораторной практике.

2. Железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной - эффективная диагностическая среда для дифференциации и идентификации энтеробактарий, в том числе иерсиний и возбудителя холеры.

3. Компонентный состав флюорогенного селективного бульона (ФСБ), содержащий в качестве источника азота панкреатический гидролизат желатина, селективные агенты и флюоресцирующую добавку.

4. Алгоритм подготовки сред Эйкмана для эпидемиологического мониторинга, включающий стадию расфасовки среды в одноразовую индивидуальную упаковку, с последующей стерилизацией у-облучением.

5. Возможность использования прибора «Бак Трак 4100» для экспресс-исследования показателей качества разработанных накопительных питательных сред Эйкмана в сравнении с аналогами.

6. Изучение биологических свойств питательных сред с использованием широкого набора музейных тест-штаммов, образцов продуктов питания, клинического материала и объектов окружающей среды для определения диагностической ценности разработанных сред.

Апробация результатов исследовании

Основные материалы по теме диссертационной работы доложены на

3-ей Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем», Махачкала 2001; VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» Оболенск 2006; IX

Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва 2007; X съезде гигиенистов и санитарных врачей Москва 2007; 9-ой Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», Волгоград 2008; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва 2008.

Публикации

Основное содержание работы отражено в 9 научных работах, включая статью Разработка и использование новой питательной среды для выявления и идентификации санитарно-показательных микроорганизмов.// Журн. Микробиол. Эпидемиол. Иммунобиол. М.: 2008. - №6 - С. 70-72.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 141 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, выводы и указатель литературы, включающий 84 работы (отечественных и зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 3 рисунками и 34 таблицами.

Содержание работы

Организация эксперимента

Работа выполнена в ФГУН ГНЦ ПМБ в рамках отраслевой программы «Научные аспекты обеспечения санэпидблагополучия в Российской Федерации» по договору № 74-Д от 31.12.2005 г и в рамках программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.) Госконтракт № 128-Д» «Проведение проблемно-ориентированных исследований и разработка комплектов питательных сред для диагностики чумы, сибирской язвы и туляремии».

Материалы исследований

Штаммы микроорганизмов, используемые для определения специфической активности разработанных питательных сред: 14 родов 147 видов возбудителей кишечных инфекций полученные из ГИСК им. Л.А. Тарасевича, отдела коллекционных культур ФГУН ГНЦ ПМБ, Государственной коллекции патогенных микроорганизмов

ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб», а также свежевыделенные штаммы, полученные из Центров гигиены и эпидемиологии.

Зарубежные и отечественные аналоги питательных сред: Eijkman Lactose Broth (HiMedia), [HiMedia Laboratories Pvt Limited 1993], Fluorocult Laurylsulfat Bouillon, Fluorocult BRILA - Bouillon (Merck) [Каталог 2004/2005 (MERCK)], питательная среда для выделения и дифференциации энтеробактерий (среда Кода) ФГУП «НПО «Микро-ген»,

г. Махачкала, питательная среда № 13 ГРМ по [ГФ XI], агар Клиглера-ГРМ - ТУ 9398030-780953226-2007, (ФГУН ГНЦ ПМБ).

Объекты внешней среды: (вода поверхностных водоемов, сточные воды, смывы на предприятиях общественного питания (столовых, кафе), магазинах, школах, детских садах, детских молочных кухнях и др.).

Биологический материал от больных, шовный и перевязочный материал при исследовании его на стерильность, испражнениях от больных острыми кишечными заболеваниями и контактных с ними, а также биологический материал от больных и трупного материала из г. Абакана (2008 г.).

Методы исследований

Использовали общепринятые физико-химические и микробиологические методы в соответствии с методическими указаниями «Методы контроля бактериологических питательных сред» МУК 4.2.2316-08, а также Инструкциями по применению на коммерческие питательные среды, проектами Инструкций по применению и утвержденными программами по испытанию питательных сред.

Биохимические характеристики и стабильность сохранения основных биологических свойств микроорганизмов определяли с использованием тест-систем (системы индикаторные бумажные для идентификации микроорганизмов (СИБ), производства ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, «ПБДЭ» - пластины биохимические, дифференцирующие энтеробактерии производства «НПО «Диагностические системы»»), а также биохимического анализатора «Multiscan assent» (Финляндия).

Сравнительный анализ интенсивности флюоресценции флюорогенных питательных сред проводили с помощью многофункционального планшетного анализатора VICTOR3 (Wallac 1420).

Взятие и посев исследуемого материала производили в соответствии с «Методическими указаниями по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями» (М.: 1984) и приказом Минздрава СССР от 22.04.85 г., № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».

Натурные испытания на наличие колиформ в сточных и речных водах, других биологических объектах были проведены на базах микробиологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области», ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Калужской области», ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора, в филиале ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Московской области в г.г. Пущино, Серпухов, Серпуховском и Чеховском районах», а также в бактериологической лаборатории ПЧС МСЧ-164 Федерального медико-биологического агентства.

Математическую обработку результатов проводили с помощью программы Microsoft Excel 5,0.

Результаты исследований н их обсуждение

Определение и обоснование составляющих компонентов питательных сред для индикации санитарно-показательных микроорганизмов

В ФГУН ГНЦПМБ при производстве сухих питательных сред используют сухие питательные основы, приготовленные из различных видов сырья - мяса, рыбы, рыбной муки, казеина и др. [Артюхин И.И., Шепелин А.П. и др., 1990].

Первоначальный этап работы по разработке составов питательных сред для обнаружения бактерий группы кишечной палочки: Эйкмана с лактозой и глюкозой, среды Кесслера-ГРМ, SDS-бульона, заключался в оптимизации составов с использованием панкреатического гидролизата рыбной муки (ПГРМ) и мясного ферментативного пептона Было доказано, что в составе питательных сред предпочтительно использовать смесь пептона и ПГРМ.

Ведущими зарубежными производителями, согласно Фармакопеи США (USP XXIII 1995) и Европейской фармакопеи (ЕР II) в качестве компонента питательных сред используется гидролизат желатина, по своему химическому составу представ-

ляющий соединение белковых веществ сложного строения, поэтому одной из задач нашей работы была разработка технологии получения сухого гидролизата желатина, конструирование на его основе питательных сред с последующим изучением биологических свойств на расширенных наборах музейных тест-штаммов.

В результате проведенных исследований показано, что среды Эйкмана с лактозой и глюкозой, среда Кесслера-ГРМ, SDS-бульои на основе панкреатического гидролизата желатина (ПГЖ), не уступают ранее отработанным составам на основе ПГРМ, пептонов мясных ферментативных в качестве белковых компонентов для эффективного роста энтеробактерий при их культивировании. Кроме того, было доказано, что в составе флюорогенного селективного бульона (ФСБ) использование ПГЖ в качестве питательной основы обеспечивает лучшие ростовые свойства среды, чем аналог.

После проведенных исследований по подбору белковой основы исследования по оптимизации компонентного состава питательных сред Кесслера-ГРМ и SDS-бульона (на основе ПГРМ) продолжили с использованием метода полного факторного эксперимента с приемом построения матрицы планирования эксперимента [Адлер Ю.П. 1976, Ашмарин И.П., 1962]. Таким образом, матрицы планирования полных факторных экспериментов с факторами в двух уровнях позволили получить модели питательных сред, обладающие оптимальными свойствами.

При выборе белковой основы для железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной было доказано, что внесение тиосульфата натрия перед высушиванием основы существенно улучшает стабильность и сроки хранения данной среды. Внесение предварительно высушенного до определенной влажности агара в сухую основу в процессе смешивания также увеличивает сроки хранения препарата. Для анализа критической влажности и состояния молекул воды в частицах препарата (свободная вода) был использован метод импульсного ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [Храмов М.В. и др. 2001].

Исходя из проведенных исследований, нами разработаны и оптимизированы составы исследуемых питательных сред:

• Питательная среда для обнаружения Е. coli и колиформных бактерий по признаку ферментации лактозы (среда Эйкмана с лактозой), г/л: ПГРМ и/или пептон сухой ферментативный - 10.0, лактоза - 5.0, натрия хлорид - 5.0, натрия карбонат - 0.050.25, бромтимоловый синий - 0.06.

• Питательная среда для обнаружения Е. coli и колиформных бактерий по признаку ферментации глюкозы (среда Эйкмана с глюкозой), г/л: ПГРМ и/или пептон сухой ферментативный - 10.0, глюкоза - 5.0, натрия хлорид - 5.0, натрия карбонат - 0.050.25, бромтимоловый синий - 0.06.

• Питательная среда для первичного обнаружения бактерий группы кишечной палочки (среда Кесслера-ГРМ), г/л: ПГРМ - 3.0, пептон сухой ферментативный - 7.0, лактоза - 10.0, желчь очищенная, сухая - 3.0, кристаллический фиолетовый - 0.04, натрия карбонат - 0.01-0.25.

• Питательная среда для выделения и дифференциации энтеробакгерий (SDS-бульон), г/л: SDS (натрий додецилсульфат) - 0.5, пептон сухой ферментативный 7.5, ПГРМ - 7.5, натрия хлорид - 6.0, лактоза - 10.0, бромтимоловый синий - 0.05, натрия карбонат - 0.3±0.05.

• Питательная среда для идентификации энтеробактерий (железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной), г/л: ПГРМ с тиосульфатом натрия - 20.5, лактоза - 20.0, глюкоза - 1.0, натрия фосфат двузамещенный - 1.0, калия фосфат однозамещенный -1.3, натрия хлорид - 5.0, железа окисного цитрат - 0.3, натрия сульфит - 0.6, мочевина - 10.0, феноловый красный — 0.05, агар микробиологический - 10.0 ± 3.0.

• Питательная среда для определения общих колиформных бактерий и Е. coli в исследуемых образцах - флюорогенный селективный бульон (ФСБ) г/л: ПГЖ - 10.0, лактоза - 10.0, желчь очищенная - 20.0, бриллиантовый зеленый - 0.0133, L - триптофан - 1.0,4-мстилумбеллиферил-Р-0-глюкуронид (MUG) - 0.1.

Выбор штаммов для контроля питательных сред

Ведущими зарубежными и отечественными фирмами используется общепринятый набор тест-штаммов, необходимый для биологического контроля воды, продуктов и др., состоящий из следующих культур микроорганизмов: Escherichia coli АТСС 25922, Enterobacter aerogenes АТСС 13048, Streptococcus faecalis АТСС 29212. Поэтому при конструировании питательных сред в набор штаммов для контроля также входили бактерии группы кишечной палочки (БГКП), энтерококки и дополнительно ряд микроорганизмов других таксономических групп (таблица 1).

Тест-штаммы Разработанные питательные среды

Эйкмана с глюкозой Эйкмана с лактозой Кессле-ра-ГРМ SDS- бульон железо-глюко- 30- лактоз-ный агар с мочевиной ФСБ

ЕсоЛ 3912/41 (055:К59) + + +

£«?// Ewing(0[24K72) 227 + +

Есо/; АТСС 25922 + + +

£ coli 4 (0157:Н7) + +

со/г 675 + + +

Р. aeruginosa 27/99 + + +

P. vn/gara НХ 19 222 + + + + +

5. aureus Wood- 46 + + +

E.aerogenes 10006 + + + + +

К. pneumoniae 418 +

C.freundii 101/57 + + +

К. pneumoniae 3534/51 +

Serratia marceseens 1 +

S.flexneri la 8516 +

Y. pestis EV +

Y. enlerocolitiea 287 II +

Y. pseudotuberculosis III +

S. sormei «S form» +

E.faecalis 775 +

V/cholerae non 01 +

Изучение специфической активности питательных сред

Для получения сведений о специфической активности разработанных питательных сред для индикации санитарно-показательных микроорганизмов были проведены контрольные испытания на средах с использованием музейных тест штаммов. При культивировании колиформных бактерий и E.coli в исследуемых жидких питательных средах установлено наличие характерного визуально видимого роста микроорганизмов (диффузное помутнение, изменение цвета среды и газообразование) через 18-48 ч при температуре 37 °С из разведений 10"6и 10"7, что подтверждает высокую чувствительность.

Способность термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре (44±1) °С в течение 24-48 ч, определяли на средах Эйкмана и Кесслера-ГРМ.

Кроме того, в отличие от контрольной среды Эйкмана Eijkman Lactose Broth (HiMedia), разработанные среды Эйкмана с глюкозой и лактозой содержат индикатор бромтимоловый синий, что дает возможность более правильно интерпретировать результаты анализа.

Ингибирующие свойства питательных сред Кесслера-ГРМ, SDS-бульона проверяли на музейных тест-штаммах: S. aureus Wood-46, P. vulgaris HX 19 222. Анализ результатов подтвердил ингибицию при всех испытанных концентрациях (10'1 , 10"4, соответственно).

Исследования, касающиеся железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной, показали, что железо-глюкозо-лактозный агар, содержащий в своем составе мочевину, позволяет различать иерсинии вследствие неодинаковой способности её расщеплять. Нами была исследована возможность использования железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной для дифференциации Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica от Y. pestis.

Большое значение для санитарной оценки внешней среды (воды, пищевых продуктов) имеет обнаружение возбудителя холеры (Vibrio cholerae). При лабораторной диагностике отобранные подозрительные на холерный вибрион колонии, выросшие после сред накопления на дифференциально-диагностических питательных средах, отсевают на лактозно-сахарозную среду, среду Клиглера или среду Кристенсена. Нами была исследована возможность использования железо-глюкозо-лактозного агара с

мочевиной для дифференциации типового вида рода V. cholerae по признаку ферментации глюкозы без образования газа.

Было доказано, что питательная среда обеспечивает во всех засеянных пробирках рост каждого штамма с проявлением типичных биохимических свойств: утилизацию мочевины, ферментацию лактозы и глюкозы, газообразование, образование сероводорода.

Принцип действия флюорогенного селективного бульона (ФСБ) основан на выявлении специфических ферментов ß-глюкуронидазы и триптофаназы E.coli. Кишечная палочка расщепляет флюорогенный субстрат 4-метилумбеллиферил -ß-Д- глюку-ронид (МУГ), в результате образуется флюоресцирующий в УФ-свете (366 нм) продукт реакции, а обнаружение индола, (вследствие расщепления триптофана) при добавлении реактива Ковача позволяет выявить E.coli с надежностью 99,9 %.

При исследовании ростовых свойств Е. coli и колиформных микроорганизмов из разведения 10"7 через 18 ч инкубации при температуре 37 °С наблюдалось диффузное помутнение, газообразование, наличие флюоресценции в УФ-свете (366 нм). Рост грамположительных микроорганизмов подавлен.

Степень интенсивности голубой флюоресценции, характерной для E.coli при ультрафиолетовом облучении микробного роста визуально ярче выражена на предлагаемой среде ФСБ, чем на среде Fluorocult BRILA Broth (FBB). Данный факт подтвердился и в результате сравнения интенсивности флюоресценции с помощью многофункционального планшетного анализатора VICTOR3 (Wallac 1420), производящим измерения с использованием флуориметрии со следующими режимами: umbelliferone; CW-lamp filter name F355; Emission filter name F460; Measurement time 0.1s.(рисунок 1).

1200000

г£л

rfi

rfl

-b

исследуемые штаммы E. coli

□ ФСБ

Рис. 1. Показатели интенсивности свечения флюорогенного селективного бульона (ФСБ) в сравнении с показателями среды Fluorocult BRILA Broth (FBB).

Определение сроков годности питательных сред

При разработке питательных сред были необходимы исследования их характеристик в процессе длительного хранения для определения сроков их годности. Качество экспериментальных серий питательных сред в процессе хранения их при различных температурах оценивали по физико-химическим и биологическим показателям.

Эксперимент по определению срока годности разрабатываемых сред Эйкмана с лактозой и глюкозой, Кесслера-ГРМ, 81Э8-бульона показал, что особо значимых изменений качественных показателей сред при хранении в течение 36 месяцев не выявлено по сравнению с исходными образцами. По совокупности полученных результатов было доказано, что среды имеют гарантированный срок годности 2 года.

Исследованиями установлено, что питательная среда для идентификации энте-робактерий (железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной) с предложенной технологией подготовки компонентов в течение 18 месяцев не теряет своих физико-химических и биологических свойств, что соответствует гарантийному сроку хранения - 1 год.

Использование экспресс анализаторов «Бак Трак 4100» для оптимизации составов и оценки качества сред Эйкмана

Так как разрабатываемые среды Эйкмана по своим свойствам соответствуют требованиям, предъявляемым к импедансным питательным средам (абсолютная прозрачность и оптимальный ионный состав), нами исследована возможность использования приборов типа «Бак Трак 4100» для определения качества сред Эйкмана по показателям чувствительности и скорости роста E.coli в исследуемых образцах в сравнении со средой Eijkman Lactose Broth (пр-во HI MEDIA) (рисунок 2).

На рисунке 2 приведены типичные кривые импедансного сигнала при определении E.coli с использованием сред Эйкмана с лактозой и глюкозой в сравнении со средой. Видно, что эффективность и скорость роста кишечной палочки на разработанных средах Эйкмана по сравнению со скоростью роста на контрольной среде выше, что подтверждено классическим методом высева на плотные питательные среды.

Кроме того, при росте тест-штаммов наблюдалось изменение цвета питательной среды с исходного зеленого на желтый, что дополнительно позволяет исключить вариабельность интерпретации результатов по сравнению с контрольной средой Eijkman Lactose Broth без индикатора. Таким образом, использование прибора для определения эффективности, скорости роста накопительных сред на примере сред Эйкмана, позволяет исключить рутинный классический метод.

БакЭвал - Общая диаграмма-Е и Общая диаграмма-М 22.10.2009

Полученные р«>упи»ты

М%

[ВЮСМ1Р] C:\PROGRA-lVSY-l_AB\BacWin\DalaBase

Рис.2. Кривые импедансного сигнала при определении Е.соН с использованием сред Эйкмана с лактозой и глюкозой в сравнении с аналогом.

Применение радиационного метода стерилизации и индивидуальной упаковки для сред Эйкмана

В отечественной промышленности отсутствуют сухие накопительные питательные среды в стерильной расфасовке для непосредственного внесения в определенный объем воды при использовании в полевых условиях. Нами предложен алгоритм подготовки сред Эйкмана для эпидемиологического мониторинга, который включает одноразовую индивидуальную упаковку и стерилизацию у- облучением. Сухие среды Эйкмана с лактозой (глюкозой), рассчитанные на исследование 100 мл воды, были расфасованы и герметично укупорены во флаконы из полистирола и стекла для стерилизации у-облучением на кобальтовой стационарной водоохлаждаемой установке КСВ-500. Экспериментально установлена оптимальная минимальная доза в 5 кГр, достаточная для стерилизации сухих питательных сред.

Таким образом, сухие питательные среды Эйкмана с лактозой (глюкозой) в индивидуальной упаковке имеют дополнительное преимущество: просты и удобны в приготовлении для использования в стационарных и передвижных лабораториях и могут быть рекомендованы для применения в практику здравоохранения для повышения эффективности эпидемиологического мониторинга объектов внешней среды (воды).

Разработка нормативной документации

В связи с необходимостью совершенствования диагностики возбудителей кишечных инфекций нами были разработаны ТУ, регламенты производства, инструкции по применению для установления единых норм, требований и показателей качества питательных сред, а также единых методов испытания этих показателей и требований к упаковке, маркировке, транспортированию, хранению. Результатом разработки нормативной документации является внедрение в производство усовершенствованных питательных сред.

Разработка методических рекомендаций

В России широко применяется методология обнаружения и выявления БГКП с применением бактериологических питательных сред лабораторного изготовления при санитарно-микробиологическом исследовании объектов внешней среды, пищевых продуктов, оборудования предприятий пищевой промышленности, для оценки санитарного состояния лечебных учреждений, учреждений общественного питания и т.д.

Разработан проект методических рекомендаций по использованию усовершенствованной, сухой питательной среды Эйкмана с лактозой при санитарно-микробиологическом анализе воды для обнаружения колиформных бактерий и Е.соП. Присутствие и подсчет количества общих колиформных бактерий (ОКБ) и термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) определяют титрационным методом (методом бродильных проб), который может быть использован при отсутствии материалов и оборудования для выполнения анализа методом мембранной фильтрации; при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ; в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных общих колиформных бактерий. Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду с последующим пересевом на плотную дифференциальную среду с лактозой и идентификации колоний по культу-ральным и биохимическим тестам. Для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ рекомендовано производить высев 1 мл из объемов среды Эйкмана, где отмечено помутнение, газообразование и изменение цвета среды, в пробирки со средой Эйкмана, предварительно прогретой до 44 °С, с поплавками. Посевы выдерживают в термостате при (44±1) °С в течение (24±2) часов. При обнаружении кислоты и газа выдают положительный ответ.

Испытание разработанных питательных сред в баклабораториях

На завершающем этапе работы образцы разработанных питательных сред были совместно испытаны на базах микробиологических лабораторий.

При исследовании проб из водоисточников на ТКБ с использованием разработанных сред Эйкмана с лактозой и глюкозой на базе микробиологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Калужской области» было отмечено, что испытуемые среды при различных температурах инкубирования (37 и 44) °С в течение 24 ч. дают характерный рост БГКП. Выявляемость энтеробактерий 100 %.

Испытания сред Эйкмана с лактозой проводились при санитарных обследованиях предприятий общественного питания, воды поверхностных водоемов и сточных вод, пищевых продуктов (молоко и молочнокислые продукты, кондитерские изделия с кремом). Всего было исследовано 623 молочных продукта, в 68 были обнаружены БГКП; 756 смывов - из них 120 положительных находок; 46 поверхностных водоемов - 8 находок; 30 колодцев и родников - 12 положительных находок. На среде Эйкмана

с глюкозой общее количество исследований - 756 из них 128 положительных находок при 100 % совпадении с контрольными средами.

Проведенные испытания качества питательных сред Эйкмана в ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора показали, что выявляе-мость энтеробактерий в исследуемых образцах воды на средах Эйкмана с глюкозой и лактозой также составила 100 %, скорость роста энтеробактерий на испытуемых средах сопоставима со скоростью роста на контрольной среде Кесслера-ГРМ, биохимические и культуральные свойства микроорганизмов стабильны. Чувствительность сред Эйкмана с глюкозой и лактозой (при посеве 19 штаммов энтеробактерий, в том числе в посевной дозе <102 микробных клеток, инкубации в течение 24 - 48 часов) составила 100%.

При испытании среды Кесслера-ГРМ в качестве контроля использовалась среда Кесслера лабораторного изготовления. Посев материала осуществлялся на среды с соблюдением условия равнозначности. Посевы инкубировались при температурах (37 и 43)°С в течение 24 ч.

По результатам апробации среды Кесслера ГРМ, проведенной в централизованной микробиологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области», было отмечено, что при посеве исследуемых образцов как в экспериментальную среду, так и в среду лабораторного изготовления отмечался рост в виде помутнения и образования газа при наличии БГКП (таблица 2).

Аналогичные испытания среды Кесслера-ГРМ были проведены в лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии по Калужской области». Было исследовано 2175 проб в виде смывов, пищевых продуктов и т. д. В ходе исследований установлено, что выявляемость культур на среде Кесслера - ГРМ выше по сравнению с контрольной и составляет 103 % (таблица 3).

Наименование учреждения Кол-во посевов / выделено культур Виды культур и кол-во

Смывы

ЛПУ 50/4 Е. coli - 2 К. pneumoniae -1 S. infantis -1

Детские комбинаты 95/19 Е. coli -12 К. pneumoniae - 3 С. freundii -4

Предприятие общ. питания 40/24 Е. coli -9 К. pneumoniae -15

Предприятие пищевой промышленности 10/0

Пищевые продукты

Детские учреждения 9/5 Е. coli - 3 К. oxytoca - 2

Предприятие общ. питания 3/1 К. pneumoniae

Молокозавод 11/0 -

Таблица 3 - Выявляемость БГКП при посеве объектов внешней среды.

Выявленные штаммы при испытаниях Исследуемая среда Кесслера-ГРМ Среда Кесслера лабораторного изготовления

Количество посевов 2715 2715

Количество находок 103 100

БГКП, в т.ч. 98 95

Е. coli Lac' 41 40

К. pneumoniae 1 1

К. oxytoca 8 8

Е. aerogenes 9 9

Е. cloacae 8 8

С. diversus 3 3

С. freundii 14 14

Итого, %: 103 100

Не энтеробактерии

P. aeruginosa 5 5

Результаты проведенных исследований на всех базах показали, что среда Кесс-лера-ГРМ проста, удобна в приготовлении, стандартна, обладает высокой чувствительностью в отношении БГКП.

Испытания ЗВБ-бульона по микробиологическим показателям (по выявляемо-сти энтеробактерий в образцах воды, смывов и др.), были проведены в Центре Госсанэпиднадзора г.Серпухова и в лаборатории ФГУЗ «Центр ГиЭ по Калужской области» (таблица 4).

Таблица 4 - Выявляемость энтеробактерий на SDS-бульоне (по результатам на двух базах).

Выявленные штаммы при испытаниях Испытуемая среда SDS-бульон Контрольная среда Кода

Количество посевов 702 702

Количество положительных находок энтеробактерий, в т. ч. 101 87

Е. coli Lac+ 49 40

С. freundii 11 22

С. diversus 2 . 1

К. pneumoniae 26 22

S. infantis 1 1

К. oxytoca 2 2

E. cloacae 2 2

E. aerogenes 2 2

E. coli Lac' 4 4

Выявляемость энтеробакте- 116,1 100

рий, % в т. ч.

Е. coli Lac+ 123 100

С. freundii 100 100

С. diversus 100 100

К. pneumoniae 118 100

S. infantis 100 100

К. oxytoca 100 100

E. cloacae 100 100

E. aerogenes 100 100

E. coli Lac~ 100 100

В результате проведенных экспериментов установлено, что по чувствительности, скорости роста энтеробактерий, ингибирующим свойствам в отношении микробов

- ассоциантов, сохранности основных биологических показателей выделенных энте-робактерий испытуемая среда SDS-бульон идентична контрольной - среде Кода (филиал ФГУП НПО «Микроген» г. Махачкала). Но по выявляемое™ энтеробактерий разработанная среда показала преимущество перед контрольной средой -116.1 %.

Испытания железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной, проведенные в лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» с использованием музейных, свежевыделенных штаммов, биоматериала от больных, шовного и перевязочного материала при исследовании его на стерильность, показали хорошие идентифицирующие свойства и предпочтительное ее использование перед средой Клиглера, (выявлено на 4 находки больше или 122 %, вследствие дополнительного теста по расщеплению мочевины) (таблица 5).

Таблица 5 - Выявляемость энтеробактерий на испытуемой и контрольной средах при посеве

клинического материала

Выявленные штаммы при испытаниях Питательная среда (железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной) Контрольная среда Клигле-ра-ГРМ

Количество посевов 856 856

Количество положительных находок: 22 18

Sh. Jlexsneri 2а 15 15

S. enteritidis 3 3

Pr.reffgeri 3 -

К. pneumoniae 1 -

Питательные среды Эйкмана с лактозой и глюкозой, флюорогенный селективный бульон и железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной успешно прошли апробацию при микробиологических исследованиях материала от больных, при вспышке бактериальной инфекции в г.Абакане в 2008 г.

Образцы испражнений из ДДУ г.Абакаиа (при вспышке менингококковой инфекции) были доставлены в ФГУН ГНЦ ПМБ для выявления наличия патогенных энтеробактерий.

Первичный материал был посеян для накопления и выделения на среды Эйкмана с лактозой и глюкозой, ФСБ, агар Эндо, Сорбитол Е.соН 0157:Н7 агар, иерсиниоз-ную среду. Инкубацию проводили при температуре 37 °С в течение 18 ч. В результате полученных исследований на питательных средах, в том числе и на средах Эйкмана с 22

глюкозой и лактозой, железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной и на флюороген-ном селективном бульоне, было подтверждено наличие колиформных бактерий E.coli во всех образцах, кроме одного образца, что указывает на высокую степень дисбакте-риоза кишечника.

Заключение

Представители семейства Enterobacteriaceae (энтеробактерии) играют важнейшую роль в патологии человека, вызывая инфекционные процессы различной тяжести. Идет интенсивный процесс детализации таксономического положения отдельных родов и видов, выявление и описание новых. Поэтому, вполне естественно, что и бактериологам, и клиницистам приходится следить за новой информацией. Многие редкие виды не включены в базы данных наиболее распространенных коммерческих тест-систем, что затрудняет идентификацию этих микроорганизмов. Облегчает ситуацию тот факт, что использование бактериологического метода с применением набора питательных сред остается «золотым стандартом» обнаружения, выделения и идентификации микроорганизмов с нитрованием их родовой и видовой принадлежности.

Наиболее широко известным и распространенным способом решения данной проблемы является применение сред для первичной дифференциации.

Целью использования таких сред является накопление чистой культуры и одновременная дифференциация, основанная на регистрации некоторых биохимических свойств бактерий, что позволяет упростить процедуру дальнейшей идентификации за счет сужения круга подозреваемых микроорганизмов.

Основным результатом диссертационной работы явилась разработка и внедрение в производство новых и усовершенствованных диагностических препаратов для оценки санитарно-эпидемического состояния объектов внешней среды, клинического материала и пищевых продуктов на наличие колиформных микроорганизмов. С этой целью разработаны сухие, стандартные, высокочувствительные, пригодные к использованию как в лабораторных, так и в полевых условиях диагностические питательные среды для первичной идентификации микроорганизмов: среды Эйкмана с лактозой и глюкозой, среда Кесслера-ГРМ, SDS-бульон, железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной, флюорогенный селективный бульон (ФСБ).

За период с 01.01.07. по 31.10.09. в ФГУН ГНЦ ПМБ произведено БОБ-бульона -7800 кг, среды Кесслера-ГРМ - 8000 кг, железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной - 6000 кг.

Предложена современная методология контроля водоисточников с использованием стерилизованных у-облучением сред Эйкмана в одноразовой индивидуальной упаковке при применении в стационарных и передвижных лабораториях.

В отличие от препаратов сравнения, разработанные среды Эйкмана с глюкозой и лактозой содержат индикатор бромтимоловый синий, что дает возможность более точно интерпретировать результаты анализа.

Для экспресс индикации и сокращения времени исследования по выявлению ко-лиформных бактерий разработан флюорогенный селективный бульон (ФСБ), принцип действия которого основан на способности Е. соИ расщеплять флюорогенный субстрат, благодаря наличию р-клюкуронидазы, с визуальным определением продуктов реакции.

Таким образом, внедрение в производство вышеуказанных питательных сред, разработка методических рекомендаций по их применению, способствует эффективному обнаружению и дифференциации колиформных микроорганизмов в исследуемых материалах.

Выводы

1. Разработаны составы отечественных сухих питательных сред промышленного производства с использованием панкреатических гидролизатов рыбной муки, пептона ферментативного в качестве белковых основ. В результате определения сроков годности питательных сред Эйкмана с лактозой и глюкозой, среды Кесслера-ГРМ, 808-бульона, железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной методом ускоренного хранения доказано, что расчетные сроки могут служить нормативом годности для этих питательных сред.

2. Обосновано использование железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной для проведения первичной идентификации по отношению к углеводам и мочевине представителей родов Yersinia и Vibrio.

3. На основе разработанного панкреатического гидролизата желатина создана новая, высокочувствительная, флюорогенная питательная среда (ФСБ), позволяющая значительно сократить время исследования.

4. Отработана технология изготовления сред Эйкмана в одноразовой индивидуальной упаковке, простерилизованных у-облучением для исследований проб воды. В отличие от коммерческих сред, разработанные среды Эйкмана с глюкозой и лактозой содержат индикатор бромтимоловый синий, что дает возможность более точно интерпретировать результаты анализа.

5. Показана возможность использования приборов типа «Бак Трак» для определения эффективности накопительных сред (на примере сред Эйкмана).

6. По результатам исследования были разработаны, согласованы и утверждены ТУ, промышленные регламенты, инструкции по применению, а также зарегистрированы в установленном порядке и разрешены к применению питательные среды Эйкмана с лактозой (глюкозой), Кесслера-ГРМ, SDS-бульона.

7. В результате проведенных испытаний разработанных питательных сред в бактериологических лабораториях доказана их высокая эффективность. Произведенные с момента внедрения, разработанные питательные среды позволили качественно провести в баклабораториях различного уровня около восьми миллионов бактериологических исследований по обнаружению БГКП.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Храмов М.В., Полосенко О.В., Марчихина И.И., Булатова Р.Ф. «Разработка прописи и процесса производства сухой питательной среды с мочевиной (Агар Ольке-ницкого-ГРМ)» // Материалы 3-ей Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем» - Махачкала 2001. - С. 30-31.

2. Шепелин А.П., Храмов М.В., Мартовецкий М.Н., Миронова E.H., Марчихина И.И., Полосенко О.В. «Использование унифицированной белковой основы при производстве питательных сред для диагностики ООИ» // Материалы VII Межгосударст-

венной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» - Оболенск 2006. - С. 255-256.

3. Полосенко О.В., Храмов М.В. «Разработка опытно-промышленной технологии производства сред Эйкмана» // Материалы IX Съезда Всероссийского научно -практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.-М.: 2007. -Том 3 - С. 76.

4. Храмов М.В., Полосенко О.В., Марчихина И.И., Мартовецкий М.Н. «Метод ускоренного обнаружения и выделения Е. coli и колиформных бактерий из объектов внешней среды в условиях сложной эпидобстановки» // Материалы 9 Межгосударственной научно-практической конференции " Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ". - Волгоград 2008. - С. 125 - 126.

5. Шолохова Л.П., Марчихина И.И., Бизяева Г.В., Приймак Н.П., Полосенко О.В., Мартовецкий М.Н., Храмов М.В. «Адаптация методов выделения энтеробакте-рий в соответствии с международными стандартами» // Труды конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» - С-П.: 2008. - №2 (22), прил. (часть 1), - С.223.

6. Полосенко О.В., Ажермачева H.H., Марчихина И.И., Мартовецкий М.Н., Храмов М.В. «Определение специфической активности сухих сред Эйкмана, просте-рилизованных радиационным методом»// Материалы X съезда гигиенистов и санитарных врачей. - М.: 2007,- Книга II - С. 785 - 786.

7. Полосенко О.В., Храмов М.В., Шолохова Л.П., Ажермачева Н.И., Мартовецкий М.Н., Марчихина И.И., Мицевич Е.В., Мицевич И.П., Борзенков В.Н. «Совершенствование бактериологической диагностики кишечных инфекций» // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» - М.: 2008.- С. 99.

8. Полосенко О.В., Марчихина И.И., Шолохова Л.П., Мартовецкий М.Н., Храмов М.В. «Разработка и использование новой питательной среды для выявления и

идентификации санитарно-показательных микроорганизмов» // Журн. Микробиол. Эиидемиол. Иммунобиол. - М.: 2008. - №6 - С. 70-72.

9. Храмов М.В., Полосенко О.В., Марчихина И.И., Мартовецкий М.Н. «Питательная среда для определения общих колиформных бактерий и Е. coli в исследуемых образцах». Приоритет по заявке на патент (рег.№ 2008125457/13 (030956)) на № 12-05/838.

По итогам диссертационной работы разработаны методические рекомендации «Обнаружение колиформных бактерий Е. coli при санитарно - микробиологическом анализе питьевой воды с использованием питательной среды Эйкмана с лактозой.

Разработаны, утверждены и зарегистрированы технические условия:

1. ТУ 9398-089-78095326-2008 «Питательная среда для обнаружения Е. coli и колиформных бактерий по признаку ферментации лактозы сухая (среда Эйкмана с лактозой)»;

2. ТУ 9398-089-78095326-2008 «Питательная среда для обнаружения Е. coli и колиформных бактерий по признаку ферментации глюкозы сухая (среда Эйкмана с глюкозой)»;

3. ТУ 9398-031 -78095326-2007(взамен ФСП 42-0084019200) «Питательная среда для обнаружения бактерий группы кишечной палочки сухая («Среда Кесслера-ГРМ»);

4. ТУ 9398-033-78095326-2007 (взамен ФСП 42-0084019400) «Питательная среда для выделения и идентификации энтеробактерий сухая («SDS-бульон»)».

Разработаны и утверждены регламенты производства:

1. Питательная среда для обнаружения бактерий группы кишечной палочки (среда Кесслера-ГРМ)» ПР № 78095326-23-2006;

2. Питательная среда для выделения и идентификации энтеробактерий сухая (SDS-бульона) ПР № 78095326-46-2006;

3. Питательная среда для контроля микробной загрязненности (лактозный бульон - среда для предварительного обогащения бактерий семейства Enterobacteriaceae) «Питательная среда № 11 ГРМ» ПР № 78095326-3-2006;

Получены регистрационные удостоверения на наборы реагентов для бактериологических исследований:

1. Регистрационное удостоверение на набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для обнаружения бактерий группы кишечной па-

лочки сухая (среда Кесслера-ГРМ) № ФСР 2007/00971 приказ Росздравнадзора от 22 октября 2007 года № 3321-Пр/07;

2. Регистрационное удостоверение на набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для выделения и идентификации энтеробактерий сухая (SDS-бульон)» № ФСР 2007/00969 приказ Росздравнадзора от 22 октября 2007 года № 3319-Пр/07;

3. Регистрационное удостоверение на набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для обнаружения Е. coli и колиформных бактерий по признаку ферментации глюкозы сухая (среда Эйкмана с глюкозой)» № ФСР 2008/03655 от 2 декабря 2008 года № 9588-Пр/08;

4. Регистрационное удостоверение на набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для обнаружения Е. coli и колиформных бактерий по признаку ферментации лактозы сухая (среда Эйкмана с лактозой)» № ФСР 2008/03656 от 2 декабря 2008 года № 9591-Пр/08.

Подписано в печать 13.11.09 Зак. 130 Тираж - 70 экз. в Копировальном Центре ООО «Времянеждёт» Москва, Варшавское шоссе, д.41 Тел./факс: (495) 781-0271, 781-0272 www.vnz.ru сору2@>упг.т

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Полосенко, Ольга Вадимовна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, 6 ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. САНИТАРНО-ПОКАЗATEЛЬНЫЕ МИКРООРГАНИЗ- 19 МЫ - ПРИОРИТЕТНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО СОЗДАНИЮ УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫХ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ИХ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ

1.2. СИТУАЦИЯ С ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬЮ И ПРОФИЛАК- 21 ТИКОЙ ОПАСНЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

1.3. НЕОБХОДИМОСТЬ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ СО- 30 ВРЕМЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ИНДИКАЦИИ СА-НИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

1.4. АКТУАЛЬНОСТЬ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГ- 32 НОСТИКИ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РАЗРАБАТЫВАЕМЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

1.5. ПРЕИМУЩЕСТВО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА ИЗ- 35 МЕРЕНИЯ ИМПЕДАНСА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.6. РАДИАЦИОННАЯ СТЕРИЛИЗАЦИЯ И ИНДИВИДУ- 36 АЛЬНАЯ УПАКОВКА

1.7. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ НОВОГО ПОКОЛЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. РАЗРАБОТКА ПРОГРАММ СРАВНИТЕЛЬНЫХ ИС- 3 9 ПЫТАНИЙ НОВЫХ И КОНТРОЛЬНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

2.2. МАТЕРИАЛЫ

2.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.4. МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ 43 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

3.1 ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К КАЧЕСТВУ РАЗРАБА- 45 ТЫВАЕМЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД. ПРОТОТИПЫ И СУЩЕСТВУЮЩИЕ АНАЛОГИ

3.1.1. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ' 45 Е. COLI И КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ ПО ПРИЗНАКУ ФЕРМЕНТАЦИИ ЛАКТОЗЫ (СРЕДА ЭЙКМАНА С ЛАКТОЗОЙ)

3.1.2. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ Е. 46 COLI И КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ ПО ПРИЗНАКУ ФЕРМЕНТАЦИИ ГЛЮКОЗЫ (СРЕДА ЭЙКМАНА С ГЛЮКОЗОЙ)

3.1.3. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ БАК- 47 ТЕРИЙ ГРУППЫ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ (СРЕДА КЕССЛЕР А-ГРМ)

3.1.4. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕН- 48 ТИФИКАЦИИ ЭНТЕРОБ АКТЕРИЙ (SDS-БУЛЬОН)

3.1.5. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ 50 ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ (ЖЕЛЕЗО-ГЛЮКОЗО-ЛАКТОЗНЫЙ АГАР

С МОЧЕВИНОЙ)

3.1.6. ФЛЮОРОГЕННЫЙ СЕЛЕКТИВНЫЙ БУЛЬОН (ФСБ)

3.2. ВЫБОР БЕЖОВОЙ ОСНОВЫ

3.3. ВЫБОР ШТАММОВ

3.3.1. ТЕСТ-ШТАММЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ СРЕД ЭЙКМАНА 61 С ЛАКТОЗОЙ И ГЛЮКОЗОЙ

3.3.2. ТЕСТ-ШТАММЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ СРЕДЫ КЕССЛЕ- 62 РА-ГРМ

3.3.3. ТЕСТ-ШТАММЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ SDS-БУЛЬОНА

3.3.4. ТЕСТ-ШТАММЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЖЕЛЕЗО

ГЛЮКОЗО-ЛАКТОЗНОГО АГАРА С МОЧЕВИНОЙ

3.3.5. ТЕСТ-ШТАММЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ФЛЮОРОГЕН- 65 НОГО СЕЛЕКТИВНОГО БУЛЬОНА (ФСБ)

3.4. ОПТИМИЗАЦИЯ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТ- 66 ВЕННОГО СОСТАВА ПО СОВОКУПНОСТИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ, ХАРАКТЕРНЫХ ДЛЯ АНАЛОГИЧНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

3.4.1 .СРЕДА ЭЙКМАНА С ЛАКТОЗОЙ (ГЛЮКОЗОЙ)

3.4.2. СРЕДА КЕССЛЕРА-ГРМ

3.4.3 SDS-БУЛЬОН

3.4.4. ЖЕЛЕЗО-ГЛЮКОЗО-ЛАКТОЗНЫЙ АГАР С МОЧЕ- 83 ВИНОЙ

3.4.5. ФЛЮОРОГЕННЫЙ СЕЛЕКТИВНЫЙ БУЛЬОН (ФСБ) 90 3.5 .ИЗУЧЕНИЕ РОСТОВЫХ И ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХ

СВОЙСТВ РАЗРАБОТАННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА РАСШИРЕННОМ НАБОРЕ МУЗЕЙНЫХ ТЕСТ-ШТАММОВ

3.5.1. СРЕДА ЭЙКМАНА С ЛАКТОЗОЙ (ГЛЮКОЗОЙ)

3.5.2. СРЕДА КЕССЛЕРА-ГРМ

3.5.3. SDS-БУЛЬОН

3.5.4. ЖЕЛЕЗО-ГЛЮКОЗО-ЛАКТОЗНЫЙ АГАР С МОЧЕ- 106 ВИНОЙ

3.5.5. ФЛЮОРОГЕННЫЙ СЕЛЕКТИВНЫЙ БУЛЬОН (ФСБ)

3.6. ОБОСНОВАНИЕ СРОКОВ ГОДНОСТИ РАЗРАБАТЫ- 111 ВАЕМЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

3.7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКСПРЕСС АНАЛИЗАТОРА 118 «БАК ТРАК 4100» ДЛЯ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА РАЗРАБАТЫВАЕМЫХ СРЕД ЭЙКМАНА С ЛАКТОЗОЙ И ГЛЮКОЗОЙ

3.8. ПРИМЕНЕНИЕ РАДИАЦИОННОГО МЕТОДА СТЕРИ- 121 ЛИЗАЦИИ И ИНДИВИДУАЛЬНОЙ УПАКОВКИ ДЛЯ СРЕД ЭЙКМАНА С ЛАКТОЗОЙ И ГЛЮКОЗОЙ

3.9. ИСПЫТАНИЕ ОБРАЗЦОВ РАЗРАБОТАННЫХ ПИТА- 122 ТЕЛЬНЫХ СРЕД В БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЯХ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка питательных сред для индикации санитарно-показательных микроорганизмов"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Состояние инфекционной заболеваемости по медицинской и социально-экономической значимости остается актуальной проблемой для России и в настоящее время. В 2008 г в Российской Федерации зарегистрировано почти 750 тыс. заболеваний острыми кишечными инфекциями, среди которых почти половину составляет кишечные заболевания неустановленной этиологии [43]. Возникновение очагов холеры, угроза появления и распространения опасных кишечных инфекций вследствие ухудшения экологического состояния поверхностных вод, возможности возникновения в любом регионе эпидемической ситуации и по другим инфекциям, таким как псевдотуберкулез, кишечный иерсиниоз - все это обусловливает необходимость контроля качества объектов внешней среды, пищевых продуктов, причем не только в отношении санитарно-показательных микроорганизмов, но и условно-патогенных энтеробактерий (УПЭ). Так как бактерии рода Escherichia являются постоянными обитателями кишечника человека и животных, обнаружение их в воде, почве, на пищевых продуктах свидетельствует о фекальном загрязнении этих объектов. Обнаружение Е. coli в воде является сигналом об опасности, которое связано с самим фактом попадания фекальных масс, являющихся местом обитания болезнетворных микробов кишечно-тифозной и дизентерийной групп. Эта проблема требует постоянного внимания со стороны работников здравоохранения и медицинской науки, так как инфекционные болезни зачастую принимают характер эпидемии. Выявление и ускоренная идентификация УПЭ - имеют большое значение, как для эпидемиологии, так и при проведении санитарно-микробиологического контроля объектов внешней среды, пищевых продуктов, а также для предупреждения внутрибольничных инфекций [23].

Одной из проблем клинических лабораторий и практических служб Рос-потребнадзора является проблема правильной и своевременной диагностики инфекций, вызываемых санитарно-значимыми микроорганизмами и, как следствие, обеспечение поддержания благополучной санитарно-эпидемической обстановки.

В настоящее время реально существует угроза появления и распространения социально-значимых инфекций, что находит отражение в современных понятиях «новых и возвращающихся» инфекционных болезней, на которые обращено внимание в международных и национальных проектах. На саммите «Группы восьми» в Санкт-Петербурге 15-17 июля 2006 г. по предложению России рассматривались вопросы, связанные с противодействием угрозе инфекционных заболеваний, возможностью проявления биотерроризма и биогенными катастрофами [39]. В этой связи повышается роль обеспечения противоэпидемических мероприятий новыми, высококачественными и стабильными диагностическими препаратами, создание которых основано на использовании методов современной биотехнологии.

Молекулярно-биологические вопросы, патогенез, клинические проявления, диагностика и лечение заболеваний, вызванных кишечными инфекциями, до настоящего времени сохраняют свою актуальность в связи с повсеместным распространением данной нозологии на территории нашей страны и стран ближнего зарубежья, сохранением высокого уровня заболеваемости. В нашей стране рост заболеваемости и изменение клинической картины связывают с новыми социальными и эпидемиологическими условиями, сложившимися в последние несколько лет, и, несомненно, влияющими на ход инфекционного процесса.

В последние годы интегративное использование в микробиологии и ин-фектологии достижений молекулярной биологии и генетики, метода клонирования генов и полимеразной цепной реакции существенно углубили имеющиеся знания о факторах патогенности микроорганизмов различных таксономических групп, в том числе энтеробактерий, и механизмах развития инфекционных болезней [8]. Но, в то же время использование бактериологического метода в проблеме диагностики заболеваний, вызванных кишечными инфекциями, имеет большое практическое значение. Несмотря на «революционную» направленность к автоматизации санитарно-бактериологического контроля, «золотым стандартом» обнаружения, выделения и идентификации микроорганизмов с ти-пированием их родовой и видовой принадлежности остается бактериологический метод с использованием набора питательных сред. Поэтому вопросы расширения номенклатуры, улучшения ростовых и дифференциально-диагностических свойств питательных сред, внедрение в практику клинической микробиологии методик, позволяющих сократить время получения чистой культуры возбудителя, не теряют значимости.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

• Оценка диагностической ценности новых питательных сред с препаратами сравнения в лабораторных условиях.

• Обоснование разработки состава флюорогенного селективного бульона (ФСБ) для определения колиформных бактерий и E.coli с использованием гидролизата желатина в качестве белковой основы.

• Определение алгоритма использования питательных сред Эйкмана с лактозой и глюкозой в одноразовой индивидуальной^ упаковке, простерилизо-ванных у-облучением, для оценки наличия бактерий группы кишечной палочки в модельных исследованиях водных объектов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Впервые на основе экспериментальных данных о характере роста возбудителей кишечных инфекций разработана промышленная технология производства усовершенствованных питательных сред Эйкмана с лактозой (глюкозой), Кесслера-ГРМ, SDS-бульона, железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной с использованием отечественных белковых основ: панкреатического гид-ролизата рыбной муки, пептонов, гидролизата желатина.

3. Впервые предложена современная методология контроля водоисточников с использованием сухих расфасованных, готовых к употреблению, стерильных сред Эйкмана для применения в полевых условиях. Для стерилизации сред Эйкмана адаптирован, метод радиационной стерилизации у-облучением с целью упрощения их использования.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

2. Внедрение в производство и в практику здравоохранения разработанных и усовершенствованных стандартных сухих питательных сред для дифференциации энтеробактерий (с 2007 по 2009 гг выпущено около 20 тонн) повысило стабильность микробиологических исследований, а также эффективность эпидемиологического мониторинга объектов внешней среды (почвы, воды), пищевых продуктов и др.

3. Предполагаемый промышленный выпуск и внедрение в практику здравоохранения флюорогенного бульона (ФСБ) существенно сократит время исследования по сравнению с классическим методом, обеспечивая высокую точность результатов в условиях чрезвычайных ситуаций и сложной эпидобста-новки.

5. По результатам проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Обнаружение колиформных бактерий и Е. coli при санитарно — микробиологическом анализе питьевой воды с использованием питательной среды Эйкмана с лактозой».

ВНЕДРЕНИЕ Разработаны, утверждены ^согласованы ТУ, регламенты производства, инструкции по применению, а также зарегистрированы в установленном порядке и разрешены к применению питательные среды Эйкмана с лактозой (глюкозой), Кесслера-ГРМ, SDS-бульона (регистрационные удостоверения № ФСР 2007/00971, № ФСР 2007/00969, № ФСР 2008/03656,,№ ФСР 2008/03655).

Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке от 18 августа 2009 г, № 2008125457/13 (030956) на № 12-05/838, «Питательная среда для определения общих колиформных бактерий и Е. coli в исследуемых образцах».

Материалы диссертации используются преподавателями в лекциях для магистрантов и аспирантов ФГУН ГНЦ ПМБ, на курсах повышения квалификации Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИ мясной промышленности им. В.М. Горбатова) и Роспотребнадзора (ФГУЗ «Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии»).

Разработаны методические рекомендации по применению среды Эйкмана с лактозой.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

6. Изучение биологических свойств питательных сред с использованием широкого набора музейных тест-штаммов, образцов продуктов питания, клия 1 нического материала и объектов окружающей среды для определения диагностической ценности разработанных сред.

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА:

Настоящая диссертационная работа выполнена при консультативной помощи Главного врача ФГУЗ ФЦГ и Э Роспотребнадзора - Верещагина А.И., зав баклабораторией Калужского ФГУЗ ЦГиЭ- Мироновой З.А., зав. микробиологической лабораторией филиала ФГУЗ ЦГиЭ в МО в г.г. Пущино, Серпухов, Серпуховском и Чеховском районах- Оснач А.А., зав. лабораторией Противочумного Центра МСЧ 164 - Борзенковой Т.Х.

Искренне признательна за содействие в проведении исследований по теме диссертации сотрудникам ГНЦ ПМБ: зав. ООК Н.И. Ажермачевой, зав. научно-производственного отдела питательных сред, к. х. н. М.Н. Мартовецкому, зав. лабораторией микробиологических и физико-химических методов анализа И.И. Марчихиной, н.с. Булатовой Р.Ф., к. б. н., с.н.с. Кравченко Т. Б., к.б.н., зав.сектором лаборатории иммунобиохимии Фирстовой В.В., м.н.с. Подкопае-ву Я.В., за оформление диссертации -вед.инж. Филипповой А.П.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные материалы по теме диссертационной работы доложены на

3-ей Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы- разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем», Махачкала 2001; VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» Оболенск 2006; IX Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва 2007; X съезде гигиенистов и санитарных врачей Москва 2007; 9-ой Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», Волгоград 2008; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва 2008.

ПУБЛИКАЦИИ. Основное содержание работы отражено в 9 научных работах, включая статью Разработка и использование новой питательной среды для выявления и идентификации санитарно-показательных микроорганизмов.// Журн. Микробиол. Эпидемиол. Иммунобиол. М.: 2008. - №6 - С. 70-72.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Полосенко, Ольга Вадимовна

выводы

1. Разработаны составы отечественных сухих питательных сред промышленного производства с использованием панкреатических гидролизатов рыбной муки, пептона ферментативного в качестве белковых основ. В результате определения сроков годности питательных сред Эйкмана с лактозой и глюкозой, среды Кесслера-ГРМ, SDS-бульона, железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной методом ускоренного хранения доказано, что расчетные сроки могут служить нормативом годности для этих питательных сред.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представители семейства Enterobacteriaceao, (энтеробактерии) играют важнейшую роль в патологии человека, вызывая инфекционные процессы различной тяжести. Идет интенсивный процесс детализации таксономического положения отдельных родов и видов, выявление и описание новых. Поэтому, вполне естественно, что и бактериологам, и клиницистам приходится следить за новой информацией. Многие редкие виды не включены в базы данных наиболее распространенных коммерческих тест-систем, что затрудняет идентификацию этих микроорганизмов. Облегчает ситуацию тот факт, что использование бактериологического метода с применением набора питательных сред остается «золотым стандартом» обнаружения, выделения и идентификации микроорганизмов с типированием их родовой и видовой принадлежности.

Наиболее широко известным и распространенным способом решения данной проблемы является применение сред первичной дифференциации.

Целью использования таких сред является накопление чистой культуры и одновременное выявление некоторых свойств бактерий, что позволяет упростить процедуру дальнейшей дифференциации за счет сужения круга подозреваемых микроорганизмов.

Основным результатом диссертационной работы явилась разработка и внедрение в производство новых и усовершенствованных диагностических препаратов для оценки санитарно-эпидемического состояния объектов внешней среды, клинического материала и пищевых продуктов на наличие колиформных микроорганизмов. С этой целью разработаны сухие, стандартные, высокочувствительные, пригодные к использованию как в лабораторных, так и в полевых условиях диагностические питательные среды для- первичной идентификации микроорганизмов: среды Эйкмана с лактозой и глюкозой, среда Кесслера-ГРМ, SDS-бульон, железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной, флюорогенный селективный бульон (ФСБ).

За период с 01.01.07. по 31.10.09. в ФГУН ГНЦ ПМБ произведено SDS-бульона - 7800 кг, среды Кесслера-ГРМ - 8000 кг, железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной — 6000 кг.

Применение железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной позволяет дифференцировать микроорганизмы по способности продуцировать сероводород, расщеплять мочевину и утилизировать глюкозу. Дополнительно обосновано использование железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной для проведения первичной идентификации по отношению к углеводам и мочевине представителей родов Yersinia и Vibrio.

Для экспресс индикации и сокращения времени исследования по выявлению колиформных бактерий разработан флюорогенный селективный бульон (ФСБ), принцип действия которого основан на способности E.coli расщеплять флюорогенный субстрат, благодаря наличию Р-клюкуронидазы, с визуальным определением продуктов реакции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полосенко, Ольга Вадимовна, Оболенск

1. Адлер Ю.П., Маркова Е.В., Грановский Ю.В. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий. М: Наука, 1976 - С. 129.

2. Азаров В.Н. Основы микробиологии и пищевой гигиены. М: Экономика, 1981.-С. 208-209.

3. Артюхин В.И., Шепелин А.П. и др. Производство и применение продуктов микробиологических производств //Белковые гидролизаты в производстве питательных сред. М: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР. - 1990. Вып. 9-10.-С.11-16.

4. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л: Гос. изд. мед. лит., 1962. - 180 с.

5. Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс-анализатора «Бак Трак 4100». Метод.указ. М: Минздрав России, 1997-С. 9-11.

6. Бакулина Н.А., Краева Э.Л. Микробиология. 2-е изд. перераб. и доп. — М: Медицина, 1980. С. 422 -442.

7. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М: Медицина, 1982. — С. 399-441.

8. Бондаренко В.М., Шахмарданов М.З. Шигеллезы: теория и практика. М: БФРГТЗ, 2002. - С. 5.

9. Вейант Р., Мосс У., Уивер Р., Холлис Д.и др. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий. М: Мир, 1999. - С. 27-57.

10. Ю.Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Е. coli и колиформных бактерий. ГОСТ Р 52426-2005 (ИСО 9308-1:2000). Часть 1 М.: 2005 - С. 25-35.

11. Н.Голубева И.В., Килессо В.А., Киселева Б.С. и др. Энтеробактерии: Рук. для врачей. — М: Медицина, 1985. — С. 321.

12. XI Государственная Фармакопея СССР /Вып. 2. М.: 1990 - С. 187.

13. XII Государственная Фармакопея Российской Федерации. М.: 2007. - С. 21-46.

14. ЕфимочкинаН.Р. Эмерджентные бактериальные патогенны в пищевой микробиологии. М: РАМН, 2008. - С. 11-26.

15. Инструкция по микробиологической диагностике кишечных заболеваний, вызванных шигеллами, сальмонеллами и энтеропатогенными кишечными палочками./Под.ред Ю.И. Литинского: МЗ СССР 1966 Б № 629-66. М.: 1966. - С. 25-36.

16. Информация о продукции: Сухие питательные среды и добавки. HiMedia Laboratories Pvt Limited. А-406/ Bhaveshwar Plaza, LBS Marg, Mumbai -400 086, India, 1993. - C. 84-85.

17. Использование метода измерения электрического сопротивления (импеданса) для санитарно-микробиолгического исследования питьевой воды: Метод. указ. МУК 4.2.1111. -02. Инф.-изд.центр Минздрав России, М.: - 2002. -С.59.

18. Клиническая лабораторная аналитика /Под ред.В.В. Меньшикова — М: Агат-Мед, 2003. С. 237-244.

19. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. М: Мед-гиз, 1960.-С. 155-156.

20. Корнелаева Р.П., Степаненко П.П., Павлова Е.В. Санитарная микробиология сырья и продуктов животного происхождения. М: Медицина, 2006 — С. 118.

21. Лабинская Л.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М: Медицина, 1988 - С.78.

22. Медицинская микробиология. /Гл. ред. В.И.Покровский, O.K. Поздеев. — М: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. С. 987-999.

23. Методы контроля бактериологических питательных сред: Метод, указ. МУК 4.2.2316-08. М: Роспотребнадзор, 2008. - С. 39-41.

24. Методы микробиологического контроля питьевой воды: Метод, указ МУК1005.045.03. Астана, 2003. - С. 23-32.

25. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов: Метод, указ. МУК 4.2.577-96. М: Госкомсан-эпиднадзор России, 1996. - С. 44-46.

26. Методы микробиологического исследования в клинической микробиологии: Метод, рек. Министерство здравоохранения. М.: 1983. - С. 31.

27. Методы общей бактериологии. /Под ред. Ф.Герхарда и др. М: Мир, 1983. - С. 324-350.

28. Микробиологическая диагностика заболеваний, вызываемых энтеробакте-риями: Метод.указ. Министерство здравоохранения. М.: 1986. - 70 с.

29. Микробиология: Каталог 2004/2005 (MERCK), М: ООО ВИТЭК-ФАРМ, 2005.-С 171-172.

30. Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов: СанПиН № 42-1234940-88. Министерство здравоохранения. - М.: 1988. - 72 с.

31. Мол око и молочные продукты. Методы микробиологического анализа: Госстандарт. ГОСТ 9225-84.- М: Изд.Стандартов, 1984 25 с.

32. Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям ГОСТ Р 50396.0 92 (7702.2.0 - 95). - М.: 1995 - С. 29.

33. Определение колиформных бактерий и E.coli с использованием хромоген-ных и флюорогенных индикаторных сред производства Merck (Германия): Метод.рек. М: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.-С. 16-24.

34. Определение сроков годности сухих микробиологических сред и питательных основ методом "ускоренного старения" при повышенной температуре: Метод, рек. Махачкала, 1987. - 8 с.

35. Острые кишечные инфекции, вызываемые условно-патогенными бактериями: Метод, рек. Министерства здравоохранения. М.: 1984. - 27 с.

36. Поздеев O.K. Медицинская микробиология /Под ред. акад. РАМН В.И.Покровского. М: ГЭОТАР-МЕД, 2001. - С. 351-381.

37. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб: ЭЛБИ, 2008. - С. 78-96.

38. Проблемы особо опасных инфекций: Сб. науч. тр./Под ред. докт. мед. наук, профессора В.В.Кутырева: Вып. 2(82) ОГУП РИК Саратов: Полиграфия Поволжья, 2001. — С. 5.

39. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий): Госстандарт России. ГОСТ Р. 50474-93. М: Стандарт, 1993. - С. 4-6.

40. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии./Под ред. Н.П. Блинова. М: Медицина, 1988. - С. 149-150.

41. Санитарная микробиология. /Под ред. С.Я. Любашенко М Пищ. пром.,1980.-С. 14-16.

42. Санитарно гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов: СанПин 2.3.2.560-96 - М.: 1996. -С. 35.

43. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды: Метод, указ. МУК 4.2.1018-01. М.:2001 - С. 22-23.

44. Скала Л.З.,. Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г. и др. Практические аспекты современной клинической микробиологии. Тверь: Изд. Триада, 2004. — С.31-58.

45. Справочник по микробиологическим питательным средам. /Под ред. М.М. Меджидова. Махачкала: Дагестан, книжн. изд., 1989. - С. 27-51.

46. Среды бактериологические /Каталог 2007/2008 (НЕМ), ООО ГЕМ, 2007 -С. 87-88.

47. Стейниер Р., Эдельберг Э. и др. Мир микробов Т. 3. М: Мир, 1979. - С. 144-166.

48. Фомин Г.С. Вода. Контроль химической,, бактериальной и радиационной безопасности по международным стандартам: Энцикл. Справ. 3-е изд., пе-рераб. и доп. М: Изд. Протектор, 2000. - 496 с.

49. Фролова И.В;, Трошкова Г.П., Камший Л.П. Разработка технологии изготовления сухих стерильных питательных сред для клеток млекопитающих.// Биотехнология 1999. — № 4 - С. 38-43.

50. Храмов М.В., Полосенко О.В. и др. Разработка прописи и процесса производства сухой питательной среды с мочевиной (Агар Олькеницкого-ГРМ)»

51. Межд. научн.-практ. конф. Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем Махачкала 2001, С. 30-31.

52. Шлегель Г. Общая микробиология. М: Мир, 1987. - С. 30.

53. Энтеробактерии: Руководство для врачей. /Под ред. акад. РАМН СССР, проф., В.И. Покровского. М: Медицина, 1985. - С. 57-220.

54. Bacteria and bacteriophages. American type culture Collection. Catalogue 1992, P. 415-604.

55. Bergey's Manual of systematic bacteriology/Eds. NR. Krieg, JG. Holt. Baltimore: Willam& Willcins Co., 1984, 9th ed. V.l: P. 296-603.

56. BioLife Manual, Second edition, printed in Italy, by INGRAF, Milan, 1991, P. 88.

57. Boyce T.G. N.Englm J. Med. 1995; 333:364-368.

58. Brotman M., et al. Gastroenterology 1995; 108:1923-1934.

59. Bryant H.E., et al. J. Infect. Dis. 1989; 160:858-864.

60. Difco, Laboratories PO BOX 331058 Detroit Mi 48232-7058 USA, 1992, P. 3.

61. Doile M.P. Shoeni J. Appl. Environ. Microbiol. 1987; 52:2394-2396.

62. HiMedia. Laboratories Pvt. Limited 1993

63. Holt J.G., editor in ch. Bergey's manual of determinative bacteriology. Baltimor: Williams & Wilkins; 1994

64. Manual of BBL products and laboratory procedures. Sixth Edition 1991.- 52000.1. P. 172.

65. Microbiology Manual, MERCK, LPRO UBA-V. 1996. P. 314-316.

66. Microbiological Media /by Ronald M. Atlas, second edition. 1997. P. 5051523.

67. Microbiology Culture Media for general microbiology, for Food Analisis, For Environmental'Analisis, for molecular Biology (1994), Fluka P. 69.

68. Robson W.L., et al. Curr. Probl. Pediatr. 1993;23: P. 16-33.81 .Ryan M.J., et al. Nngl.J.Med. 1995; 333:1712-1713.

69. The manual of microbiological'culture media Gibco BRL, 1988 — P. 51.

70. The Oxoid manual of culture media, ingredients and other laboratory services

71. Oxoid Limited 1979). 84.Selconis W.C., Winter J.A. Microbes in water.//ASTM Standartization News -1992-№4. P. 50-53.

Информация о работе

Полосенко, Ольга Вадимовна
кандидата биологических наук
Оболенск, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка питательных сред для индикации санитарно-показательных микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы